Ensayo de ligadura de proximidad para estudiar los conflictos de transcripción-replicación derivados de oncogenes

En este trabajo se presenta un método sensible y específico para detectar conflictos de transcripción-replicación (TRCs) inducidos por oncogenes mediante el ensayo de ligadura de proximidad (PLA). Este enfoque aprovecha los anticuerpos específicos dirigidos a PCNA y fosfo-CTD RNAPII, lo que permite evaluar la prevalencia de TRC entre la transcripción de la ARN polimerasa II y la maquinaria de replicación del ADN.

Tanto la replicación del ADN como la transcripción del ARN utilizan el ADN genómico como plantilla, lo que requiere la separación espacial y temporal de estos procesos. Los conflictos entre la replicación y la maquinaria de transcripción, denominados conflictos de transcripción-replicación (TRC), representan un riesgo considerable para la estabilidad del genoma, un factor crítico en el desarrollo del cáncer. Si bien se han identificado varios factores que regulan estas colisiones, sigue siendo difícil identificar las causas primarias debido a las limitadas herramientas para la visualización directa y la interpretación clara. En este estudio, visualizamos directamente las TRC utilizando un ensayo de ligadura de proximidad (PLA), aprovechando los anticuerpos específicos contra el PCNA y la CTD fosforilada de la ARN polimerasa II. Este enfoque permite la medición precisa de las TRC entre los procesos de replicación y transcripción mediados por la ARN polimerasa II. El método se mejora aún más a través de cebadores de ADN conjugados covalentemente con estos anticuerpos, junto con la amplificación por PCR mediante sondas fluorescentes, proporcionando un medio altamente sensible y específico para detectar TRC endógenos. La microscopía de fluorescencia permite la visualización de estos conflictos, ofreciendo una poderosa herramienta para estudiar los mecanismos de inestabilidad del genoma asociados con el cáncer. Esta técnica aborda la brecha en la visualización directa de TRC, lo que permite un análisis y una comprensión más completos de los procesos subyacentes que impulsan la inestabilidad del genoma en las células.

El genoma sirve como plantilla para los procesos biológicos esenciales, incluida la replicación y la transcripción. En las células sanas, la transcripción del ARN y la maquinaria de replicación del ADN suelen cooperar y están segregadas espacial y temporalmente 1,2,3,4. Sin embargo, en condiciones patológicas, como la sobreexpresión de oncogenes, esta cooperación armoniosa puede verse interrumpida.

Los oncogenes a menudo conducen niveles elevados de transcripción, lo que aumenta la probabilidad de colisiones entre la maquinaria de transcripción y replicación⁵. Algunos oncogenes alteran la arquitectura de la cromatina, haciéndola más accesible para la transcripción, pero potencialmente dificultando la progresión de la horquilla de replicación⁵. Además, la activación de oncogenes puede inducir estrés de replicación al acelerar el ciclo celular⁶. La actividad de la ARN polimerasa II (RNAPII) se eleva significativamente durante la transición de fase G1/S debido a la fosforilación de Rb de la quinasa dependiente de ciclina (CDK), que libera factores de transcripción E2F que promueven la transcripción de proteínas esenciales, incluidas ciclinas, CDK y genes de mantenimiento⁷. La expresión génica de las histonas alcanza su punto máximo durante la fase S, coincidiendo con la replicación del ADN⁸. Además, la transcripción completa de algunas transcripciones muy largas requiere más de un ciclo celular⁹. Con cada entrada en la fase S, la actividad simultánea de la maquinaria de transcripción y replicación en las mismas regiones genómicas puede dar lugar a encuentros perjudiciales, lo que conduce a conflictos. Estos conflictos son una fuente intrínseca primaria de inestabilidad del genoma, que está estrechamente asociada con la tumorigénesis. La forma en que la maquinaria de replicación se coordina con la transcripción de RNAPII para evitar choques dañinos y mantener la estabilidad genómica sigue siendo una pregunta importante. Por lo tanto, la visualización directa de los conflictos de transcripción-replicación (TRC) asociados a RNAPII se ha vuelto esencial para comprender los mecanismos moleculares que resuelven estos conflictos y, finalmente, puede sentar las bases para aprovechar estos conflictos con fines terapéuticos.

