رصد كيناز والفوسفاتيز الأنشطة من خلال دورة الخلية التي Ratiometric الحنق

يتزايد استخدام الحنق المستندة للصحفيين لرصد كيناز والفوسفاتيز الأنشطة في الخلايا الحية. نحن هنا وصف الأسلوب على كيفية استخدام الحنق المستندة للصحفيين لتقييم دورة الخلية التي تعتمد على التغيرات في الفسفرة الهدف.

فورستر نقل الطاقة الرنين (الحنق) على أساس السماح للصحفيين ¹ تقييم كيناز الذاتية والأنشطة الفوسفاتيز في الخلايا الحية. وعادة ما تتألف مثل هذه التحقيقات من المتغيرات من CFP وYFP ، تدخلت تسلسل phosphorylatable مجال الفوسفات وملزم. على الفسفرة ، والتشكل التغييرات التحقيق ، مما يؤدي الى تغيير في المسافة أو الميل بين CFP وYFP ، مما يؤدي إلى تغيير في كفاءة الحنق (الشكل 1). وقد نشرت تحقيقات عدة خلال العقد الماضي ، ورصد تحركات التوازن نشاط متعددة وphosphatases ، بما في ذلك مراسلي PKA ² ، ³ PKB ، PKC ⁴ ، ⁵ PKD ، إرك ⁶ ، ⁷ JNK ، CDK ¹⁸ ، أورورا B ⁹ و ⁹ Plk1 . نظرا لتصميم وحدات ، تحقيقات إضافية من المرجح أن تظهر في ¹⁰ في المستقبل القريب.

يتأثر تطور خلال دورة الخلية signali الإجهاد¹¹ نانوغرام المسارات. على وجه الخصوص ، وينظم دورة الخلية بشكل مختلف خلال رابط الجأش النمو بالمقارنة مع الخلايا عندما يتماثلون للشفاء من الإجهاد ^12. الوقت الفاصل بين التصوير من الخلايا من خلال دورة الخلية لذا يتطلب الحذر خاصة. هذا يصبح مشكلة خاصة عندما توظف ratiometric التصوير ، لأن المطلوب صورتين مع اشارة الى ارتفاع نسبة الضوضاء إلى تفسير صحيح للنتائج. Ratiometric الحنق وقد تم التصوير في الغالب من التغيرات في دورة الخلية تعتمد أنشطة كيناز والفوسفاتيز يقتصر على أقسام فرعية للدورة الخلية ^{8،9،13،14.}

هنا ، نحن نناقش طريقة لرصد الحنق على أساس تحقيقات باستخدام التصوير ratiometric طوال دورة الخلية البشرية. أسلوب يعتمد على المعدات التي تتوفر لكثير من الباحثين في علوم الحياة و لا يتطلب معرفة متخصصة المجهري أو معالجة الصور.

1. تقديم لجنة التحقيق إلى الخلايا

1. شارك في transfect الخلايا مع التحقيق الذي تجريه الحنق على أساس المقاومة ومنح البلازميد. اختيار طريقة ترنسفكأيشن تتسم بالكفاءة في نوع الخلايا اهتمامك. U2OS للخلايا ، ومعيار أساليب ترنسفكأيشن فوسفات الكالسيوم يعطي نتائج كافية ^15.
2. حدد الخلايا الموجودة في المضادات الحيوية المناسبة لسبعة أيام على الأقل. هذا يثري كمية من الخلايا معربا عن التحقيق ويحد من كمية الخلايا التي تحتوي على مستويات التعبير السامة ، أو مستويات التعبير التي تؤثر بشدة على دورة الخلية.
3. (اختياري) حدد لاستنساخ مستقرة.
4. استخدام خلايا ثابتة أو حي ، تحقق من أن كلا CFP وYFP موجودة في جميع الخلايا في النسبة تقريبا.
5. في حالة احتواء بعض الخلايا فقط أو CFP YFP ، حدث تأشب احتمالا. يمكن أن يحدث إما أثناء إعادة التركيب نمو البكتيريا أو بعد ترنسفكأيشن لجنة التحقيق ، وربما في الحالة الأخيرة تعتمد على نوعية البلازميد. كرر ع البلازميدالجبر ويصبح خطي من قبل البلازميد ترنسفكأيشن إذا استمرت المشكلة.

