Sıçanlarda Oligoastenospermi Tedavisinde Shu-Mu Beyin-Böbrek Akupunktur Noktasının Hipotalamik-Hipofiz-Testis Ekseni ile Mekanizması

Bu çalışma, Shu-Mu Beyin-Böbrek akupunktur noktasının sıçanlarda oligoastenospermi üzerindeki terapötik etkisini doğrulamayı ve hipotalamik-hipofiz-testis (HPT) ekseni aracılığıyla altta yatan mekanizmasını araştırmayı amaçlamaktadır.

Oligoastenospermi, erkek infertilitesinin yaygın bir nedenidir. Hipotalamik-hipofiz-testiküler (HPT) ekseni, üreme hormonu sentezi ve salınımı yoluyla gonadal farklılaşmayı ve olgunlaşmayı düzenler ve erkek doğurganlığında hayati bir rol oynar. HPT ekseni stabilitesinin bozulması sperm üretimini bozarak semen kalitesini düşürür. Elektroakupunkturun HPT eksen regülasyonu üzerindeki etkisinin araştırılması, oligoastenospermi tedavisinde fikir verebilir. Elli 8 haftalık erkek SD sıçan rastgele boş, model, Shu-Mu Beyin-Böbrek, akupunktur noktası olmayan ve L-karnitin gruplarına ayrıldı (grup başına n = 10). Boş grup dışında, sıçanlar modeli oluşturmak için 28 gün boyunca intragastrik olarak adenin aldı. Modelleme sonrası, Shu-Mu Beyin-Böbrek grubuna belirlenen akupunktur noktalarında elektroakupunktur uygulanırken, akupunktur noktası olmayan gruba günde 30 dakika boyunca sahte tedavi uygulandı. L-karnitin grubuna günde bir kez intragastrik olarak L-karnitin (10 mL/kg) verildi. Tedaviler 28 gün boyunca devam etti. Genel durumlar, organ katsayıları ve semen kalitesi değerlendirildi. HE boyaması doku morfolojisini analiz etti ve ELISA serum hormonu değişikliklerini tespit etti. Model grubuyla karşılaştırıldığında, Shu-Mu Beyin-Böbrek ve L-karnitin grupları, vücut ağırlığının artmasıyla birlikte ruh, diyet ve bağırsak hareketlerinde önemli gelişmeler sergilerken, akupunktur noktası olmayan grup önemli bir değişiklik göstermedi. Renal organ katsayıları Shu-Mu Beyin-Böbrek ve L-karnitin gruplarında önemli ölçüde azaldı, ancak akupunktur noktası olmayan grupta değişmeden kaldı. Testis organ katsayıları tedavi grupları arasında anlamlı fark göstermedi. Sperm sayısı, yoğunluğu, sağkalım ve motilite oranları Shu-Mu Beyin-Böbrek ve L-karnitin gruplarında önemli ölçüde iyileşti, ancak akupunktur noktası olmayan grupta değil. H&E boyaması, Shu-Mu Beyin-Böbrek ve L-karnitin gruplarında iyileşmiş böbrek ve testis dokusu hasarı gösterdi. ELISA, bu gruplarda artmış T, GnRH ve INHB ve azalmış LH, FSH, E2 ve PRL seviyelerini ortaya çıkardı (p < 0.001), akupunktur noktası olmayan grupta anlamlı bir değişiklik olmadı. Bu bulgular, Shu-Mu Beyin-Böbrek akupunktur noktası tedavisinin, HPT eksenini düzenleyerek sperm kalitesini iyileştirdiğini ve oligoastenospermi için potansiyel bir tedavi sunduğunu göstermektedir.

"Oligospermi" ve "astenospermi" olarak ikiye ayrılan oligoastenospermi, erkek kısırlığı vakalarının yaklaşık %75'ini oluşturan insidans oranı ile yaygın erkek kısırlığı türlerinden biridir¹. Oligoastenospermi esas olarak testislerde azalmış sperm yoğunluğu ve motilitesi ile karakterizedir ve çoğunlukla klinik olarak spermatogenez bozukluğu, azalmış sperm sayısı ve düşük sperm motilitesi ile kendini gösterir ^2,3. Son yıllarda oligoastenospermi görülme sıklığı yıldan yıla artmıştır⁴. Etkili tedavi olmadan, hastaların fiziksel ve zihinsel sağlığı ve hatta aile uyumu üzerinde uzun vadeli olumsuz etkileri olacaktır⁵. Çalışmalar, genetik problemlerin⁶, üreme endokrin bozukluklarının⁷, ürogenital sistem enfeksiyonlarının⁸ ve kimyasal ilaçların⁹ sperm üretimini ve olgunlaşmasını etkileyerek semen kalitesinde düşüşe yol açabileceğini göstermiştir. Şu anda, hasarlı spermin kalitesinin iyileştirilmesi tıp alanında zorlu bir sorun haline gelmiştir.

Hipotalamik-hipofiz-testiküler (HPT) ekseni, hipotalamus, hipofiz bezi ve testislerle ilgili üreme hormonlarının sentezini ve salınımını uyararak gonadların farklılaşmasını ve olgunlaşmasını düzenleyebilen vücuttaki üreme düzenlemesinin ana yoludur ve normal erkek üreme fonksiyonunun sürdürülmesinde önemli bir rol oynar¹⁰. HPT eksen fonksiyonunun stabilitesi bozulursa, testis sekresyonunun testosteronun fizyolojik konsantrasyonuna ulaşmak için yetersiz kalmasına neden olur ve bu da testis^11'deki sperm sayısında ve kalitesinde bir azalmaya neden olur. Bu nedenle, oligoastenospermi tedavisi esas olarak HPT ekseninin işlevini düzenlemeyi ve ilgili endokrin hormonların dengesini koruma amacına ulaşmayı, böylece menideki sperm sayısını artırmayı, sperm aktivitesini arttırmayı ve semen kalitesini iyileştirmeyi amaçlar.

