JoVE Logo

Войдите в систему

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Данное исследование направлено на проверку терапевтического эффекта акупунктурной точки Shu-Mu Brain-Kidney на олигоастеноспермию у крыс и изучение ее основного механизма через ось гипоталамо-гипофиз-яичко (HPT).

Аннотация

Олигоастеноспермия является распространенной причиной мужского бесплодия. Гипоталамо-гипофизарно-тестикулярная ось (HPT) регулирует дифференцировку и созревание гонад посредством синтеза и высвобождения репродуктивных гормонов, играя жизненно важную роль в мужской фертильности. Нарушение стабильности оси HPT ухудшает выработку спермы, снижая качество спермы. Изучение влияния электроакупунктуры на регуляцию оси HPT может дать представление о лечении олигоастеноспермии. Пятьдесят 8-недельных самцов крыс SD были случайным образом разделены на пустые, модельные, Shu-Mu Brain-Kidney, неакупунктурные и L-карнитины (n = 10 в группе). За исключением холостой группы, крысы получали аденин внутрижелудочно в течение 28 дней для формирования модели. После моделирования группа Shu-Mu Brain-Kidney подвергалась электроакупунктуре в определенных акупунктурных точках, в то время как группа без акупунктурных точек получала фиктивное лечение в течение 30 минут ежедневно. Группа L-карнитина получала L-карнитин (10 мл/кг) внутрижелудочно один раз в сутки. Лечение продолжалось в течение 28 дней. Оценивали общее состояние, коэффициенты органов и качество спермы. При окрашивании HE анализировалась морфология тканей, а с помощью ИФА выявлялись изменения гормонов сыворотки крови. По сравнению с модельной группой, группы Shu-Mu Brain-Kidney и L-карнитин продемонстрировали значительные улучшения в духе, диете и опорожнении кишечника с увеличением массы тела, в то время как группа без акупунктурных точек не показала существенных изменений. Коэффициенты почечных органов значительно снизились в группах Shu-Mu Brain-Kidney и L-карнитина, но остались неизменными в группе без акупунктурных точек. Коэффициенты тестикулярных органов не показали достоверных различий между группами лечения. Количество сперматозоидов, их плотность, выживаемость и подвижность значительно улучшились в группах Shu-Mu Brain-Kidney и L-карнитина, но не в группах без акупунктурных точек. Окрашивание H&E показало улучшение повреждения почек и тканей яичек в группах Shu-Mu Brain-Kidney и L-карнитина. ИФА выявила повышение T, ГнРГ и INHB и снижение уровней ЛГ, ФСГ, Е2 и PRL в этих группах (p < 0,001), без существенных изменений в группе без акупунктурных точек. Эти результаты указывают на то, что акупунктурная терапия Shu-Mu Brain-Kidney улучшает качество спермы за счет регулирования оси HPT, предлагая потенциальное лечение олигоастеноспермии.

Введение

Олигоастеноспермия, разделенная на «олигоспермию» и «астеноспермию», является одним из распространенных типов мужского бесплодия, с частотой заболеваемости, составляющей около 75% случаев мужского бесплодия. Олигоастеноспермия в основном характеризуется снижением плотности и подвижности сперматозоидов в яичках и в основном клинически проявляется нарушением сперматогенеза, снижением количества сперматозоидов и низкой подвижностью сперматозоидов 2,3. В последние годы заболеваемость олигоастеноспермией увеличивается из года в4 года. Без эффективного лечения он будет иметь долгосрочные неблагоприятные последствия для физического и психического здоровья пациентов и даже для гармонии в семье5. Исследования показали, что генетические проблемы6, репродуктивные эндокринные расстройства7, инфекции урогенитального тракта8 и химические препараты9 могут влиять на производство и созревание сперматозоидов, что приводит к снижению качества спермы. В настоящее время улучшение качества поврежденной спермы стало сложной проблемой в медицинской сфере.

Гипоталамо-гипофизарно-тестикулярная ось (HPT) является основным путем регуляции репродуктивной функции в организме, который может регулировать дифференцировку и созревание половых желез, стимулируя синтез и высвобождение репродуктивных гормонов, связанных с гипоталамусом, гипофизом и яичками, и играет важную роль в поддержании нормальной мужской репродуктивнойфункции.. Если стабильность функции оси HPT нарушена, это приведет к тому, что секреция яичек будет недостаточной для достижения физиологической концентрации тестостерона, что приведет к снижению количества и качества сперматозоидов в яичке11. Таким образом, лечение олигоастеноспермии в основном направлено на регулирование функции оси HPT и достижение цели поддержания баланса родственных эндокринных гормонов, тем самым увеличивая количество сперматозоидов в сперме, повышая активность сперматозоидов и улучшая качество спермы.

