Kronik yara yönetimi için çekirdek kılıflı 3D biyobaskılı iskele kullanarak hücre dışı vezikül dağıtımını optimize etme

Bu çalışma, kronik yara iyileşmesi için çekirdek kılıflı 3D-biyo-baskılı iskelelerin imalatı için bir protokol sunmaktadır. Hücre dışı veziküller mezenkimal kök hücrelerden izole edilir ve karboksimetil selüloz ve aljinat liyazdan yapılan kılıf ile çekirdeğe (aljinat) yüklenir. Bu tasarım, kontrollü iskele bozulmasına ve verimli EV'lerin serbest bırakılmasına izin verir.

Bu çalışma, kronik yara iyileşmesini arttırmak için tasarlanmış çekirdek kılıflı 3D biyobaskılı iskelelerin üretimi için ayrıntılı bir protokolün ana hatlarını çizmektedir. Protokol, rejeneratif ve immünomodülatör özellikleri ile bilinen mezenkimal kök hücrelerden (MSC'ler) hücre dışı veziküllerin (EV'ler) izole edilmesini içerir. Bu EV'ler daha sonra benzersiz bir iskele yapısına dahil edilir. İskele, karboksimetil selüloz ve aljinat liyazdan yapılmış bir kılıfla çevrili, EV'lerle yüklü aljinattan oluşan bir çekirdeğe sahiptir. Bu yenilikçi tasarım, yara bölgesinde EV'lerin verimli ve kontrollü bir şekilde serbest bırakılmasını teşvik ederken kontrollü iskele bozulmasını sağlar. Protokol, EV'lerin hazırlanması ve karakterizasyonu, 3D biyo-baskı için biyo-mürekkeplerin formülasyonu ve istenen çekirdek-kılıf mimarisini elde etmek için baskı parametrelerinin optimizasyonu dahil olmak üzere temel adımları kapsar. İskele, yapısal bütünlüğü ve biyoaktiviteyi birleştirerek, geleneksel yara örtülerinin sınırlamalarını ele almayı, doku yenilenmesini hızlandırmak ve kronik yaralarda iltihabı azaltmak için hedefli bir yaklaşım sunmayı amaçlamaktadır. Bu yöntem, kronik yara yönetiminde potansiyel klinik uygulamalara sahip gelişmiş biyomateryaller geliştirmek için tekrarlanabilir ve ölçeklenebilir bir strateji sağlar. Protokol ayrıca, gelecekteki terapötik uygulamalar için uyarlanabilirliği sağlayarak tutarlı sonuçlar elde etmek için kritik hususları vurgulamaktadır.

Genellikle aşırı iltihaplanma ile bağlantılı kronik yaralar, amputasyonlara yol açabilecek enfeksiyonlar ve doku nekrozu gibi ciddi komplikasyonları önlemek için zamanında tedavi gerektirir. İlerlemelere rağmen, mevcut tedaviler maliyetli, elverişsiz, yan etkilere sahip ve sınırlı etkinliğe sahip olmaya devam ediyor, bu da daha iyileştirici pansumanlara olan ihtiyacı vurgulamaktadır ^1,2,3. Kronik yaralar için özel olarak tasarlanmış yeni nesil yara örtülerinin geliştirilmesi, bu zorlukların üstesinden gelmek için çok önemlidir. Ayrıca, yara iyileşmesinin karmaşık doğası, nemlendirme, esneklik, yapışma, biyoaktivite ve biyolojik olarak parçalanabilirlik dahil olmak üzere bir dizi özelliğe sahip pansuman malzemeleri gerektirir⁴. Bu çalışma, kontrollü bir terapötik ortam sağlamak ve kronik yara iyileşmesini hızlandırmak için hücre dışı vezikülleri (EV'ler) çekirdek kılıflı 3D biyobaskılı bir iskele ile entegre eden biyomühendislik ürünü bir yara örtüsü geliştirmeyi amaçlamaktadır.

Kök hücrelerden elde edilen EV'ler, anti-inflamatuar yanıtları, hücre büyümesini, göçü ve kan damarı oluşumunu teşvik ederek kronik yara iyileşmesine yardımcı olur⁵. Ek olarak, EV'ler, kronik yara yönetimi için küçük moleküllü ilaçlar, gen ve protein yapıları dahil olmak üzere biyoaktif moleküller sağlayabilir⁶. Ayrıca, kargoyu enzimatik bozunmadan koruma yetenekleri, terapötik ajanların stabilitesini ve biyoyararlanımını geliştirerek, genellikle in vivo olarak hızla bozunan geleneksel büyüme faktörlerine ve küçük moleküllü ilaçlara göre belirgin avantajlar sunar ⁷. Bu avantajlara rağmen, EV'lerin hedef dokulara verimli ve sürekli olarak verilmesi önemli bir zorluk olmaya devam etmektedir.