Oligoastenosperminin klinik tedavisinde, modern tıp esas olarak cerrahi ve anti-oksidasyon ilaçları gibi yöntemleri benimser ve sperm motilitesini^{arttırır 12,13}, ^{elektroakupunktur} tedavisi ise geleneksel Çin akupunkturu ve modern tıbbi biyoelektriği birleştirir. Hızlı ve doğru olması, belirgin bir iyileştirici etkiye sahip olması, az sayıda yan versit reaksiyona sahip olması, uygun hastalıkların geniş bir yelpazede bulunması ve düşük tedavi maliyeti, oligoastenospermi üzerinde iyi bir tedavi etkisine sahip olması gibi avantajlara sahiptir^14,15. "Sırt yang ve karın yin." Shu-Mu akupunktur noktası kombinasyonu, Shu noktalarını, biri önde diğeri arkada, biri yin ve biri yang olmak üzere Mu noktalarıyla birleştirir ve birlikte çalışır, aynı zamanda ön-arka akupunktur noktası kombinasyon yöntemi olarak da bilinir. Geleneksel Çin tıbbı (TCM), böbreğin doğum öncesi özün kökü olduğuna ve hastalığın böbrekte bulunduğuna inanmaktadır. Böbreğin Ön-mu noktası, Jingmen (GB25) ve Arka-shu noktası, Shenshu (BL23) seçilir, bu da böbreği ısıtma, yang'a yardım etme ve yin^16,17 içinde yang arama etkisine sahiptir; böbrek özü depolar ve ilik üretimini yönetir, beyin ilik denizi ve tüm yang'ın buluşma yeridir ve Taixi (KI3), karaciğeri ve böbreği düzenleyebilen ve tonlayabilen, yin'i besleyebilen ve ilik üretebilen ayak Shaoyin böbrek meridyeninin kaynak noktasıdır¹⁸. Epangsanxian (MS4) ile birleştiğinde, TCM^19'daki "Shu-Mu Beyin-Böbrek akupunktur noktası kombinasyonu" fikrini yansıtan böbrek ve beyni birbirine bağlar ve terapötik etki sıradan akupunkturdan daha belirgindir.

Semen kalitesi ile ilgili güncel tedavi çalışmaları öncelikle testis yapısını ve fonksiyonunu iyileştirmeye odaklanırken, hipotalamik-hipofiz-testis (HPT) ekseninin farklı dokularında serum hormon seviyelerinin düzenlenmesi üzerine sınırlı araştırma yapılmıştır²⁰. Ön araştırmada, sağlıklı sıçanların ve adenin kaynaklı oligozoospermi modeli sıçanların hipotalamik, hipofiz ve testis dokularında semen kalitesinin düzenlenmesinde rol oynayan aday genleri ve düzenleyici yolları tanımlamak için RNA dizilimi (RNA-Seq) kullanıldı²¹. Ek olarak, her iki grupta da semen kalite testi ve testis dokularının histolojik analizi yapıldı. Bu bulgular, adenin ile indüklenen oligoastenospermi sıçanlarında semen kalitesinin altında yatan moleküler mekanizmalar hakkında bilgi sağlamıştır. Uzak yaklaşık akupunktur noktası ile elektroakupunktur tedavisi, HPT eksenini düzenleyerek oligoastenospermi sıçanlarında sperm kalitesini artırabilir ve etki oksidatif stres süreci ile ilgilidir²². Bununla birlikte, Shu-Mu Beyin-Böbrek akupunktur noktasının, HPT eksenini düzenleyerek sıçanların semen kalitesini iyileştirip iyileştiremeyeceği bilinmemektedir. Oligoastenospermi sıçanlarında semen kalitesini iyileştirmenin düzenleyici mekanizmasını ve etkili tedavi yöntemlerini daha fazla araştırmak için, bu çalışmada adenin kaynaklı bir sıçan oligoastenospermi modeli kullanıldı ve Shu-Mu Beyin-Böbrek akupunktur noktasının sıçanlarda oligoastenospermi üzerindeki terapötik etkisinin ilgili mekanizmasını HPT ekseni açısından araştırmak için dört akupunktur noktası, Epangsanxian, Shenshu, Jingmen ve Taixi seçildi. klinik tedavi için daha bilimsel bir temel sağlar.