Los conflictos de transcripción-replicación (TRC) pueden surgir en dos orientaciones: frontal, donde la transcripción y la replicación progresan entre sí, y codireccional, donde se mueven en la misma dirección. Las colisiones frontales son mucho más destructivas que las codireccionales 10,11,12,13. La formación de híbridos ADN-ARN (R-loops) se ha identificado como uno de los principales impulsores de las TRC; así, una cantidad considerable de investigaciones han inferido la presencia de TRCs evaluando la ocurrencia de R-loops y sus regiones en respuesta a la replicación y/o transcripción desregulada ^10,11. Sin embargo, si la acumulación de bucles R derivados de la transcripción sirve como un obstáculo proporcional para la replicación y se correlaciona directamente con las TRC sigue siendo una cuestión no resuelta. Los investigadores también han investigado las TRC mediante el análisis de la dinámica de las horquillas de replicación. Por ejemplo, la electroforesis bidimensional en gel de genes reporteros puede descubrir el replicsoma específico del locus en pausa¹², mientras que los ensayos de fibras de ADN permiten a los investigadores examinar las alteraciones en la velocidad de la horquilla de replicación, la densidad de origen y la asimetría de la horquilla¹³. El avance de la tecnología de secuenciación de próxima generación ha llevado al desarrollo de varios métodos innovadores, como la secuenciación de fragmentos de Okazaki (Ok-seq)^14,15, la secuenciación del sitio de iniciación (ini-seq)^16,17, la secuenciación de cadenas nacientes cortas (SNS-seq)¹⁸, Repli-seq19 y la secuenciación de uso de la polimerasa (Pu-seq)²⁰. Estas técnicas han proporcionado perfiles de todo el genoma del uso del origen de la replicación, la direccionalidad de la horquilla y la terminación de la replicación, revelando factores clave involucrados en la coordinación de la replicación y la transcripción. TRIPn-seq es uno de los pocos métodos capaces de detectar directamente la co-ocupación de la transcripción y la replicación, ampliando significativamente nuestra comprensión de la organización dinámica de la replicación y transcripción del ADN en condiciones fisiológicas y patológicas²¹. A pesar de los valiosos conocimientos que proporcionan estos métodos basados en la secuenciación, su alto costo y su naturaleza intensiva en tiempo limitan su aplicación más amplia. Por lo tanto, es crucial establecer un método de detección más definitivo, altamente sensible, conveniente y rápido para visualizar y cuantificar las TRC a nivel de una sola célula.

El ensayo de ligadura de proximidad (PLA) in situ , también conocido como tecnología PLA Duolink, es un método potente para evaluar la proximidad física de las proteínas objetivo en secciones de tejido o cultivos celulares. Esta técnica genera una señal solo cuando dos proteínas o complejos de proteínas están a menos de 40 nm entre sí. Requiere dos anticuerpos primarios contra las proteínas objetivo, cada uno de una especie diferente (por ejemplo, ratón/conejo, conejo/cabra o ratón/cabra). Después de incubar la muestra con estos anticuerpos primarios, se aplican anticuerpos secundarios conocidos como sondas PLA (uno PLUS y otro MINUS). A diferencia de los anticuerpos secundarios regulares que se unen a las regiones constantes de los anticuerpos primarios, las sondas PLA se unen covalentemente a cebadores de ADN específicos. Cuando las proteínas objetivo están muy cerca (menos de 40 nm), un oligonucleótido conector puede hibridarse con ambas sondas de PLA, lo que facilita la ligadura enzimática de sus oligonucleótidos unidos en una molécula de ADN de longitud completa. Este ADN recién formado sirve como un marcador sustituto para la interacción de proteínas detectada y actúa como un molde para la amplificación. A continuación, el producto amplificado se visualiza utilizando sondas de oligonucleótidos marcadas con fluorescencia. Si las proteínas están separadas por más de 40 nm, las sondas PLA no pueden formar una plantilla de ADN, lo que resulta en una señal no detectable. El diagrama esquemático del PLA se muestra en la Figura 1. La proximidad y/o interacción se visualizan mediante microscopía de fluorescencia como puntos fluorescentes, y se puede cuantificar el número y la intensidad de estos puntos. Desde su invención en 2002, el PLA se ha vuelto popular para monitorear las interacciones de las proteínas debido a su alta sensibilidad y especificidad. A diferencia de los ensayos basados en secuenciación, el PLA requiere solo pequeñas cantidades de muestras, lo que lo hace favorable para analizar muestras escasas.