2. ratiometric رصد الحنق

1. خلايا البذور على أطباق أسفل الزجاج ، أو زلات لتركيب الغطاء في الغرفة. تأكد من أن أطباق / زلات تغطية توجد 1.5 (170 ميكرون سميكة).
2. جبل الخلايا في النمو دون الحمراء المتوسطة الفينول على مجهر epifluorescence بمحركات مع مجموعة التحكم في درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية. ضمان تنظيم درجة الحموضة وسائل الإعلام ، إما عن طريق CO ₂ أو باستخدام ثاني أكسيد الكربون ₂ وسائل الإعلام المستقلة مثل يبوويتز - 15.
3. التركيز على الخلايا باستخدام الضوء المرسل. لا تبدو على الخلايا باستخدام ضوء الفلورسنت.
4. يبدأ من خلال الحصول على صورة 12 بت أو 16 باستخدام الإثارة YFP (YFPex) ومرشحات YFP الانبعاثات (YFPem) ومرآة مناسبة مزدوج اللون. استخدام binning القصوى المتاحة التي لا يزال يسمح القرار المطلوب التحت خلوية. باستخدام binning عالية لتقليل مدة التعرض أو شدة أمر حاسم لتجنب الضيائية.
5. أناasure أو تقدير شدة الضوضاء الخلفية وتقريبية من خلال قياس أو تقدير متوسط ​​، والحد الأدنى الخام والقيم بكسل كحد أقصى في منطقة خالية من الخلايا. تغيير وقت التعرض ومحايدة مرشحات الكثافة بحيث إشارة المتوسط ​​في الخلية هو ما يقرب من كثافة الخلفية بالإضافة إلى خمسة إلى عشرة أضعاف الفرق بين الحد الأقصى وشدة الخلفية دقيقة.
6. تحقق من أن الصور ليست على وشك المشبعة. ينبغي للكثافة القصوى في صورة أقل من نصف النطاق الديناميكي (مثل ماكس 2000 في صورة 12 بت) للسماح لشدة الخلافات عندما تدخل خلايا الانقسام.
7. كرر الخطوة 2،4-2،6 باستخدام الإثارة وعوامل الانبعاثات CFP YFP ومرآة مناسبة مزدوج اللون.
8. حدد مناطق متعددة مع خلايا transfected ، باستثناء المناطق المستخدمة ل2،4-2،7 نقطة ، وضمان أقصى قدر من كثافة أقل من نصف النطاق الديناميكي في جميع الخلايا.
9. بدء تجربة مرور الزمن اكتساب صورتين كل 45 دقائق باستخدام YFPex -- YFPem وCFPex -- YFPem مجموعات التصفية.

3. وتحسين شروط التحقق

1. فتح الصور التي اكتسبوها ورصد زمن دورة الخلية من الانقسام على الانقسام للخلايا التي تعبر عن لجنة التحقيق transfected.
2. قارن دورة الخلية قياس الوقت لنشر البيانات لنوع من الخلايا المستخدمة. بدلا من ذلك ، untransfected الفيلم من خلال الحصول على خلايا صورة واحدة من الضوء ينتقل فقط (على سبيل المثال مدينة دبي للإنترنت ، أو مرحلة التباين) في كل ساعة للحصول على أوقات إشارة دورة الخلية.
3. في حالة الوقت من الانقسام الخيطي ليتوافق مع مواعيد مرجعية دورة الخلية ، انتقل إلى الخطوة 4. بدلا من ذلك ، وإعادة الحصول على صور باستخدام الصعب التعرض لمزيد من الوقت أو عدة نقاط ض المستويات وكرر الخطوة 3.
4. transfected الفيلم في حالة من الانقسام في وقت لالانقسام لا تتوافق مع إشارة توقيت دورة الخلية ، من خلال الحصول على خلايا صورة واحدة من الضوء ينتقل فقط (على سبيل المثال مدينة دبي للإنترنت ، أو مرحلة النقيض) كل ساعة تليها صورة واحدة في نهايةالتجربة لتحديد الخلايا transfected.
5. إذا كانت الخلايا لا تزال تظهر transfected مرات أطول دورة الخلية ، كرر الخطوة 1 ولكن أقل transfect التحقيق أو تحديد لاستنساخ المستقرة التي تحتوي على كميات منخفضة جدا من التحقيق.
6. إذا كانت الخلايا طبيعية تظهر transfected مرات دورة الخلية في غياب ضوء الفلورسنت ، وكرر الخطوة 2 ولكن أقل من التعرض عن طريق تعديل binning ، مرشحات الكثافة محايدة ، ومدة التعرض ، والوقت بين الصور.