Tüm hayvan deneyleri, Ningxia Tıp Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır (onay numarası: IACUC-NYLAC-2021-130). Çalışma, hayvan deneyleri için ARRIVE Yönergeleri 2.0'a sıkı sıkıya bağlı kalınarak gerçekleştirildi ve NIH Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nda açıklanan hayvan refahı ilkelerine bağlı kaldı. Bu randomize kontrollü hayvan çalışması, tek yönlü varyans analizi kullandı ve Mart-Mayıs 2023 tarihleri arasında Ningxia Tıp Üniversitesi Hayvan Deney Merkezi'nde gerçekleştirildi. Bu çalışma için 180-220 g ağırlığındaki sekiz haftalık SPF dereceli erkek SD sıçanlar kullanıldı. Kullanılan reaktiflerin ve ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Hayvan modeli oluşturma ve tedavi işlemleri

1. Deney hayvanları ve grupları
   1. 180-220 g ağırlığında elli adet 8 haftalık SPF dereceli erkek SD sıçan elde edin.
   2. Tüm sıçanları standart koşullar altında barındırın, oda sıcaklığını 22-25 °C, nem oranını %50-60 arasında tutun ve standart kemirgen yemi ve suyuna serbest erişim sağlayın.
   3. Bir haftalık adaptasyondan sonra, rasgele sayı tablosu yöntemini kullanarak fareleri rastgele bir boş (B) grubuna (n = 10) ve bir modelleme grubuna (n = 40) bölün. Boş gruba normal salin ve modelleme grubuna oral gavaj ile adenin uygulayın.
   4. 28 gün sonra, modelleme grubunu rastgele bir model (M) grubuna, Shu-Mu Beyin-Böbrek (S) grubuna, akupunktur noktası olmayan (N) gruba ve L-karnitin (L) grubuna (grup başına n = 10) bölün. Model grubunu tedavi edilmeden bırakın.
      1. Shu-Mu Beyin-Böbrek grubuna Shu-Mu Beyin-Böbrek akupunktur noktası eşleştirme yöntemini kullanarak elektroakupunktur müdahalesi uygulayın. Akupunktur noktası olmayan gruba akupunktur noktası olmayan tedavi ve L-karnitin grubuna gavaj yoluyla L-karnitin oral sıvısı uygulayın. Tüm grupları 28 gün boyunca sürekli olarak tedavi edin.
2. Model yapımı
   NOT: Çalışmalar, yüksek dozda adenin sıçanlarda testis fonksiyonunu etkileyebileceğini, seks hormonlarının anormal salgılanmasına, HPT ekseninin fonksiyonel stabilitesinin bozulmasına ve sperm kalitesinde düşüşe yol açabileceğini göstermiştir²³. Bu nedenle, adenin, erkek hayvan kısırlık modelleri oluşturmak için yaygın olarak kullanılır.
   1. Boş gruba normal salin (1 mL / 100 g vücut ağırlığı) ve oral gavaj ile model grubuna adenin (20 mg / 100 g vücut ağırlığı) uygulayın (Şekil 1A).
   2. Adenin çökelmesini ve gavaj iğnesinin tıkanmasını önlemek için gavaj sırasında sürekli çalkalama sağlayın. Tedaviyi 28 gün boyunca günde bir kez uygulayın.
3. 1.3 Tedavi prosedürü
   1. Shu-Mu Beyin-Böbrek grubu
      1. Modellemeden sonraki ilk gün müdahaleye başlayın. Tek kullanımlık steril akupunktur iğneleri ile iki taraflı noktalara akupunktur yapın. Fareyi sabitledikten sonra, akupunktur bölgesini açığa çıkarın ve dezenfekte edin.
      2. Akupunktur bölgesinin cildini sol elinizle sabitleyin ve sağ elinizdeki tek kullanımlık steril akupunktur iğnesi ile akupunktur noktasını hızlı bir şekilde delin. Bir elektrik stimülatörü bağlayın. Elektroakupunktur frekansı 2 Hz, stimülasyon yoğunluğu 1.5 mA ve lokal kasın hafif titremesi ile dilatasyon dalgaları uygulayın.
      3. Art arda 28 gün boyunca, günde bir kez, her seferinde 30 dakika boyunca elektroakupunktur tedavisi uygulayın (Şekil 1B).
         NOT: Yong Tang'ın Deneysel Akupunktur ve Yakı Bilimi, Ek II, "Deney Hayvanlarında Yaygın Olarak Kullanılan Akupunktur Noktaları"na atıfta bulunarak sıçanlarda akupunktur noktalarını seçin, karşılaştırmalı anatomik nokta seçim yöntemi¹⁹ ile birlikte. Aşağıdaki noktalar seçildi: (1) Epangsanxian (MS4): Touwei noktasının 3 mm altında ve 4 mm dışında bulunur. Çalışma: 1-2 mm düz delin; (2) Shenshu (BL23): Omurga bölgesinde, ikinci bel omurun alt omurga sürecinin her iki yanında, medyan sırt çizgisinin 6 mm yanında bulunur. Çalışma: 6 mm düz delin; (3) Jingmen (GB25): Yan belde, alt taraftaki 13. kaburganın serbest ucunda bulunur. Çalışma: 1-2 mm düz delin; (4) Taixi (KI3): Ayağın iç tarafında, medial ayak bileğinin yüksek noktası ile Aşil tendonunun arka kenarı arasındaki çöküntüde bulunur. Çalışma: 3 mm düz delin.
   2. Akupunktur noktası olmayan grup
      1. Akupunktur noktası olmayan 1, 2 ve 3'ü Shu-Mu Beyin-Böbrek grubuyla aynı şekilde seçin ve çalıştırın (Şekil 1B).
         NOT: Akupunktur olmayan noktalar meridyenler boyunca nokta seçimi prensibine uymadığından ve Geleneksel Çin Tıbbı (TCM) teorisine ve uzun süreli klinik gözlemlere göre, bu üç akupunktur noktasının oligoastenozoospermi²⁴ olan hastalar üzerinde çok az terapötik etkisi vardır. (1) Akupunktur noktası olmayan 1: Dirseğin iç tarafında dirsek ucu ile koltuk altı arasındaki çizginin orta noktasında bulunur. Çalışma: 1-2 mm düz delin; (2) Akupunktur olmayan 2: Humerusun medial epikondili ile ulnanın el bileği arasındaki orta noktada, ulnar kenarda bulunur. Çalışma: 1-2 mm düz delin; (3) Akupunktur noktası olmayan 3: Ön deltoid kas ile iç koldaki pazı kasının kesiştiği noktada bulunur. Çalışma: 1-2 mm düz delin.
   3. L-karnitin grubu
      1. Levokarnitin oral sıvısını, art arda 28 gün boyunca günde bir kez 10 mL / kg vücut ağırlığı dozunda oral gavaj ile uygulayın (Şekil 1A).
4. Ötanazi
   1. Tedaviden sonra, tüm sıçanların 24 saat oruç tutmasına izin verin, intraperitoneal %2 pentobarbital sodyum enjeksiyonu (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek 40 mg / kg vücut ağırlığı) ile anestezi yapın ve tek kullanımlık bir intravenöz kan alma iğnesi kullanarak kalbin tepesinden kan toplayın^21,24.
   2. Dekapitasyon ile ölümden sonra, meni kalitesini ölçmek için epididimin bir tarafını çıkarın. Böbrek ve testis dokularını toplayın, tartın ve kaydedin ve parafin^24'e gömmeden önce oda sıcaklığında 48 saat paraformaldehit fiksatifinde sabitleyin.