3D biyo-baskı iskeleleri, EV'lerin terapötik etkilerini artırmaları için bir dağıtım platformu olarak hizmet edebilir⁸. Bu iskeleler doğal hücresel ortamları taklit eder ve EV'lerin kontrollü bir şekilde serbest bırakılmasına izin^{verir 9,10}. Ayrıca EV'leri bozulmaya karşı koruyarak mikroRNA'larının ve proteinlerinin^{stabilitesini arttırırlar 11}. Han ve ark. EV'lerin 3D biyobaskılı GelMA iskelelerinden etkili bir şekilde serbest bırakılabileceğini gösterdi. Bu salınım, iskelelere¹² ekilen insan bukkal yağ yastığı mezenkimal kök hücrelerinde (hBFP-MSC'ler) gelişmiş hücre bağlanmasına ve mekanotransdüksiyon yollarıyla ilgili gelişmiş gen ekspresyonuna yol açtı. Born ve diğerleri, çapraz bağlayıcının konsantrasyonunu optimize ederek, EV'lerin kontrollü bir şekilde serbest bırakılmasını sağladı. Bu yaklaşım, anjiyogenezi teşvik etmede etkinlik göstermiştir ve EV'lerin düzenlenmiş iletimi için umut verici bir yöntem sunmaktadır¹³.

Çekirdek kılıf 3D biyobaskı, bir kılıf içine yerleştirilmiş bir çekirdek malzemeyi yazdırarak karmaşık, çok malzemeli yapıların oluşturulmasını sağlar. Çekirdek, hücreleri, büyüme faktörlerini veya ilaçları içerebilirken, kılıf mekanik destek ve koruma sağlar veya bir bariyer görevi görür. Bu yöntemin doku mühendisliği ve rejeneratif tıpta vasküler ağlar geliştirme, doğal doku yapılarını taklit etme ve ilaç dağıtım sistemleri oluşturma gibi uygulamaları vardır. Malzeme dağılımı ve bileşimi üzerinde hassas kontrol sağlayarak yapıların işlevselliğini ve biyolojik uygunluğunu artırır. Alternatif tekniklerle karşılaştırıldığında, çekirdek kılıf 3D biyobaskı, malzeme dağılımı ve bileşimi üzerinde hassas kontrol sağlayarak yapıların işlevselliğini ve biyolojik uygunluğunu geliştirir^14,15.

Yara örtülerinde tasarlanmış bozulma, değişiklikler sırasında daha az rahatsızlık, iyileşme ve enfeksiyon kontrolü için nemli bir ortam, zamanında terapötik uygulama ve optimal doku rejenerasyonu gibi faydalar sunar 16,17,18. Aljinat (Alg) ve karboksimetil selüloz (CMCh) hidrojeller biyouyumludur ve yaralara hücre dışı veziküller (EV'ler) vermek, hücresel iletişim ve iltihabı azaltma yoluyla iyileşmeyi artırmak için etkilidir¹⁸. Bu çalışmada, EV'ler bir Alg çekirdeğine entegre edilirken, hızlı pansuman bozunmasını ve EV'lerin verilmesini sağlamak için bir CMCh ve AlgLiyaz (AlgLiyaz) kılıfı kullanıldı. Bu çekirdek kılıf tasarımı, iskele bozulmasına yanıt olarak EV'lerin hızlı bir şekilde salınmasını kolaylaştırır, terapötik etkinliklerini artırır ve mevcut kronik yara tedavilerinin sınırlamalarını ele alır. Bu çalışmanın birincil amacı, kontrollü EV salınımını duyarlı bir şekilde parçalanabilen bir iskele ile entegre ederek yara iyileşmesini artıran ve sonuçta kronik yaralar için tedavi sonuçlarını iyileştiren biyomühendislik ürünü bir yara örtüsü geliştirmektir.

Hayvan araştırması, Ulusal Biyoetik Komitesi ve Nizwa Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi tarafından belirlenen etik standartlara tam olarak uygun olarak yürütülmüştür. Bu çalışma için etik onay, izin kimliği: VCGSR, AREC/01/2023 kapsamında verilmiştir. Tüm hayvanlar standart laboratuvar koşulları altında barındırıldı ve çalışma boyunca refahlarını korumak için optimal çevresel kontroller, doğru beslenme ve kapsamlı bakım sağlandı. Hayvanları içeren tüm prosedürler, kurumsal politikalara, uluslararası hayvan bakım standartlarına ve ARRIVE yönergelerine sıkı sıkıya bağlı kalmıştır.