Los estudios han demostrado que la expresión de la mutación oncogénica KRAS G12D conduce a conflictos de transcripción-replicación (TRCs)^22,23. Por ejemplo, la investigación presentada por Meng et ^al.23 indica que la expresión ectópica de KRAS G12D en células epiteliales ductales pancreáticas humanas (HPNE) aumenta las TRC y los R-loops relacionados con TRC. Para permitir la detección de colisiones entre la transcripción de RNAPII y la maquinaria de replicación en líneas celulares, proporcionamos un protocolo desarrollado específicamente para este propósito. El plásmido KRAS (G12D) y el control del vector se transfectan en células epiteliales BEAS-2B del pulmón humano, y la expresión de KRAS (G12D), junto con el daño en el ADN (γH2AX), se verifica mediante Western blot. La acumulación de R-loop se confirma mediante el análisis de transferencia de puntos S9.6, que en conjunto indica la acumulación de obstáculos de replicación e inestabilidad del genoma en células que expresan KRAS (G12D). Finalmente, las células se fijan en portaobjetos para el ensayo de PLA. Para la detección localizada de colisiones, las células se tiñen primero con anticuerpos primarios RNAPII y PCNA, seguido de una tinción con anticuerpos secundarios conjugados con sondas de PLA. Una molécula circular de ADN se forma a través de una ligadura exitosa, que sirve como molde para la posterior amplificación del círculo rodante (RCA). A continuación, los portaobjetos se montan con los medios de montaje adecuados y se visualizan bajo un microscopio de fluorescencia. Las imágenes se pueden analizar con ImageJ.

1. Producción y transducción de lentivirus a la línea celular diana

1. Producción de lentivirus²⁴
   1. Semillas 293T células de empaquetamiento a 3 × 10⁶ células por placa de 10 cm en medio Eagle modificado de Dulbecco con alto contenido de glucosa (DMEM; medio completo). Cultive las células a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO₂ durante 18-20 h adicionales.
   2. En dos tubos de 1,5 mL, prepare una mezcla de ADN de un total de 24 μg de ADN plásmido en 500 μL de Opti-MEM (medio sérico reducido) que contenga 9,2 μg de psPAX2, 2,8 μg de pMD2.G, junto con 12 μg de plásmido pLVX-KRAS o vector vacío respectivamente.
      NOTA: Debido a que las endotoxinas disminuyen significativamente la eficiencia de la transfección, se recomienda eliminar la endotoxina del plásmido durante la purificación.
   3. Diluir 144 μL de polietilenimina (PEI; 1 mg/mL) en 1 mL de medio sérico reducido, mezclar e incubar durante 5 min a temperatura ambiente (RT).
   4. Agregue 500 μL de PEI diluido gota a gota a la mezcla de ADN diluido mientras golpea suavemente el tubo. Incubar las mezclas de PEI/ADN durante 15 min en RT.
   5. Durante la incubación, aspire suavemente los medios de las placas de 10 cm previamente sembradas. Reemplace con 10 mL de DMEM completo fresco.
   6. Después de la incubación, pipetear lentamente la mezcla de transfección de ADN: PEI en las placas de 10 cm, asegurándose de no desprender las células.
      NOTA: El PEI es un reactivo de transfección de uso común, pero su concentración debe optimizarse cuidadosamente para equilibrar la eficiencia de la transfección y la citotoxicidad. A pesar del mayor costo de Lipofectamine 3000 (reactivo de transfección), ha demostrado una mayor eficiencia de transfección y una menor citotoxicidad en comparación con PEI en ciertas líneas celulares, lo que ha llevado a una mejor producción viral. La electroporación es otra alternativa que utiliza pulsos eléctricos para introducir ácidos nucleicos en las células. Si bien es eficaz, requiere equipo especializado y puede ser más laborioso.
   7. Cultive las células durante 18 h, luego reemplace cuidadosamente el medio de transfección con 10 mL frescos de medio DMEM Complete que contenga 25 μM de cloroquina.
   8. Después de 72 h de la transfección, recoja el medio de cultivo que contiene la partícula del virus. Retire el envase de las células 293T centrifugando a 500 x g durante 5 min.
   9. Recoja el sobrenadante y fíltrelo a través de un filtro de polietersulfona (PES) de 0,45 μm. Utilice el sobrenadante viral directamente.
      NOTA: El sobrenadante viral debe ser alícuota y congelado en nitrógeno líquido y mantenido a -80 °C para evitar la pérdida de título.
2. Infección lentiviral de células diana
   1. Siembre 2 × 10⁶ células diana BEAS-2B en dos placas de 6 cm y crezca a 37 °C, 5% de CO₂ durante la noche. Tras la transducción, asegúrese de que las células BEAS-2B tengan aproximadamente un 70% de confluente.
   2. Retire con cuidado el medio viejo y agregue los 0,5 mL apropiados de KRAS o partículas lentivirales vectoriales junto con 3 mL de medio RPMI-1640 completo fresco en dos placas, respectivamente.
   3. Cultive las células a 37 °C durante 18-20 h en una incubadora de 5% de CO₂ . Reemplace el medio antiguo que contiene partículas lentivirales con 3,5 mL de medio de cultivo completo fresco y precalentado. Después de 72 h de transducción, recoja las células para el siguiente ensayo.
      NOTA: Si la incubación nocturna con el virus causa toxicidad, el tiempo de incubación puede acortarse a 4 h. Para lograr el equilibrio entre la eficiencia de la transducción y la salud celular, se deben considerar las siguientes estrategias: (1) Optimizar la multiplicidad de infecciones; (2) Utilizar preparaciones virales de alta calidad; (3) Utilizar policationes (como el polibreno) para mejorar la eficiencia, permitiendo el uso de títulos virales más bajos y reduciendo la toxicidad potencial; (4) Para estudios a largo plazo, considere el uso de sistemas de expresión inducible para controlar temporalmente la expresión de transgenes, reduciendo la carga sobre las células y minimizando la toxicidad potencial.

