В данной работе мы представляем чувствительный и специфичный метод выявления онкоген-индуцированных конфликтов транскрипции-репликации (TRC) с использованием анализа близости-лигирования (PLA). В этом подходе используются специфические антитела, нацеленные на PCNA и фосфо-CTD RNAPII, что позволяет оценить распространенность TRC между транскрипцией РНК-полимеразы II и механизмом репликации ДНК.

Как репликация ДНК, так и транскрипция РНК используют геномную ДНК в качестве матрицы, что требует пространственного и временного разделения этих процессов. Конфликты между механизмами репликации и транскрипции, называемые конфликтами транскрипции и репликации (TRC), представляют значительный риск для стабильности генома, что является критическим фактором в развитии рака. Несмотря на то, что было выявлено несколько факторов, регулирующих эти коллизии, точное определение основных причин остается затруднительным из-за ограниченных инструментов для прямой визуализации и четкой интерпретации. В этом исследовании мы непосредственно визуализируем TRC с помощью анализа бесконтактного лигирования (PLA), используя антитела, специфичные к PCNA и фосфорилированному CTD РНК-полимеразы II. Этот подход позволяет точно измерять TRC между процессами репликации и транскрипции, опосредованными РНК-полимеразой II. Метод дополнительно усовершенствован за счет ковалентно конъюгированных с этими антителами праймеров ДНК в сочетании с амплификацией ПЦР с использованием флуоресцентных зондов, что обеспечивает высокочувствительные и специфичные средства обнаружения эндогенных TRC. Флуоресцентная микроскопия позволяет визуализировать эти конфликты, предлагая мощный инструмент для изучения механизмов нестабильности генома, связанных с раком. Этот метод устраняет пробел в прямой визуализации TRC, позволяя проводить более всесторонний анализ и понимание основных процессов, вызывающих нестабильность генома в клетках.

Геном служит шаблоном для основных биологических процессов, включая репликацию и транскрипцию. В здоровых клетках механизм транскрипции РНК и репликации ДНК обычно взаимодействуют и пространственно и временно сегрегированы 1,2,3,4. Однако при патологических состояниях, таких как гиперэкспрессия онкогенов, это гармоничное сотрудничество может быть нарушено.

Онкогены часто стимулируют повышенный уровень транскрипции, увеличивая вероятность коллизий^{между механизмом} транскрипции и репликации. Некоторые онкогены изменяют архитектуру хроматина, делая ее более доступной для транскрипции, но потенциально препятствуя^{прогрессированию} репликационной вилки5. Кроме того, активация онкогена может вызывать репликационный стресс за счет ускорения клеточного цикла⁶. Активность РНК-полимеразы II (RNAPII) значительно повышается во время фазового перехода G1/S из-за фосфорилирования Rb циклин-зависимой киназой (CDK), которое высвобождает факторы транскрипции E2F, способствующие транскрипции основных белков, включая циклины, CDK и гены хозяйственной части⁷. Экспрессия гена гистонов достигает пика во время S-фазы, совпадая с репликацией ДНК⁸. Более того, для расшифровки полноразмерных транскриптов некоторых очень длинных генов требуется более одного клеточного^цикла9. При каждом вступлении в S-фазу одновременная активность механизмов транскрипции и репликации в одних и тех же областях генома может привести к пагубным столкновениям, ведущим к конфликтам. Эти конфликты являются основным внутренним источником нестабильности генома, которая тесно связана с онкогенезом. Важным вопросом остается вопрос о том, как механизм репликации координируется с транскрипцией RNAPII для предотвращения вредных коллизий и поддержания стабильности генома. Таким образом, прямая визуализация RNAPII-ассоциированных конфликтов транскрипции и репликации (TRC) стала важной для понимания молекулярных механизмов, которые разрешают эти конфликты, и в конечном итоге может заложить основу для использования этих конфликтов в терапевтических целях.