В клиническом лечении олигоастеноспермии современная медицина в основном использует такие методы, как хирургия и препараты против окисления и повышения подвижности сперматозоидов12,13, в то время как электроакупунктура сочетает в себе традиционную китайскую акупунктуру и современную медицинскую биоэлектрическую. Он имеет преимущества в том, что он быстрый и точный, имеет очевидный лечебный эффект, имеет небольшое количество побочных реакций, широкий спектр подходящих заболеваний и низкую стоимость лечения, а также имеет хороший лечебный эффект при олигоастеноспермии14,15. «Задняя часть — ян, а живот — инь». Комбинация акупунктурных точек Шу-Му сочетает в себе точки Шу с точками Му, одну спереди и одну сзади, одну инь и одну ян, работающие вместе, также известный как метод комбинации акупунктурных точек спереди-сзади. Традиционная китайская медицина (ТКМ) считает, что почка является корнем пренатальной эссенции, а заболевание локализуется в почках. Выбрана точка Фронт-му почки, Цзинмэнь (GB25), и точка Бэк-шу, Шэньшу (BL23), которая имеет эффект согревания почки, помощи ян и поиска ян внутри инь16,17; Почка хранит эссенцию и управляет производством костного мозга, мозг является морем костного мозга и местом встречи всего ян, а Тайси (KI3) является исходной точкой меридиана почек стопы Шаоинь, который может регулировать и тонизировать печень и почки, питать инь и вырабатывать костный мозг18. В сочетании с Epangsanxian (MS4) он соединяет почку и мозг, отражая идею «комбинации мозга и почек Шу-Му» в TCM19, и терапевтический эффект более очевиден, чем у обычной акупунктуры.

Текущие исследования качества спермы в первую очередь сосредоточены на улучшении структуры и функции яичек, в то время как были проведены ограниченные исследования по регуляции уровня гормонов в сыворотке крови в различных тканях гипоталамо-гипофизарно-тестикулярной оси (HPT)20. В предварительных исследованиях секвенирование РНК (RNA-Seq) было использовано для идентификации генов-кандидатов и регуляторных путей, участвующих в регуляции качества спермы в гипоталамо-гипофизарных и тестикулярных тканях здоровых крыс и крыс с моделью олигозооспермии, индуцированной аденином21. Кроме того, в обеих группах был проведен анализ качества спермы и гистологический анализ тканей яичка. Эти результаты позволили получить представление о молекулярных механизмах, лежащих в основе качества спермы у крыс, страдающих олигоастеноспермией, вызванной аденином. Электроакупунктурная терапия с дистанционно-приближенной акупунктурной точкой может улучшить качество спермы у крыс с олигоастеноспермией за счет регуляции оси HPT, и этот эффект связан с процессом окислительного стресса22. Тем не менее, неизвестно, может ли акупунктурная точка Shu-Mu Brain-Kidney улучшить качество спермы крыс за счет регуляции оси HPT. Для дальнейшего изучения регуляторного механизма улучшения качества спермы у крыс с олигоастеноспермией и эффективных методов лечения, в этом исследовании использовалась модель олигоастеноспермии крыс, индуцированная аденином, и были выбраны четыре акупунктурные точки: Эпангсансянь, Шэньшу, Цзинмэнь и Тайси, чтобы изучить связанный механизм терапевтического эффекта акупунктурной точки Shu-Mu Brain-Kidney на олигоастеноспермию у крыс с точки зрения оси HPT. обеспечение более научной основы для клинического лечения.

протокол

Все эксперименты на животных были рассмотрены и одобрены Комитетом по этике животных Медицинского университета Нинся (номер одобрения: IACUC-NYLAC-2021-130). Исследование проводилось в строгом соответствии с рекомендациями ARRIVEs Guidelines 2.0 для экспериментов на животных и с соблюдением принципов благополучия животных, описанных в Руководстве NIH по уходу и использованию лабораторных животных. Это рандомизированное контролируемое исследование на животных с использованием одностороннего дисперсионного анализа проводилось в Центре экспериментов на животных Медицинского университета Нинся с марта по май 2023 года. Для исследования были использованы восьминедельные самцы крыс-класса SPF с массой тела 180-220 г. Подробная информация об используемых реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Процедуры создания и лечения животных моделей

