Onkogenden Kaynaklı Transkripsiyon-Replikasyon Çatışmalarını İncelemek için Yakınlık Ligasyon Testi

Burada, yakınlık ligasyon testi (PLA) kullanarak onkogen kaynaklı transkripsiyon-replikasyon çatışmalarını (TRC'ler) tespit etmek için hassas ve spesifik bir yöntem sunuyoruz. Bu yaklaşım, PCNA ve fosfo-CTD RNAPII'yi hedefleyen spesifik antikorlardan yararlanarak, RNA polimeraz II transkripsiyonu ve DNA replikasyon mekanizması arasındaki TRC prevalansının değerlendirilmesini sağlar.

Hem DNA replikasyonu hem de RNA transkripsiyonu, genomik DNA'yı şablon olarak kullanır ve bu süreçlerin uzamsal ve zamansal olarak ayrılmasını gerektirir. Transkripsiyon-replikasyon çatışmaları (TRC'ler) olarak adlandırılan replikasyon ve transkripsiyon mekanizması arasındaki çatışmalar, kanser gelişiminde kritik bir faktör olan genom stabilitesi için önemli bir risk oluşturmaktadır. Bu çarpışmaları düzenleyen çeşitli faktörler tanımlanmış olsa da, doğrudan görselleştirme ve net yorumlama için sınırlı araçlar nedeniyle birincil nedenleri belirlemek zor olmaya devam etmektedir. Bu çalışmada, PCNA'ya özgü antikorlardan ve RNA polimeraz II'nin fosforile CTD'sinden yararlanan bir yakınlık ligasyon testi (PLA) kullanarak TRC'leri doğrudan görselleştiriyoruz. Bu yaklaşım, RNA polimeraz II'nin aracılık ettiği replikasyon ve transkripsiyon süreçleri arasında TRC'lerin hassas ölçümüne izin verir. Yöntem, bu antikorlara kovalent olarak konjuge edilmiş DNA primerleri yoluyla daha da geliştirilir, floresan problar kullanılarak PCR amplifikasyonu ile birleştirilir ve endojen TRC'leri tespit etmek için oldukça hassas ve spesifik bir araç sağlar. Floresan mikroskobu, kanserle ilişkili genom kararsızlık mekanizmalarını incelemek için güçlü bir araç sunarak bu çatışmaların görselleştirilmesini sağlar. Bu teknik, doğrudan TRC görselleştirmesindeki boşluğu ele alarak, hücrelerde genom kararsızlığına neden olan altta yatan süreçlerin daha kapsamlı bir analizine ve anlaşılmasına olanak tanır.

Genom, replikasyon ve transkripsiyon dahil olmak üzere temel biyolojik süreçler için bir şablon görevi görür. Sağlıklı hücrelerde, RNA transkripsiyonu ve DNA replikasyon mekanizması tipik olarak işbirliği yapar ve uzamsal ve zamansal olarak ayrılır 1,2,3,4. Bununla birlikte, onkogen aşırı ekspresyonu gibi patolojik koşullar altında, bu uyumlu işbirliği bozulabilir.

Onkogenler genellikle yüksek transkripsiyon seviyelerine neden olur ve transkripsiyon ve replikasyon mekanizması arasındaki çarpışma olasılığını artırır⁵. Bazı onkogenler kromatin mimarisini değiştirerek transkripsiyon için daha erişilebilir hale getirir, ancak replikasyon çatalının ilerlemesini potansiyel olarak engeller⁵. Ek olarak, onkogen aktivasyonu, hücre döngüsünü^{hızlandırarak} replikasyon stresini indükleyebilir 6. RNA polimeraz II (RNAPII) aktivitesi, Rb'nin siklin bağımlı kinaz (CDK) fosforilasyonuna bağlı olarak G1/S faz geçişi sırasında önemli ölçüde artar, bu da siklinler, CDK'lar ve temizlik genleri⁷ dahil olmak üzere temel proteinlerin transkripsiyonunu destekleyen E2F transkripsiyon faktörlerini serbest bırakır. Histon gen ekspresyonu, DNA replikasyonu⁸ ile aynı zamana denk gelen S fazı sırasında zirve yapar. Ayrıca, bazı çok uzun genlerin tam uzunluktaki transkriptlerini kopyalamak, birden fazla hücre döngüsü⁹ gerektirir. S fazına her girişte, aynı genomik bölgelerdeki transkripsiyon ve replikasyon mekanizmasının eşzamanlı aktivitesi, zararlı karşılaşmalara neden olarak çatışmalara yol açabilir. Bu çatışmalar, tümör oluşumu ile yakından ilişkili olan genom kararsızlığının birincil içsel kaynağıdır. Replikasyon mekanizmasının, zararlı çatışmaları önlemek ve genomik stabiliteyi korumak için RNAPII transkripsiyonu ile nasıl koordine edildiği önemli bir soru olmaya devam etmektedir. Bu nedenle, RNAPII ile ilişkili transkripsiyon-replikasyon çatışmalarının (TRC'ler) doğrudan görselleştirilmesi, bu çatışmaları çözen moleküler mekanizmaları anlamak için gerekli hale gelmiştir ve sonunda bu çatışmaları terapötik amaçlar için kullanmanın temelini atabilir.

Transkripsiyon-replikasyon çatışmaları (TRC'ler) iki yönde ortaya çıkabilir: transkripsiyon ve replikasyonun birbirine doğru ilerlediği kafa kafaya ve aynı yönde hareket ettikleri eş yönlü. Kafa kafaya çarpışmalar, eş yönlü olanlardan çok daha yıkıcıdır 10,11,12,13. DNA-RNA hibritlerinin (R-döngüleri) oluşumu, TRC'lerin önemli bir itici gücü olarak tanımlanmıştır; bu nedenle, önemli miktarda araştırma, düzensiz replikasyon ve/veya transkripsiyona yanıt olarak R-döngülerinin ve bölgelerinin oluşumunu değerlendirerek TRC'lerin varlığını ortaya çıkarmıştır^10,11. Bununla birlikte, transkripsiyondan türetilen R-döngülerinin birikiminin, replikasyona orantılı bir engel teşkil edip etmediği ve TRC'lerle doğrudan ilişkili olup olmadığı çözülmemiş bir soru olarak kalmaktadır. Araştırmacılar ayrıca replikasyon çatalı dinamiklerini analiz ederek TRC'leri araştırdılar. Örneğin, raportör genlerin iki boyutlu jel elektroforezi, lokusa özgü replisome duraklamasını¹² ortaya çıkarabilirken, DNA lifi tahlilleri, araştırmacıların replikasyon çatal hızı, orijin yoğunluğu ve çatal asimetrisi^13'teki değişiklikleri incelemesine olanak tanır. Yeni nesil dizileme teknolojisinin ilerlemesi, Okazaki fragman dizilimi (Ok-seq)^14,15, başlangıç bölgesi dizilimi (ini-seq)^16,17, kısa yeni ortaya çıkan iplik dizilimi (SNS-seq)¹⁸, Repli-seq¹⁹ ve polimeraz kullanım dizilimi (Pu-seq)²⁰ gibi birçok yenilikçi yöntemin geliştirilmesine yol açmıştır. Bu teknikler, replikasyon ve transkripsiyonun koordinasyonunda yer alan temel faktörleri ortaya çıkararak, replikasyon orijini kullanımı, çatal yönlülüğü ve replikasyon sonlandırmanın genom çapında profillerini sağlamıştır. TRIPn-seq, fizyolojik ve patolojik koşullar altında DNA replikasyonu ve transkripsiyonunun dinamik organizasyonu hakkındaki anlayışımızı önemli ölçüde genişleterek, transkripsiyon ve replikasyon birlikteliğini doğrudan tespit edebilen birkaç yöntemden biridir²¹. Bu sıralama tabanlı yöntemlerin sağladığı değerli içgörülere rağmen, yüksek maliyetleri ve zaman yoğun yapıları, daha geniş uygulamalarını sınırlar. Bu nedenle, TRC'leri tek hücre düzeyinde görselleştirmek ve ölçmek için daha kesin, oldukça hassas, kullanışlı ve hızlı bir tespit yöntemi oluşturmak çok önemlidir.

Duolink PLA teknolojisi olarak da bilinen in situ yakınlık ligasyon testi (PLA), doku kesitlerinde veya hücre kültürlerinde hedef proteinlerin fiziksel yakınlığını değerlendirmek için güçlü bir yöntemdir. Bu teknik, yalnızca iki protein veya protein kompleksi birbirinden 40 nm uzakta olduğunda bir sinyal üretir. Hedef proteinlere karşı, her biri farklı bir türden (örneğin, fare / tavşan, tavşan / keçi veya fare / keçi) iki birincil antikor gerektirir. Numune bu birincil antikorlarla inkübe edildikten sonra, PLA probları (bir ARTI ve bir EKSİ) olarak bilinen ikincil antikorlar uygulanır. Primer antikorların sabit bölgelerine bağlanan düzenli sekonder antikorların aksine, PLA probları spesifik DNA primerlerine kovalent olarak bağlanır. Hedef proteinler yakın olduğunda (40 nm'den az), bir konektör oligonükleotidi her iki PLA probu ile hibritleşebilir ve bağlı oligonükleotidlerinin tam uzunlukta bir DNA molekülüne enzimatik ligasyonunu kolaylaştırabilir. Bu yeni oluşan DNA, tespit edilen protein etkileşimi için bir vekil belirteç görevi görür ve amplifikasyon için bir şablon görevi görür. Amplifiye edilmiş ürün daha sonra floresan etiketli oligonükleotid probları kullanılarak görselleştirilir. Proteinler birbirinden 40 nm'den fazla uzaktaysa, PLA probları bir DNA şablonu oluşturamaz ve bu da saptanabilir bir sinyale neden olmaz. PLA'nın şematik diyagramı Şekil 1'de gösterilmiştir. Yakınlık ve/veya etkileşim, floresan mikroskobu ile floresan noktalar olarak görselleştirilir ve bu noktaların sayısı ve yoğunluğu ölçülebilir. 2002 yılındaki icadından bu yana PLA, yüksek duyarlılığı ve özgüllüğü nedeniyle protein etkileşimlerini izlemek için popüler hale gelmiştir. Dizileme tabanlı tahlillerin aksine, PLA yalnızca küçük miktarlarda numune gerektirir ve bu da onu kıt numuneleri analiz etmek için uygun hale getirir.

Çalışmalar, onkojenik KRAS G12D mutasyonunun ekspresyonunun transkripsiyon-replikasyon çatışmalarına (TRC'ler) yol açtığını ^{göstermiştir22,23}. Örneğin, Meng ve ^ark.23 tarafından sunulan araştırmalar, insan pankreatik duktal epitel (HPNE) hücrelerinde KRAS G12D'nin ektopik ekspresyonunun TRC'leri ve TRC ile ilişkili R-döngülerini arttırdığını göstermektedir. Hücre hatlarındaki RNAPII transkripsiyon ve replikasyon makineleri arasındaki çarpışmaların tespit edilmesini sağlamak için, bu amaç için özel olarak geliştirilmiş bir protokol sunuyoruz. KRAS (G12D) plazmidi ve vektör kontrolü, insan akciğer epitel BEAS-2B hücrelerine transfekte edilir ve DNA hasarı (γH2AX) ile birlikte KRAS (G12D) ekspresyonu Western blot ile doğrulanır. R-loop birikimi, KRAS (G12D) eksprese eden hücrelerde replikasyon barikatlarının birikimini ve genom kararsızlığını gösteren S9.6 nokta leke analizi ile doğrulanır. Son olarak, hücreler PLA tahlili için slaytlara sabitlenir. Çarpışmaların lokalize tespiti için, hücreler önce RNAPII ve PCNA primer antikorları ile boyanır, ardından PLA probları ile konjuge edilmiş ikincil antikorlarla boyanır. Dairesel bir DNA molekülü, başarılı ligasyon yoluyla oluşur ve sonraki yuvarlanma çemberi amplifikasyonu (RCA) için bir şablon görevi görür. Slaytlar daha sonra uygun montaj ortamı ile monte edilir ve bir floresan mikroskobu altında görselleştirilir. Görüntüler ImageJ kullanılarak analiz edilebilir.

1. Lentivirüs üretimi ve hedef hücre hattına transdüksiyon

1. Lentivirus üretimi²⁴
   1. Yüksek glikozlu Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamında (DMEM; tam ortam) 10 cm'lik plaka başına 3 ×^{10 6} hücreli tohum paketleme hücreleri. Hücreleri nemlendirilmiş% 5 CO₂ inkübatörde 37 ° C'de 18-20 saat daha büyütün.
   2. İki adet 1.5 mL tüpte, sırasıyla 9.2 μg psPAX2, 2.8 μg pMD2.G içeren 500 μL Opti-MEM (indirgenmiş serum ortamı) içinde toplam 24 μg plazmit DNA'nın bir DNA karışımını hazırlayın.
      NOT: Endotoksinler transfeksiyon verimliliğini önemli ölçüde azalttığından, saflaştırma sırasında endotoksinin plazmitten uzaklaştırılması önerilir.
   3. 144 μL polietilenimi (PEI; 1 mg / mL) 1 mL indirgenmiş serum ortamında seyreltin, karıştırın ve oda sıcaklığında (RT) 5 dakika inkübe edin.
   4. Tüpü hafifçe hafifçe vururken seyreltilmiş DNA karışımına damla damla 500 μL seyreltilmiş PEI ekleyin. PEI / DNA karışımlarını RT'de 15 dakika inkübe edin.
   5. Kuluçka sırasında, ortamı önceden ekilmiş 10 cm'lik plakalardan nazikçe aspire edin. 10 mL taze tam DMEM ile değiştirin.
   6. İnkübasyondan sonra, DNA: PEI transfeksiyon karışımını 10 cm'lik plakalara yavaşça pipetleyin ve hücreleri ayırmamaya dikkat edin.
      NOT: PEI, yaygın olarak kullanılan bir transfeksiyon reaktifidir, ancak transfeksiyon verimliliğini ve sitotoksisiteyi dengelemek için konsantrasyonu dikkatli bir şekilde optimize edilmelidir. Lipofectamine 3000'in (transfeksiyon reaktifi) daha yüksek maliyetine rağmen, belirli hücre hatlarında PEI'ye kıyasla daha yüksek transfeksiyon verimliliği ve daha düşük sitotoksisite göstermiştir ve bu da viral üretimin iyileşmesine yol açmıştır. Elektroporasyon, nükleik asitleri hücrelere sokmak için elektrik darbeleri kullanan başka bir alternatiftir. Etkili olsa da, özel ekipman gerektirir ve daha emek yoğun olabilir.
   7. Hücreleri 18 saat büyütün, daha sonra transfeksiyon ortamını 25 μM klorokin içeren taze 10 mL DMEM Komple besiyeri ile dikkatlice değiştirin.
   8. 72 saatlik transfeksiyondan sonra, virüs partikülünü içeren kültür ortamını toplayın. Ambalaj 293T hücrelerini 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyerek çıkarın.
   9. Süpernatanı toplayın ve 0.45 μm polietersülfon (PES) filtreden süzün. Viral süpernatanı doğrudan kullanın.
      NOT: Viral süpernatant, titre kaybını önlemek için sıvı nitrojen içinde kesilmeli ve dondurulmalı ve -80 ° C'de tutulmalıdır.
2. Hedef hücrelerin Lentiviral Enfeksiyonu
   1. Tohum 2 × 10⁶ hedef hücre BEAS-2B'yi iki adet 6 cm'lik plakada ve gece boyunca 37 ° C'de,% 5 CO₂ olarak büyür. Transdüksiyon üzerine, BEAS-2B hücrelerinin yaklaşık% 70 oranında birleştiğinden emin olun.
   2. Eski ortamı dikkatlice çıkarın ve uygun 0.5 mL KRAS veya vektör lentiviral partikülleri 3 mL taze tam RPMI-1640 ortamı ile birlikte sırasıyla iki plakaya ekleyin.
   3. Hücreleri 37 ° C'de 18-20 saat% 5 CO₂ inkübatörde büyütün. Lentiviral partiküller içeren eski ortamı 3.5 mL taze önceden ısıtılmış tam kültür ortamı ile değiştirin. 72 saatlik transdüksiyondan sonra, bir sonraki tahlil için hücreleri toplayın.
      NOT: Virüsle gece boyunca inkübasyon toksisiteye neden oluyorsa, inkübasyon süresi 4 saate kadar kısaltılabilir. Transdüksiyon verimliliği ve hücresel sağlık dengesini sağlamak için aşağıdaki stratejilerin dikkate alınması gerekir: (1) Enfeksiyon çeşitliliğini optimize edin; (2) Yüksek kaliteli viral preparatlar kullanın; (3) Verimliliği artırmak, daha düşük viral titrelerin kullanılmasına izin vermek ve potansiyel toksisiteyi azaltmak için polikatyonları (polibren gibi) kullanın; (4) Uzun süreli çalışmalar için, transgen ekspresyonunu geçici olarak kontrol etmek, hücreler üzerindeki yükü azaltmak ve potansiyel toksisiteyi en aza indirmek için indüklenebilir ekspresyon sistemleri kullanmayı düşünün.

2. KRAS (G12D) kaynaklı DNA hasarının ve R-loop oluşumunun doğrulanması

1. WB testi ile gen ekspresyonunu ve DNA hasarını doğrulayın
   1. Kültür ortamını plakalardan aspire edin.
   2. Kalan ortamı veya kalıntıları temizlemek için hücreleri 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile nazikçe yıkayın.
   3. Kazıma işlemi sırasında hücreleri nemli tutmak için küçük bir hacimde 1x PBS ekleyin.
   4. Bir hücre kazıyıcı kullanın, belirli bir açıyla tutun ve hücreleri yüzeyden tutarlı bir yönde nazikçe kazıyın.
      NOT: Hücrelere zarar verebilecek çok fazla basınç uygulamamaya dikkat edin.
   5. Plakayı eğin ve hücre süspansiyonunu bir tüpe toplamak için bir pipet kullanın ve hücreleri 5 dakika boyunca 500 x g'da döndürün. Süpernatanı atın.
   6. 2x RIPA tamponunu seyrelterek 1x RIPA tamponunu hazırlayın (bkz. Tablo 1) ve kullanmadan hemen önce proteaz inhibitörü kokteylini ve fosfataz inhibitörü kokteylini ekleyin.
   7. Hücre peletini önceden soğutulmuş RIPA tamponu (1x) ile parçalayın ve buz üzerinde 30 dakika inkübe edin. 10 dakika boyunca 15.000 x g'da santrifüj ederek kalıntıları temizleyin. Süpernatanı toplayın ve Bradford testini kullanarak protein konsantrasyonunu ölçün.
   8. Süpernatanıma 4 x sodyum dodesil sülfat (SDS) numune yükleme tamponu ekleyin ve proteinleri 95 ° C'de 5 dakika boyunca denatüre edin. İlk olarak, %12,5 SDS-poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) jeli içinde her numuneden 40 μg proteini ayırın ve ardından 0,2 μm nitroselüloz membranlara aktarın (bkz.
   9. Transferi bitirdikten sonra, membranları Bloke Edici Tampon ile bloke edin (% 0.1 Tween 20 [TBST; Tablo 1]) 1 saat boyunca.
   10. Membranı TBST ile kısaca durulayın ve ardından membranı FLAG etiketine (PBST'de 1: 2500 seyreltme) ve γH2AX'e (PBST'de 1:1000 seyreltme) karşı birincil antikorlarla inkübe edin (bkz. Malzeme Tablosu) gece boyunca 4 ° C'de.
   11. Birincil antikorları çıkarın ve zarı her seferinde 10 dakika boyunca 3 kez TBST ile yıkayın.
   12. Membranları seyreltilmiş yaban turpu peroksidaz (HRP) ile konjuge ikincil antikorlara (% 5 yağsız süt içeren TBST tamponunda 1: 5.000) oda sıcaklığında (RT) 1 saat daldırın.
   13. Membranı TBST ile her seferinde 10 dakika olmak üzere 3 kez yıkayın.
   14. Gelişmiş kemilüminesans (ECL) reaktifleri aracılığıyla protein seviyelerini görselleştirin (bkz. Malzeme Tablosu).
2. Nokta lekesi ile R-döngüsünün algılanması²⁵​
   1. Kültür ortamını plakalardan aspire edin.
   2. Kalan ortamı veya kalıntıları temizlemek için hücreleri 1x PBS ile nazikçe yıkayın.
   3. Kazıma işlemi sırasında hücreleri nemli tutmak için küçük bir hacimde 1x PBS ekleyin.
   4. Bir hücre kazıyıcı kullanın, belirli bir açıyla tutun ve hücreleri yüzeyden tutarlı bir yönde nazikçe kazıyın.
      NOT: Hücrelere zarar verebilecek çok fazla basınç uygulamamaya dikkat edin.
   5. Plakayı eğin ve hücre süspansiyonunu bir tüpe toplamak için bir pipet kullanın ve hücreleri 5 dakika boyunca 500 x g'da döndürün. Süpernatanı atın.
   6. 300 μL buz gibi soğuk Hücre Lizis Tamponu ile 2 ×^{10 6} hücreli Lyse (bakınız Tablo 1). Buz üzerinde 10 dakika inkübe edin. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de döndürün ve süpernatanı atın. Pelet çekirdek içerir.
   7. Her peleti 300 μL önceden soğutulmuş Nükleer Lizis Tamponu ile yeniden süspanse etmek için geniş delikli bir uç kullanın (bkz. Tablo 1).
   8. Her numuneye 3 μL 20 mg/mL proteinaz K ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve 55 °C'de 3-5 saat sindirin.
   9. Her tüpe 100 μL Elüsyon Tamponu ( Tablo 1'e bakınız) ekleyin ve iyice karıştırın.
   10. Her tüpe 400 μL fenol: kloroform: izoamil alkol (25: 24: 1 pH 8.0) ekleyin. Güçlü girdaptan sonra, DNA'yı diğer hücre içeriğinden ayırmak için 12.000 x g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin.
   11. Üst sulu fazı dikkatlice yeni tüplere aktarın.
   12. Numuneye 1/10 hacim 3 M sodyum asetat (pH 5.2) ve 2.5 hacim önceden soğutulmuş %100 etanol ekleyerek DNA'yı çökeltin. İyice karıştırın ve 4 saat veya gece boyunca -20 °C'de inkübe edin.
       NOT: Numuneye glikojen ilavesi (Bkz. Malzeme Tablosu) etanol çökelmesinden DNA geri kazanımını artırabilir. Nihai glikojen konsantrasyonu yaklaşık 0.05-1 μg/μL'dir.
   13. DNA'yı 12.000 x g'da 4 ° C'de 30 dakika santrifüjleyerek peletleyin. Peleti bozmadan süpernatanı atın.
   14. Peleti 1 mL buz gibi %70 etanol ile durulayın ve 4 °C'de 12.000 x g'da 5-15 dakika tekrar santrifüjleyin.
   15. DNA peletini rahatsız etmemek için süpernatanı dikkatlice atın.
   16. DNA peletini 5-10 dakika havayla kurutun.
   17. 50 μL önceden ısıtılmış TE tamponu (pH8.0) ekleyerek DNA peletini çözün ve 37 °C'de 30 dakika inkübe edin. Her numunenin DNA konsantrasyonunu ölçün.
   18. TE tamponunda (5 ng / μL ila 200 ng / μL) istenen konsantrasyonlara DNA seyreltmelerini hazırlayın. Her numunenin 20 μL'sini bir nokta leke aparatı ile pozitif yüklü bir naylon membran üzerine eşit şekilde yerleştirin.
       NOT: Bir nokta leke tahlili kullanarak R-döngülerini tespit etmek için, nokta başına yaklaşık 500 ng genomik DNA uygulanması önerilir. Bu miktarın, bu yapılara spesifik olarak bağlanan S9.6 monoklonal antikoru kullanıldığında RNA-DNA hibritlerini tespit etmek için yeterli hassasiyet sağladığı gösterilmiştir.
   19. UV çapraz bağlayıcı "Otomatik Çapraz Bağlama" ayarı (1.200 μJ x 100) (bkz. Malzeme Tablosu) aracılığıyla DNA'yı naylon zara çapraz bağlayarak (Malzeme Tablosuna bakınız) DNA'yı hareketsiz hale getirin.
   20. Membranları oda sıcaklığında 1 saat boyunca Bloke Edici Tampona (bkz. Tablo 1) daldırın. Daha sonra membranları TBST ile kısaca durulayın.
   21. Gece boyunca membranı birincil antikor ile 4 ° C'de inkübe edin ( Malzeme Tablosuna Bakınız). S9.6'nın seyreltilmesi, %5 BSA içeren TBST'de 1: 1.000'dir.
   22. Birincil antikoru çıkarın ve TBST ile 3 kez ve her seferinde 10 dakika boyunca yıkayın.
   23. Membranı, oda sıcaklığında 1 saat boyunca TBST'de% 5 BSA'da HRP konjuge ikincil antikor ile inkübe edin.
   24. İkincil antikoru çıkarın ve TBST ile 3 kez ve her seferinde 10 dakika boyunca yıkayın.
   25. ECL (Gelişmiş Kemilüminesans) reaktifleri aracılığıyla R-döngü seviyelerini görselleştirin, Malzeme Tablosuna Bakın).

3. PLA testi

1. Hücre hazırlığı
   NOT: KRAS G12D onkogeni ile hücrelerin transdüksiyonu, pozitif bir PLA sinyali ile kanıtlandığı gibi TRC'lerde bir artışa yol açar. Bu yöntem, antibiyotik seçimine gerek kalmadan onkogen kaynaklı TRC'leri arka plan seviyelerinden etkili bir şekilde ayırt eder. Bununla birlikte, transdüksiyon sonrası antibiyotik seçiminin uygulanması, başarılı bir şekilde transdüksiyon yapılan hücrelerin popülasyonunu zenginleştirerek genel sinyali artırabilir, böylece testin duyarlılığını ve özgüllüğünü iyileştirebilir.
   1. 12 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 12 mm çapında kapak camları yerleştirin.
   2. Lentivirüs ile enfekte olmuş hücreleri enfeksiyondan 24 saat sonra bu kuyucuklara tohumlayın ve hücreleri% 5 CO₂ ile 37 ° C'de 500 μL tam RPMI-1640 ortamında kapak camlarında tutun.
   3. Optimal) Deneysel tasarım, başarılı bir şekilde transdüksiyon yapılan hücreleri zenginleştirmek için antibiyotik seçimini içeriyorsa, bu aşamada kültür ortamına uygun antibiyotiği ekleyin.
   4. Enfeksiyondan 48-72 saat sonra yaklaşık% 60 birleşmeye ulaştıklarından emin olmak için hücreleri izleyin.
   5. RPMI-1640'ı dikkatlice çıkarın ve hücreleri buz üzerinde 4 dakika boyunca soğuk% 0.5 NP-40 ile önceden çıkarın.
   6. Hücreleri RT'de 15 dakika boyunca sabitlemek için doğrudan 500 μL Fiksasyon Tamponu ( Tablo 1'e bakınız) ekleyin.
      NOT: Sabitleme adımından önce hücrelerin yıkanmaması tavsiye edilir, çünkü bu, özellikle hücre hattı ayrılmaya duyarlıysa, büyüdükleri yüzeyden ayrılmalarına neden olabilir; Bu nedenle, fiksatif çözeltinin doğrudan eklenmesi sıklıkla tercih edilir.
   7. Fiksasyon tamponunu çıkararak ve hücreleri 1x PBS ile 3 kez dikkatlice yıkayarak reaksiyonu durdurun.
   8. PBS'yi aspire edin ve hücrelere 500 μL önceden soğutulmuş %100 metanol ekleyin.
   9. -20 °C'de 15-30 dakika inkübe ederek hücreleri geçirgen hale getirir.
   10. RT'de 1 saat boyunca Duolink blok çözeltisi ile hücreleri bloke edin.
2. Antikor boyama
   1. Duolink antikor seyreltme tamponunda fare anti-RNAPII 8WG16 (1:500) ve tavşan anti-PCNA(D3H8P) (1:500) seyreltin. Hücreleri, birincil antikor karışımı ile gece boyunca 4 ° C'de bir nem odasında inkübe edin.
      NOT: PLA protokolünü, diğerini atlayarak birincil antikorlardan yalnızca birini (anti-RNAPII veya anti-PCNA) kullanarak gerçekleştirin. Bu, bireysel antikorların veya PLA problarının spesifik olmayan etkileşimlerinden kaynaklanan herhangi bir arka plan sinyalinin tanımlanmasına yardımcı olur.
   2. Hücrelere dokunmadan tüy bırakmayan bir atık kağıt tabakası kullanarak birincil antikorları slaytlardan nazikçe çıkarın. Daha sonra hücreleri 1x PBS ile 3 kez yıkayın.
   3. PLA problarını (veya ikincil antikor) aşağıdaki prosedüre göre hazırlayın (bakınız Tablo 2), ardından karıştırın ve oda sıcaklığında 20 dakika bekletin.
   4. İkincil antikor karışımını slaytlara ekleyin ve RT'de 2 saat boyunca bir nem odasında inkübe edin.
3. Ligasyon ve amplifikasyon
   1. İkincil antikor karışımını atın ve slaytları 5 dakika boyunca her biri 1x Tampon A ile iki kez yıkayın.
   2. Ligasyon karışımını aşağıdaki prosedüre göre hazırlayın (bkz. Tablo 2).
   3. Her bir kapak slaytına 15 μL ligasyon karışımı uygulayın ve 37 ° C'de 30 dakika boyunca bir nem odasında inkübe edin.
   4. Slaytları 1x Tampon A ile her biri 2 dakika boyunca iki kez yıkayın.
   5. Amplifikasyon Karışımını aşağıdaki prosedüre göre hazırlayın (bkz. Tablo 2).
   6. Her slayta 15 μL Amplifikasyon Karışımı uygulayın ve bir nem odasında 37 ° C'de 100 dakika inkübe edin. Amplifikasyonu atın: Her biri 1 dakika boyunca 1x Tampon B ile karıştırın ve iki kez yıkayın.
   7. Slaytları 0.01x tampon B ile 1 dakika boyunca bir kez yıkayın.
   8. Tampon B'yi aspire edin ve kızakları DAPI ile Duolink In Situ montaj ortamına monte edin.
4. Görüntü analizi ve eşik belirleme:
   1. ImageJ ile PLA odaklarının sayısını ölçün. Otomatik görüntü analiz yazılımı, PLA sinyallerinin objektif olarak ölçülmesine yardımcı olabilir. Eşik olarak çekirdek başına 3 veya daha fazla PLA odağı eşiği seçin, çünkü kontrol hücrelerinin% 1'inden daha azı bozulmamış koşullar altında 3 PLA odağı elde eder.
      NOT: Eşik, değişkenliği hesaba katmak için birden fazla numune ve kontrol analiz edilerek deneysel olarak belirlendiğinden, karşılaştırılabilirliği sağlamak için tüm numunelerde tutarlı görüntüleme ayarlarının (örn. maruz kalma süresi, kazanç) korunması gerekir.

γH2AX, DNA hasarı için bir biyobelirteç görevi görür. KRAS'ın (G12D) aşırı ekspresyonu, Western blot analizinde artmış γH2AX sinyali ile kanıtlandığı gibi, bu hücrelerde genomik stabiliteyi bozar (Şekil 2A). Ek olarak, vektör kontrollerine kıyasla KRAS (G12D) eksprese eden hücrelerde yoğunlaştırılmış S9.6 nokta lekesi sinyali (Şekil 2B), onkojenik KRAS ekspresyonunun DNA kırılması oluşumuna katkıda bulunabilecek anormal R-döngülerinin birikimine yol açtığını gösterir.

Şekil 3, yakınlık ligasyon testinden (PLA) temsili görüntüleri sunar. Bu görüntülerde, çekirdeklerin içindeki parlak yeşil noktalar, PCNA ile ilişkili replikasyon kompleksi ile RNAPII transkripsiyon kompleksi arasındaki mesafenin 40 nm'den az olduğunu göstermektedir. Vektör kontrol hücrelerinde yeşil noktalar nadiren tespit edilirken, KRAS (G12D) eksprese eden hücrelerde çekirdek başına birden fazla yeşil nokta gözlenir. Bu, onkojenik KRAS ekspresyonunun RNAPII ve replikasyon kompleksleri arasındaki karşılaşma sıklığını artırdığını göstermektedir. Bu PLA sonuçları, Western blot (Şekil 2A) ve nokta blot testlerinden (Şekil 2B) elde edilen bulgularla uyumludur.

Özetle, bu bulgular, yakınlık ligasyon testinin, RNAPII ve replikasyon mekanizması arasındaki onkogenin neden olduğu çatışmaları etkili bir şekilde tespit ettiğini göstermektedir. Bu yetenek, anormal onkogen ekspresyonundan kaynaklanan çeşitli numune türlerinde TRC'lerin miktar tayinini sağlayarak gelecekteki uygulamalar için önemli bir potansiyele sahiptir. Bazı sınırlamalar mevcut olsa da, bu yöntemin beklentileri, özellikle farklı örneklere göre uyarlanmış deney koşullarında yapılan ayarlamalarla umut vericidir.

Şekil 1: Yerinde yakınlık ligasyon testinin şematik gösterimi. (1) İlginçin eşleştirilmiş etkileşim ortaklarını belirleyin. (2) Numuneyi, istenen proteinleri hedefleyen eşleştirilmiş birincil antikorlarla inkübe edin, ardından oligonükleotid probları ile konjuge edilmiş ikincil antikorlar izleyin. (3) Her bir PLA probuna bağlı oligoları tamamlayan konektör oligoları tanıtılır. Hedef proteinler yeterince yakınsa, PLA problarına bağlı oligonükleotid dizileri yakın olacaktır. (4) Hedef proteinler yakınsa (tipik olarak <40 nm), PLA probları üzerindeki oligonükleotidler temas eder ve dairesel bir DNA molekülü oluşturmak için bir DNA ligaz tarafından bağlanabilir. (5) Dairesel DNA'yı amplifiye etmek için bir polimeraz kullanarak RCA gerçekleştirin ve uzun, tekrarlayan bir DNA zinciri oluşturun. Floresan etiketli oligonükleotidleri, amplifiye edilmiş DNA ürününe hibritleştirerek görselleştirmeye izin verir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: KRAS (G12D) ekspresyon hücrelerinde DNA hasarı ve R-loop birikimi. (A) BEAS-2B hücrelerinden tam hücre lizatlarının temsili Western blot analizi, 72 saat KRAS G12D ekspresyonundan sonra γH2AX seviyelerinde bir artışı göstermektedir. γH2AX lekesi, DNA hasarını değerlendirmek için kullanıldı ve ACTB yükleme kontrolü olarak görev yaptı. FLAG lekesi, KRAS G12D'nin ifadesini doğruladı. (B) KRAS G12D ekspresyonu olan ve olmayan koşulların karşılaştırılması, BEAS-2B hücrelerinde R-döngü oluşumunun temsili nokta lekesi analizi. S9.6 antikoru, R-döngülerini tespit etmek için kullanılırken, toplam DNA'yı ölçmek için bir anti-DNA antikoru kullanıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: KRAS (G12D) ekspresyon hücrelerinde TRC birikimi. PLA tahlilinden temsili görüntüler. KRAS G12D eksprese eden hücrelerdeki parlak yeşil odaklar, PCNA ve RNA Polimeraz II (RNAPII) arasındaki çarpışmaları gösterir. İmmünositokimya PLA, KRAS G12D eksprese eden hücrelerde vektör hücrelere kıyasla yüksek TRC'ler gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Tampon hazırlama. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 2: PLA reaksiyon hazırlığı. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 3: PLA testi için sorun giderme. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

RNAPII transkripsiyon makinesi, DNA replikasyon çatalının^{ilerlemesine 26,27} engel oluşturarak, özellikle kanser hücrelerinde^28,29 TRC'leri ve DNA hasarını teşvik edebilir. TRC'leri düzenleyen proteinlerin deşifre edilmesi ve ayrıntılı mekanizmaların anlaşılması, bu zararlı olayların nasıl meydana geldiğini anlamamıza yardımcı olabilir ve gelecekte yeni terapötik yaklaşımların geliştirilmesine rehberlik edebilir. Bu nedenle, TRC'leri tam olarak anlamak için, TRC tespiti için hızlı ve güvenilir yöntemler gereklidir.

Burada, yerinde bir PLA testi kullanarak transkripsiyon-replikasyon çatışmalarının (TRC'ler) insidansını incelemek için bir prosedür açıklıyoruz. Bu yaklaşım, hücreler içinde onkojenik sinyalleme varlığında TRC frekansının kolay bir şekilde tahmin edilmesini sağlar. Pahalı ekipman veya büyük miktarda başlangıç malzemesi gerektirmez. Protokolümüz ayrıca KRAS (G12D) ekspresyonundan türetilen TRC sinyalinin özgüllüğünü doğrulamak için S9.6 nokta lekesi ve Western lekesi içerir.

Bu test, birlikte lokalize yuvarlanma çemberi amplifikasyon reaksiyonları için şablon görevi gören DNA daireleri üreten antikor-oligonükleotid konjugatları (PLA probları) çiftleri tarafından replikasyon ve RNAPII transkripsiyon komplekslerinin tanınmasına dayanır. Hedef proteinlerin ikili tanınması gerekliliği, antikor çiftleri tarafından paylaşılmayan herhangi bir çapraz reaktiviteyi ortadan kaldırarak, kesin ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlayarak seçiciliği artırır. Bu nedenle, antikorların özgüllüğü ve güçlü afinitesi, PLA testinin başarısı için esastır. (i) hücre fiksasyonu ve geçirgenleştirme koşullarını, (ii) bloke edici çözeltiyi ve (iii) birincil antikor seyreltmesini içeren numune içindeki antikor performansı koşullarını optimize etmek kritik öneme sahiptir. Uygun negatif kontroller çok önemlidir, çünkü (i) knockdown kontrolleri primer antikorların özgüllüğünü doğrulayabilir ve (ii) izotip IgG'li kontroller PLA problarının özgüllüğünü test edebilir.

PLA testi ile ilgili yaygın sorunların çoğu tanımlanmıştır. Bunlar, beklenen sinyalin yokluğunu ve spesifik olmayan bir arka plan sinyalinin varlığını içerir. Bu sorunların olası nedenlerinin ve çözümlerinin bir özeti Tablo 3'te verilmiştir.

Özellikle, bu yöntem yalnızca PCNA ve RNA polimeraz II arasındaki fiziksel yakınlığı doğrulayabilir; bununla birlikte, bu yakınlık mutlaka zararlı DNA kırılmalarının meydana geldiği anlamına gelmez. Diğer bir önemli sınırlama, bu yöntemin, bu iki kompleksin etkileşime girdiği spesifik kromatin lokusları hakkında bilgi sağlayamamasıdır. Transkripsiyonla ilişkili DNA kırılmalarını tam olarak anlamak daha karmaşık analizler gerektirir. Yeni nesil dizileme teknolojisinden yararlanan TRIPn-seq'in geliştirilmesi, çoğalan herhangi bir hücreye^{uygulanabilen}, transkripsiyon ve replikasyon birlikte doluluğunu kesin olarak belirleyebilen birkaç yöntemden biridir ^21,29. Bununla birlikte, bu yöntemin bilgilendirici olmasına rağmen, yüksek maliyeti ve zaman yoğun doğası erişilebilirliğini sınırlamaktadır.

Özetle, çalışmalarımız in situ PLA'nın hem kantitatif hem de uzamsal çözünürlükle sabit hücrelerde replikasyon ve RNAPII transkripsiyon mekanizmasının yakınlığını belirlemek için etkili bir yaklaşım olduğunu göstermektedir. PCNA ve RNAPII (8WG16) antikorlarının spesifik kullanımının, BEAS-2B hücrelerinde TRC'leri incelemek için etkili olduğu kanıtlanmıştır. RNAPII transkripsiyonu ile ilişkili TRC'lere ek olarak, in situ PLA testi, uygun kontroller ve ayarlamaların uygulanması koşuluyla, klinik ve araştırma ortamlarında RNAPI ve RNAPIII ile ilişkili TRC'leri araştırmak için de kullanılabilir.

Yakın zamanda yayınlanan bir çalışma³⁰ , ekstrakromozomal DNA (ecDNA) ile karakterize edilen kanserler için yeni bir terapötik strateji ortaya koymuştur. Araştırmacılar, ecDNA pozitif kanser hücrelerindeki güvenlik açıklarından yararlanmak için transkripsiyon-replikasyon çatışmalarını (TRC'ler) artırdılar ve normal hücreleri korurken seçici olarak onları hedef aldılar. PLA yöntemini kullanarak TRC durumunu değerlendirmek, bir hastanın kanser hücrelerinin genomik stabilitesi hakkında değerli bilgiler sağlayabilir. Tedavi sırasında TRC durumunun izlenmesi, TRC'leri hedef alan tedavilerin etkinliğinin değerlendirilmesine yardımcı olabilir. Bu nedenle, PLA tabanlı TRC değerlendirmesini kişiselleştirilmiş tıp yaklaşımlarına entegre etmek, bireysel tümörler içindeki moleküler dinamiklerin daha derin bir şekilde anlaşılmasını sağlayarak kanser teşhisi, prognostiği ve tedavi izlemesini iyileştirmek için umut vaat etmektedir.

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Bu çalışma, Güney Çin Üniversitesi'nin başlangıç fonu tarafından desteklendi.