Конфликты транскрипции и репликации (TRC) могут возникать в двух направлениях: лобовом, когда транскрипция и репликация развиваются навстречу друг другу, и сонаправленном, когда они движутся в одном направлении. Лобовые столкновения гораздо более разрушительны, чем сонаправленные 10,11,12,13. Образование гибридов ДНК-РНК (R-петель) было определено как основной движущий фактор TRC; таким образом, значительное количество исследований позволило сделать вывод о присутствии TRC путем оценки возникновения R-петель и их областей в ответ на нерегулируемую репликацию и/или транскрипцию ^10,11. Тем не менее, служит ли накопление R-петель, полученных от транскрипции, пропорциональным препятствием для репликации и напрямую коррелирует с TRC, остается нерешенным вопросом. Исследователи также исследовали TRC, анализируя динамику репликационной вилки. Например, двумерный гель-электрофорез репортерных генов может выявить локус-специфичную реплисомную паузу¹², в то время как анализ волокон ДНК позволяет исследователям изучить изменения скорости репликационной вилки, исходной плотности и асимметрии^вилки13. Развитие технологии секвенирования нового поколения привело к разработке нескольких инновационных методов, таких как секвенирование фрагментов Окадзаки (Ok-seq)^14,15, секвенирование сайта инициации (ini-seq)^16,17, секвенирование коротких зарождающихся нитей (SNS-seq)¹⁸, Repli-seq¹⁹ и секвенирование с использованием полимеразы (Pu-seq)²⁰. Эти методы позволили получить полногеномные профили использования источника репликации, направленности вилки и окончания репликации, выявив ключевые факторы, участвующие в координации репликации и транскрипции. TRIPn-seq является одним из немногих методов, способных непосредственно обнаруживать совместное занятие транскрипции и репликации, что значительно расширяет наши представления о динамической организации репликации и транскрипции ДНК в физиологических и патологических^{условиях.} Несмотря на ценную информацию, которую дают эти методы, основанные на секвенировании, их высокая стоимость и трудоемкий характер ограничивают их более широкое применение. Поэтому крайне важно разработать более точный, высокочувствительный, удобный и быстрый метод обнаружения для визуализации и количественного определения TRC на уровне отдельных клеток.

Анализ близкого лигирования in situ (PLA), также известный как технология Duolink PLA, является мощным методом оценки физической близости белков-мишеней в срезах тканей или клеточных культурах. Эта методика генерирует сигнал только тогда, когда два белка или белковых комплекса находятся в пределах 40 нм друг от друга. Для этого требуются два первичных антитела против целевых белков, каждый из которых принадлежит разным видам (например, мышь/кролик, кролик/коза или мышь/коза). После инкубации образца с этими первичными антителами применяются вторичные антитела, известные как зонды PLA (один ПЛЮС и один МИНУС). В отличие от обычных вторичных антител, которые связываются с постоянными областями первичных антител, зонды PLA ковалентно связаны со специфическими праймерами ДНК. Когда белки-мишени находятся в непосредственной близости (менее 40 нм), соединительный олигонуклеотид может гибридизоваться с обоими зондами PLA, облегчая ферментативное лигирование присоединенных к ним олигонуклеотидов в полноразмерную молекулу ДНК. Эта новообразованная ДНК служит суррогатным маркером для обнаруженного белкового взаимодействия и выступает в качестве матрицы для амплификации. Затем амплифицированный продукт визуализируют с помощью флуоресцентно меченных олигонуклеотидных зондов. Если белки находятся на расстоянии более 40 нм друг от друга, зонды PLA не могут сформировать матрицу ДНК, что приводит к отсутствию обнаруживаемого сигнала. Принципиальная схема PLA изображена на рисунке 1. Близость и/или взаимодействие визуализируются с помощью флуоресцентной микроскопии в виде флуоресцентных точек, а количество и интенсивность этих точек могут быть количественно определены. С момента своего изобретения в 2002 году PLA стал популярным для мониторинга белковых взаимодействий благодаря своей высокой чувствительности и специфичности. В отличие от анализов, основанных на секвенировании, PLA требует лишь небольшого количества образцов, что делает его благоприятным для анализа дефицитных образцов.

Исследования показали, что экспрессия онкогенной мутации KRAS G12D приводит к конфликтам транскрипции и репликации (TRCs)^22,23. Например, исследование, представленное Meng et ^al.23, показывает, что эктопическая экспрессия KRAS G12D в клетках протокового эпителия поджелудочной железы человека (HPNE) усиливает TRC и связанные с TRC R-петли. Чтобы обеспечить обнаружение коллизий между механизмами транскрипции и репликации RNAPII в клеточных линиях, мы предоставляем протокол, специально разработанный для этой цели. Плазмида KRAS (G12D) и векторный контроль трансфицируются в эпителиальные клетки легких человека BEAS-2B, а экспрессия KRAS (G12D), наряду с повреждением ДНК (γH2AX), подтверждается вестерн-блоттингом. Накопление R-петли подтверждено анализом S9.6 dot blot, который в совокупности указывает на накопление препятствий репликации и нестабильность генома в клетках, экспрессирующих KRAS (G12D). Наконец, клетки фиксируются на предметных стеклах для анализа PLA. Для локализованного обнаружения коллизий клетки сначала окрашивают первичными антителами RNAPII и PCNA, а затем окрашивают вторичными антителами, конъюгированными с зондами PLA. Кольцевая молекула ДНК образуется в результате успешного лигирования, служа матрицей для последующей амплификации по скользящему кругу (RCA). Затем предметные стекла монтируются с помощью соответствующих монтажных сред и визуализируются под флуоресцентным микроскопом. Изображения могут быть проанализированы с помощью ImageJ.