  1. Экспериментальные животные и группы
    1. Получить пятьдесят 8-недельных самцов крыс-SD класса SPF массой 180-220 г.
    2. Содержать всех крыс в стандартных условиях, поддерживая комнатную температуру 22-25 °C, влажность 50%-60%, а также обеспечивая свободный доступ к стандартному корму и воде для грызунов.
    3. После одной недели адаптации случайным образом разделите крыс на пустую (B) группу (n = 10) и моделирующую группу (n = 40) с помощью метода таблицы случайных чисел. Введение нормального физиологического раствора в пустую группу и аденина в моделирующую группу пероральным зондированием.
    4. Через 28 дней случайным образом разделите моделирующую группу на модельную группу (M), группу Shu-Mu Brain-Kidney (S), группу без акупунктурных точек (N) и группу L-карнитина (L) (n = 10 в группе). Оставьте модельную группу без лечения.
      1. Применение электроакупунктурного вмешательства с использованием метода сопоставления акупунктурных точек Shu-Mu Brain-Kidney к группе Shu-Mu Brain-Kidney group. Назначайте неакупунктурную терапию группе без акупунктурных точек и жидкость L-карнитина перорально через зонд группе L-карнитина. Лечите все группы непрерывно в течение 28 дней.
  2. Построение модели
    ПРИМЕЧАНИЕ: Исследования показали, что высокие дозы аденина могут влиять на функцию яичек у крыс, что приводит к аномальной секреции половых гормонов, нарушению функциональной стабильности оси HPT иснижению качества спермы. Таким образом, аденин обычно используется для установления моделей бесплодия самцов животных.
    1. Введите нормальный физиологический раствор (1 мл/100 г массы тела) в бланковую группу и аденин (20 мг/100 г массы тела) в модельную группу путем перорального зондирования (рис. 1A).
    2. Обеспечьте непрерывное перемешивание во время зондирования, чтобы предотвратить осаждение аденина и закупорку иглы зондажа. Применяйте лечение один раз в день в течение 28 дней.
  3. 1.3 Процедура лечения
    1. Группа Шу-Му Мозг-Почки
      1. Начинайте вмешательство в первый день после моделирования. Выполняйте иглоукалывание одноразовыми стерильными акупунктурными иглами по двусторонним точкам. После фиксации крысы обнажите и продезинфицируйте место иглоукалывания.
      2. Зафиксируйте кожу места иглоукалывания левой рукой и быстро проткните точку акупунктуры одноразовой стерильной иглой для акупунктуры в правой руке. Подключите электростимулятор. Применяют дилатационные волны с частотой электроакупунктуры 2 Гц, интенсивностью стимуляции 1,5 мА и легким тремором местной мышцы.
      3. Проводите лечение электроакупунктурой в течение 30 минут каждый раз, один раз в день, в течение 28 дней подряд (рисунок 1B).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор акупунктурных точек у крыс со ссылкой на Экспериментальную науку об акупунктуре и прижигании Йонг Тана, Приложение II, «Акупунктурные точки, обычно используемые у экспериментальных животных», в сочетании со сравнительным методом выбора анатомических точек19. Были выбраны следующие точки: (1) Эпангсаньсянь (MS4): расположена на 3 мм ниже и на 4 мм за пределами точки Тоувэй. Операция: Прокол 1-2 мм прямо; (2) Шэньшу (BL23): Расположен в области позвоночника, по обе стороны от нижнего остистого отростка второго поясничного позвонка, в 6 мм от срединной дорсальной линии. Операция: Укол 6 мм прямой; (3) Цзинмэнь (GB25): Расположен на боковой талии, на свободном конце 13-го ребра на нижней стороне. Операция: Прокол 1-2 мм прямо; (4) Тайси (KI3): Расположен на внутренней стороне стопы, в углублении между верхней точкой медиальной лодыжки и задним краем ахиллова сухожилия. Применение: Укол 3 мм прямо.
    2. Группа без акупунктурных точек
      1. Выберите и управляйте неакупунктурными точками 1, 2 и 3 таким же образом, как и группа Shu-Mu Brain-Kidney (рисунок 1B).
        Примечание: Поскольку неакупунктурные точки не следуют принципу выбора точек вдоль меридианов, и в соответствии с теорией традиционной китайской медицины (ТКМ) и долгосрочным клиническим наблюдением, эти три акупунктурные точки оказывают незначительный терапевтический эффект на пациентов с олигоастенозооспермией24. (1) Неакупунктура 1: Расположена в середине линии между кончиком локтя и подмышкой на внутренней стороне локтя. Операция: Прокол 1-2 мм прямо; (2) Неакупунктура 2: Расположена в средней точке между медиальным надмыщелком плечевой кости и запястьем локтевой кости, на локтевом крае. Операция: Прокол 1-2 мм прямо; (3) Неакупунктурная точка 3: Расположена на пересечении передней дельтовидной мышцы и двуглавой мышцы на внутренней стороне руки. Применение: Прокол 1-2 мм прямо.
    3. Группа L-карнитинов
      1. Применяйте левокарнитин перорально через зонд в дозе 10 мл/кг массы тела один раз в сутки в течение 28 дней подряд (рисунок 1A).
  4. Эвтаназия
    1. После лечения дать всем крысам поголодать в течение 24 ч, обезболить их путем внутрибрюшинной инъекции 2% пентобарбитала натрия (40 мг/кг массы тела, в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами) и собрать кровь из верхушки сердца с помощью одноразовой иглы для внутривенного сбора крови21,24.
    2. После смерти в результате обезглавливания удалите одну сторону придатка яичка, чтобы измерить качество спермы. Соберите ткани почек и яичек, взвесьте и запишите их, а затем зафиксируйте в параформальдегидном фиксаторе при комнатной температуре в течение 48 часов, прежде чем погрузить их в парафин24.