4. تحليل الحنق

1. يمكن إجراء التحليل من قبل معظم البرامج المخصصة لالمجهري. هنا ونحن تصف كيفية إجراء التحليل باستخدام ImageJ مجانية ( http://rsb.info.nih.gov/ij ) الاستفادة من البرنامج المساعد زائد نسبة ( http://imagej.nih.gov/ij/plugins/ratio-plus . HTML ).
2. فتح الصور في ImageJ. في حالة الصور في شكل لSTAC متعدد الألوانك (على سبيل المثال Deltavision) ، فصل عن طريق تحويل القنوات الفردية الأولى هم لhyperstack : صورة لhyperstack - hyperstack المكدس والانقسام في وقت لاحق لهم باستخدام مداخن قناة واحدة : صورة - hyperstack - تقليل أبعاد
3. مضاعفة YFPex -- مكدس YFPem به مع 3 : عملية - الرياضيات ضرب هذه الخطوة اختيارية ، والغرض منه هو زيادة وضوح بصرية للصور عن طريق ضمان أن النسب ليست في نطاق بين 0 و 1.
4. في YFPex -- مكدس YFPem ، رسم المنطقة ذات الاهتمام (ROI) في المنطقة التي تخلو من الخلايا ، ولكن هذا هو على مقربة من خلية إلى أن يقاس. قد خلايا مختلفة في نفس الصورة تتطلب مختلف المناطق ، لأن كلا من الخلفية وكثافة الإشارة عادة في مركز أقوى من الصورة.
5. إضافة إلى مدير ROI العائد على الاستثمار : تحليل عائد الاستثمار ، الأدوات ، مدير.
6. قياس كثافة متوسط ​​العائد على الاستثمار في YFPex على حد سواء -- وYFPem CFPex و-- مكدس YFPem : تحليل القياس .
7. تكرار في timepoints متعددة والتحقق من أن شدة الخلفية بالقرب من الخلية التي تهم مماثلة طوال الفيلم.
8. ضبط القياسات لتشمل الحد الأدنى من شدة : تحليل لضبط قياسات مين وماكس قيمة الرمادي.
9. رسم المنطقة التي تغطي معظم الاهتمام من خلية وقياس كثافة أدنى في YFPex على حد سواء -- وYFPem CFPex و-- YFPem المكدس. تأخذ الفرق بين الحد الأدنى من قياس كثافة وشدة الخلفية من 4.6 وتقسيمها على اثنين. يوفر هذا تقدير لقيمة بدءا قطة.
10. فتح نسبة زائد. حدد YFPex -- YFPem وCFPex و-- YFPem المكدس. لنسبة الحنق ، حدد CFPex -- YFPem كما المكدس 1 ، لمقلوب نسبة الحنق تصور تحقيقات حيث يقلل كفاءة الحنق على الفسفرة ، حدد YFPex -- YFPem كما مكدس 1.
11. إدراج قياس كثافة الخلفية والقيم لقطة.
12. تعيين التحجيم من المكدس نسبة الناتج وتطبيق ش تبدو مناسبةع الجدول (طرفية) لتصور التغييرات النسبة.

5. ممثل النتائج

Plk1 النشاط مرئية الأول في النواة في المرحلة G2 والقمم خلال الانقسام. الشكل 3 يوضح تجربة باستخدام إعدادات الضيائية الحد الأدنى كما هو موضح في القسم 2. يرجى ملاحظة أن هذا هو نتيجة ممثل الأولية والتي يمكن تعديلها أو ظروف التعرض الوقت بين الصور لزيادة اشارة الى نسبة الضوضاء أو قرار مؤقت. يوضح الشكل 3D أن غالبية الخلايا تتكاثر معربا عن التحقيق مع خلية دورة الزمن ما بين 20 و 25 ساعة ، مشيرا الى ان ظروف التصوير ومستويات التعبير عن التحقيق لا تؤثر على توقيت دورة الخلية. وإن كان هناك ضجيج كبير ، والاتجاه نحو زيادة النشاط في Plk1 G2 وتبلغ ذروتها في ¹⁴ الانقسام مرئيا بوضوح (الشكل 3A). معالجة البيانات الخام ، والتي تعني هنا الترشيح المقدمة بوصفها kymograph (الشكل 3B) ، أو في تقدير حجم را مقلوب المتوسط يمكن تيو (الشكل 3C) تعزيز الوضوح.