2. Verificación del daño en el ADN derivado de KRAS (G12D) y formación de bucles R

1. Confirmar la expresión génica y el daño en el ADN mediante el ensayo WB
   1. Aspire el medio de cultivo de las placas.
   2. Lave suavemente las células con solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x para eliminar cualquier medio residual o residuo.
   3. Agregue un pequeño volumen de 1x PBS para mantener las celdas húmedas durante el proceso de raspado.
   4. Use un raspador de células, sosteniéndolo en ángulo, y raspe suavemente las células de la superficie en una dirección consistente.
      NOTA: Tenga cuidado de no aplicar demasiada presión, lo que podría dañar las células.
   5. Incline la placa y use una pipeta para recoger la suspensión de células en un tubo y gire las células a 500 x g durante 5 minutos. Deseche el sobrenadante.
   6. Prepare el tampón RIPA 1x diluyendo el tampón RIPA 2x (ver Tabla 1) y agregue el cóctel de inhibidores de la proteasa y el cóctel de inhibidores de la fosfatasa inmediatamente antes de usar.
   7. Lisar el pellet de celda con tampón RIPA preenfriado (1x) e incubar durante 30 minutos en hielo. Retire los residuos centrifugando a 15.000 x g durante 10 min. Recoja el sobrenadante y mida la concentración de proteínas mediante el ensayo de Bradford.
   8. Añadir 4 x tampón de carga de muestra de dodecil sulfato de sodio (SDS) al sobrenadante y desnaturalizar las proteínas durante 5 min a 95 °C. En primer lugar, separar 40 μg de proteína de cada muestra en un gel de electroforesis (PAGE) en gel de electroforesis en gel de poliacrilamida al 12,5% y, a continuación, transferirlo a membranas de nitrocelulosa de 0,2 μm (véase la tabla de materiales).
   9. Después de finalizar la transferencia, bloquee las membranas con tampón de bloqueo (5% de leche descremada en solución salina tamponada con Tris que contiene 0.1% Tween 20 [TBST; Tabla 1]) durante 1 h.
   10. Enjuague brevemente la membrana con TBST y, a continuación, incube la membrana con anticuerpos primarios contra FLAG-tag (dilución 1:2500 en PBST) y γH2AX (dilución 1:1000 en PBST) (véase la tabla de materiales) durante la noche a 4 °C.
   11. Retire los anticuerpos primarios y lave la membrana con TBST 3 veces, cada vez durante 10 minutos.
   12. Sumerja las membranas en anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante diluido (HRP) (1:5.000 en tampón TBST que contiene un 5% de leche descremada) durante 1 h a temperatura ambiente (RT).
   13. Lave la membrana con TBST 3 veces, cada vez durante 10 minutos.
   14. Visualice los niveles de proteínas a través de los reactivos de quimioluminiscencia mejorada (ECL) (consulte la tabla de materiales).
2. Detección de R-loop por Dot blot²⁵​
   1. Aspire el medio de cultivo de las placas.
   2. Lave suavemente las celdas con 1x PBS para eliminar cualquier medio residual o desecho.
   3. Agregue un pequeño volumen de 1x PBS para mantener las celdas húmedas durante el proceso de raspado.
   4. Use un raspador de células, sosteniéndolo en ángulo, y raspe suavemente las células de la superficie en una dirección consistente.
      NOTA: Tenga cuidado de no aplicar demasiada presión, lo que podría dañar las células.
   5. Incline la placa y use una pipeta para recoger la suspensión de células en un tubo y gire las células a 500 x g durante 5 minutos. Deseche el sobrenadante.