2. Индексы наблюдений

  1. Общее наблюдение: Наблюдайте за психическим состоянием, диетой и опорожнением кишечника крыс, а также ежедневно контролируйте вес их тела.
  2. Коэффициенты органов: После смерти тщательно удалите поверхностный жир и соединительную ткань из почек и тканей яичек, промойте обычным физиологическим раствором, высушите фильтровальной бумагой, взвесьте на весах и запишите измерения для расчета коэффициентов органов. Коэффициент органа (%) = (масса органа [г] / масса тела [г]) x 100%.
  3. Качество спермы
    1. После удаления лишнего жира удалите и поместите по одной стороне придатка яичка у каждой крысы на водяную баню постоянной температуры при температуре 37 °C на 5 минут. Затем нарежьте, профильтруйте, аккуратно подуйте и хорошо перемешайте образец.
    2. Возьмите аликвоту 10 мкл разведенной сперматозоидной суспензии и опустите ее на край покровного стекла предварительно нагретой счетной пластины, позволяя сперматозоидной суспензии автоматически проникнуть в счетную камеру.
    3. Измерьте количество сперматозоидов, их плотность, выживаемость и подвижность с помощью системы CASA (компьютерный анализ спермы)21.
  4. Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации о процедуре обратитесь к Yang, N. et al.21.
    1. Промойте неподвижные ткани проточной водой, обезвожьте и заделайте их.
    2. Срезать срезы парафина (толщиной 5 мкм) с помощью микротома и выпекать при температуре 65 °C в течение 4 часов.
    3. Очистите срезы от воска и увлажните их водой.
    4. Окрашивайте срезы раствором для окрашивания гематоксилина в течение 3 минут, затем промойте проточной водой.
    5. Обезвоживайте участки 95% этанолом в течение 1 минуты, затем окрашивайте раствором эозина в течение 2 минут.
    6. После запечатывания слайдов выполните сканирование с помощью сканера слайдов, а также соберите и проанализируйте изображения.
  5. Иммуноферментный анализ (ИФА)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации о процедуре обратитесь к Yang, N. et al.21.
    1. Для приготовления сыворотки в лунки стандартного вещества и отмеряемые лунки для проб добавляют стандартные вещества и сыворотку соответствующих концентраций с последующим добавлением меченного ферментом реагента.
    2. Проведите этапы инкубации, промывки, развития цвета и уничтожения.
    3. Определите абсорбцию на длине волны 450 нм с помощью инструмента, меченного ферментами, и рассчитайте уровни экспрессии тестостерона (Т), гонадотропин-рилизинг-гормона (ГнРГ), ингибина В (INHB), лютеинизирующего гормона (ЛГ), фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), эстрадиола (Е2) и пролактина (ПРЛ).

3. Статистический анализ

  1. Проанализируйте экспериментальные данные с помощью статистического программного обеспечения и представьте результаты каждой группы в виде среднего ± стандартного отклонения (среднее ± SD).
  2. Используйте однофакторный ANOVA для сравнения средних выборок между несколькими группами, которые удовлетворяют предположениям нормальности и однородности дисперсии.
  3. Используйте t-критерий для сравнения двух групп, а непараметрические тесты — для данных, которые не соответствуют вышеуказанным предположениям.
  4. Учитывайте статистически значимые различия при p < 0,05.

Результаты

Оценка модели

После моделирования наблюдайте за крысами на предмет вялости, согнутой позы, холодных конечностей, нежелания есть, потери веса, увеличения объема мочи, жидкого стула и других симптомов, которые в целом соответствуют синдрому почечной недостаточности.

После вскрытия обратите внимание, что почки жесткие, белые и тяжелые. Окрашивание H&E показывает, что ткани почек и яичек модельных крыс серьезно повреждены, с неправильной формой клубочков, интерстициальным воспалением почечных канальцев и большим количеством эпителиальных клеток, подвергающихся дегенерации и даже фиброзу. Более семенные канальцы в яичках атрофированы и деформированы, с неупорядоченными или даже отсутствующими сперматогенными клетками (Рисунок 2), что указывает на успешное становление модели.

