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在这里,我们提出了一种灵敏且特异的方法,使用邻位连接测定 (PLA) 检测癌基因诱导的转录复制冲突 (TRC)。这种方法利用靶向 PCNA 和磷酸化 CTD RNAPII 的特异性抗体,能够评估 RNA 聚合酶 II 转录和 DNA 复制机制之间的 TRC 患病率。
DNA 复制和 RNA 转录都使用基因组 DNA 作为模板,因此需要对这些过程进行空间和时间分离。复制和转录机制之间的冲突,称为转录-复制冲突 (TRC),对基因组稳定性构成相当大的风险,而基因组稳定性是癌症发展的关键因素。虽然已经确定了几个调节这些碰撞的因素,但由于直接可视化和清晰解释的工具有限,确定主要原因仍然很困难。在这项研究中,我们使用邻位连接测定 (PLA) 直接可视化 TRC,利用对 PCNA 具有特异性的抗体和 RNA 聚合酶 II 的磷酸化 CTD。这种方法允许精确测量由 RNA 聚合酶 II 介导的复制和转录过程之间的 TRC。通过与这些抗体共价偶联的 DNA 引物,结合使用荧光探针的 PCR 扩增,该方法进一步增强,提供了一种检测内源性 TRC 的高灵敏度和特异性方法。荧光显微镜能够可视化这些冲突,为研究与癌症相关的基因组不稳定机制提供了强大的工具。该技术解决了直接 TRC 可视化的差距,可以更全面地分析和理解导致细胞基因组不稳定性的潜在过程。
基因组是基本生物过程的模板,包括复制和转录。在健康细胞中,RNA 转录和 DNA 复制机制通常合作,并在空间和时间上分离 1,2,3,4。然而,在病理条件下,例如癌基因过表达,这种和谐的合作可能会被破坏。
癌基因通常会驱动转录水平升高,从而增加转录和复制机制之间发生冲突的可能性5。一些癌基因会改变染色质结构,使其更容易进行转录,但可能会阻碍复制分叉进程5。此外,癌基因激活可以通过加速细胞周期来诱导复制应激6。由于 Rb 的细胞周期蛋白依赖性激酶 (CDK) 磷酸化,RNA 聚合酶 II (RNAPII) 活性在 G1/S 相变期间显著升高,Rb 磷酸化释放 E2F 转录因子,促进必需蛋白质(包括细胞周期蛋白、CDK 和管家基因)的转录7。组蛋白基因表达在 S 期达到峰值,与 DNA 复制一致8。此外,转录一些非常长的基因的全长转录本需要不止一个细胞周期9。每次进入 S 期时,转录和复制机制在同一基因组区域同时活动可能会导致有害的相遇,从而导致冲突。这些冲突是基因组不稳定性的主要内在来源,这与肿瘤发生密切相关。复制机制如何与 RNAPII 转录协调以防止有害冲突并保持基因组稳定性仍然是一个重要问题。因此,RNAPII 相关转录复制冲突 (TRC) 的直接可视化对于理解解决这些冲突的分子机制至关重要,并可能最终为利用这些冲突进行治疗奠定基础。
转录-复制冲突 (TRC) 可以以两个方向出现:正面冲突(转录和复制相互推进)和同向冲突(它们朝同一方向移动)。正面碰撞比同向碰撞更具破坏性 10,11,12,13。DNA-RNA 杂交体 (R 环) 的形成已被确定为 TRC 的主要驱动因素;因此,大量研究通过评估 R 环及其区域响应失调复制和/或转录的发生来推断 TRC 的存在10,11。然而,转录衍生的 R 环的积累是否会成为复制的成比例障碍并与 TRC 直接相关仍然是一个未解决的问题。研究人员还通过分析复制叉动力学来研究 TRC。例如,报告基因的二维凝胶电泳可以揭示位点特异性复制体停顿12,而 DNA 纤维测定允许研究人员检查复制叉速度、起始密度和叉不对称性的改变13。新一代测序技术的进步催生了多种创新方法,例如冈崎片段测序 (Ok-seq)14,15、起始位点测序 (ini-seq)16,17、短新生链测序 (SNS-seq)18、Repli-seq19 和聚合酶使用测序 (Pu-seq)20.这些技术提供了复制起点使用、分叉方向性和复制终止的全基因组概况,揭示了复制和转录协调中涉及的关键因素。TRIPn-seq 是为数不多的能够直接检测转录和复制共占据的方法之一,显着扩展了我们对生理和病理条件下 DNA 复制和转录动态组织的理解21。尽管这些基于测序的方法提供了有价值的见解,但它们的高成本和时间密集型性质限制了它们更广泛的应用。因此,建立一种更明确、高灵敏度、方便和快速的检测方法以在单细胞水平上可视化和定量 TRC 至关重要。