2. Gözlem endeksleri

1. Genel gözlem: Sıçanların zihinsel durumunu, diyetini ve bağırsak hareketlerini gözlemleyin ve vücut ağırlıklarını günlük olarak izleyin.
2. Organ katsayıları: Ölümden sonra, hem böbrek hem de testis dokularından yüzey yağını ve bağ dokusunu dikkatlice çıkarın, normal tuzlu su ile durulayın, filtre kağıdı ile kurulayın, bir teraziye tartın ve organ katsayılarının hesaplanması için ölçümleri kaydedin. Organ katsayısı (%) = (organ ağırlığı [g] / vücut ağırlığı [g]) x %100.
3. Semen kalitesi
   1. Fazla yağı çıkardıktan sonra, epididimin bir tarafını her sıçandan çıkarın ve 5 dakika boyunca 37 ° C'de sabit sıcaklıktaki bir su banyosuna yerleştirin. Ardından kesin, süzün, hafifçe üfleyin ve numuneyi iyice karıştırın.
   2. Seyreltilmiş sperm süspansiyonunun 10 μL'lik bir alikotunu alın ve önceden ısıtılmış bir sayma plakasının kapak camının kenarına bırakın, böylece sperm süspansiyonunun otomatik olarak sayma odasına nüfuz etmesine izin verin.
   3. Bir CASA (bilgisayar destekli semen analizi) sistemi kullanarak sperm sayısını, yoğunluğunu, hayatta kalma oranını ve motilite oranını ölçün²¹.
4. Hematoksilen ve Eozin (H & E) boyama
   NOT: Prosedürle ilgili ayrıntılar için Yang, N. ve ^ark.21'e bakın.
   1. Sabit dokuları akan su ile durulayın, kurutun ve gömün.
   2. Bir mikrotom kullanarak parafin bölümlerini (5 μm kalınlığında) kesin ve 65 ° C'de 4 saat pişirin.
   3. Bölümleri mumdan arındırın ve suyla yeniden sulandırın.
   4. Bölümleri hematoksilen boyama solüsyonu ile 3 dakika boyayın, ardından akan su ile durulayın.
   5. Bölümleri 1 dakika% 95 etanol ile kurutun, ardından 2 dakika boyunca eozin çözeltisi ile boyayın.
   6. Slaytları mühürledikten sonra, bir slayt tarayıcı kullanarak tarama yapın ve görüntüleri toplayın ve analiz edin.
5. Enzime Bağlı İmmünosorbent Testi (ELISA)
   NOT: Prosedürle ilgili ayrıntılar için Yang, N. ve ^ark.21'e bakın.
   1. Serumu hazırlamak için, standart madde kuyucuklarına ve ölçülecek numune kuyucuklarına standart maddeler ve karşılık gelen konsantrasyonlarda serum ekleyin, ardından enzim etiketli reaktifin eklenmesi izleyin.
   2. Kuluçka, yıkama, renk geliştirme ve sonlandırma adımlarını gerçekleştirin.
   3. Enzim etiketli bir alet kullanarak 450 nm dalga boyunda absorbansı belirleyin ve testosteron (T), gonadotropin salgılatıcı hormon (GnRH), inhibin B (INHB), luteinize edici hormon (LH), folikül uyarıcı hormon (FSH), estradiol (E2) ve prolaktin (PRL).

3. İstatistiksel analiz

1. Deneysel verileri istatistiksel yazılım kullanarak analiz edin ve her grubun sonuçlarını ortalama ± standart sapma (ortalama ± SD) olarak sunun.
2. Normallik ve varyansın homojenliği varsayımlarını karşılayan birden çok grup arasındaki örnek ortalamaları karşılaştırmak için tek yönlü ANOVA kullanın.
3. İki grup arasındaki karşılaştırmalar için t-testini ve yukarıdaki varsayımları karşılamayan veriler için parametrik olmayan testleri kullanın.
4. p < 0.05 olduğunda farklılıkları istatistiksel olarak anlamlı olarak düşünün.