1. Производство лентивируса и его трансдукция в линию клеток-мишеней

1. Производство лентивирусов²⁴
   1. Засейте 293T упаковочных ячеек при 3 × 10⁶ клеток на 10 см-пластину в модифицированную орлиную среду с высоким содержанием глюкозы Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM; полная среда). Выращивайте клетки при температуре 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5% содержанием_CO2 в течение дополнительных 18-20 часов.
   2. В двух пробирках объемом 1,5 мл приготовьте смесь ДНК из 24 мкг плазмидной ДНК в 500 мкл Opti-MEM (восстановленная сывороточная среда), которая содержит 9,2 мкг psPAX2, 2,8 мкг pMD2.G, а также 12 мкг плазмиды pLVX-KRAS или пустого вектора соответственно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку эндотоксины значительно снижают эффективность трансфекции, рекомендуется удалять эндотоксин из плазмиды во время очистки.
   3. Разведите 144 мкл полиэтиленимина (ПЭИ; 1 мг/мл) в 1 мл восстановленной сывороточной среды, перемешайте и инкубируйте в течение 5 минут при комнатной температуре (ОТ).
   4. Добавьте 500 μл разбавленного PEI по каплям в разбавленную смесь ДНК, осторожно переворачивая пробирку. Инкубируйте смеси PEI/DNA в течение 15 минут при RT.
   5. Во время инкубации аккуратно отсасывайте среду из ранее засеянных 10 см пластин. Замените 10 мл свежего полного DMEM.
   6. После инкубации медленно пипетируйте ДНК: перемешайте ДНК: ПЭИ на 10-сантиметровые пластины, следя за тем, чтобы клетки не отделились.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ПЭИ является широко используемым реагентом для трансфекции, но его концентрация должна быть тщательно оптимизирована, чтобы сбалансировать эффективность трансфекции и цитотоксичность. Несмотря на более высокую стоимость Липофектамина 3000 (реагент для трансфекции), он продемонстрировал более высокую эффективность трансфекции и меньшую цитотоксичность по сравнению с PEI в некоторых клеточных линиях, что привело к улучшению вирусной продукции. Электропорация является еще одной альтернативой, которая использует электрические импульсы для введения нуклеиновых кислот в клетки. Несмотря на свою эффективность, он требует специализированного оборудования и может быть более трудоемким.
   7. Выращивайте клетки в течение 18 ч, затем осторожно замените трансфекционную среду свежей 10 мл среды DMEM Complete, содержащей 25 мкМ хлорохина.
   8. Через 72 ч после трансфекции соберите питательную среду, содержащую вирусную частицу. Извлеките упаковочные элементы 293T путем центрифугирования при 500 х г в течение 5 мин.
   9. Соберите надосадочную жидкость и отфильтруйте ее через фильтр из полиэфирсульфона (PES) 0,45 мкм. Используйте непосредственно вирусный надосадочный ток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вирусный надосадочный продукт следует аликвотировать и заморозить в жидком азоте и хранить при температуре -80 °C во избежание потери титра.
2. Лентивирусная инфекция клеток-мишеней
   1. Засейте 2 ×^{10 6} клеток-мишеней BEAS-2B в две 6-сантиметровые пластины и вырастите при 37 °C, 5%_CO2 в течение ночи. После трансдукции убедитесь, что клетки BEAS-2B слиты примерно на 70%.
   2. Осторожно удалите старую среду и добавьте соответствующие 0,5 мл KRAS или векторных лентивирусных частиц вместе с 3 мл свежей полной среды RPMI-1640 в две пластины соответственно.
   3. Выращивайте клетки при 37 °C в течение 18-20 часов в инкубаторе с 5% содержанием_CO2 . Замените старую среду, содержащую лентивирусные частицы, 3,5 мл свежей предварительно подогретой полной питательной среды. После 72 ч трансдукции соберите клетки для следующего анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если ночная инкубация с вирусом вызывает токсичность, время инкубации можно сократить до 4 часов. Для достижения баланса эффективности трансдукции и клеточного здоровья необходимо рассмотреть следующие стратегии: (1) Оптимизация множественности инфекции; (2) Использовать высококачественные вирусные препараты; (3) Использование поликатионов (таких как полибрен) для повышения эффективности, что позволяет использовать более низкие титры вирусов и снижать потенциальную токсичность; (4) Для долгосрочных исследований рассмотрите возможность использования индуцируемых систем экспрессии для временного контроля экспрессии трансгенов, снижая нагрузку на клетки и сводя к минимуму потенциальную токсичность.