Общее состояние крыс

В пустой группе крысы демонстрировали хорошее настроение, чувствительные реакции, блестящую шерсть, а также нормальное питание и дефекацию. После вскрытия почки у них стали красновато-коричневыми и мягкими. В модельной группе у крыс наблюдалась вялость, согнутые спины, холодные тела, потеря аппетита, потеря массы тела (p < 0,001), учащенное мочеиспускание и жидкий стул. После вскрытия их почки стали жесткими, и наблюдался вид «большой белой почки» (Рисунок 2А). По сравнению с модельной группой, вышеуказанные симптомы значительно улучшились в группе Shu-Mu Brain-Kidney Group, не улучшились значительно в группе без акупунктурных точек, а также значительно улучшились в группе L-карнитина. Сравнение массы тела между группами показано на рисунке 3.

Коэффициенты почек и яичек

Как показано на рисунке 4, по сравнению с бланковой группой коэффициенты почечных органов крыс модельной группы достоверно увеличились (p < 0,01), при этом достоверной разницы в коэффициентах двусторонних яичек не было обнаружено (p > 0,05), что свидетельствует о снижении качества обоих яичек после моделирования. По сравнению с модельной группой, коэффициенты почечных органов в группах Shu-Mu Brain-Kidney и L-карнитин достоверно снизились (p < 0,05), но в группе без акупунктурных точек достоверной разницы обнаружено не было (p > 0,05). Не было обнаружено существенной разницы в коэффициентах двустороннего тестикулярного органа между группами Shu-Mu Brain-Kidney, L-карнитином и группами без акупунктурных точек по сравнению с модельной группой (p > 0,05), что указывает на то, что двусторонняя масса яичек увеличилась в группах Shu-Mu Brain-Kidney и L-карнитина, в то время как в группе без акупунктурных точек не наблюдалось существенных изменений.

Анализ качества спермы

Как показано на рисунке 5, по сравнению с пустой группой, количество сперматозоидов, плотность, выживаемость и подвижность значительно снизились в модельной группе (p < 0,001). По сравнению с модельной группой, количество сперматозоидов, плотность сперматозоидов, выживаемость и скорость подвижности значительно увеличились в группах Shu-Mu Brain-Kidney и L-карнитин (p < 0,001), но не было обнаружено существенной разницы в группе без акупунктурных точек.

Морфологические изменения в почках

Как показано на рисунке 6, почечная ткань крыс в бланковой группе имела законченную структуру и нормальную форму. Клубочки были круглыми и полными, плотно связанными с почечными капсулами, а почечные канальцы были правильными и аккуратно расположенными. По сравнению с белой группой, в модельной группе наблюдалось серьезное повреждение почечной ткани, неправильная морфология клубочков, атрофия, редукция, тяжелое интерстициальное воспаление почечных канальцев, дегенерация многочисленных эпителиальных клеток и тяжелый фиброз. По сравнению с модельной группой, степень повреждения почечной ткани значительно улучшилась в группах Shu-Mu Brain-Kidney и L-карнитина, с более правильной формой клубочков, небольшим отделением от почечных капсул, денатурацией нескольких канальцевых эпителиальных клеток и легкой инфильтрацией интерстициальных клеток почечных канальцев и фиброзом. По сравнению с модельной группой, степень повреждения почечной ткани была менее выражена в группе без акупунктурных точек, с более правильной формой клубочков, отделением от почечных капсул, большей денатурацией и нарушением эпителиальных клеток почечных канальцев, умеренной воспалительной инфильтрацией клеток вокруг клубочков и в интерстиции почечных канальцев, а также большим фиброзом.

Морфологические изменения яичек

Как показано на рисунке 7, семенники крыс в бланковой группе имели полную тканевую структуру, нормальную морфологию, аккуратные семенные канальцы и регулярные сперматогенные клетки. По сравнению с белой группой, повреждение ткани яичка было тяжелым в модельной группе, с большей атрофией и деформацией семенных канальцев, а также неупорядоченными или даже отсутствующими сперматогенными клетками. По сравнению с модельной группой, степень повреждения ткани яичка значительно улучшилась в группах Shu-Mu Brain-Kidney и L-карнитина, при этом большинство семенных канальцев расположены аккуратно, а сперматогенные клетки расположены регулярно. По сравнению с модельной группой, степень повреждения ткани яичка достоверно не снизилась в группе без акупунктурных точек, при этом в некоторых семенных канальцах наблюдались атрофия и деформация, некроз клеток, вакуоли, а также неупорядоченные и отсутствующие сперматогенные клетки.