原位邻位连接测定 (PLA),也称为 Duolink PLA 技术,是一种用于评估组织切片或细胞培养物中靶蛋白物理接近度的强大方法。该技术仅在两种蛋白质或蛋白质复合物彼此相距 40 nm 以内时产生信号。它需要两种针对靶蛋白的一抗,每种抗体来自不同的物种(例如,小鼠/兔、兔/山羊或小鼠/山羊)。将样品与这些一抗孵育后,使用称为 PLA 探针的二抗(一个 PLUS 和一个 MINUS)。与一抗恒定区结合的常规二抗不同,PLA 探针与特异性 DNA 引物共价连接。当靶蛋白非常接近(小于 40 nm)时,连接寡核苷酸可以与两种 PLA 探针杂交,促进它们连接的寡核苷酸酶促连接成全长 DNA 分子。这种新形成的 DNA 用作检测到的蛋白质相互作用的替代标记物,并作为扩增的模板。然后使用荧光标记的寡核苷酸探针对扩增的产物进行可视化。如果蛋白质相距超过 40 nm,PLA 探针无法形成 DNA 模板,因此无法检测到信号。PLA 的示意图如图 1 所示。通过荧光显微镜将接近和/或相互作用可视化为荧光点,并且可以量化这些点的数量和强度。自 2002 年发明以来,PLA 因其高灵敏度和特异性而成为监测蛋白质相互作用的流行趋势。与基于测序的检测不同,PLA 只需要少量样品,因此有利于分析稀缺样品。
研究表明,致癌 KRAS G12D 突变的表达会导致转录-复制冲突 (TRC)22,23。例如,Meng 等人23 提出的研究表明,KRAS G12D 在人胰管上皮 (HPNE) 细胞中的异位表达增强了 TRC 和 TRC 相关 R 环。为了能够检测细胞系中 RNAPII 转录和复制机制之间的碰撞,我们提供了专门为此目的开发的方案。将 KRAS (G12D) 质粒和载体对照转染到人肺上皮 BEAS-2B 细胞中,并通过 Western blot 验证 KRAS (G12D) 表达以及 DNA 损伤 (γH2AX)。R 环积累通过 S9.6 斑点印迹分析证实,这共同表明表达 KRAS (G12D) 的细胞中存在复制障碍和基因组不稳定性的积累。最后,将细胞固定在载玻片上进行 PLA 测定。为了局部检测碰撞,首先用 RNAPII 和 PCNA 一抗对细胞进行染色,然后用与 PLA 探针偶联的二抗进行染色。通过成功连接形成环状 DNA 分子,作为后续滚环扩增 (RCA) 的模板。然后用适当的封固剂封片,并在荧光显微镜下观察玻片。可以使用 ImageJ 分析图像。
1. 慢病毒生产和转导到靶细胞系
2. 验证 KRAS (G12D) 衍生的 DNA 损伤和 R 环形成
3. PLA 测定
γH2AX 可作为 DNA 损伤的生物标志物。KRAS (G12D) 的过表达会损害这些细胞中的基因组稳定性,Western blot 分析中 γH 2 AX 信号增加证明了这一点(图 2A)。此外,与载体对照相比,表达 KRAS (G12D) 的细胞中增强的 S9.6 点印迹信号(图 2B)表明致癌 KRAS 表达导致异常 R 环的积累,这可能导致 DNA 断裂的形成。
图 3 显示了邻位连接测定 (PLA) 的代表性图像。在这些图像中,细胞核内的亮绿色点表明 PCNA 相关复制复合物和 RNAPII 转录复合物之间的距离小于 40 nm。在载体对照细胞中,几乎无法检测到绿点,而在表达 KRAS (G12D) 的细胞中,每个细胞核观察到多个绿点。这表明致癌性 KRAS 表达增加了 RNAPII 和复制复合物之间相遇的频率。这些 PLA 结果与 Western blot(图 2A)和斑点印迹测定(图 2B)的结果一致。