2. Верификация повреждений ДНК, полученных из KRAS (G12D) и образования R-петли

1. Подтвердите экспрессию генов и повреждение ДНК с помощью анализа WB
   1. Отсадите питательную среду из пластин.
   2. Аккуратно промойте клетки 1x фосфатно-солевым буфером (PBS), чтобы удалить остатки среды или мусора.
   3. Добавьте небольшой объем 1x PBS, чтобы клетки оставались влажными в процессе соскабливания.
   4. Используйте скребок для клеток, держа его под углом, и аккуратно соскребите клетки с поверхности в последовательном направлении.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны и не оказывайте слишком большое давление, которое может повредить клетки.
   5. Наклоните планшет и с помощью пипетки соберите клеточную суспензию в пробирку и вращайте клетки при давлении 500 x g в течение 5 минут. Выбросьте надосадочную жидкость.
   6. Приготовьте 1x буфер RIPA, разбавив 2x буфер RIPA (см. Таблицу 1), и добавьте коктейль ингибиторов протеазы и коктейль ингибиторов фосфатазы непосредственно перед использованием.
   7. Лизируйте клеточную гранулу с помощью предварительно охлажденного буфера RIPA (1x) и инкубируйте в течение 30 минут на льду. Удалите мусор центрифугированием при давлении 15 000 x g в течение 10 минут. Соберите надосадочную жидкость и измерьте концентрацию белка с помощью анализа Брэдфорда.
   8. Добавьте 4 буфера для загрузки образцов додецилсульфата натрия (SDS) в надосадочную жидкость и денатурируйте белки на 5 минут при 95 °C. Сначала отделите 40 г белка от каждого образца в геле для электрофореза (PAGE) с 12,5% SDS-полиакриламидным гелем для электрофореза (PAGE), а затем перенесите его на мембраны из нитроцеллюлозы размером 0,2 мкм (см. Таблицу материалов).
   9. После завершения переноса заблокируйте мембраны с помощью блокирующего буфера (5% обезжиренного молока в трис-буферном физрастворе, содержащем 0,1% Tween 20 [TBST; Таблица 1]) за 1 ч.
   10. Кратковременно промойте мембрану TBST, а затем инкубируйте мембрану с первичными антителами против FLAG-tag (разведение 1:2500 в PBST) и γH2AX (разведение 1:1000 в PBST) (см. Таблицу материалов) в течение ночи при 4 °C.
   11. Удалите первичные антитела и промойте мембрану с помощью TBST 3 раза, каждый раз в течение 10 минут.
   12. Погрузите мембраны в разведенные вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP) (1:5000 в буфере TBST, содержащем 5% обезжиренного молока) на 1 ч при комнатной температуре (ЛТ).
   13. Промойте мембрану TBST 3 раза, каждый раз в течение 10 минут.
   14. Визуализируйте уровни белка с помощью реагентов с усиленной хемилюминесценцией (ECL) (см. Таблицу материалов).
2. Определение R-петли с помощью Dot blot²⁵​
   1. Отсадите питательную среду из пластин.
   2. Аккуратно промойте ячейки с помощью 1x PBS, чтобы удалить остатки среды или мусора.
   3. Добавьте небольшой объем 1x PBS, чтобы клетки оставались влажными в процессе соскабливания.
   4. Используйте скребок для клеток, держа его под углом, и аккуратно соскребите клетки с поверхности в последовательном направлении.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны и не оказывайте слишком большое давление, которое может повредить клетки.
   5. Наклоните планшет и с помощью пипетки соберите клеточную суспензию в пробирку и вращайте клетки при давлении 500 x g в течение 5 минут. Выбросьте надосадочную жидкость.