   6. Lisar 2 × 10⁶ células con 300 μL de tampón de lisis celular helado (ver Tabla 1). Incubar en hielo durante 10 min. Centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante. El pellet contiene núcleos.
   7. Utilice una punta de orificio ancho para volver a suspender cada pellet con 300 μL de tampón de lisis nuclear preenfriado (consulte la Tabla 1).
   8. Añadir 3 μL de 20 mg/mL de proteinasa K (ver Tabla de Materiales) a cada muestra y digerir durante 3-5 h a 55 °C.
   9. Agregue 100 μL de tampón de elución (consulte la Tabla 1) a cada tubo y mezcle bien.
   10. Añadir 400 μL de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25:24:1 pH 8,0) a cada tubo. Después de un vórtice vigoroso, centrifugar a 12.000 x g durante 5 minutos a 4 °C para separar el ADN del contenido de otras células.
   11. Transfiera con cuidado la fase acuosa superior a los nuevos tubos.
   12. Precipite el ADN añadiendo 1/10 de volumen de acetato de sodio 3 M (pH 5,2) y 2,5 de volumen de etanol 100% preenfriado a la muestra. Mezclar bien e incubar durante 4 h o toda la noche a -20 °C.
       NOTA: La adición de glucógeno (Ver Tabla de Materiales) a la muestra puede aumentar la recuperación de ADN de la precipitación de etanol. La concentración final de glucógeno es de aproximadamente 0,05-1 μg/μL.
   13. Granular el ADN centrifugando a 12.000 x g durante 30 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante sin alterar la pellet.
   14. Enjuague el pellet con 1 ml de etanol al 70% helado y vuelva a centrifugar durante 5-15 min a 12.000 x g a 4 °C.
   15. Deseche el sobrenadante con cuidado para evitar alterar la bolita de ADN.
   16. Seque al aire el pellet de ADN durante 5-10 min.
   17. Disuelva el gránulo de ADN añadiendo 50 μL de tampón TE precalentado (pH8,0) e incube durante 30 min a 37 °C. Mida la concentración de ADN de cada muestra.
   18. Prepare diluciones de ADN a las concentraciones deseadas en tampón TE (5 ng/μL a 200 ng/μL). Coloque uniformemente 20 μL de cada muestra en una membrana de nailon cargada positivamente mediante un aparato de transferencia de puntos.
       NOTA: Para detectar R-loops utilizando un ensayo de transferencia de puntos, se recomienda aplicar aproximadamente 500 ng de ADN genómico por punto. Se ha demostrado que esta cantidad proporciona suficiente sensibilidad para detectar híbridos de ARN-ADN cuando se utiliza el anticuerpo monoclonal S9.6, que se une específicamente a estas estructuras.
   19. Inmovilizar el ADN mediante la reticulación del ADN a la membrana de nailon (ver Tabla de Materiales) a través del ajuste de "Auto Crosslink" del reticulante UV (1.200 μJ x 100) (ver Tabla de Materiales).
   20. Sumerja las membranas en el tampón de bloqueo (consulte la tabla 1) durante 1 h a temperatura ambiente. A continuación, enjuague brevemente las membranas con TBST.
   21. Durante la noche, incubar la membrana con el anticuerpo primario (Ver Tabla de Materiales) a 4°C. La dilución de S9.6 es 1:1,000 en TBST que contiene 5% de BSA.
   22. Retire el anticuerpo primario y lávese 3 veces con TBST, y cada vez durante 10 minutos.
   23. Incubar la membrana con anticuerpo secundario conjugado con HRP en BSA al 5% en TBST a temperatura ambiente durante 1 h.
   24. Retire el anticuerpo secundario y lávese 3 veces con TBST, y cada vez durante 10 min.
   25. Visualice los niveles del bucle R a través de los reactivos ECL (quimioluminiscencia mejorada) (consulte la tabla de materiales).