1. Hücre kültürü

1. Sıvı nitrojen deposundan bir şişe MSC (pasaj #2) alın ve kontaminasyonu önlemek için aseptik tekniklerle kullanın. Hücreleri 37 ° C'lik bir su banyosunda hızla çözün ve küçük bir buz parçası kalır kalmaz onları çıkardığınızdan emin olun.
2. %1 (h/h) MSC SFM XenoFree takviyesi, %1 (h/h) GlutaMAX ve %0.01 (h/h) Gentamisin ile desteklenmiş MSC SFM Bazal Ortam içeren eksiksiz bir ortam hazırlayın. 1 mL önceden ısıtılmış (37 °C) tam ortamı her 5 saniyede bir 3 ila 5 damla oranında şişeye ekleyin ve ardından yavaşça karıştırın. MSC şişesinin tüm içeriğini, Sınıf II biyogüvenlik kabininde aseptik koşullar altında 4 mL önceden ısıtılmış tam ortam içeren 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın.
3. Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin. Santrifüjün uygun şekilde dengelendiğinden emin olun.
4. Süpernatanı aspire edin ve hücreleri 1 mL önceden ısıtılmış tam ortamda yeniden süspanse edin. Ardından, hücreleri 4 mL tam ortam içeren bir T25 şişesine aktarın.
5. Hücrelerin eşit şekilde dağıldığından emin olmak için şişeyi hafifçe eğin. Şişeyi 37 °C'de% 5 CO₂ ile inkübe edin.
6. Ortamı her 2 günde bir değiştirin, taze, önceden ısıtılmış, tam ortamla değiştirin. Hücre bozulmasını önlemek için nazik pipetleme kullanın. % 70 -% 80 birleşmeye ulaştıktan sonra, harcanan ortamı T25 şişesinden aspire edin.
7. Kalıntıları gidermek için hücreleri 3 mL taze PBS ile yıkayın. Yıkama sırasında şişenin tamamen kaplandığından emin olun.
8. T25 şişesine 1 mL %0.25 tripsin çözeltisi ekleyin, 37 ° C'de 3-7 dakika inkübe edin ve ayrılmayı mikroskop altında 4x büyütmede dikkatlice izleyin.
9. Hücrenin tamamen ayrılmasını sağlamak için gerekirse şişeye hafifçe vurun. Şişeye önceden ısıtılmış tam ortam ekleyin ve hücrelerin ayrılmasına yardımcı olmak için yüzey üzerinde yukarı ve aşağı pipetleyin. Ardından, hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
10. Tüpü oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin. Hücre peletini taze, eksiksiz bir ortamda askıya alın ve bir Neubauer hemositometresi kullanarak hücreleri sayın. Hücreleri bir T75 şişesine aktarın. Optimum büyüme için 5.000 hücre/^cm2'lik bir tohumlama yoğunluğu sağlayın.
11. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO₂ ile inkübe edin. 72 saatlik hücre inkübasyonundan sonra, EV'lerin izolasyonu için şartlandırılmış ortamı hücrelerden toplayın. Toplandıktan hemen sonra kullanın.

2. EV izolasyonu

1. Hücresel kalıntıları gidermek için toplanan şartlandırılmış ortamın 13 mL'sini 800 x g'da 15 dakika santrifüjleyin. Büyük parçacıkları çıkarmak için 0.22 μm'lik bir şırınga filtresi kullanarak süpernatanı nazikçe filtreleyin.
2. Filtrelenmiş şartlandırılmış ortama 5 mL yağış tamponu ekleyin ve karıştırmak için iyice girdaplayın. Çözeltinin homojen olduğundan emin olun.
3. EV'lerin çökelmesini sağlamak için karışımı gece boyunca 4 °C'de inkübe edin. Karışımı 3.220 x g'da 20 °C'de 30 dakika santrifüjleyin. Tüplerin dengesini kontrol edin.
4. Peleti bozmadan süpernatanı dikkatlice atın. Kalan sıvıyı çıkarmak için peleti 5 saniye boyunca 3.220 x g'da bir kez daha santrifüjleyin.
5. EV'lere zarar vermemek için EV peletini 200 μL PBS'de nazikçe pipetleyin. Üreticinin talimatlarına göre EV'lerin protein konsantrasyonunu ölçün (BCA Protein Test Kiti).
6. EV fenotipi^18'i doğrulamak için EV'ye özgü belirteçleri (CD63, CD81 ve CD9) tespit etmek için Western blotlama yapın. Analiz, EV'lerin kimliğini^{doğrulayan bu} belirteçlerin varlığını doğruladı 19.
7. RNase kontaminasyon riskini en aza indirmek için, ek depolama olmadan doğrudan kullanılması önerilir. İhtiyaç duyulması durumunda, daha sonra kullanmak üzere EV'leri -80 °C'de saklayın. Tekrarlanan donma-çözülme döngülerini önlemek için EV'lerin süspansiyonunu 40 μL'lik hacimlere ayırın.