总之,这些发现表明,邻位连接测定可有效检测 RNAPII 和复制机制之间癌基因诱导的冲突。这种能力在未来的应用中具有巨大的潜力,能够定量由异常癌基因表达引起的不同样品类型的 TRC。虽然存在一定的局限性,但这种方法的前景是有希望的,特别是根据不同的样品调整实验条件。
图 1: 原位 邻位连接测定的示意图。 (1) 确定 interest 的成对交互伙伴。(2) 将样品与靶向所需蛋白质的配对一抗一起孵育,然后与寡核苷酸探针偶联的二抗一起孵育。(3) 引入连接寡核苷酸,它们与连接到每个 PLA 探针的寡核苷酸互补。如果靶蛋白足够接近,则连接到 PLA 探针的寡核苷酸序列将很接近。(4) 如果靶蛋白非常接近(通常为 <40 nm),PLA 探针上的寡核苷酸会接触,并可通过 DNA 连接酶连接形成环状 DNA 分子。(5) 使用聚合酶进行 RCA 扩增环状 DNA,形成一条长而重复的 DNA 链。将荧光标记的寡核苷酸与扩增的 DNA 产物杂交,实现可视化。 请单击此处查看此图的较大版本。
图 2:KRAS (G12D) 表达细胞中的 DNA 损伤和 R 环积累。 (A) BEAS-2B 细胞全细胞裂解物的代表性蛋白质印迹分析,表明 KRAS G12D 表达 72 小时后 γH2AX 水平增加。γH2AX 印迹用于评估 DNA 损伤,以 ACTB 作为上样对照。FLAG 印迹证实了 KRAS G12D 的表达。(B) BEAS-2B 细胞中 R 环形成的代表性斑点印迹分析,比较有和没有 KRAS G12D 表达的条件。S9.6 抗体用于检测 R 环,而抗 DNA 抗体用于定量总 DNA。 请单击此处查看此图的较大版本。
图 3:TRC 在 KRAS (G12D) 表达细胞中的积累。 PLA 分析的代表性图像。表达 KRAS G12D 的细胞中的亮绿色病灶表明 PCNA 和 RNA 聚合酶 II (RNAPII) 之间存在碰撞。免疫细胞化学 PLA 在表达 KRAS G12D 的细胞中显示出与载体细胞相比的高 TRC。 请单击此处查看此图的较大版本。
表 1:缓冲液制备。请点击此处下载此表格。
表 2:PLA 反应制备。请点击此处下载此表格。
表 3:PLA 分析的故障排除。请点击此处下载此表格。
RNAPII 转录机制可以阻碍 DNA 复制叉进程26,27,促进 TRC 和 DNA 损伤,尤其是在癌细胞中28,29。破译调节 TRC 的蛋白质并了解详细机制可以帮助我们理解这些有害事件是如何发生的,并指导未来新治疗方法的开发。因此,要充分了解 TRC,快速可靠的 TRC 检测方法至关重要。
在这里,我们描述了一种使用 原位 PLA 测定检查转录-复制冲突 (TRC) 发生率的程序。这种方法允许在细胞内存癌信号传导的情况下轻松估计 TRC 频率。它不需要昂贵的设备或大量的起始材料。我们的方案还包括 S9.6 斑点印迹和 Western blot,以确认源自 KRAS (G12D) 表达的 TRC 信号的特异性。
该检测依赖于抗体-寡核苷酸偶联物 (PLA 探针) 对复制和 RNAPII 转录复合物的识别,它们共同产生 DNA 环,作为局部滚环扩增反应的模板。对靶蛋白的双重识别要求通过消除抗体对不共享的任何交叉反应性来提高选择性,从而确保明确且可重现的结果。因此,抗体的特异性和强亲和力对于 PLA 检测的成功至关重要。优化样品中的抗体性能条件至关重要,包括 (i) 细胞固定和透化条件,(ii) 封闭溶液,以及 (iii) 一抗稀释。适当的阴性对照至关重要,因为 (i) 敲低对照可以验证一抗的特异性,并且 (ii) 具有同种型 IgG 的对照可以测试 PLA 探针的特异性。