   6. Лиз 2 × 10⁶ клеток с 300 мкл ледяного буфера для лизиса клеток (см. Таблицу 1). Выдерживать на льду в течение 10 минут. Отжимайте при 500 x g в течение 5 минут при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость. Гранула содержит ядра.
   7. Используйте наконечник с широким отверстием для повторного суспендирования каждой гранулы с 300 мкл предварительно охлажденного буфера для ядерного лизиса (см. Таблицу 1).
   8. Добавьте 3 мкл 20 мг/мл протеиназы К (см. Таблицу материалов) в каждый образец и разваривайте в течение 3-5 ч при 55 °C.
   9. Добавьте 100 μL элюирующего буфера (см. Таблицу 1) в каждую пробирку и тщательно перемешайте.
   10. Добавьте 400 мкл фенола: хлороформа: изоамилового спирта (25:24:1 pH 8,0) в каждую пробирку. После энергичного вихря центрифугируйте при 12 000 x g в течение 5 мин при 4 °C, чтобы отделить ДНК от другого содержимого клеток.
   11. Осторожно перенесите верхнюю водную фазу в новые трубки.
   12. Осаждение ДНК путем добавления в образец 1/10 объема 3 М ацетата натрия (pH 5,2) и 2,5 объема предварительно охлажденного 100% этанола. Тщательно перемешайте и выдержите в течение 4 часов или в течение ночи при температуре -20 °C.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление гликогена (см. Таблицу материалов) в образец может увеличить восстановление ДНК после осаждения этанола. Конечная концентрация гликогена составляет около 0,05-1 мкг/мкл.
   13. Гранулируйте ДНК центрифугированием при 12 000 x g в течение 30 минут при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость, не потревожив гранулы.
   14. Промойте гранулу 1 мл ледяного 70% этанола и снова центрифугируйте в течение 5-15 минут при 12 000 x g при 4 °C.
   15. Осторожно выбросьте надосадочную жидкость, чтобы не повредить гранулу ДНК.
   16. Высушите гранулу ДНК на воздухе в течение 5-10 минут.
   17. Растворите гранулу ДНК, добавив 50 мкл предварительно подогретого TE буфера (pH8,0), и инкубируйте в течение 30 минут при 37 °C. Измерьте концентрацию ДНК в каждом образце.
   18. Приготовьте разведения ДНК до желаемых концентраций в TE-буфере (от 5 нг/мкл до 200 нг/мкл). Равномерно нанесите 20 мкл каждого образца на положительно заряженную нейлоновую мембрану с помощью аппарата для дот-блоттинга.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Для обнаружения R-петель с помощью анализа дот-блоттинга рекомендуется применять примерно 500 нг геномной ДНК на точку. Показано, что это количество обеспечивает достаточную чувствительность для детектирования РНК-ДНК-гибридов при использовании моноклонального антитела S9.6, которое специфически связывается с этими структурами.
   19. Иммобилизуйте ДНК путем сшивки ДНК с нейлоновой мембраной (см. Таблицу материалов) с помощью УФ-сшивающего агента с настройкой «Auto Crosslink» (1 200 μJ x 100) (см. Таблицу материалов).
   20. Погрузите мембраны в блокирующий буфер (см. Таблицу 1) на 1 час при комнатной температуре. Затем коротко промойте мембраны с помощью TBST.
   21. В течение ночи инкубируйте мембрану с первичным антителом (см. Таблицу материалов) при 4°C. Разведение S9.6 составляет 1:1000 в TBST, содержащем 5% BSA.
   22. Удалите первичное антитело и промойте 3 раза TBST, причем каждый раз в течение 10 минут.
   23. Инкубируют мембрану с HRP-конъюгированным вторичным антителом в 5% BSA в TBST при комнатной температуре в течение 1 ч.
   24. Удалите вторичное антитело и промойте 3 раза TBST, причем каждый раз по 10 мин.
   25. Визуализируйте уровни R-петли с помощью реагентов ECL (усиленная хемилюминесценция) (см. Таблицу материалов).