3. Ensayo de PLA

1. Preparación de células
   NOTA: La transducción de células con el oncogén KRAS G12D conduce a un aumento de TRC, como lo demuestra una señal de PLA positiva. Este método distingue eficazmente las TRC impulsadas por oncogenes de los niveles de fondo sin necesidad de seleccionar antibióticos. Sin embargo, la implementación de la selección de antibióticos después de la transducción puede mejorar la señal general al enriquecer la población de células transducidas con éxito, mejorando así la sensibilidad y la especificidad del ensayo.
   1. Coloque cubreobjetos de 12 mm de diámetro en cada pocillo de una placa de 12 pocillos.
   2. Siembre las células infectadas con lentivirus en estos pocillos 24 h después de la infección y mantenga las células en cubreobjetos en 500 μL de medio RPMI-1640 completo a 37 °C con 5% de CO₂.
   3. Si el diseño experimental incluye la selección de antibióticos para enriquecer las células transducidas con éxito, agregue el antibiótico apropiado al medio de cultivo en esta etapa.
   4. Monitorizar las células para asegurar que alcanzan aproximadamente el 60% de confluencia 48-72 h después de la infección.
   5. Retire con cuidado RPMI-1640 y preextraiga las células con NP-40 al 0,5% frío durante 4 minutos en hielo.
   6. Agregue 500 μL de tampón de fijación (ver Tabla 1) directamente para fijar las celdas durante 15 min en RT.
      NOTA: Se recomienda no lavar las células antes de la etapa de fijación, ya que esto puede hacer que se desprendan de la superficie en la que están creciendo, especialmente si la línea celular es sensible al desprendimiento; Por lo tanto, a menudo se prefiere agregar directamente la solución fijadora.
   7. Detenga la reacción retirando el tampón de fijación y lavando cuidadosamente las células con 1x PBS 3 veces.
   8. Aspire el PBS y agregue 500 μL de metanol 100% preenfriado a las celdas.
   9. Permeabilizar las células incubando a -20 °C durante 15-30 min.
   10. Celdas de bloque con solución de bloque Duolink durante 1 h en RT.
2. Tinción de anticuerpos
   1. Diluir anti-RNAPII de ratón 8WG16 (1:500) y anti-PCNA de conejo (D3H8P) (1:500) en tampón de dilución de anticuerpos Duolink. Incubar las células con la mezcla de anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C en una cámara de humedad.
      NOTA: Realice el protocolo PLA utilizando solo uno de los anticuerpos primarios (ya sea anti-RNAPII o anti-PCNA) y omita el otro. Esto ayuda a identificar cualquier señal de fondo resultante de interacciones inespecíficas de los anticuerpos individuales o sondas de PLA.
   2. Retire suavemente los anticuerpos primarios de los portaobjetos utilizando una hoja de papel de desecho sin pelusa sin tocar las células. A continuación, lave las células 3 veces con 1x PBS.
   3. Prepare las sondas de PLA (o anticuerpo secundario) de acuerdo con el siguiente procedimiento (consulte la Tabla 2), luego mezcle y deje reposar durante 20 minutos a temperatura ambiente.
   4. Agregue la mezcla de anticuerpos secundarios a los portaobjetos e incube en una cámara de humedad durante 2 h a RT.
3. Ligadura y amplificación
   1. Deseche la mezcla de anticuerpos secundarios y lave los portaobjetos dos veces con 1x Tampón A cada uno durante 5 minutos.
   2. Prepare la mezcla de ligadura de acuerdo con el siguiente procedimiento (ver Tabla 2).
   3. Aplique 15 μL de mezcla de ligadura a cada portaobjetos de cobertura e incube a 37 °C durante 30 min en una cámara de humedad.
   4. Lave los portaobjetos dos veces con 1x Tampón A cada uno durante 2 min.
   5. Prepare la mezcla de amplificación de acuerdo con el siguiente procedimiento (consulte la Tabla 2).
   6. Aplique 15 μL de mezcla de amplificación a cada portaobjetos e incube durante 100 minutos a 37 °C en una cámara de humedad. Deseche la amplificación Mezcle y lave dos veces con 1x Buffer B cada uno durante 10 min.
   7. Lave los portaobjetos una vez con tampón B 0.01x durante 1 min.
   8. Aspire el tampón B y monte las guías en el medio de montaje Duolink In Situ con DAPI.
4. Análisis de imágenes y determinación de umbrales:
   1. Cuantifique el número de focos de PLA por ImageJ. El software de análisis de imágenes automatizado puede ayudar a cuantificar las señales de PLA de forma objetiva. Elija un umbral de 3 o más focos de PLA por núcleo como umbral porque menos del 1% de las células de control adquieren 3 focos de PLA en condiciones no perturbadas.
      NOTA: Dado que el umbral se determina experimentalmente mediante el análisis de múltiples muestras y controles para tener en cuenta la variabilidad, se deben mantener ajustes de imagen consistentes (por ejemplo, tiempo de exposición, ganancia) en todas las muestras para garantizar la comparabilidad.