الشكل 1. مبدأ تحقيق الحنق القائم على رصد أنشطة كيناز والفوسفاتيز. ترتبط اثنين fluorophores ، CFP عادة (الأزرق) وYFP (الأخضر) ، من خلال مجال الفوسفات وملزمة (البرتقال) وتسلسل phosphorylatable (الصفراء). الفسفرة (الحمراء) يتوسط ملزمة إلى المجال الفوسفات وملزمة ، وبالتالي إحداث تغيير متعلق بتكوين جزئي في التحقيق. نتائج تغيير متعلق بتكوين جزئي في الفرق في المسافة أو التوجه fluorophores بين البلدين ، الأمر الذي يؤثر على كفاءة بين الحنق وYFP CFP. ويمكن تصور أن يكون الحنق التي CFP مثيرة ورصد الانبعاثات YFP (الخطوط المنقطة).

الشكل 2. مخطط تخطيطي لإجراء التجارب.

p_upload/3410/3410fig3.jpg "/>
الشكل 3. Plk1 النشاط مرئية الأول في النواة في المرحلة G2 والقمم خلال الانقسام. وتم تصوير الخلايا U2OS تعبر عن رصد المسبار الحنق المستندة Plk1 النشاط لمدة 60 ساعة ^9،14 باستخدام نظام التصوير Deltavision Spectris مجهزة الهدف NA 20X الهواء 0.7 و مصباح الزئبق. وقد تم اختيار ظروف التصوير لسبب الضيائية الحد الأدنى ، كما هو مبين في المادة 2 ، وذلك باستخدام مرشحات binning 4x والكثافة المحايدة التي تمنع 99 ٪ من ضوء واردة. A ، تمثيل الألوان الزائفة مقلوب نسبة - الحنق ، بعد خلية واحدة إلى 4 الانقسامات. B ، kymograph من الخلية هو مبين في وبعد تطبيق مرشح الوسط. C ، القياس الكمي لمقلوب نسبة الحنق من الخلية هو موضح في D A. ، التراكمي دخول الإنقسامية من 50 الحنق التحقيق خلايا الإعراب ، بما في ذلك انقسامات الخلايا الوليدة.

رصد الحنق في جميع مراحل دورة الخلية تتطلب الاعتبارات التي هي أقل أهمية عند تقييم الاستجابات قصيرة الأجل للمؤثرات الخارجية. الأولى ، يتم بسهولة تقدم دورة الخلية مضطرب من جراء إشارات الإجهاد ، والتي تتطلب أن يتم الاحتفاظ الضيائية إلى الحد الأدنى. ثانيا ، يمكن لجميع الصحفيين تؤثر على العمليات الخلوية التي المعايرة من كاينيسات ، phosphatases أو مجالات التفاعل. ربما الطريقة الأكثر مباشرة لتقييم ما إذا كانت ظروف تجريبية كافية لقياس طول دورة الخلية من الانقسام إلى الانقسام وذلك لمقارنة التجارب المستقلة مضان التصوير والتعبير عن التحقيق.

وثمة عامل حاسم في رصد نسب الحنق في جميع مراحل دورة الخلية لمقاومة إغراء الحصول على صور جميلة مع دقة عالية. على الرغم من أن ضبط الدقيق يتوقف على مدى حساسية النظام المجهر ومستوى التعبير وطبيعة التحقيق على وجه الخصوص ، من المهم استخداممستوى binning الذي يتوافق مع ما هو ضروري للغاية لرؤيته. على الرغم من أن الوقت بين CFPex -- YFPem وYFPex -- صور YFPem حاجة إلى أن تكون قصيرة لتجنب التغييرات في مورفولوجية الخلية ، في أيدينا هو أفضل الأوقات للحفاظ على التعرض لأكثر من 0.1 ثانية ، والحد من شدة ضوء الفلورسنت من خلال مرشحات الكثافة محايدة .

كيف يؤثر الضيائية دورة الخلية يعتمد إلى حد كبير على مستويات التعبير وتوطين التحقيق. والمسبار الذي يتم مترجمة إلى لونين ، مثلا عن طريق الاندماج مع هيستون ، ويجعل الخلايا أكثر حساسية للضوء الفلورسنت ، ويفترض أن يتم إنشاؤها منذ تركات الضوئية في المناطق القريبة من الحمض النووي. لذا فمن الأهمية بمكان لرصد الخلايا التي تعبر عن مستويات منخفضة نسبيا للصحفيين وإعادة فحص الخلية دورة توقيت إذا توطين التحقيق إلى الهياكل التحت خلوية مختلفة.