Сравнение уровня гормонов в сыворотке крови

Как показано на рисунке 8, по сравнению с белой группой, уровни тестостерона (Т), гонадотропин-рилизинг-гормона (ГнРГ) и ингибина В (INHB) в сыворотке крови снижались в модельной группе (р < 0,001), в то время как лютеинизирующий гормон (ЛГ), фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), эстрадиол (Е2) и пролактин (ПРЛ) повышались (р < 0,001). По сравнению с модельной группой, T, GnRH и INHB увеличивались в группах Shu-Mu Brain-Kidney и L-карнитина (p < 0,001), в то время как уровни LH, FSH, E2 и PRL снижались (p < 0,001), но в группе без акупунктурных точек не было обнаружено существенной разницы.

figure-results-7421
Рисунок 1: Экспериментальные методы. (А) Процедура перорального зондирования. (Б) Метод лечения с использованием электроакупунктуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-7950
Рисунок 2: Верификация модели. (A) Внешний вид почки до и после моделирования. (Б) Нормальная почечная ткань. (В) Ткань почек после моделирования (окрашивание ПЭ, 200x, масштабная линейка: 100 мкм). (D) Нормальная ткань яичка. (E) Ткань яичка после моделирования (окрашивание HE, 100x, масштабная линейка: 200 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-8713
Рисунок 3: Сравнение массы тела между группами. B: пустая группа, M: модельная группа, S: группа Shu-Mu Brain-Kidney group, N: неакупунктурная группа, L: L-карнитиновая группа. Данные представлены в виде среднего ± стандартного отклонения (n = 3). а< 0,05, бр < 0,01, ср < 0,001, нс > 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-9446
Рисунок 4: Сравнение коэффициентов почек и яичек между группами. (A) Коэффициенты левого почечного органа. (В) Коэффициенты правых почечных органов. (В) Коэффициенты левого яичкового органа. (D) Коэффициенты правого тестикулярного органа. B: пустая группа, M: модельная группа, S: группа Shu-Mu Brain-Kidney group, N: неакупунктурная группа, L: L-карнитиновая группа. Коэффициент органа (%) = масса органа (г) / масса тела (г) × 100%. Данные представлены в виде среднего ± стандартного отклонения (n = 3). ap < 0,05, bp < 0,01, cp < 0,001, nsp > 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-10508
Рисунок 5: Сравнение качества спермы между группами. (A) Количество сперматозоидов. (Б) Плотность сперматозоидов. (C) Выживаемость сперматозоидов. (D) Коэффициент активности сперматозоидов. B: пустая группа, M: модельная группа, S: группа Shu-Mu Brain-Kidney group, N: неакупунктурная группа, L: L-карнитиновая группа. Выживаемость сперматозоидов (%) = количество подвижных сперматозоидов / общее количество сперматозоидов × 100%. Данные представлены в виде среднего ± стандартного отклонения (n = 3). ap < 0,05, bp < 0,01, cp < 0,001, nsp > 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-11566
Рисунок 6: Морфологические изменения в почках в каждой группе. (окрашивание HE, 200×, масштабная линейка: 100 мкм). Черные стрелки указывают на клубочки, зеленые стрелки – на почечные канальцы, желтые стрелки – на воспалительные клетки, а синие – на фиброз. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-12186
Рисунок 7: Морфологические изменения в семенниках в каждой группе. (окрашивание HE, 100×, масштабная линейка: 200 мкм). Черные стрелки указывают на нормальные семенные канальцы, зеленые стрелки – на некроз, а синие стрелки – на вакуоли. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-12785
Рисунок 8: Сравнение уровней гормонов в сыворотке крови между группами. (А) Уровень тестостерона (Т) в сыворотке крови. (B) Уровень ГнРГ в сыворотке крови. (C) Уровень ЛГ в сыворотке крови. (D) Уровни ФСГ в сыворотке крови. (E) Уровень E2 в сыворотке крови. (F) Уровни INHB в сыворотке крови. (G) Уровень PRL в сыворотке крови. B: пустая группа, M: модельная группа, S: группа Shu-Mu Brain-Kidney group, N: неакупунктурная группа, L: L-карнитиновая группа. Данные представлены в виде среднего ± стандартного отклонения (n = 3). а< 0,05, бр р < 0,01, ср < 0,001, нс > 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