3. Пробирный анализ PLA

1. Подготовка клеток
   Примечание: Трансдукция клеток онкогеном KRAS G12D приводит к увеличению TRC, о чем свидетельствует положительный сигнал PLA. Этот метод эффективно отличает онкоген-индуцированные TRC от фоновых уровней без необходимости выбора антибиотиков. Тем не менее, осуществление выбора антибиотика после трансдукции может усилить общий сигнал за счет обогащения популяции успешно трансдуцированных клеток, тем самым улучшая чувствительность и специфичность анализа.
   1. Поместите защитные стекла диаметром 12 мм в каждую лунку 12-луночного планшета.
   2. Посейте инфицированные лентивирусом клетки в эти лунки через 24 ч после заражения и поддерживайте клетки на покровных стеклах в 500 мкл полной среды RPMI-1640 при температуре 37 °C с 5%_CO2.
   3. Оптимальный) Если план эксперимента включает выбор антибиотика для обогащения успешно трансдуцированных клеток, добавьте соответствующий антибиотик в питательную среду на этом этапе.
   4. Следите за клетками, чтобы убедиться, что они достигают примерно 60% слияния через 48-72 часа после заражения.
   5. Осторожно удалить RPMI-1640 и предварительно извлечь клетки холодным 0,5% NP-40 на 4 мин на льду.
   6. Добавьте 500 мкл фиксирующего буфера (см. Таблицу 1) непосредственно для фиксации ячеек на 15 мин при ОТ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется не мыть клетки перед этапом фиксации, так как это может привести к их отделению от поверхности, на которой они растут, особенно если клеточная линия чувствительна к отслоению; Поэтому часто предпочтительнее прямое добавление фиксирующего раствора.
   7. Остановите реакцию, удалив фиксирующий буфер и тщательно промыв клетки 1x PBS 3 раза.
   8. Отсадите PBS и добавьте в клетки 500 мкл предварительно охлажденного 100% метанола.
   9. Пермеабилизируйте клетки путем инкубации при -20 °C в течение 15-30 минут.
   10. Блокируйте ячейки с помощью блочного решения Duolink на 1 час в RT.
2. Окрашивание антителами
   1. Разведите мышиный анти-RNAPII 8WG16 (1:500) и кроличий анти-PCNA (D3H8P) (1:500) в буфере для разведения антител Duolink. Инкубируйте клетки со смесью первичных антител в течение ночи при 4 °C в камере влажности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте протокол PLA, используя только одно из первичных антител (либо анти-RNAPII, либо анти-PCNA), исключая другое. Это помогает идентифицировать любой фоновый сигнал, возникающий в результате неспецифических взаимодействий отдельных антител или зондов PLA.
   2. Аккуратно удалите первичные антитела со стекол с помощью безворсового листа макулатуры, не касаясь клеток. Затем промойте клетки 3 раза 1x PBS.
   3. Приготовьте зонды PLA (или вторичное антитело) в соответствии со следующей процедурой (см. Таблицу 2), затем перемешайте и дайте постоять 20 минут при комнатной температуре.
   4. Добавьте вторичную смесь антител на предметные стекла и инкубируйте во влажной камере в течение 2 ч при РТ.
3. Лигирование и амплификация
   1. Выбросьте вторичную смесь антител и дважды промойте предметные стекла 1x буфером А каждый в течение 5 минут.
   2. Приготовьте смесь для лигирования в соответствии со следующей процедурой (см. Таблицу 2).
   3. Нанесите 15 мкл смеси для лигирования на каждое предметное стекло и инкубируйте при температуре 37 °C в течение 30 минут в камере влажности.
   4. Дважды вымойте предметные стекла с 1x буфером A каждая в течение 2 минут.
   5. Приготовьте смесь для усиления в соответствии со следующей процедурой (см. Таблицу 2).
   6. Нанесите 15 мкл амплификационной смеси на каждое предметное стекло и инкубируйте в течение 100 мин при 37 °C в камере с влажностью. Выбросьте смесь для усиления и дважды промойте 1x Buffer B каждый в течение 10 минут.
   7. Промойте предметные стекла один раз с 0,01x буфером B в течение 1 минуты.
   8. Отберите буфер B и установите направляющие в монтажную среду Duolink In Situ с DAPI.
4. Анализ изображений и определение пороговых значений:
   1. Количественное определение количества очагов PLA с помощью ImageJ. Программное обеспечение для автоматизированного анализа изображений может помочь в объективной количественной оценке сигналов PLA. Выберите порог в 3 или более очагов PLA на ядро в качестве порога, потому что менее 1% контрольных клеток приобретают 3 очага PLA в невозмутимых условиях.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку пороговое значение определяется экспериментально путем анализа нескольких образцов и контрольных образцов для учета вариабельности, для обеспечения сопоставимости необходимо поддерживать согласованные настройки изображения (например, время экспозиции, усиление) для всех образцов.