3. PKH-26 ile EV etiketleme

1. Tampon hazırlama
   1. Steril bir kapta yaklaşık 90 mL steril ultra saf su içinde 0.238 g HEPES çözün. Taze hazırlanmış HEPES solüsyonu kullanın. HEPES çözeltisine 0.85 g NaCl ekleyin.
   2. Kalibre edilmiş bir pH metre kullanarak gerektiği gibi 1 M NaOH veya HCl kullanarak pH'ı 7,4'e ayarlayın. Toplam hacmi 100 mL'ye getirmek için deiyonize su ekleyin. Çözeltiyi sterilize etmek için 0,22 μm'lik bir filtreden süzün.
2. 4 μL PKH-26 boyasını 1 mL hazırlanmış tampon içinde seyreltin. Homojenliği sağlamak için pipetle iyice karıştırın.
3. Saflaştırılmış EV'leri 700 μg/mL konsantrasyonda 1 mL PBS'de yeniden süspanse edin. Hazırlanan PKH-26 çözeltisinin 1 mL'sine 1 mL EV süspansiyonu ekleyin. Sadece boya kontrol grubu için, 1 mL PKH-26 çözeltisine EV'ler olmadan 1 mL tam ortam ekleyin. Sonraki tüm adımlar, potansiyel spesifik olmayan agregasyonu veya misel oluşumunu hesaba katmak için kontrol grubu için de gerçekleştirilir.
4. Tüpü 10x-15x hafifçe ters çevirerek EV'leri iyice karıştırın. Karışımı oda sıcaklığında 3-5 dakika inkübe edin ve EV'lerin boyaya eşit şekilde maruz kalmasını sağlayın.
5. Steril ultra saf su kullanarak 2 mL taze% 1'lik bir BSA çözeltisi hazırlayın ve etiketleme reaksiyonunu söndürmek için elde edilen karışımın 2 mL'sine ekleyin. Toparlanmayı önlemek için hafifçe karıştırın.
6. PKH-26 etiketli EV'leri yukarıda belirtilen protokole göre konsantre edin (adım 2.2-2.7). Etiketli EV'leri 300 μL PBS'de yeniden askıya alın. PKH-26 etiketli EV örneğini 30 kDa'lık bir filtre tüpüne pipetleyin.
7. Numuneyi 3,220 °C'de 30 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin. Bu adım sırasında, serbest PKH-26 boyası ve küçük moleküller zardan filtrata geçecek ve PKH-26 etiketli EV'ler retentatta tutulacaktır.
8. İlk santrifüjlemeden sonra, süzüntüyü atın ve retentata 300 μL PBS ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetleyerek PBS'deki EV'leri nazikçe yeniden askıya alın.
9. Kalan serbest boyayı veya küçük molekülleri yıkamak için numuneyi 3.220 x g'da 4 °C'de 30 dakika boyunca tekrar santrifüjleyin.
10. Süzüntü çözeltisinde PKH-26 eksikliğini bir floresan mikroskobu ile doğrulayın. Herhangi bir boya tespit edilirse, yıkama adımlarını tekrarlayın.
11. Üst çözeltiyi mikropipet ile toplayın ve filtreyi toplama tüpünden çıkarın. Filtreyi dikkatlice ters çevirin (ters çevirin).
12. Ters çevrilmiş filtreyi 800 x g'da 5 °C'de 4 dakika santrifüjleyin. Bu, tutulan PKH-26-EV'lerin filtre membranından yeni toplama tüpüne toplanmasına yardımcı olacaktır. Bir sonraki adım için doğrudan PKH-26-EV'leri kullanın.

4. 3D Biyo-baskı

1. Bioinks hazırlama
   1. Steril ultra saf su kullanarak taze% 4.5 (a / h) sodyum Alg çözeltisi hazırlayın. Çözeltinin tamamen çözülmesini sağlamak için gece boyunca 60 ° C'de karıştırın.
   2. %3,8 (a/a) çözelti elde etmek için CMCh'yi steril ultra saf suda çözün. Taze hazırlayın. Tamamen çözünmesi için gece boyunca 60 °C'de karıştırın.
   3. Hazırlanan biyomürekkepleri 3.220 x g'da 25°C'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin ve baskı işlemine müdahale edebilecek kabarcıkları çıkarın.
   4. EV'lerin %0.01 (a/a) konsantrasyonunu elde etmek için hazırlanan 3 mL Alg çözeltisini etiketli EV'lerle veya bir şırınga karıştırıcı kullanarak yalnızca boya kontrolü ile karıştırın. Nazikçe karıştırarak eşit dağılım sağlayın.
   5. Bir şırınga karıştırıcı kullanarak, 0,5 mU / mL'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için 1 mL CMCh'yi steril ultra saf suda taze hazırlanmış bir AlgLiyaz çözeltisi ile birleştirin.
2. Şekil 1A'da gösterildiği gibi, Alg/Exo biyomürekkebini aynı anda çekirdek kısmına ve CMCh/AlgLyase biyomürekkebini çekirdek/kılıf şırınga kurulumunun kılıf kısmına yükleyin.
3. Yazdırmadan önce biyomürekkeplerin 15 dakika dinlenmesine izin verin.
4. 3D biyo-yazıcı kurulumu
   1. 3D biyoyazıcı yazılımını kullanarak, Diyagonal Dolgu Desenli Silindirik Bir Şekil seçerek iskele yapısını oluşturun. Bunun için silindir çapını ve yüksekliğini sırasıyla 20 mm ve 1,1 mm olarak ayarlayın. Gözenek boyutunu 1 mm olarak yapılandırın.
   2. Çekirdek ve kılıf nozulu pompalama hızlarını katman başına 1 mm kalınlıkta 0.25 mm/sn'ye ayarlayın ve hareket hızını 6 mm/sn'ye ayarlayın. Oda sıcaklığında katman başına 0,25 mm kalınlığında dört katman yazdırın.
5. Polyester film üzerine yazdırmaya başlayın.
6. Ekstrüzyon işlemi sırasında iskeleyi çapraz bağlamak için nemlendiriciyi aerosol kalsiyum klorür (%2,2) ile kullanın. İskele yapısından ödün vermeden etkili çapraz bağlama sağlamak için nemlendirici memesini ekstrüzyon kafasından yaklaşık 20 cm uzağa yerleştirin. Daha fazla çapraz bağlama için, iskeleyi 10 dakika boyunca kalsiyum klorür çözeltisine (% 2,2) daldırın.
7. Fazla kalsiyum klorürü ve bağlı olmayan biyomürekkebi gidermek için iskeleyi 3x steril ultra saf suyla durulayın.
8. İskelenin bütünlüğünü ve işlevselliğini üç aya kadar korumak için iskelenin 4 °C'de steril bir ortamda saklandığından emin olun.