مطلوبة عدة تجارب مراقبة للتحقق من أن الحنق موجود فيالإعداد التجريبية والتي تعكس التغيرات نسبة الفسفرة الفعلي للتحقيق. عدا الضوابط الفنية ، مثل تثبيط أو استنزاف لكيناز ، فإنه من المستحسن أن إجراء تجارب الكيمياء الحيوية للتحقق من أن لجنة التحقيق فسفرته ، تحور في موقع الفوسفات ومتقبل المتوقع خلال التحقيق إلى بقايا غير phosphorylatable ، والمتقبلة لphotobleaching تثبت وقوع الحنق. للحصول على مثال من التحقق من صحة واسعة النطاق ، انظر الشكل 3 التكميلية في المرجع 14.

على الرغم من أنه هو الأفضل من الناحية النظرية لتقييم التغيرات الحنق من خلال رصد الانبعاثات على حد سواء وCFP YFP ، حساسة للغاية مثل هذه الاجهزة لتركيز تغييرات وظروف الإضاءة ، ويمكن أن تؤدي بسهولة إلى التحف. الحساسية للتغيرات التركيز يرجع إلى انحراف لوني ، حيث CFP وانبعاث YFP لا تركز على نقطة واحدة. التغييرات الإضاءة تعتمد بشكل كبير على محاذاة مختلفة من مسار الضوء. هذا هو بارز وخاصة عند استخدام مكعبات تحتوي على فلترمرآة مزدوج اللون. ويمكن تقليل التركيز وتغيير الإضاءة باستخدام تصحيح الأهداف ومكعبات تصفية محاذاة بعناية. ومع ذلك ، في تجربتنا ، والحفاظ على تصفية ثابت الانبعاثات يعطي نتائج متفوقة ، ويفضل باستخدام الإعداد مع تحكم منفصل من الإثارة وعوامل الانبعاثات.

يتم تقليل حجم الحنق وحظ تغير بواسطة bleedthrough من CFP مضان إلى تصفية YFP الانبعاثات. في حالة bleedthrough هي كبيرة ، وهو CFPex اضافية -- يمكن الحصول عليها لتصحيح صورة CFPem bleedthrough في CFPex -- صورة YFPem. ومع ذلك ، هذه التصويبات حساسة جدا للتركيز الخلافات ، وربما يعرض التحف. بالإضافة إلى ذلك ، فإنها تتطلب صورة اضافية ، والتي قد تنتج الضيائية.

على الرغم من أن أقل من قضية إلا عندما الانبعاثات YFP الرصد وحفظ الخلايا في التركيز طوال 24H + الوقت الفاصل بين التجربة يمكن أن يكون تحديا. لتجنب التركيز الانجرافات ، تأكد من أن المجهروطبق قبل تحسنت وان درجة الحرارة في الغرفة لا تتقلب. بدلا من ذلك ، استخدام نظام ضبط تلقائي للصورة التي لا ترتكز على التصوير من التحقيق transfected.

اختيار الهدف الذي لاستخدام يعتمد على تطبيق معين. والتي تعتمد على النفط الهدف NA عالية بجمع مزيد من الضوء ويعطي قرار زيادة ، ولكنه أكثر حساسية للتغيرات التركيز وغير عملي في الاجهزة عالية المحتوى. نحن نفضل استخدام هدفا الهواء مع NA مرتفعة نسبيا لدراسة حشوية أو نووية الحنق ، نسب ، واستخدام النفط مرتفعة NA الأهداف فقط عندما يطلب القرار أعلى التحت خلوية.

هذه الورقة تناقش طريقة مباشرة لفيلم الحنق المستندة إلى تحقيقات من خلال دورة الخلية التي تستخدم المعدات التي تتوفر عادة لكثير من الباحثين علوم الحياة ، وتتطلب فقط المعرفة القاعدية من المجهري ومعالجة الصور. بدائل أكثر تخصصا تشمل استخدام شق شعاع ، الإسفار M مدى الحياةicroscopy (فليم) ⁽¹⁾ وبرنامج لأتمتة الكائن ¹⁶ تجزئة وحساب نسبة ¹⁷ الحنق.

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

يتم اعتماد الكتاب من قبل مجلس الأبحاث السويدي ، ومؤسسة البحوث الاستراتيجية السويدية والمجتمع السويدي السرطان ، وسرطان الأطفال المجتمع السويدي ، آك Wibergs الأساس والأساس Jeanssons.