γH2AX sirve como biomarcador para el daño del ADN. La sobreexpresión de KRAS (G12D) perjudica la estabilidad genómica en estas células, como lo demuestra el aumento de la señal γH2AX en el análisis de Western blot (Figura 2A). Además, la intensificación de la señal de transferencia de puntos S9.6 en las células que expresan KRAS (G12D) en comparación con los controles vectoriales (Figura 2B) indica que la expresión oncogénica de KRAS conduce a la acumulación de bucles R aberrantes, lo que puede contribuir a la formación de roturas de ADN.

En la Figura 3 se presentan imágenes representativas del ensayo de ligadura de proximidad (PLA). En estas imágenes, los puntos verdes brillantes dentro de los núcleos indican que la distancia entre el complejo de replicación asociado a PCNA y el complejo de transcripción RNAPII es inferior a 40 nm. En las células de control de vectores, los puntos verdes apenas se detectan, mientras que en las células que expresan KRAS (G12D), se observan múltiples puntos verdes por núcleo. Esto sugiere que la expresión oncogénica de KRAS aumenta la frecuencia de encuentros entre RNAPII y complejos de replicación. Estos resultados del PLA se alinean con los hallazgos de los ensayos de Western blot (Figura 2A) y dot blot (Figura 2B).

En resumen, estos hallazgos demuestran que el ensayo de ligadura de proximidad detecta eficazmente los conflictos inducidos por oncogenes entre los RNAPII y la maquinaria de replicación. Esta capacidad tiene un potencial significativo para aplicaciones futuras, ya que permite la cuantificación de TRC en diversos tipos de muestras resultantes de la expresión de oncogenes aberrantes. Si bien existen ciertas limitaciones, las perspectivas de este método son prometedoras, especialmente con los ajustes a las condiciones experimentales adaptados a diferentes muestras.

Figura 1: Representación esquemática del ensayo de ligadura de proximidad in situ . (1) Determine los socios de interacción emparejados de interés. (2) Incubar la muestra con anticuerpos primarios emparejados dirigidos a las proteínas deseadas, seguidos de anticuerpos secundarios conjugados con sondas de oligonucleótidos. (3) Se introducen oligonucleótidos conectores, que son complementarios a los oligonucleótidos unidos a cada sonda de PLA. Si las proteínas objetivo están lo suficientemente cerca, las secuencias de oligonucleótidos unidas a las sondas de PLA estarán en proximidad. (4) Si las proteínas objetivo están muy cerca (normalmente <40 nm), los oligonucleótidos de las sondas PLA entran en contacto y pueden ser ligados por una ADN ligasa para formar una molécula de ADN circular. (5) Realizar RCA utilizando una polimerasa para amplificar el ADN circular, creando una hebra de ADN larga y repetitiva. Hibridar oligonucleótidos marcados con fluorescencia con el producto de ADN amplificado, lo que permite la visualización. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Daño en el ADN y acumulación de R-loop en células de expresión de KRAS (G12D). (A) Análisis representativo de Western blot de lisados de células enteras de células BEAS-2B, que ilustra un aumento en los niveles de γH2AX después de 72 h de expresión de KRAS G12D. La transferencia γH2AX se utilizó para evaluar el daño en el ADN, con ACTB sirviendo como control de carga. El blot FLAG confirmó la expresión de KRAS G12D. (B) Análisis representativo de la formación de bucle R en células BEAS-2B, comparando condiciones con y sin expresión de KRAS G12D. El anticuerpo S9.6 se empleó para detectar R-loops, mientras que un anticuerpo anti-ADN se utilizó para cuantificar el ADN total. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Acumulación de TRC en células de expresión de KRAS (G12D). Imágenes representativas del ensayo PLA. Los focos de color verde brillante en las células que expresan KRAS G12D indican colisiones entre PCNA y ARN polimerasa II (RNAPII). La inmunocitoquímica PLA demuestra altos TRC en las células que expresan KRAS G12D en comparación con las células vectoriales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Preparación del tampón. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Preparación de la reacción de PLA. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 3: Solución de problemas para el ensayo PLA. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

La maquinaria de transcripción RNAPII puede crear un obstáculo para la progresión de la horquilla de replicación del ADN^26,27, promoviendo TRCs y daño al ADN, especialmente en células cancerosas^28,29. Descifrar las proteínas que regulan las TRC y comprender los mecanismos detallados puede ayudarnos a comprender cómo ocurren estos eventos dañinos y guiar el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos en el futuro. Por lo tanto, para comprender completamente las TRC, es esencial contar con métodos rápidos y confiables para la detección de TRC.