5. EV'lerin piyasaya sürülmesini izleme

1. Dairesel kutanöz yara modelinin oluşturulması
   1. İntraperitoneal Ketamin (70 mg / kg) ve Xylazine (10 mg / kg) enjeksiyonu uygulayarak erkek Akita heterozigot diyabetik fareleri (8 hafta) anesteziye tabi tutun. Refleks yanıtlarının yokluğunu değerlendirerek uygun anesteziyi onaylayın (ör., ayak parmağı sıkıştırma) ve solunum hızını izleyin. Anestezi sırasında kornea kuruluğunu önlemek için gözlere steril veteriner oftalmik merhem sürün.
   2. Sırt derisi bölgesini önce elektrikli bir kesme makinesi kullanarak tıraş ederek hazırlayın. Cilt tahrişinden veya yaralanmasından kaçının. Traş edilen alanı bir povidon-iyot çözeltisi kullanarak sterilize edin.
   3. Steril bir seizer kullanarak, her farenin sırt yüzeyinde 6 mm'lik dairesel tam kalınlıkta bir kutanöz yara oluşturun.
   4. PKH etiketli EV'leri içeren 3D biyobaskılı iskeleyi doğrudan yara yatağına nazikçe yerleştirin. Steril forseps kullanarak hafifçe bastırarak iskelenin yara yüzeyini minimum hava cepleriyle tamamen kapladığından emin olun. İşlemden sonra hayvanın yakından izlendiğinden ve bilincini tamamen geri kazanana ve sternal yaslanmayı sürdürebilene kadar gözetim altında kaldığından emin olun.
2. Floresan görüntüleme
   1. İmplantasyondan 2 saat, 4 saat, 8 saat, 24 saat sonra, fareleri izofluran kullanarak anestezi altına alın. Anestezi indüksiyonu için, fareleri in vivo görüntüleme sisteminin (IVIS) odasına yerleştirin ve oksijende% 2 -% 3 izoflurana maruz bırakın. Kuruluğu önlemek için farelerin gözlerine oftalmik merhem sürün. Anestezi uygulandıktan sonra, fareleri IVIS sistemine aktarın ve burun kanallarından verilen oksijende% 1 -% 2 izofluran ile koruyun. Görüntülemeye devam etmeden önce hayvanların tamamen uyuşturulduğunu ve stabil olduğunu doğrulayın.
   2. İskeleden salınan PKH etiketli EV'lerden gelen floresan sinyallerini yakalamak için IVIS sistemini kullanın. Görüntüleme sihirbazında, Floresan Görüntüleme seçeneğini seçin ve PKH boyası için uyarma ve emisyon filtrelerini etkinleştirin. Sinyal algılamayı optimize etmek için görüş alanı ve konu yüksekliği dahil olmak üzere kamera ayarlarını yapın. Doğru karşılaştırmalar yapmak için tüm görüntüleme zaman noktalarında tutarlı konumlandırma sağlayın. Görüntüleri almaya başlayın ve elde edilen verileri kaydedin.
   3. IVIS yazılımını kullanarak floresan sinyal yoğunluklarını ölçün. Bu, EV'lerin zaman içinde piyasaya sürülmesinin izlenmesine izin verecektir.

EV'lerin hem Alg-EVs/CMCh hem de Alg-EVs/CMCh-AlgLyase iskelelerinden in vivo salınımı Şekil 1B,C'de gösterilmektedir. Beklendiği gibi, Alg-EV'ler/CMCh-AlgLyase iskelesi, özellikle 2 saat ve 4 saat zaman noktalarında Alg-EV'ler/CMCh'ye kıyasla daha hızlı bir salınım profili sergiledi. EV'lerin hidrojellerden salınması, difüzyon, şişme, erozyon ve bozunma dahil olmak üzere fizikokimyasal mekanizmaların bir kombinasyonu tarafından yönetilir²⁰. İskele, Algliyazdan yararlanarak, Alg'nin parçalanmasını kolaylaştırır ve yara iyileşmesinin erken aşamalarında kronik iltihabı etkili bir şekilde kontrol etmek için EV'lerin salınımını hızlandırır. EV'lerin erken salınımı, iyileşmeyi geciktirebilecek aşırı iltihabı hafifletmede kritik öneme sahiptir 21,22,23. Potansiyel spesifik olmayan agregasyonu veya misel oluşumunu hesaba katmak için, kontrol grubu da analiz edildi ve ihmal edilebilir floresan sinyalleri ortaya çıktı. Bu gözlem, tespit edilen sinyallerin ağırlıklı olarak etiketli EV'lerden kaynaklandığını doğrulamaktadır.

Bu sonuçlar, EV'lerin salınım oranlarını modüle etmede iskele bileşiminin kritik rolünü yansıtmaktadır. Alg-EVs/CMCh-AlgLyase iskelesinde gözlenen daha hızlı salınım, Alg'nin Alglyaz tarafından enzimatik parçalanmasına bağlanır ve bu da hidrojel bozunmasını artırır. Bu hızlı EV salınımı, yara iyileşmesinin enflamatuar fazını ele almak için özellikle avantajlıdır²⁴. Kronik yaralar genellikle iyileşmeyi bozan uzun süreli iltihaplanmadan muzdariptir; EV'lerin erken ve kontrollü salınımı, inflamatuar yanıtları modüle ederek ve pro-rejeneratif bir ortamı teşvik ederek bunu azaltabilir^22,25.