Model değerlendirmesi

Modellemeden sonra, fareleri uyuşukluk, çömelmiş duruş, soğuk uzuvlar, yemek yeme isteksizliği, kilo kaybı, artan idrar hacmi, gevşek dışkı ve genellikle böbrek-yang eksikliği sendromu ile uyumlu diğer semptomlar açısından gözlemleyin.

Diseksiyondan sonra böbreklerin sert, beyaz ve daha ağır olduğunu gözlemleyin. H&E boyama, model sıçanların böbrek ve testis dokularının, düzensiz glomerüler şekiller, renal tübül interstisyel iltihabı ve dejenerasyon ve hatta fibroz geçiren çok sayıda epitel hücresi ile ciddi şekilde hasar gördüğünü ortaya koymaktadır. Testislerdeki daha fazla seminifer tübüller atrofiye uğrar ve deforme olur, spermatojenik hücreler düzensiz veya hatta yoktur (Şekil 2), bu da başarılı bir model oluşumunu gösterir.

Sıçanların genel durumu

Boş grupta, sıçanlar iyi ruhlar, hassas reaksiyonlar, parlak saçlar ve normal yeme ve dışkılama sergilediler. Diseksiyondan sonra böbrekleri kırmızımsı kahverengi ve yumuşak görünüyordu. Model grubunda, sıçanlar uyuşukluk, çömelmiş sırtlar, soğuk cisimler, iştahsızlık, kilo kaybı (p < 0.001), artan idrara çıkma ve gevşek dışkı gösterdi. Diseksiyon sonrası böbrekleri sertti ve "büyük beyaz böbrek" görünümü gözlendi (Şekil 2A). Model grubuyla karşılaştırıldığında, yukarıdaki semptomlar Shu-Mu Beyin-Böbrek grubunda önemli ölçüde iyileşti, akupunktur noktası olmayan grupta önemli ölçüde iyileşmedi ve ayrıca L-karnitin grubunda önemli ölçüde iyileşti. Gruplar arasında vücut kütlesinin karşılaştırılması Şekil 3'te gösterilmiştir.

Böbrek ve testis organı katsayıları

Şekil 4'te görüldüğü gibi, boş gruba göre model grubundaki sıçanların renal organ katsayıları anlamlı olarak artmış (p < 0.01), bilateral testis organ katsayılarında ise anlamlı bir fark bulunmamış (p > 0.05), modelleme sonrası her iki testisin kalitesinin düştüğünü göstermektedir. Model grubu ile karşılaştırıldığında, Shu-Mu Beyin-Böbrek ve L-karnitin gruplarında böbrek organ katsayıları anlamlı olarak azaldı (p < 0.05), ancak akupunktur noktası olmayan grupta anlamlı bir fark bulunmadı (p > 0.05). Shu-Mu Beyin-Böbrek, L-karnitin ve akupunktur noktası olmayan gruplar arasında bilateral testis organ katsayılarında model grubuna göre anlamlı fark bulunmadı (p > 0,05), bu da Shu-Mu Beyin-Böbrek ve L-karnitin gruplarında bilateral testis kitlesinin arttığını, akupunktur noktası olmayan grupta ise anlamlı bir değişiklik gözlenmediğini gösterdi.

Semen kalitesi analizi

Şekil 5'te gösterildiği gibi, boş grupla karşılaştırıldığında, model grubunda sperm sayısı, yoğunluğu, sağkalım oranı ve motilite oranı anlamlı olarak azalmıştır (p < 0.001). Model grubu ile karşılaştırıldığında, sperm sayısı, sperm yoğunluğu, sağkalım oranı ve motilite oranı Shu-Mu Beyin-Böbrek ve L-karnitin gruplarında anlamlı olarak arttı (p < 0.001), ancak akupunktur noktası olmayan grupta anlamlı bir fark bulunmadı.

Böbrekteki morfolojik değişiklikler

Şekil 6'da gösterildiği gibi, boş gruptaki sıçanların böbrek dokusu tam bir yapıya ve normal bir şekle sahipti. Glomerüller yuvarlak ve doluydu, böbrek kapsüllerine sıkıca bağlıydı ve böbrek tübülleri düzenli ve düzgün bir şekilde düzenlenmişti. Boş grupla karşılaştırıldığında, model grubu ciddi böbrek dokusu hasarı, düzensiz glomerüler morfoloji, atrofi, redüksiyon, şiddetli renal tübül interstisyel inflamasyonu, çok sayıda epitel hücresinin dejenerasyonu ve şiddetli fibroz sergiledi. Model grubuyla karşılaştırıldığında, Shu-Mu Beyin-Böbrek ve L-karnitin gruplarında böbrek dokusu hasarının derecesi, daha düzenli glomerüler şekiller, böbrek kapsüllerinden hafif ayrılma, birkaç tübüler epitel hücresinin denatürasyonu ve hafif renal tübül interstisyel hücre infiltrasyonu ve fibroz. Model grubuyla karşılaştırıldığında, böbrek dokusu hasarının derecesi, daha düzenli glomerüler şekiller, böbrek kapsüllerinden ayrılma, renal tübüler epitel hücrelerinin daha fazla denatürasyonu ve bozukluğu, glomerül çevresinde ve renal tübül interstisyumunda orta derecede inflamatuar hücre infiltrasyonu ve daha fazla fibroz ile akupunktur noktası olmayan grupta daha az belirgindi.