В ТКМ «почка» состоит из «внутренней почки», относящейся к функциям мочевыделительной системы в современной медицине, и «наружной почки», относящейся к гипоталамо-гипофизарно-гонадной оси и анатомическим внешним репродуктивныморганам. Мужские семенные пузырьки относятся к «наружной почке», а их компоненты включают семенники, придатки яичек, семенные пузырьки и т. д.26. ТКМ рассматривает эссенцию как материальную основу человеческого тела, а «почечная эссенция» включает в себя «пренатальную эссенцию», унаследованную от родителей, и «постнатальную эссенцию», производимую селезенкой и желудком в результате трансформации воды и зерновой эссенции, которая используется для питания пяти внутренних органов и шести кишечников. Среди них пренатальная эссенция является изначальной субстанцией, которая составляет эмбрион и является основой жизни; Постнатальная эссенция обогащает эссенцию пяти внутренностей и шести кишечников, а оставшаяся часть откладывается в почках. Они взаимозависимы и тесно соединены в почке, образуя «почечную эссенцию». Если почечная эссенция недостаточна, то есть если семенные пузырьки не могут быть полноценными, это приведет к «олигоспермии»; Если репродуктивная эссенция может нормально выделяться, то есть если семенные пузырьки могут выполнять свои функции по производству, хранению и высвобождению сперматозоидов, то это является результатом взаимной координации вяжущей природы почки Инь и возбуждающей природы Почки Ян. Если ян почек недостаточен и слаб, вяжущая функция избыточна, а возбуждающая функция недостаточна, что приводит к простудной эссенции и «астеноспермии». Таким образом, проявления олигоастеноспермии соответствуют типам синдрома ТКМ типа «дефицит почечной эссенции и дефицит почечного янга». В этом эксперименте все смоделированные крысы в основном столкнулись с проявлениями олигоастеноспермии типа дефицита почек-ян, и лечение должно быть сосредоточено на «тонизировании почек, помощи ян, наполнении эссенции и питании костного мозга». Комбинация Эпангсаньсянь, Шэньшу, Цзинмэнь и Тайси для акупунктурной точки Шу-Му Мозг-Почка может координировать инь и ян и соединять почку и мозг, в конечном итоге достигая цели «баланса инь-ян».

Сперматогенез регулируется эндокринной активностью оси HPT, а регуляция оси HPT в основном зависит от родственных гормонов и рецепторных генов, экспрессируемых в гипоталамусе, гипофизе и яичках27, где в основном доминирует пульсирующее высвобождение ГнРГ из гипоталамуса. Это стимулирует переднюю долю гипофиза к секреции ЛГ, ФСГ и ПРЛ11. Среди них ГнРГ является наиболее важным регулятором оси HPT, и его уровень может косвенно отражать состояние оси HPT и способность яичек вырабатывать сперматозоиды28. ЛГ опосредует высвобождение Т из стромальных клеток яичка, а появление сперматозоидов зависит от стимуляции Т. Если секреция тестостерона недостаточна, количество и качество сперматозоидовснизится. ФСГ связывается с рецепторами на поверхности клеток Сертоли и действует вместе с Т, способствуя пролиферации сперматогонии и продуцируя INHB для поддержания сперматогенеза30. INHB, гликопротеин, синтезируемый в яичковых клетках Сертоли и половых клетках, является важным регулятором мужской гонады, которая, в свою очередь, может активировать гипофиз для производства ФСГ и взаимодействовать с ФСГ для совместной регуляции оси HPT 31,32,33. Тем не менее, PRL является важным фактором, влияющим на подвижность сперматозоидов34. Чрезмерное количество PRL может подавлять секрецию гонадной оси, тем самым подавляя сперматогенез35. E2 секретируется половыми железами и мозгом и оказывает негативное влияние обратной связи на ЛГ и ФСГ36. Высокий уровень Е2 повреждает клетки Сертоли и интерстициальные клетки яичек, вызывает стеатоз окружающей соединительной ткани и уменьшает диаметр мужских семенных канальцев, что приводит к нарушению фертильности пациентов37. Установлено, что сывороточные уровни ФСГ и ЛГ у крыс с олигастеноспермией, индуцированной Tripterygium wilfordii, были значительно повышены после моделирования. После 60 дней лечения таблеткой Цилинь уровни этих двух гормонов значительно снизились по сравнению с модельной группой38, что соответствовало результатам данного исследования. Другие исследования показали, что дисфункция оси HPT возникает у крыс с синдромом дефицита почек-янг, вызванным аденином, и связанные с этим уровни секреции половых гормоновтакже изменяются.

В этом исследовании, по сравнению с белой группой, крысы в модельной группе в целом находились в плохом состоянии, а качество спермы было значительно снижено (p < 0,001). Окрашивание H&E показало серьезное повреждение почек и ткани яичек, что указывает на то, что крысы, модулированные аденином, соответствовали критериям олигонастеноспермии. По сравнению с модельной группой, вышеуказанные условия значительно улучшились в группах Shu-Mu Brain-Kidney и L-карнитин (p < 0,05), в то время как улучшение не было значимым в группе без акупунктурных точек, что указывает на улучшение качества спермы, а также морфологии и структуры органов в группах Shu-Mu Brain-Kidney и L-карнитина. По сравнению с белой группой, T, GnRH и INHB снизились (p < 0,001) в модельной группе, что указывает на снижение способности к секреции T, GnRH и INHB у крыс с олигоастеноспермией после успешного моделирования. ЛГ, ФСГ, Е2 и ПРЛ увеличились (p < 0,001), что указывает на то, что секреция ЛГ, ФСГ, Е2 и ПРЛ увеличилась после успешного моделирования, что привело к ослаблению сперматогенной функции яичек. По сравнению с модельной группой, T, GnRH и INHB увеличились (p < 0,001), в то время как уровни секреции LH, FSH, E2 и PRL снизились (p < 0,001) в группах Shu-Mu Brain-Kidney и L-карнитина, но не было обнаружено существенной разницы в группе без акупунктурных точек. Это показывает, что как электроакупунктура, так и L-карнитин могут регулировать уровень гормонов оси HPT у крыс и оказывать хорошее влияние на улучшение олигонастеноспермии у крыс.