Bu sonuçları analiz etmek için araştırmacılar, IVIS sistemi kullanılarak yakalanan floresan yoğunluğunu ölçmeli ve sinyal gücünü zaman içinde EV konsantrasyonu ile ilişkilendirmelidir. Veriler, farklı iskele formülasyonları arasında karşılaştırmalara olanak tanıyacak şekilde serbest bırakma kinetiğini gösterecek şekilde çizilmelidir. Serbest bırakma profillerindeki varyasyonlar, iskele bütünlüğü ve enzim aktivitesi ile ilgili olarak da değerlendirilebilir ve altta yatan salım mekanizmaları hakkında daha fazla bilgi sağlar.

Şekil 1: İskele imalatına ve in vivo EV'lerin sürüm profiline genel bakış. (A) Alg-EVs/CMCh-AlgLyase 3D biyobaskılı iskele için üretim sürecinin şematik gösterimi. (B) Alg-EV'ler/CMCh-AlgLyase iskelesinden PKH etiketli EV'lerin in vivo salım profili, Alg-EV'ler/CMCh iskelesi ve yalnızca boya kontrol iskelesi (kontrol) ile karşılaştırıldığında. Renk çubukları floresan yoğunluk seviyelerini gösterir. (C) PKH-EV'lerin salınım yoğunluğunun kantitatif analizi (n = 3). Hata çubukları standart sapmayı temsil eder ve istatistiksel anlamlılığı değerlendirmek için tek yönlü ANOVA kullanılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Protokolün en önemli yönlerinden biri, verimli EV teslimatı elde etmek için gerekli olan çekirdek kılıflı iskele tasarımıdır. Tasarım, çekirdek malzeme olarak Alg'yi ve kılıf olarak CMCh ile Alglyase kombinasyonunu içerir. Bu kurulum, EV'lerin kontrollü ve hızlı bir şekilde serbest bırakılmasını kolaylaştırır. Çekirdek malzeme olan Alg, EV'leri kapsayarak korunmalarını ve yerelleştirilmiş teslimatlarını sağlar. CMCh ve Alglyaz'dan oluşan kılıf, EV'lerin zamanında serbest bırakılması için kritik olan Alg çekirdeğinin hızlandırılmış bozulmasını sağlar. Önceki yayınımız^18'de, benzer bir iskele sisteminden EV'lerin in vitro salım kinetiğini değerlendirdik ve uzun bir süre boyunca kontrollü bir salım profili gösterdik ve bu yaklaşımın sürekli terapötik etkiler için potansiyelini vurguladık. Bu kontrollü bozunma ve salma, hassas formülasyon ve kapsülleme teknikleri ile elde edilir. Bu veriler, EV'lerin salınım dinamiklerinin yara iyileşmesi ilerlemesi ile korelasyonunu sağlayacak ve iskelenin klinik potansiyeli hakkında daha derin bilgiler sunacaktır.

Daha yavaş salınan bir sistem, bir ilacın veya büyüme faktörünün sürekli, daha düşük konsantrasyonlarının yan etki riskini azaltırken etkinliği artırabileceği terapötik uygulamalarda avantajlar sunar. Örneğin, kademeli bir salınım, hücresel süreçlerin daha uzun bir süre boyunca sürekli olarak uyarılmasını^{sağlayabilir 26} ve toksisiteye²⁷ yol açabilecek yüksek konsantrasyonlardan kaçınabilir. Ancak, uygulamanın özel ihtiyaçları ideal sürüm profilini belirler. Bazı durumlarda, anında bir terapötik etki sağlamak için hızlı bir salınım tercih edilebilir²⁸.

Protokol dahilindeki kritik adımlar, çekirdek kılıflı iskele için biyomürekkep malzemelerinin hazırlanmasını ve katmanlanmasını içerir. Biyomürekkep hazırlığı sırasında hassas Alg, CMCh ve Alglyase konsantrasyonlarının korunması, yapısal stabilite ve etkili EV kapsüllemesi sağlar. Bir diğer kritik adım, tek tip iskele geometrisi ve işlevsel performans sağlamak için nozul hızları ve çapraz bağlama koşulları dahil olmak üzere 3D biyo-baskı parametrelerinin optimizasyonudur. PKH-26 etiketleme işleminin optimizasyonu, serbest boya ve istenmeyen partiküllerden kurtulmak için çok önemlidir. Bu süreç, EV'lerin izleme doğruluğunu artıracaktır.

Protokol, iskelenin stabilitesini ve EV sürümünün tutarlılığını artırmak için optimize edilmiştir. Örneğin, etiketleme sırasında aşırı serbest PKH-26 boyası, boya-EV oranının optimize edilmesi ve alternatif PKH-26 etiketli EV'lerin izolasyon yöntemi kullanılarak azaltılmıştır. İskelenin etkinliğini korumak için 3D biyo-baskı parametreleri için düzenli ayarlamalar yapıldı.

Biyomürekkeplerin viskozitesi, baskı sırasında tıkanmayı önlemek için optimize edilmelidir. Bozunma oranını kontrol etmek için AlgLiyaz konsantrasyonunun ayarlanması gerekir. İskelenin mekanik özelliklerinde sorun giderme, kırılgan veya aşırı yumuşak iskelelerden kaçınmak için kalsiyum klorür çapraz bağlama sürelerinin dengelenmesini içeriyordu. EV'ler sırasında etiketleme, filtreleme ve santrifüjleme adımları serbest boya kontaminasyonunu azalttı ve görüntüleme sonuçlarının doğruluğunu artırdı.

Kronik yara iyileşmesi için parçalanabilir yara örtüleri kullanmanın doğrudan faydalarına ek olarak, iskelenin bozulma hızı, EV'lerin serbest bırakma kinetiğini önemli ölçüde etkiler. Bu bozulma oranı, yaranın özel ihtiyaçlarını karşılayacak şekilde ayarlanabilir. Kılıftaki AlgLiyaz konsantrasyonunu optimize ederek, Alg çekirdeğinin bozunma oranı ince ayarlanabilir, bu da özelleştirilmiş bir salım profiline^{izin verir 29}. Bununla birlikte, farklı yara türlerindeki pH ve enzimatik aktivite gibi faktörler iskelenin performansını etkileyebileceğinden, yöntemin değişen fizyolojik koşullar altındaki etkinliği hala tam olarak anlaşılamamıştır. Bu nedenle, farklı fizyolojik koşullar altında iskele performansındaki değişkenlik göz önünde bulundurulmalıdır. Kronik yaralardaki pH, enzimatik aktivite ve sıcaklık değişimleri gibi faktörler iskelenin bozulmasını etkileyebilir ve EV'ler kinetiği serbest bırakarak potansiyel olarak terapötik etkinliği azaltabilir.

Hidrojel bazlı yara örtüleri, biyouyumlulukları ve nemli bir yara ortamını koruma yetenekleri nedeniyle yaygın olarak kullanılırken, genellikle EV'ler gibi biyoaktif moleküllerin kontrollü ve lokalize iletimini sağlama yeteneğinden yoksundurlar. EV'lerin iskele sistemine dahil edilmesi, yapısal desteği, bağışıklık tepkilerini modüle edebilen ve doku yenilenmesini artırabilen biyolojik olarak aktif, hücre kaynaklı bir terapötik bileşenle birleştirerek benzersiz bir avantaj sunar.

Benzer şekilde, nanoparçacık aracılı dağıtım sistemleri, belirli hücresel yolları hedeflemede oldukça etkilidir; Bununla birlikte, yara bölgesinde tutulmada zorluklarla karşılaşabilirler ve genellikle biyoaktiviteyi sürdürmek için ek stabilize edici ajanlara ihtiyaç duyarlar³⁰. Buna karşılık, sunulan iskele sistemi, teslimat sırasında EV'lerin biyoaktivitesini koruyan koruyucu bir mikro ortam sağlar²⁴.

Bu protokol umut verici sonuçlar sunarken, dikkate alınması gereken bazı sınırlamalar vardır. Zorluklardan biri, iskele içinde EV'lerin tek tip bir şekilde dağıtılmasını sağlamaktır. Karıştırma işlemindeki değişiklikler, iskele boyunca EV konsantrasyonunda tutarsızlıklara yol açabilir ve bu da tekrarlanabilirliği etkileyebilir. Bu zorluğun üstesinden gelmek için şırınga karıştırma tekniği bir avantajdır. Ek olarak, aljinat iskeleler için kalsiyum iyonu konsantrasyonu gibi jelleşme ve çapraz bağlama koşulları üzerinde hassas kontrol, optimum mekanik özellikleri ve yapısal bütünlüğü sağlamak için kritik öneme sahiptir. Bu parametrelerdeki sapmalar iskele performansını tehlikeye atabilir. Diğer bir sınırlama, yıkama adımları sırasında plastik kaplara yapışabilecekleri için iskele hazırlığı sırasında EV'lerin potansiyel kaybıdır. Son olarak, hidrojel matrisler zamanla bozulabileceğinden veya işlevselliğini kaybedebileceğinden, hazırlanan iskelelerin raf ömrü nispeten kısadır. Bu nedenle, hemen kullanım veya 4 °C'de kısa süreli depolama önerilir. Stabilitelerini doğrulamak için kapsüllenmiş EV'lerin periyodik bir biyoaktivite testi^{gereklidir 18}. Araştırmacılar, bu sınırlamaları ele alarak ve önerilen sorun giderme stratejilerini kullanarak, bu protokolün uygulamalarında tekrarlanabilirliğini ve etkinliğini artırabilir.

Çekirdek kılıflı iskele tasarım yöntemi, kontrollü salım mekanizmalarından yoksun geleneksel iskele tasarımlarına göre ilaç dağıtımı için önemli bir ilerleme sunmaktadır³¹. Terapötik ajanların yeterli veya zamanında salınmasını sağlayamayan tek fazlı iskelelerin aksine, bu yöntem EV'lerin dağıtımına gelişmiş hassasiyetle dinamik bir yaklaşım sunar. Hızlı bozulan bir çekirdek materyalin ve işlevsel bir kılıfın kullanılması, genellikle manuel veya sıralı ayarlamalar gerektiren geleneksel yöntemlere kıyasla daha hedefli ve etkili bir terapötik müdahaleye izin verir.