Testislerin morfolojik değişiklikleri

Şekil 7'de gösterildiği gibi, boş gruptaki sıçanların testisleri tam bir doku yapısına, normal morfolojiye, düzgün seminifer tübüllere ve düzenli spermatojenik hücrelere sahipti. Boş grupla karşılaştırıldığında, model grupta testis dokusu hasarı şiddetliydi, seminifer tübüllerde daha fazla atrofi ve deformasyon ve spermatojenik hücreler düzensiz veya hatta hiç yoktu. Model grubuyla karşılaştırıldığında, Shu-Mu Beyin-Böbrek ve L-karnitin gruplarında testis dokusu hasarının derecesi önemli ölçüde iyileşti, çoğu seminifer tübüller düzgün bir şekilde düzenlendi ve spermatojenik hücreler düzenli olarak düzenlendi. Model grubuyla karşılaştırıldığında, akupunktur noktası olmayan grupta testis dokusu hasarının derecesi önemli ölçüde azalmadı, bazı seminifer tübüller atrofi ve deformasyon, hücre nekrozu, vakuoller ve düzensiz ve eksik spermatojenik hücreler sergiledi.

Serum hormon düzeylerinin karşılaştırılması

Şekil 8'de gösterildiği gibi, boş gruba kıyasla, serumdaki testosteron (T), gonadotropin salgılatıcı hormon (GnRH) ve inhibin B (INHB) seviyeleri model grubunda azalırken (p < 0.001), luteinize edici hormon (LH), folikül uyarıcı hormon (FSH), estradiol (E2) ve prolaktin (PRL) artmıştır (p < 0.001). Model grubu ile karşılaştırıldığında, Shu-Mu Beyin-Böbrek ve L-karnitin gruplarında T, GnRH ve INHB artarken (p < 0.001), LH, FSH, E2 ve PRL seviyeleri azaldı (p < 0.001), ancak akupunktur noktası olmayan grupta anlamlı bir fark bulunmadı.

Şekil 1: Deneysel yöntemler. (A) Oral gavaj prosedürü. (B) Elektroakupunktur içeren tedavi yöntemi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Model doğrulaması. (A) Modelleme öncesi ve sonrası böbreğin görünümü. (B) Normal böbrek dokusu. (C) Modelleme sonrası böbrek dokusu (HE boyama, 200x, ölçek çubuğu: 100 μm). (D) Normal testis dokusu. (E) Modelleme sonrası testis dokusu (HE boyama, 100x, ölçek çubuğu: 200 μm). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Gruplar arasında vücut kütlesinin karşılaştırılması. B: boş grup, M: model grubu, S: Shu-Mu Beyin-Böbrek grubu, N: akupunktur noktası olmayan grup, L: L-karnitin grubu. Veriler ortalama ± standart sapma (n = 3) olarak sunulmuştur. ^AP < 0.05, ^BP < 0.01, ^CP < 0.001, ^NSP > 0.05'tir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Gruplar arasında böbrek ve testis organ katsayılarının karşılaştırılması. (A) Sol böbrek organı katsayıları. (B) Sağ böbrek organı katsayıları. (C) Sol testis organı katsayıları. (D) Sağ testis organı katsayıları. B: boş grup, M: model grubu, S: Shu-Mu Beyin-Böbrek grubu, N: akupunktur noktası olmayan grup, L: L-karnitin grubu. Organ katsayısı (%) = organ ağırlığı (g) / vücut ağırlığı (g) × %100. Veriler ortalama ± standart sapma (n = 3) olarak sunulmuştur. ^AP < 0.05, ^BP < 0.01, ^CP < 0.001, ^NSP > 0.05'tir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Gruplar arasında sperm kalitesinin karşılaştırılması. (A) Sperm sayısı. (B) Sperm yoğunluğu. (C) Sperm hayatta kalma oranı. (D) Sperm aktivite oranı. B: boş grup, M: model grubu, S: Shu-Mu Beyin-Böbrek grubu, N: akupunktur noktası olmayan grup, L: L-karnitin grubu. Sperm sağkalım oranı (%) = hareketli sperm sayısı / toplam sperm sayısı × %100. Veriler ortalama ± standart sapma (n = 3) olarak sunulmuştur. ^AP < 0.05, ^BP < 0.01, ^CP < 0.001, ^NSP > 0.05'tir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Her grupta böbrekte morfolojik değişiklikler. (HE boyama, ×200, ölçek çubuğu: 100 μm). Siyah oklar glomerülleri, yeşil oklar renal tübülleri, sarı oklar enflamatuar hücreleri ve mavi oklar fibrozu gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Her gruptaki testislerdeki morfolojik değişiklikler. (HE boyama, ×100, ölçek çubuğu: 200 μm). Siyah oklar normal seminifer tübülleri, yeşil oklar nekrozu ve mavi oklar vakuolleri gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 8: Gruplar arasında serum hormon düzeylerinin karşılaştırılması. (A) Serum testosteron (T) seviyeleri. (B) Serum GnRH seviyeleri. (C) Serum LH seviyeleri. (D) Serum FSH seviyeleri. (E) Serum E2 seviyeleri. (F) Serum INHB seviyeleri. (G) Serum PRL seviyeleri. B: boş grup, M: model grubu, S: Shu-Mu Beyin-Böbrek grubu, N: akupunktur noktası olmayan grup, L: L-karnitin grubu. Veriler ortalama ± standart sapma (n = 3) olarak sunulmuştur. ^AP < 0.05, ^BP < 0.01, ^CP < 0.001, ^NSP > 0.05'tir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