Aquí, describimos un procedimiento para examinar la incidencia de conflictos de transcripción-replicación (TRC) utilizando un ensayo PLA in situ . Este enfoque permite una estimación fácil de la frecuencia de TRC en presencia de señalización oncogénica dentro de las células. No requiere equipos costosos ni grandes cantidades de material de partida. Nuestro protocolo también incluye S9.6 dot blot y Western blot para confirmar la especificidad de la señal TRC derivada de la expresión de KRAS (G12D).

Este ensayo se basa en el reconocimiento de complejos de replicación y transcripción RNAPII por pares de conjugados anticuerpo-oligonucleótido (sondas PLA), que juntos producen círculos de ADN que sirven como moltales para reacciones de amplificación de círculo rodante localizadas. El requisito de reconocimiento dual de las proteínas diana mejora la selectividad al eliminar cualquier reactividad cruzada que no sea compartida por los pares de anticuerpos, lo que garantiza resultados inequívocos y reproducibles. Por lo tanto, la especificidad y la fuerte afinidad de los anticuerpos son esenciales para el éxito del ensayo de PLA. Es fundamental optimizar las condiciones para el rendimiento de los anticuerpos dentro de la muestra, lo que incluye (i) las condiciones de fijación y permeabilización de las células, (ii) la solución de bloqueo y (iii) la dilución del anticuerpo primario. Los controles negativos apropiados son cruciales, ya que (i) los controles de derribo pueden verificar la especificidad de los anticuerpos primarios, y (ii) los controles con isotipo IgG pueden probar la especificidad de las sondas de PLA.

Se identifican muchos de los problemas comunes con el ensayo PLA. Estos incluyen la ausencia de la señal esperada y la presencia de una señal de fondo no específica. En la Tabla 3 se presenta un resumen de las posibles causas y soluciones de estos problemas.

En particular, este método solo puede confirmar la proximidad física entre el PCNA y la ARN polimerasa II; sin embargo, esta proximidad no implica necesariamente la ocurrencia de roturas de ADN perjudiciales. Otra limitación clave es que este método no puede proporcionar información sobre los loci específicos de la cromatina donde interactúan estos dos complejos. Comprender completamente las roturas de ADN asociadas a la transcripción requiere un análisis más sofisticado. Aprovechando la tecnología de secuenciación de próxima generación, el desarrollo de TRIPn-seq es uno de los pocos métodos capaces de identificar con precisión la coocupación de la transcripción y la replicación, aplicable a cualquier célula en proliferación ^21,29. Sin embargo, a pesar del carácter informativo de este método, su alto costo y su naturaleza intensiva en tiempo limitan su accesibilidad.

En resumen, nuestros estudios indican que el PLA in situ es un enfoque eficiente para determinar la proximidad de la replicación y la maquinaria de transcripción de RNAPII en células fijas, con resolución cuantitativa y espacial. El uso específico de anticuerpos PCNA y RNAPII (8WG16) ha demostrado ser eficaz para el estudio de las TRC en células BEAS-2B. Además de las TRC asociadas a la transcripción de RNAPII, el ensayo PLA in situ también se puede utilizar para investigar las TRC asociadas a RNAPI y RNAPIII en entornos clínicos y de investigación, siempre que se apliquen los controles y ajustes adecuados.

Un estudio recientemente publicado³⁰ introdujo una nueva estrategia terapéutica para los cánceres caracterizados por ADN extracromosómico (ADNec). Los investigadores aumentaron los conflictos de transcripción-replicación (TRC) para explotar las vulnerabilidades de las células cancerosas positivas para el ADNec, dirigiéndose selectivamente a ellas sin afectar a las células normales. La evaluación del estado de TRC mediante el método PLA podría proporcionar información valiosa sobre la estabilidad genómica de las células cancerosas de un paciente. El seguimiento del estado de las TRC durante el tratamiento puede ayudar a evaluar la eficacia de las terapias dirigidas a las TRC. Por lo tanto, la integración de la evaluación TRC basada en PLA en los enfoques de medicina personalizada es prometedora para mejorar el diagnóstico, el pronóstico y el seguimiento del tratamiento del cáncer al ofrecer una comprensión más profunda de la dinámica molecular dentro de los tumores individuales.

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Este trabajo contó con el apoyo de la financiación inicial de la Universidad del Sur de China.