L-карнитин является природным антиоксидантом у млекопитающих, который может участвовать в энергетическом обмене клеток и уменьшать антиоксидантное повреждение сперматозоидов40. Многочисленные исследования доказали, что L-карнитин может значительно улучшить подвижность, морфологию и концентрацию сперматозоидов при одновременном повышении уровня гормонов, связанных с осью HPT41. В этом эксперименте L-карнитин использовался в качестве положительной контрольной группы для сравнения с группой Shu-Mu Brain-Kidney Group. Экспериментальные данные не показали существенной разницы в сравнении различных показателей между двумя группами, подтверждая, что электроакупунктура в «Эпангсансянь, Шэньшу, Цзинмэнь и Тайси» оказала хорошее влияние на крыс с олигоастеноспермией. Кроме того, иглоукалывание может координировать инь и ян внутренних органов и усиливать здоровую ци организма, чтобы противостоять патогенной ци, что делает ее безопасной, эффективной и менее токсичной с меньшим количеством побочных эффектов. Электроакупунктура может усилить лечебный эффект больше, чем обычная акупунктура, и обеспечить безопасное и эффективное лечение для клинического лечения олигоастеноспермии. Поскольку крысы в группе без акупунктурных точек не следовали принципу выбора точек по меридианам, различные экспериментальные данные значительно отличались от данных в группе Шу-Му «мозг-почка», подтверждая значимость совместимости четырех точек: «Эпангсансянь, Шэньшу, Цзинмэнь и Тайси».

Таким образом, электроакупунктура в четырех точках: «Эпангсансянь», «Шэньшу», «Цзинмэнь» и «Тайси» может улучшить функцию оси HPT у крыс, регулируя уровень соответствующих гормонов, тем самым улучшая качество спермы у крыс и, в конечном итоге, достигая цели лечения олигоастеноспермии. Он обеспечивает еще один безопасный и эффективный метод лечения олигонастеноспермии.

Однако из-за нехватки технологий и средств данное исследование было ограничено изучением уровня гормонов в сыворотке крови по оси HPT, а методы обнаружения были ограничены. В будущих экспериментах мы рассмотрим использование различных средств, таких как хроматография, для дальнейшей проверки изменений уровня гормонов и использование транскриптомики или метаболомики для проведения дальнейших исследований регуляции оси HPT с помощью электроакупунктуры на уровне генов и далее.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было поддержано Ключевым проектом исследований и разработок Нинся-Хуэйского автономного района (2021BEG02041), научно обоснованной оценкой и клиническим исследованием совместимости акупунктурных точек акупунктурной терапии, регулирующей «гипоталамо-гипофизарно-тестикулярную ось» в лечении мужской репродуктивной дисфункции, руководитель проекта: Хуэйшэн Ма; 2024 Проект строительства первоклассной дисциплины (ZY0019110305), руководитель проекта: Хуэйшэн Ма; Китайская академия медицинских наук (YZ-202128), руководитель проекта: Хуэйшэн Ма.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
AdenineBeijing Solarbio Science & Technology Co. Ltd.A8330
CASA computer-assisted semen analysis systemNanning Songjing Tianlun Biotechnology Co., Ltd.VICOS-SPERM
CentrifugeSartoriusA-14C
Differentiation fluidShanghai Biyuntian Biotechnology Co., LtdC0163M
Disposable sterile acupuncture needlesHanyi brand0.25mm*13mm
Drying machineLeicaHI1220
Electrical stimulatorHua Tuo BrandSDZ-II
Electronic balanceHangzhou Youheng Weighing Equipment Co., LtdHLD-6002
ELISA kitShanghai Jianglai Biotechnology Co. LTDJL13251?JL11473?JL11525?JL12505?JL13256?JL12201
Enzyme-labeled instrumentRaytoRT-6100
Eosin staining solutionZhuhai Beso Biotechnology Co. LTDBA-4024
Hematoxylin staining solutionZhuhai Beso Biotechnology Co. LTDBA-4041
Levocarnitine oral liquidNortheast Pharmaceutical Group Shenyang First Pharmaceutical Co. LTD.H19990372
MicrotomeLeicaRM2255
Neutral balsamBeijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co., LtdZli-9555
Paraffin embedding machineLeicaHistoCore Arcadia H
SD rat, 8-week-old, Male, 180-220 g144 Animal Center of Ningxia Medical University
Slide scannerLeicaAperio LV1
Vortex oscillatorHaimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., LtdQL-902

Ссылки

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE219

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены