用于研究癌基因衍生的转录-复制冲突的邻位连接测定

在这里，我们提出了一种灵敏且特异的方法，使用邻位连接测定 （PLA） 检测癌基因诱导的转录复制冲突 （TRC）。这种方法利用靶向 PCNA 和磷酸化 CTD RNAPII 的特异性抗体，能够评估 RNA 聚合酶 II 转录和 DNA 复制机制之间的 TRC 患病率。

DNA 复制和 RNA 转录都使用基因组 DNA 作为模板，因此需要对这些过程进行空间和时间分离。复制和转录机制之间的冲突，称为转录-复制冲突 （TRC），对基因组稳定性构成相当大的风险，而基因组稳定性是癌症发展的关键因素。虽然已经确定了几个调节这些碰撞的因素，但由于直接可视化和清晰解释的工具有限，确定主要原因仍然很困难。在这项研究中，我们使用邻位连接测定 （PLA） 直接可视化 TRC，利用对 PCNA 具有特异性的抗体和 RNA 聚合酶 II 的磷酸化 CTD。这种方法允许精确测量由 RNA 聚合酶 II 介导的复制和转录过程之间的 TRC。通过与这些抗体共价偶联的 DNA 引物，结合使用荧光探针的 PCR 扩增，该方法进一步增强，提供了一种检测内源性 TRC 的高灵敏度和特异性方法。荧光显微镜能够可视化这些冲突，为研究与癌症相关的基因组不稳定机制提供了强大的工具。该技术解决了直接 TRC 可视化的差距，可以更全面地分析和理解导致细胞基因组不稳定性的潜在过程。

基因组是基本生物过程的模板，包括复制和转录。在健康细胞中，RNA 转录和 DNA 复制机制通常合作，并在空间和时间上分离 1,2,3,4。然而，在病理条件下，例如癌基因过表达，这种和谐的合作可能会被破坏。

癌基因通常会驱动转录水平升高，从而增加转录和复制机制之间发生冲突的可能性⁵。一些癌基因会改变染色质结构，使其更容易进行转录，但可能会阻碍复制分叉进程⁵。此外，癌基因激活可以通过加速细胞周期来诱导复制应激⁶。由于 Rb 的细胞周期蛋白依赖性激酶 （CDK） 磷酸化，RNA 聚合酶 II （RNAPII） 活性在 G1/S 相变期间显著升高，Rb 磷酸化释放 E2F 转录因子，促进必需蛋白质（包括细胞周期蛋白、CDK 和管家基因）的转录⁷。组蛋白基因表达在 S 期达到峰值，与 DNA 复制一致⁸。此外，转录一些非常长的基因的全长转录本需要不止一个细胞周期⁹。每次进入 S 期时，转录和复制机制在同一基因组区域同时活动可能会导致有害的相遇，从而导致冲突。这些冲突是基因组不稳定性的主要内在来源，这与肿瘤发生密切相关。复制机制如何与 RNAPII 转录协调以防止有害冲突并保持基因组稳定性仍然是一个重要问题。因此，RNAPII 相关转录复制冲突 （TRC） 的直接可视化对于理解解决这些冲突的分子机制至关重要，并可能最终为利用这些冲突进行治疗奠定基础。

转录-复制冲突 （TRC） 可以以两个方向出现:正面冲突（转录和复制相互推进）和同向冲突（它们朝同一方向移动）。正面碰撞比同向碰撞更具破坏性 10,11,12,13。DNA-RNA 杂交体 （R 环） 的形成已被确定为 TRC 的主要驱动因素;因此，大量研究通过评估 R 环及其区域响应失调复制和/或转录的发生来推断 TRC 的存在^10,11。然而，转录衍生的 R 环的积累是否会成为复制的成比例障碍并与 TRC 直接相关仍然是一个未解决的问题。研究人员还通过分析复制叉动力学来研究 TRC。例如，报告基因的二维凝胶电泳可以揭示位点特异性复制体停顿¹²，而 DNA 纤维测定允许研究人员检查复制叉速度、起始密度和叉不对称性的改变¹³。新一代测序技术的进步催生了多种创新方法，例如冈崎片段测序 （Ok-seq）^14,15、起始位点测序 （ini-seq）^16,17、短新生链测序 （SNS-seq）¹⁸、Repli-seq¹⁹ 和聚合酶使用测序 （Pu-seq）²⁰.这些技术提供了复制起点使用、分叉方向性和复制终止的全基因组概况，揭示了复制和转录协调中涉及的关键因素。TRIPn-seq 是为数不多的能够直接检测转录和复制共占据的方法之一，显着扩展了我们对生理和病理条件下 DNA 复制和转录动态组织的理解²¹。尽管这些基于测序的方法提供了有价值的见解，但它们的高成本和时间密集型性质限制了它们更广泛的应用。因此，建立一种更明确、高灵敏度、方便和快速的检测方法以在单细胞水平上可视化和定量 TRC 至关重要。

原位邻位连接测定 （PLA），也称为 Duolink PLA 技术，是一种用于评估组织切片或细胞培养物中靶蛋白物理接近度的强大方法。该技术仅在两种蛋白质或蛋白质复合物彼此相距 40 nm 以内时产生信号。它需要两种针对靶蛋白的一抗，每种抗体来自不同的物种（例如，小鼠/兔、兔/山羊或小鼠/山羊）。将样品与这些一抗孵育后，使用称为 PLA 探针的二抗（一个 PLUS 和一个 MINUS）。与一抗恒定区结合的常规二抗不同，PLA 探针与特异性 DNA 引物共价连接。当靶蛋白非常接近（小于 40 nm）时，连接寡核苷酸可以与两种 PLA 探针杂交，促进它们连接的寡核苷酸酶促连接成全长 DNA 分子。这种新形成的 DNA 用作检测到的蛋白质相互作用的替代标记物，并作为扩增的模板。然后使用荧光标记的寡核苷酸探针对扩增的产物进行可视化。如果蛋白质相距超过 40 nm，PLA 探针无法形成 DNA 模板，因此无法检测到信号。PLA 的示意图如图 1 所示。通过荧光显微镜将接近和/或相互作用可视化为荧光点，并且可以量化这些点的数量和强度。自 2002 年发明以来，PLA 因其高灵敏度和特异性而成为监测蛋白质相互作用的流行趋势。与基于测序的检测不同，PLA 只需要少量样品，因此有利于分析稀缺样品。

研究表明，致癌 KRAS G12D 突变的表达会导致转录-复制冲突 （TRC）^22,23。例如，Meng 等人²³ 提出的研究表明，KRAS G12D 在人胰管上皮 （HPNE） 细胞中的异位表达增强了 TRC 和 TRC 相关 R 环。为了能够检测细胞系中 RNAPII 转录和复制机制之间的碰撞，我们提供了专门为此目的开发的方案。将 KRAS （G12D） 质粒和载体对照转染到人肺上皮 BEAS-2B 细胞中，并通过 Western blot 验证 KRAS （G12D） 表达以及 DNA 损伤 （γH2AX）。R 环积累通过 S9.6 斑点印迹分析证实，这共同表明表达 KRAS （G12D） 的细胞中存在复制障碍和基因组不稳定性的积累。最后，将细胞固定在载玻片上进行 PLA 测定。为了局部检测碰撞，首先用 RNAPII 和 PCNA 一抗对细胞进行染色，然后用与 PLA 探针偶联的二抗进行染色。通过成功连接形成环状 DNA 分子，作为后续滚环扩增 （RCA） 的模板。然后用适当的封固剂封片，并在荧光显微镜下观察玻片。可以使用 ImageJ 分析图像。

1. 慢病毒生产和转导到靶细胞系

1. 慢病毒生产²⁴
   1. 在高葡萄糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM;完全培养基）中，以 3 × 10 个⁶ 个细胞/10 cm 板接种 293T 包装细胞。在 37 °C 下在加湿的 5% CO₂ 培养箱中再培养细胞 18-20 小时。
   2. 在两个 1.5 mL 试管中，在 500 μL Opti-MEM（减血清培养基）中制备总共 24 μg 质粒 DNA 的 DNA 混合物，其中分别含有 9.2 μg psPAX2、2.8 μg pMD2.G 以及 12 μg pLVX-KRAS 质粒或空载体。
      注:由于内毒素会显著降低转染效率，因此建议在纯化过程中去除质粒中的内毒素。
   3. 在 1 mL 还原血清培养基中稀释 144 μL 聚乙烯亚胺 （PEI;1 mg/mL），混合，并在室温 （RT） 下孵育 5 分钟。
   4. 将 500 μL 稀释的 PEI 滴加到稀释的 DNA 混合物中，同时轻轻弹动试管。在 RT 下将 PEI/DNA 混合物孵育 15 分钟。
   5. 在孵育过程中，从先前接种的 10 cm 板中轻轻吸出培养基。更换为 10 mL 新鲜的完整 DMEM。
   6. 孵育后，将 DNA:PEI 转染混合物缓慢移液到 10 cm 板上，确保不要分离细胞。
      注:PEI 是一种常用的转染试剂，但必须仔细优化其浓度，以平衡转染效率和细胞毒性。尽管 Lipofectamine 3000（转染试剂）的成本较高，但在某些细胞系中，与 PEI 相比，它表现出更高的转染效率和更低的细胞毒性，从而提高了病毒产量。电穿孔是另一种使用电脉冲将核酸引入细胞的替代方案。虽然有效，但它需要专门的设备，并且可能更加劳动密集。
   7. 将细胞培养 18 小时，然后小心地用新鲜的 10 mL 含有 25 μM 氯喹的 DMEM 完全培养基替换转染培养基。
   8. 转染 72 小时后，收集含有病毒颗粒的培养基。以 500 x g 离心 5 分钟，去除包装的 293T 细胞。
   9. 收集上清液并通过 0.45 μm 聚醚砜 （PES） 过滤器过滤。直接使用病毒上清液。
      注:应将病毒上清液分装并在液氮中快速冷冻，并保持在 -80 °C 以避免滴度损失。
2. 靶细胞慢病毒感染
   1. 在两个 6 cm 板中接种 2 × 10⁶ 个靶细胞 BEAS-2B，并在 37 °C、5% CO₂ 下生长过夜。转导后，确保 BEAS-2B 细胞达到约 70% 的汇合度。
   2. 小心地去除旧培养基，将适当的 0.5 mL KRAS 或载体慢病毒颗粒与 3 mL 新鲜的 RPMI-1640 完全培养基分别加入两个板中。
   3. 将细胞在 37 °C 下在 5% CO₂ 培养箱中培养 18-20 小时。用 3.5 mL 新鲜预热的完全培养基替换含有慢病毒颗粒的旧培养基。转导 72 小时后，收集细胞进行以下测定。
      注意:如果与病毒孵育过夜引起毒性，则孵育时间可缩短至 4 小时。为了实现转导效率和细胞健康的平衡，需要考虑以下策略:（1） 优化感染的多样性;（2） 使用高质量的病毒制剂;（3） 利用聚阳离子（如聚凝胺）提高效率，允许使用较低的病毒滴度并降低潜在毒性;（4） 对于长期研究，考虑使用诱导型表达系统暂时控制转基因表达，减轻细胞负担并最大限度地减少潜在毒性。

2. 验证 KRAS （G12D） 衍生的 DNA 损伤和 R 环形成

1. 通过 WB 检测确认基因表达和 DNA 损伤
   1. 从平板中吸出培养基。
   2. 用 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 轻轻洗涤细胞，以去除任何残留的培养基或碎片。
   3. 加入少量 1x PBS 以在刮擦过程中保持细胞湿润。
   4. 使用细胞刮刀，以一定角度握住，然后沿一致的方向轻轻地从表面刮除细胞。
      注意:小心不要施加太大的压力，这可能会损坏细胞。
   5. 倾斜板，用移液管将细胞悬液收集到试管中，并以 500 x g 旋转细胞 5 分钟。丢弃上清液。
   6. 通过稀释 2x RIPA 缓冲液制备 1x RIPA 缓冲液（参见 表 1），并在使用前立即添加蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂混合物。
   7. 用预冷的 RIPA 缓冲液 （1x） 裂解细胞沉淀，并在冰上孵育 30 分钟。通过以 15,000 x g 离心 10 分钟去除碎片。收集上清液并使用 Bradford 测定法测量蛋白质浓度。
   8. 向上清液中加入 4 x 十二烷基硫酸钠 （SDS） 样品上样缓冲液，并在 95 °C 下使蛋白质变性 5 分钟。首先，在 12.5% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （PAGE） 凝胶中从每个样品中分离 40 μg 蛋白质，然后将其转移到 0.2 μm 硝酸纤维素膜上（参见 材料表）。
   9. 完成转移后，用封闭缓冲液（含 0.1% 吐温 20 [TBST; 表 1]）持续 1 小时。
   10. 用TBST短暂冲洗膜，然后将膜与针对FLAG标签（PBST中1:2500稀释）和γH 2 AX（PBST中1:1000稀释）的一抗孵育过夜（参见 材料表）。
   11. 去除一抗，用 TBST 洗涤膜 3 次，每次 10 分钟。
   12. 在室温 （RT） 下将膜浸入稀释的辣根过氧化物酶 （HRP） 偶联的二抗（在含有 5% 脱脂牛奶的 TBST 缓冲液中以 1:5,000 的比例）浸泡 1 小时。
   13. 用 TBST 洗涤膜 3 次，每次 10 分钟。
   14. 通过增强化学发光 （ECL） 试剂观察蛋白质水平（参见 材料表）。
2. 通过斑点印迹检测 R 环²⁵​
   1. 从平板中吸出培养基。
   2. 用 1x PBS 轻轻洗涤细胞以去除任何残留的培养基或碎片。
   3. 加入少量 1x PBS 以在刮擦过程中保持细胞湿润。
   4. 使用细胞刮刀，以一定角度握住，然后沿一致的方向轻轻地从表面刮除细胞。
      注意:小心不要施加太大的压力，这可能会损坏细胞。
   5. 倾斜板，用移液管将细胞悬液收集到试管中，并以 500 x g 旋转细胞 5 分钟。丢弃上清液。
   6. 用 300 μL 冰冷的细胞裂解缓冲液裂解 2 ×^{10 6} 个细胞（见 表 1）。在冰上孵育 10 分钟。在 4 °C 下以 500 x g 旋转 5 分钟，然后弃去上清液。颗粒含有细胞核。
   7. 使用广口吸头用 300 μL 预冷的核裂解缓冲液重新悬浮每个沉淀（见 表 1）。
   8. 向每个样品中加入 3 μL 20 mg/mL 蛋白酶 K（参见 材料表），并在 55 °C 下消化 3-5 小时。
   9. 向每个试管中加入 100 μL 洗脱缓冲液（见 表 1）并充分混合。
   10. 向每个试管中加入 400 μL 苯酚:氯仿:异戊醇 （25:24:1 pH 8.0）。剧烈涡旋后，在 4 °C 下以 12,000 x g 离心 5 分钟，以将 DNA 与其他细胞内容物分离。
   11. 小心地将上层水相转移到新试管中。
   12. 向样品中加入 1/10 体积的 3 M 乙酸钠 （pH 5.2） 和 2.5 体积的预冷 100% 乙醇，沉淀 DNA。充分混合并在 -20 °C 下孵育 4 小时或过夜。
       注:向样品中添加糖原（参见 材料表）可以提高乙醇沉淀中 DNA 的回收率。最终糖原浓度约为 0.05-1 μg/μL。
   13. 通过在 4 °C 下以 12,000 x g 离心 30 分钟来沉淀 DNA。 弃去上清液，不要干扰沉淀。
   14. 用 1 mL 冰冷的 70% 乙醇冲洗沉淀，并在 4 °C 下以 12,000 x g 再次离心 5-15 分钟。
   15. 小心丢弃上清液，以免干扰 DNA 沉淀。
   16. 将 DNA 沉淀风干 5-10 分钟。
   17. 加入 50 μL 预热的 TE 缓冲液 （pH8.0） 溶解 DNA 沉淀，并在 37 °C 下孵育 30 分钟。 测量每个样品的 DNA 浓度。
   18. 在 TE 缓冲液中制备所需浓度的 DNA 稀释液（5 ng/μL 至 200 ng/μL）。通过斑点印迹仪将 20 μL 每个样品均匀地点样到带正电荷的尼龙膜上。
       注:要使用斑点印迹法检测 R 环，建议每个点滴添加约 500 ng 基因组 DNA。当使用 S9.6 单克隆抗体时，该量已被证明为检测 RNA-DNA 杂交提供了足够的灵敏度，S9.6 单克隆抗体特异性结合这些结构。
   19. 通过紫外线交联剂的"自动交联"设置 （1,200 μJ x 100） 将 DNA 交联到尼龙膜上（参见 材料表），从而固定 DNA（参见 材料表）。
   20. 在室温下将膜浸入 封闭缓冲液 （参见 表 1）中 1 小时。然后用 TBST 短暂冲洗膜。
   21. 将膜与一抗（参见 材料表）在 4°C 下孵育过夜。 S9.6 在含有 5% BSA 的 TBST 中稀释为 1:1,000。
   22. 去除一抗并用 TBST 洗涤 3 次，每次 10 分钟。
   23. 在室温下将膜与 HRP 偶联的二抗在 TBST 中的 5% BSA 中孵育 1 小时。
   24. 去除二抗并用 TBST 洗涤 3 次，每次 10 分钟。
   25. 通过 ECL（增强化学发光）试剂观察 R 环水平参见材料表）。

3. PLA 测定

1. 细胞制备
   注:用 KRAS G12D 癌基因转导细胞会导致 TRC 增加，阳性 PLA 信号证明了这一点。该方法有效地将癌基因驱动的 TRC 与背景水平区分开来，而无需选择抗生素。然而，转导后实施抗生素选择可以通过富集成功转导的细胞群来增强整体信号，从而提高检测的灵敏度和特异性。
   1. 将直径为 12 mm 的盖玻片放入 12 孔板的每个孔中。
   2. 感染后 24 小时将慢病毒感染的细胞接种到这些孔中，并将细胞保存在 500 μL 完全 RPMI-1640 培养基中，在 37 °C 和 5% CO₂ 中。
   3. 最佳）如果实验设计包括抗生素选择以富集成功转导的细胞，则在此阶段向培养基中添加适当的抗生素。
   4. 监测细胞以确保它们在感染后 48-72 小时达到约 60% 汇合。
   5. 小心去除 RPMI-1640 并在冰上用冷的 0.5% NP-40 预提取细胞 4 分钟。
   6. 直接加入 500 μL 固定缓冲液（见 表 1），在 RT 下固定细胞 15 分钟。
      注:建议在固定步骤之前不要洗涤细胞，因为这会导致它们从生长的表面分离，特别是如果细胞系对分离敏感;因此，通常首选直接添加固定液。
   7. 通过去除固定缓冲液并用 1x PBS 小心洗涤细胞 3 次来终止反应。
   8. 吸出 PBS，向细胞中加入 500 μL 预冷的 100% 甲醇。
   9. 通过在-20°C下孵育15-30分钟来透化细胞。
   10. 用 Duolink 封闭溶液在 RT 下封闭细胞 1 小时。
2. 抗体染色
   1. 在 Duolink 抗体稀释缓冲液中稀释小鼠抗 RNAPII 8WG16 （1:500） 和兔抗 PCNA（D3H8P） （1:500）。将细胞与一抗混合物在湿度室中于 4 °C 孵育过夜。
      注:仅使用一种一抗（抗 RNAPII 或抗 PCNA）执行 PLA 方案，而省略另一种。这有助于识别由单个抗体或 PLA 探针的非特异性相互作用产生的任何背景信号。
   2. 使用无绒废纸轻轻地从载玻片中取出一抗，不要接触细胞。然后，用 1x PBS 洗涤细胞 3 次。
   3. 根据以下程序准备 PLA 探针（或二抗）（见 表 2），然后混合并在室温下静置 20 分钟。
   4. 将二抗混合物添加到载玻片中，并在 RT 下在湿度室中孵育 2 小时。
3. 连接和扩增
   1. 弃去二抗混合物，用 1x 缓冲液 A 洗涤载玻片两次，每次 5 分钟。
   2. 根据以下程序准备连接混合物（见 表 2）。
   3. 将 15 μL 连接混合物涂在每个盖玻片上，并在 37 °C 下在湿度室中孵育 30 分钟。
   4. 用 1x 缓冲液 A 洗涤载玻片两次，每次 2 分钟。
   5. 根据以下程序制备扩增混合物（参见 表 2）。
   6. 将 15 μL 扩增混合物涂到每张玻片上，并在 37 °C 的湿度室中孵育 100 分钟。弃去扩增混合物，用 1x 缓冲液 B 洗涤两次，每次 10 分钟。
   7. 用 0.01x 缓冲液 B 洗涤载玻片一次，持续 1 分钟。
   8. 吸出缓冲液 B 并将载玻片封固在带有 DAPI 的 Duolink 原位 封固剂中。
4. 图像分析和阈值确定:
   1. 通过 ImageJ 量化 PLA 病灶的数量。自动图像分析软件可以帮助客观地量化 PLA 信号。选择每个细胞核 3 个或更多 PLA 病灶的阈值作为阈值，因为在未受干扰的条件下，只有不到 1% 的对照细胞获得 3 个 PLA 病灶。
      注意:由于阈值是通过分析多个样品和对照来通过实验确定的，因此必须在所有样品中保持一致的成像设置（例如，曝光时间、增益）以确保可比性。

γH2AX 可作为 DNA 损伤的生物标志物。KRAS （G12D） 的过表达会损害这些细胞中的基因组稳定性，Western blot 分析中 γH 2 AX 信号增加证明了这一点（图 2A）。此外，与载体对照相比，表达 KRAS （G12D） 的细胞中增强的 S9.6 点印迹信号（图 2B）表明致癌 KRAS 表达导致异常 R 环的积累，这可能导致 DNA 断裂的形成。

图 3 显示了邻位连接测定 （PLA） 的代表性图像。在这些图像中，细胞核内的亮绿色点表明 PCNA 相关复制复合物和 RNAPII 转录复合物之间的距离小于 40 nm。在载体对照细胞中，几乎无法检测到绿点，而在表达 KRAS （G12D） 的细胞中，每个细胞核观察到多个绿点。这表明致癌性 KRAS 表达增加了 RNAPII 和复制复合物之间相遇的频率。这些 PLA 结果与 Western blot（图 2A）和斑点印迹测定（图 2B）的结果一致。

总之，这些发现表明，邻位连接测定可有效检测 RNAPII 和复制机制之间癌基因诱导的冲突。这种能力在未来的应用中具有巨大的潜力，能够定量由异常癌基因表达引起的不同样品类型的 TRC。虽然存在一定的局限性，但这种方法的前景是有希望的，特别是根据不同的样品调整实验条件。

图 1: 原位 邻位连接测定的示意图。 （1） 确定 interest 的成对交互伙伴。（2） 将样品与靶向所需蛋白质的配对一抗一起孵育，然后与寡核苷酸探针偶联的二抗一起孵育。（3） 引入连接寡核苷酸，它们与连接到每个 PLA 探针的寡核苷酸互补。如果靶蛋白足够接近，则连接到 PLA 探针的寡核苷酸序列将很接近。（4） 如果靶蛋白非常接近（通常为 <40 nm），PLA 探针上的寡核苷酸会接触，并可通过 DNA 连接酶连接形成环状 DNA 分子。（5） 使用聚合酶进行 RCA 扩增环状 DNA，形成一条长而重复的 DNA 链。将荧光标记的寡核苷酸与扩增的 DNA 产物杂交，实现可视化。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2:KRAS （G12D） 表达细胞中的 DNA 损伤和 R 环积累。 （A） BEAS-2B 细胞全细胞裂解物的代表性蛋白质印迹分析，表明 KRAS G12D 表达 72 小时后 γH2AX 水平增加。γH2AX 印迹用于评估 DNA 损伤，以 ACTB 作为上样对照。FLAG 印迹证实了 KRAS G12D 的表达。（B） BEAS-2B 细胞中 R 环形成的代表性斑点印迹分析，比较有和没有 KRAS G12D 表达的条件。S9.6 抗体用于检测 R 环，而抗 DNA 抗体用于定量总 DNA。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3:TRC 在 KRAS （G12D） 表达细胞中的积累。 PLA 分析的代表性图像。表达 KRAS G12D 的细胞中的亮绿色病灶表明 PCNA 和 RNA 聚合酶 II （RNAPII） 之间存在碰撞。免疫细胞化学 PLA 在表达 KRAS G12D 的细胞中显示出与载体细胞相比的高 TRC。 请单击此处查看此图的较大版本。

表 1:缓冲液制备。请点击此处下载此表格。

表 2:PLA 反应制备。请点击此处下载此表格。

表 3:PLA 分析的故障排除。请点击此处下载此表格。

RNAPII 转录机制可以阻碍 DNA 复制叉进程^26,27，^促进 TRC 和 DNA 损伤，尤其是在癌细胞中^28,29。破译调节 TRC 的蛋白质并了解详细机制可以帮助我们理解这些有害事件是如何发生的，并指导未来新治疗方法的开发。因此，要充分了解 TRC，快速可靠的 TRC 检测方法至关重要。

在这里，我们描述了一种使用 原位 PLA 测定检查转录-复制冲突 （TRC） 发生率的程序。这种方法允许在细胞内存癌信号传导的情况下轻松估计 TRC 频率。它不需要昂贵的设备或大量的起始材料。我们的方案还包括 S9.6 斑点印迹和 Western blot，以确认源自 KRAS （G12D） 表达的 TRC 信号的特异性。

该检测依赖于抗体-寡核苷酸偶联物 （PLA 探针） 对复制和 RNAPII 转录复合物的识别，它们共同产生 DNA 环，作为局部滚环扩增反应的模板。对靶蛋白的双重识别要求通过消除抗体对不共享的任何交叉反应性来提高选择性，从而确保明确且可重现的结果。因此，抗体的特异性和强亲和力对于 PLA 检测的成功至关重要。优化样品中的抗体性能条件至关重要，包括 （i） 细胞固定和透化条件，（ii） 封闭溶液，以及 （iii） 一抗稀释。适当的阴性对照至关重要，因为 （i） 敲低对照可以验证一抗的特异性，并且 （ii） 具有同种型 IgG 的对照可以测试 PLA 探针的特异性。

已确定 PLA 检测的许多常见问题。这些包括缺乏预期信号和非特异性背景信号。 表 3 总结了这些问题的可能原因和解决方案。

值得注意的是，这种方法只能确认 PCNA 和 RNA 聚合酶 II 之间的物理接近性;然而，这种接近并不一定意味着有害 DNA 断裂的发生。另一个关键限制是该方法无法提供有关这两个复合物相互作用的特定染色质位点的信息。要完全了解转录相关的 DNA 断裂需要更复杂的分析。利用下一代测序技术，TRIPn-seq 的开发是为数不多的能够精确定位转录和复制共占据的方法之一，适用于任何增殖细胞^21,29。然而，尽管这种方法信息量很大，但其高成本和时间密集型性质限制了它的可访问性。

总之，我们的研究表明， 原位 PLA 是一种确定固定细胞中复制和 RNAPII 转录机制紧密接近程度的有效方法，具有定量和空间分辨率。PCNA 和 RNAPII （8WG16） 抗体的特异性用途已被证明对研究 BEAS-2B 细胞中的 TRC 有效。除了 RNAPII 转录相关 TRC 外， 原位 PLA 测定还可用于在临床和研究环境中研究 RNAPI 和 RNAPIII 相关 TRC，前提是应用适当的控制和调整。

最近发表的一项研究³⁰ 介绍了一种以染色体外 DNA （ecDNA） 为特征的癌症的新型治疗策略。研究人员增加了转录-复制冲突 （TRC） 以利用 ecDNA 阳性癌细胞的脆弱性，选择性地靶向它们，同时保留正常细胞。使用 PLA 方法评估 TRC 状态可以为患者癌细胞的基因组稳定性提供有价值的见解。治疗期间监测 TRC 状态可能有助于评估针对 TRC 的治疗的有效性。因此，将基于 PLA 的 TRC 评估整合到个性化医学方法中有望通过更深入地了解单个肿瘤内的分子动力学来改善癌症诊断、预后和治疗监测。

作者没有需要披露的利益冲突。

这项工作得到了南华大学的启动资金支持。