TCM'de "böbrek", modern tıpta üriner sistemin işlevlerine atıfta bulunan "iç böbrek" ve hipotalamik-hipofiz-gonadal eksene ve anatomik dış üreme organlarına atıfta bulunan "dış böbrek"ten oluşur²⁵. Erkek seminal veziküller "dış böbrek" e aittir ve bileşenleri arasında testisler, epididimitler, seminal veziküller vb. bulunur²⁶. TCM, özü insan vücudunun maddi temeli olarak kabul eder ve "böbrek özü", ebeveynlerden miras kalan "doğum öncesi özü" ve dalak ve midenin su ve tahıl özünü dönüştürmesiyle üretilen "doğum sonrası özü" içerir. Bunlar arasında doğum öncesi öz, embriyoyu oluşturan ve yaşamın temeli olan orijinal maddedir; Doğum sonrası öz, beş iç organın ve altı bağırsağın özünü zenginleştirir ve kalan kısım böbrekte depolanır. İkisi birbirine bağımlıdır ve "böbrek özü" oluşturmak için böbrekte yakından birleştirilir. Böbrek özü yetersizse, yani seminal kesecikler tam olamazsa, "oligospermi"ye yol açacaktır; Üreme özü normal olarak boşaltılabiliyorsa, yani seminal veziküller sperm üretme, depolama ve boşaltma işlevlerini yerine getirebiliyorsa, bu, böbrek yin'in büzücü doğası ile böbrek yang'ın uyarıcı doğasının karşılıklı koordinasyonunun sonucudur. Böbrek yang'ı eksik ve zayıfsa, büzücü fonksiyon aşırı, uyarıcı fonksiyon ise yetersizdir, bu da soğuk öz ve "astenospermi" ile sonuçlanır. Bu nedenle, oligoastenospermi belirtileri, TCM sendromu "böbrek özü eksikliği ve böbrek yang eksikliği" tiplerine karşılık gelir. Bu deneyde, modellenen tüm sıçanlar temel olarak böbrek-yang eksikliği tipi oligoastenosperminin tezahürlerini karşıladı ve tedavi "böbreği tonlamak, yang'a yardımcı olmak, özü doldurmak ve iliği beslemek" üzerine odaklanmalıdır. Shu-Mu Beyin-Böbrek akupunktur noktası için Epangsanxian, Shenshu, Jingmen ve Taixi'nin kombinasyonu, yin ve yang'ı koordine edebilir ve böbrek ile beyni birbirine bağlayabilir ve sonuçta "yin-yang dengesi" amacına ulaşabilir.

Spermatogenez, HPT ekseninin endokrin aktivitesi tarafından düzenlenir ve HPT ekseninin düzenlenmesi esas olarak hipotalamus, hipofiz bezi ve testislerde²⁷ eksprese edilen ilgili hormonlara ve reseptör genlerine bağlıdır ve bu genler, esas olarak hipotalamustan GnRH'nin pulsatil salınımının hakimiyetindedir. Bu, ön hipofizi LH, FSH ve PRL¹¹ salgılaması için uyarır. Bunlar arasında, GnRH, HPT ekseninin en kritik düzenleyicisidir ve seviyesi, HPT ekseninin durumunu ve testislerin sperm üretme yeteneğini dolaylı olarak yansıtabilir²⁸. LH, testis stromal hücrelerinden T salınımına aracılık eder ve sperm oluşumu T'nin uyarılmasına bağlıdır. T salgısı yetersiz olursa sperm sayısı ve kalitesi düşecektir²⁹. FSH, Sertoli hücrelerinin yüzeyindeki reseptörlere bağlanır ve spermatogonia'nın proliferasyonunu teşvik etmek için T ile birlikte hareket eder ve spermatogenezi sürdürmek için INHB^{üretir 30}. Testis Sertoli hücrelerinde ve germ hücrelerinde sentezlenen bir glikoprotein olan INHB, erkek gonadın önemli bir düzenleyicisidir, bu da FSH üretmek için hipofiz bezini aktive edebilir ve HPT eksenini ortaklaşa düzenlemek için FSH ile etkileşime girebilir 31,32,33. Bununla birlikte, PRL sperm motilitesini etkileyen önemli bir faktördür³⁴. Aşırı PRL, gonadal eksenin sekresyonunu inhibe edebilir, böylece spermatogenezi inhibe edebilir³⁵. E2, gonadlar ve beyin tarafından salgılanır ve LH ve FSH³⁶ üzerinde olumsuz bir geri bildirim etkisine sahiptir. Yüksek E2 seviyeleri Sertoli hücrelerine ve testis interstisyel hücrelerine zarar verir, çevredeki bağ dokusunun steatozuna neden olur ve erkek seminifer tübüllerin çapını küçülterek hastaların doğurganlığının bozulmasına neden olur³⁷. Tripterygium wilfordii ile indüklenen oligastenospermi sıçanlarında FSH ve LH'nin serum düzeylerinin modelleme sonrası anlamlı olarak arttığı bulunmuştur. Qilin Hapı ile 60 günlük tedaviden sonra, bu iki hormonun seviyeleri, bu çalışmanın sonuçlarıyla tutarlı olan model grubu^38'e kıyasla önemli ölçüde azaldı. Diğer çalışmalar, adenin neden olduğu böbrek-yang eksikliği sendromu olan sıçanlarda HPT eksen disfonksiyonunun meydana geldiğini ve buna bağlı seks hormonu salgı seviyelerinin de değiştiğini göstermiştir³⁹.