γH2AX служит биомаркером повреждения ДНК. Сверхэкспрессия KRAS (G12D) нарушает стабильность генома в этих клетках, о чем свидетельствует повышенный сигнал γH2AX при вестерн-блоттинге (рис. 2A). Кроме того, усиленный сигнал S9.6 dot blot в клетках, экспрессирующих KRAS (G12D), по сравнению с контрольной группой векторов (рис. 2B) указывает на то, что онкогенная экспрессия KRAS приводит к накоплению аберрантных R-петель, которые могут способствовать образованию разрывов ДНК.

На рисунке 3 представлены репрезентативные изображения, полученные с помощью анализа бесконтактного лигирования (PLA). На этих изображениях ярко-зеленые точки внутри ядер указывают на то, что расстояние между PCNA-ассоциированным репликационным комплексом и транскрипционным комплексом RNAPII составляет менее 40 нм. В клетках векторного контроля зеленые точки почти не обнаруживаются, тогда как в клетках, экспрессирующих KRAS (G12D), наблюдается несколько зеленых точек на ядро. Это говорит о том, что онкогенная экспрессия KRAS увеличивает частоту встреч между RNAPII и репликационными комплексами. Эти результаты PLA согласуются с результатами анализа вестерн-блоттинга (Рисунок 2A) и дот-блоттинга (Рисунок 2B).

Таким образом, эти результаты демонстрируют, что анализ близости-лигирования эффективно выявляет онкоген-индуцированные конфликты между RNAPII и механизмом репликации. Эта возможность обладает значительным потенциалом для будущих применений, позволяя количественно определять TRC в различных типах образцов в результате аберрантной экспрессии онкогенов. Несмотря на наличие определенных ограничений, перспективы этого метода многообещающие, особенно с поправкой на экспериментальные условия, адаптированные к разным образцам.

Рисунок 1: Схематическое изображение анализа близости-лигирования in situ . (1) Определите парных партнеров по взаимодействию. (2) Инкубируйте образец с парными первичными антителами, нацеленными на желаемые белки, с последующими вторичными антителами, конъюгированными с олигонуклеотидными зондами. (3) Вводятся олиго-коннекторы, которые комплементарны олигону, прикрепленным к каждому зонду PLA. Если целевые белки находятся достаточно близко, то олигонуклеотидные последовательности, прикрепленные к зондам PLA, будут находиться в непосредственной близости. (4) Если белки-мишени находятся в непосредственной близости (обычно <40 нм), олигонуклеотиды на зондах PLA вступают в контакт и могут быть лигированы с помощью ДНК-лигазы с образованием кольцевой молекулы ДНК. (5) Выполните RCA с использованием полимеразы для амплификации кольцевой ДНК, создавая длинную, повторяющуюся цепь ДНК. Гибридизируйте флуоресцентно меченные олигонуклеотиды с продуктом амплифицированной ДНК, обеспечивая визуализацию. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Повреждение ДНК и накопление R-петли в клетках экспрессии KRAS (G12D). (A) Репрезентативный вестерн-блоттинг полноклеточных лизатов из клеток BEAS-2B, иллюстрирующий повышение уровня γH2AX после 72 ч экспрессии KRAS G12D. Для оценки повреждения ДНК использовали блот γH2AX, а ACTB служил в качестве контроля нагрузки. Блоттинг FLAG подтвердил экспрессию KRAS G12D. (B) Репрезентативный точечный блоттинг формирования R-петли в клетках BEAS-2B, сравнение условий с экспрессией KRAS G12D и без нее. Антитело S9.6 использовалось для обнаружения R-петель, в то время как антитело против ДНК использовалось для количественного определения общего количества ДНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Накопление TRC в экспрессирующих клетках KRAS (G12D). Репрезентативные изображения из анализа PLA. Ярко-зеленые очаги в клетках, экспрессирующих KRAS G12D, указывают на столкновения между PCNA и РНК-полимеразой II (RNAPII). Иммуноцитохимия PLA демонстрирует высокие TRC в клетках, экспрессирующих KRAS G12D, по сравнению с векторными клетками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Таблица 1: Подготовка буфера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 2: Подготовка реакции PLA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 3: Поиск и устранение неисправностей при анализе PLA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Механизм транскрипции RNAPII может создавать препятствия для прогрессирования репликационной вилки^{ДНК 26,27}, способствуя образованию TRC и повреждению ДНК, особенно в раковых клетках^28,29. Расшифровка белков, которые регулируют TRC, и понимание подробных механизмов может помочь нам понять, как происходят эти вредные события, и направить разработку новых терапевтических подходов в будущем. Таким образом, для полного понимания TRC необходимы быстрые и надежные методы обнаружения TRC.