Bu çalışmada kullanılan Alg ve CMCh gibi iskele materyalleri biyouyumlulukları ile bilinmesine rağmen, klinik çeviri için kronik yara ortamlarında uzun vadeli biyouyumluluklarının daha kapsamlı bir değerlendirmesi gereklidir. Önceki çalışmamızda, iskelenin in vivo etkilerini klinik öncesi bir hayvan modelinde araştırdık ve hiçbir toksik etki veya önemli bağışıklık tepkisi gözlemlemedik, bu da materyallerin kısa vadede iyi tolere edildiğini düşündürüyor¹⁸. Bununla birlikte, potansiyel bağışıklık tepkileri ve bozunma yan ürünlerinin etkileri de dahil olmak üzere uzun vadeli biyouyumluluk, daha fazla araştırma gerektirir. İskele malzemelerinin bozulması, özellikle bağışıklık tepkisinin değişebileceği diyabetik veya yaşlı modeller bağlamında, yara iyileşme sürecini etkileyebilecek veya kronik iltihaplanmaya neden olabilecek yan ürünleri potansiyel olarak serbest bırakabilir. Bu nedenle, bozunma ürünlerinin yara mikro çevresini ve genel doku rejenerasyonunu nasıl etkilediğini değerlendirmek için ek çalışmalar yapmak çok önemlidir. Bağışıklık tepkilerine ve iskele bozulmasına odaklanan uzun süreli in vivo çalışmalar da dahil olmak üzere daha fazla biyouyumluluk testinin, kronik yara iyileşmesi için bu yaklaşımın güvenliğini ve klinik önemini anlamak için gerekli olduğunu kabul ediyoruz.

Bu iskele tasarımı özellikle doku mühendisliği ve rejeneratif tıp alanlarında önemlidir. EV'leri hızlı ve kontrollü bir şekilde verme yeteneği, onu kronik yara iyileşmesi, kıkırdak onarımı ve diğer doku yenileme çabaları gibi uygulamalar için değerli kılar³². Yöntem, iskele bozulması ve EV'lerin serbest bırakılması ile ilgili sorunları ele alarak, bu alanlarda hasta sonuçlarını iyileştirmek için umut vaat ediyor. Ek olarak, farklı doku tiplerine özelleştirme ve adaptasyon potansiyeli, kişiselleştirilmiş tıbbı ilerletmedeki çok yönlülüğünün ve alaka düzeyinin altını çizmektedir.

Bu çalışmada Akita diyabetik fare modelinin kullanılması, diyabetik koşullar altında kronik yara iyileşmesini araştırmak için değerli bir platform sağlar. Bu model, kalıcı hiperglisemi, gecikmiş anjiyogenez ve bozulmuş doku onarımı dahil olmak üzere insan diyabetik yaralarının temel patofizyolojik özelliklerini taklit eder^33,34. Ayrıca, harici kimyasal indüksiyona ihtiyaç duymadan genetik tutarlılık ve spontan diyabet başlangıcı avantajı sunar ve dolayısıyla deneysel sonuçlardaki değişkenliği azaltır³³. Bununla birlikte, bulguları insan kronik yaralarına çevirirken bu modelin sınırlamalarını kabul etmek önemlidir. Murin cilt mimarisi, özellikle daha ince epidermisi, daha gevşek dermal yapısı ve iyileşme sırasında yeniden epitelizasyondan ziyade yara kasılmasının baskın rolü ile insan derisinden farklıdır³⁵. Ek olarak, murin bağışıklık tepkileri ve inflamatuar profiller, insanlarda gözlenenleri tam olarak temsil etmemektedir, bu da bağışıklık modülasyon tedavilerinin yorumlanmasını etkileyebilir³⁶. Bu farklılıklara rağmen, Akita modeli, kronik yara patogenezinin merkezinde yer alan sistemik diyabetik komplikasyonları özetleme yeteneği nedeniyle klinik öncesi çalışmalar için yaygın olarak kabul edilen ve etkili bir araç olmaya devam etmektedir. Önerilen terapötik yaklaşımın translasyonel potansiyelini daha fazla doğrulamak için, Akita model bulgularını tamamlamak için gelecekteki çalışmalara ihtiyaç vardır. Ex vivo insan derisi modelleri veya diyabetik büyük hayvan modelleri gibi insanla ilgili ek sistemler oldukça destekleyici olacaktır.

Sonuç olarak, EV'lerin kontrollü salınımı ile önerilen iskele tasarımı, terapötik ajanların uygulanmasında önemli bir ilerlemeye işaret etmektedir. Teknik karmaşıklıklara rağmen, bu yenilikçi yaklaşım mevcut yöntemlere göre önemli avantajlar sunar ve kronik yara örtülerinin iyileştirilmesi için büyük bir potansiyele sahiptir.

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Happy Production'dan Said Al-Hashmi ve Abdulrahman Almharbi'ye çekimlerdeki mükemmel çalışmaları için özel teşekkürler. Ayrıca Yüksek Öğrenim, Araştırma ve Yenilik Bakanlığı'na ve Nizwa Üniversitesi'ne mali destekleri ve gerekli kaynakları sağladıkları için şükranlarımızı sunarız.