Bu çalışmada, boş grupla karşılaştırıldığında, model grubundaki sıçanlar genellikle kötü durumdaydı ve semen kalitesi önemli ölçüde azalmıştı (p < 0.001). H & E boyaması, böbrek ve testis dokusunda ciddi hasar gösterdi, bu da adenin modülasyonlu sıçanların oligolastenospermi kriterlerini karşıladığını gösterdi. Model grubuyla karşılaştırıldığında, yukarıdaki koşullar Shu-Mu Beyin-Böbrek ve L-karnitin gruplarında önemli ölçüde iyileşirken (p < 0.05), akupunktur noktası olmayan grupta iyileşme anlamlı değildi, bu da sperm kalitesinin ve organ morfolojisinin ve yapısının Shu-Mu Beyin-Böbrek ve L-karnitin gruplarında iyileştiğini göstermektedir. Boş grupla karşılaştırıldığında, model grubunda T, GnRH ve INHB azaldı (p < 0.001), bu da başarılı modellemeden sonra oligoastenospermi sıçanlarında T, GnRH ve INHB salgılama yeteneğinin azaldığını gösterdi. LH, FSH, E2 ve PRL'nin tümü artmıştır (p < 0.001), bu da başarılı modellemeden sonra LH, FSH, E2 ve PRL sekresyonunun arttığını ve testiküler spermatojenik fonksiyonun zayıflamasına yol açtığını göstermektedir. Model grubu ile karşılaştırıldığında, Shu-Mu Beyin-Böbrek ve L-karnitin gruplarında T, GnRH ve INHB artarken (p < 0.001), LH, FSH, E2 ve PRL sekresyon düzeyleri azaldı (p < 0.001), ancak akupunktur noktası olmayan grupta anlamlı bir fark bulunmadı. Bu, hem elektroakupunkturun hem de L-karnitinin sıçanlarda HPT ekseninin hormon seviyelerini düzenleyebileceğini ve sıçanlarda oligolastenospermiyi iyileştirmede iyi bir etkiye sahip olduğunu göstermektedir.

L-karnitin, memelilerde hücre enerji metabolizmasına katılabilen ve spermin antioksidan hasarını azaltabilen doğal bir antioksidandır⁴⁰. Çok sayıda çalışma, L-karnitinin HPT ekseni ile ilgili hormonların seviyesini arttırırken sperm hareketliliğini, morfolojisini ve konsantrasyonunu önemli ölçüde iyileştirebileceğini kanıtlamıştır⁴¹. Bu deneyde, L-karnitin, Shu-Mu Beyin-Böbrek grubu ile karşılaştırmak için pozitif bir ilaç kontrol grubu olarak kullanıldı. Deneysel veriler, iki grup arasındaki çeşitli indekslerin karşılaştırılmasında anlamlı bir fark göstermedi ve "Epangsanxian, Shenshu, Jingmen ve Taixi" deki elektroakupunkturun oligoastenospermi sıçanları üzerinde iyi bir etkiye sahip olduğunu doğruladı. Dahası, akupunktur iç organların yin ve yang'ını koordine edebilir ve vücudun sağlıklı qi'sini patojenik qi'ye direnmek için geliştirebilir, bu da onu daha az yan etki ile güvenli, etkili ve daha az toksik hale getirir. Elektroakupunktur, iyileştirici etkiyi sıradan akupunkturdan daha fazla artırabilir ve oligoastenosperminin klinik yönetimi için güvenli ve etkili bir tedavi sağlayabilir. Akupunktur noktası olmayan gruptaki sıçanlar, meridyenler boyunca nokta seçimi ilkesini takip etmediğinden, çeşitli deneysel veriler Shu-Mu Beyin-Böbrek grubundakilerden önemli ölçüde farklıydı ve dört noktanın uyumluluğunun önemini doğruladı, "Epangsanxian, Shenshu, Jingmen ve Taixi."

Özetle, "Epangsanxian, Shenshu, Jingmen ve Taixi" adlı dört noktadaki elektroakupunktur, ilgili hormonların seviyesini düzenleyerek sıçanlarda HPT ekseninin işlevini iyileştirebilir, böylece sıçanlarda sperm kalitesini iyileştirebilir ve sonuçta oligoastenospermi tedavi etme amacına ulaşabilir. Oligonastenosperjinin klinik yönetimi için başka bir güvenli ve etkili tedavi sağlar.

Bununla birlikte, teknoloji ve fon eksikliği nedeniyle, bu çalışma HPT ekseninde serum hormon düzeylerinin incelenmesi ile sınırlıydı ve tespit yöntemleri sınırlıydı. Gelecekteki deneylerde, hormon seviyelerindeki değişiklikleri daha fazla doğrulamak için kromatografi gibi çeşitli araçlar kullanmayı düşüneceğiz ve gen düzeyinde ve ötesinde elektroakupunktur ile HPT ekseninin düzenlenmesi üzerine daha fazla çalışma yapmak için transkriptomik veya metabolomik kullanacağız.

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Bu araştırma, Ningxia Hui Özerk Bölgesi (2021BEG02041) Anahtar Araştırma ve Geliştirme Projesi, erkek üreme disfonksiyonunun tedavisinde "hipotalamik-hipofiz-testis eksenini" düzenleyen akupunktur tedavisinin akupunktur uyumluluğu üzerine kanıta dayalı değerlendirme ve klinik çalışma tarafından desteklenmiştir, Proje lideri: Huisheng Ma; 2024 Birinci Sınıf Disiplin İnşaat Projesi (ZY0019110305), Proje lideri: Huisheng Ma; Çin Tıp Bilimleri Akademisi (YZ-202128), Proje lideri: Huisheng Ma.