В этой статье мы описываем процедуру изучения частоты конфликтов транскрипции и репликации (TRC) с использованием анализа PLA-анализа in situ . Такой подход позволяет легко оценить частоту TRC при наличии онкогенной передачи сигналов в клетках. Для этого не требуется дорогостоящее оборудование или большое количество исходного материала. Наш протокол также включает в себя S9.6 dot blot и Western blot для подтверждения специфичности сигнала TRC, полученного из экспрессии KRAS (G12D).

Этот анализ основан на распознавании репликационных и транскрипционных комплексов RNAPII парами конъюгатов антитело-олигонуклеотид (зондов PLA), которые вместе образуют круги ДНК, служащие шаблонами для локализованных реакций амплификации катящихся кругов. Требование двойного распознавания белков-мишеней повышает селективность за счет устранения любой перекрестной реактивности, которая не является общей для пар антител, обеспечивая однозначные и воспроизводимые результаты. Таким образом, специфичность и сильное сродство антител имеют важное значение для успеха анализа PLA. Крайне важно оптимизировать условия для функционирования антител в образце, которые включают (i) условия фиксации клеток и пермеабилизации, (ii) блокирующий раствор и (iii) первичное разведение антител. Надлежащий негативный контроль имеет решающее значение, так как (i) нокдаун-контроль может проверить специфичность первичных антител, и (ii) контроль с изотипом IgG может проверить специфичность зондов PLA.

Выявлены многие из распространенных проблем при анализе PLA. К ним относятся отсутствие ожидаемого сигнала и наличие неспецифического фонового сигнала. Краткое изложение возможных причин и решений этих проблем представлено в таблице 3.

Примечательно, что этот метод может подтвердить только физическую близость между PCNA и РНК-полимеразой II; однако эта близость не обязательно подразумевает возникновение вредных разрывов ДНК. Еще одним ключевым ограничением является то, что этот метод не может предоставить информацию о конкретных локусах хроматина, где эти два комплекса взаимодействуют. Полное понимание разрывов ДНК, связанных с транскрипцией, требует более сложного анализа. Используя технологию секвенирования нового поколения, разработка TRIPn-seq является одним из немногих методов, способных точно определить совместную занятость транскрипции и репликации, применимых к любым пролиферирующим клеткам^21,29. Однако, несмотря на информативность данного метода, его высокая стоимость и трудоемкость ограничивают его доступность.

Таким образом, наши исследования показывают, что in situ PLA является эффективным подходом к определению непосредственной близости механизмов репликации и транскрипции RNAPII в фиксированных клетках как с количественным, так и с пространственным разрешением. Специфическое использование антител PCNA и RNAPII (8WG16) доказало свою эффективность для изучения TRC в клетках BEAS-2B. В дополнение к RNAPII-ассоциированным TRC, анализ in situ PLA также может быть использован для исследования RNAPI и RNAPIII-ассоциированных TRC в клинических и исследовательских условиях, при условии применения соответствующего контроля и корректировки.

В недавно опубликованном исследовании³⁰ была представлена новая терапевтическая стратегия для лечения рака, характеризующегося внехромосомной ДНК (экДНК). Исследователи увеличили конфликты транскрипции и репликации (TRC), чтобы использовать уязвимости в ecDNA-положительных раковых клетках, избирательно нацеливаясь на них, щадя нормальные клетки. Оценка статуса TRC с использованием метода PLA может дать ценную информацию о стабильности генома раковых клеток пациента. Мониторинг статуса TRC во время лечения может помочь оценить эффективность терапии, направленной на TRC. Таким образом, интеграция оценки TRC на основе PLA в подходы персонализированной медицины обещает улучшить диагностику, прогнозирование и мониторинг лечения рака, предлагая более глубокое понимание молекулярной динамики в отдельных опухолях.

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Эта работа была поддержана финансированием стартапа Университета Южного Китая.