已确定 PLA 检测的许多常见问题。这些包括缺乏预期信号和非特异性背景信号。 表 3 总结了这些问题的可能原因和解决方案。
值得注意的是,这种方法只能确认 PCNA 和 RNA 聚合酶 II 之间的物理接近性;然而,这种接近并不一定意味着有害 DNA 断裂的发生。另一个关键限制是该方法无法提供有关这两个复合物相互作用的特定染色质位点的信息。要完全了解转录相关的 DNA 断裂需要更复杂的分析。利用下一代测序技术,TRIPn-seq 的开发是为数不多的能够精确定位转录和复制共占据的方法之一,适用于任何增殖细胞21,29。然而,尽管这种方法信息量很大,但其高成本和时间密集型性质限制了它的可访问性。
总之,我们的研究表明, 原位 PLA 是一种确定固定细胞中复制和 RNAPII 转录机制紧密接近程度的有效方法,具有定量和空间分辨率。PCNA 和 RNAPII (8WG16) 抗体的特异性用途已被证明对研究 BEAS-2B 细胞中的 TRC 有效。除了 RNAPII 转录相关 TRC 外, 原位 PLA 测定还可用于在临床和研究环境中研究 RNAPI 和 RNAPIII 相关 TRC,前提是应用适当的控制和调整。
最近发表的一项研究30 介绍了一种以染色体外 DNA (ecDNA) 为特征的癌症的新型治疗策略。研究人员增加了转录-复制冲突 (TRC) 以利用 ecDNA 阳性癌细胞的脆弱性,选择性地靶向它们,同时保留正常细胞。使用 PLA 方法评估 TRC 状态可以为患者癌细胞的基因组稳定性提供有价值的见解。治疗期间监测 TRC 状态可能有助于评估针对 TRC 的治疗的有效性。因此,将基于 PLA 的 TRC 评估整合到个性化医学方法中有望通过更深入地了解单个肿瘤内的分子动力学来改善癌症诊断、预后和治疗监测。
作者没有需要披露的利益冲突。
这项工作得到了南华大学的启动资金支持。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Clarity Western ECL Substrate | Bio-Rad | 1705061 | |
Duolink In Situ Detection Reagents Green | Sigma | DUO92014 | |
FLAG antibody | Millipore | F7425 | |
gamma H2AX antibody | Cell Signaling | 25955 | |
Glycogen, molecular biology grade | ThermoFisher | R0561 | |
Image J | NIH | https://imagej.net/ij/ | |
nitrocellulose membranes | Amersham | 10600004 | |
PCNA antibody | Cell Signaling | 13110 | |
pLVX-Kras G12D | N/A | N/A | |
pMD2.G | Addgene | 12259 | |
Proteinase K, recombinant, PCR grade | ThermoFisher | EO0491 | |
psPAX2 | Addgene | 12260 | |
RNAPII antibody | SCBT | sc-56767 | |
S9.6 antibody | Active motif | 65683 | |
UV crosslinkers | Fisher Scientific | FB-UVXL-1000 |
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