בדיקת קשירת קרבה לחקר קונפליקטים של שעתוק-שכפול שמקורם באונקוגן

כאן, אנו מציגים שיטה רגישה וספציפית לאיתור קונפליקטים של שעתוק-שכפול המושרים על ידי אונקוגנים (TRCs) באמצעות מבחן קשירת קרבה (PLA). גישה זו ממנפת נוגדנים ספציפיים המכוונים ל-PCNA ו-phospho-CTD RNAPII, ומאפשרת להעריך את שכיחות ה-TRC בין שעתוק RNA פולימראז II למנגנון שכפול DNA.

גם שכפול ה-DNA וגם שעתוק ה-RNA משתמשים ב-DNA גנומי כתבנית שלהם, מה שמחייב הפרדה מרחבית וזמנית של תהליכים אלה. קונפליקטים בין מנגנון השכפול והשעתוק, המכונים קונפליקטים של שעתוק-שכפול (TRCs), מהווים סיכון ניכר ליציבות הגנום, גורם קריטי בהתפתחות סרטן. בעוד שזוהו מספר גורמים המווסתים את ההתנגשויות הללו, איתור הגורמים העיקריים נותר קשה בשל כלים מוגבלים להדמיה ישירה ופרשנות ברורה. במחקר זה, אנו מדמיינים ישירות TRCs באמצעות בדיקת קשירת קרבה (PLA), תוך מינוף נוגדנים ספציפיים ל-PCNA ו-CTD זרחני של RNA פולימראז II. גישה זו מאפשרת מדידה מדויקת של TRCs בין תהליכי שכפול ושעתוק בתיווך RNA פולימראז II. השיטה משופרת עוד יותר באמצעות פריימרים של DNA המצומדים קוולנטית לנוגדנים אלה, יחד עם הגברת PCR באמצעות בדיקות פלואורסצנטיות, המספקים אמצעי רגיש וספציפי ביותר לזיהוי TRCs אנדוגניים. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מאפשרת הדמיה של קונפליקטים אלה, ומציעה כלי רב עוצמה לחקר מנגנוני חוסר יציבות גנומיים הקשורים לסרטן. טכניקה זו מטפלת בפער בהדמיה ישירה של TRC, ומאפשרת ניתוח והבנה מקיפים יותר של התהליכים הבסיסיים המניעים את חוסר היציבות של הגנום בתאים.

הגנום משמש כתבנית לתהליכים ביולוגיים חיוניים, כולל שכפול ושעתוק. בתאים בריאים, שעתוק RNA ומנגנון שכפול DNA בדרך כלל משתפים פעולה ומופרדים מרחבית וזמנית 1,2,3,4. עם זאת, בתנאים פתולוגיים, כגון ביטוי יתר של אונקוגן, שיתוף פעולה הרמוני זה עלול להיות מופרע.

אונקוגנים מניעים לעתים קרובות רמות שעתוק גבוהות, מה שמגדיל את הסבירות להתנגשויות בין מנגנון השעתוק והשכפול⁵. חלק מהאונקוגנים משנים את ארכיטקטורת הכרומטין, מה שהופך אותו לנגיש יותר לשעתוק אך עלול לעכב את התקדמות מזלג השכפול⁵. בנוסף, הפעלת אונקוגן יכולה לגרום למתח שכפול על ידי האצת מחזור התא⁶. פעילות RNA פולימראז II (RNAPII) מוגברת משמעותית במהלך מעבר הפאזה G1/S עקב זרחון קינאז תלוי ציקלין (CDK) של Rb, המשחרר גורמי שעתוק E2F המקדמים שעתוק של חלבונים חיוניים, כולל ציקלינים, CDKs וגנים משק בית⁷. ביטוי הגנים של היסטון מגיע לשיא במהלך שלב S, במקביל לשכפול DNA⁸. יתר על כן, תמלול התעתיקים באורך מלא של כמה גנים ארוכים מאוד דורש יותר ממחזור תא אחד⁹. עם כל כניסה לשלב S, הפעילות בו-זמנית של מנגנון שעתוק ושכפול באותם אזורים גנומיים עלולה לגרום למפגשים מזיקים, מה שמוביל לקונפליקטים. קונפליקטים אלה הם מקור מהותי עיקרי לחוסר יציבות גנומי, הקשור קשר הדוק לגידול. כיצד מנגנון השכפול מתואם עם שעתוק RNAPII כדי למנוע התנגשויות מזיקות ולשמור על יציבות גנומית נותרה שאלה חשובה. לכן, הדמיה ישירה של קונפליקטים של שעתוק-שכפול הקשורים ל-RNAPII (TRCs) הפכה חיונית להבנת המנגנונים המולקולריים הפותרים קונפליקטים אלה ועשויה בסופו של דבר להניח את היסודות לרתימת קונפליקטים אלה למטרות טיפוליות.

קונפליקטים של שעתוק-שכפול (TRCs) יכולים להופיע בשני כיוונים: חזיתית, שבה שעתוק ושכפול מתקדמים זה לקראת זה, וקו-כיווני, שבו הם נעים באותו כיוון. התנגשויות חזיתיות הן הרבה יותר הרסניות מהתנגשויות דו-כיווניות 10,11,12,13. היווצרות היברידיות DNA-RNA (לולאות R) זוהתה כמניע עיקרי של TRCs; לפיכך, כמות ניכרת של מחקרים הסיקו את נוכחותם של TRCs על ידי הערכת התרחשותם של לולאות R ואזוריהם בתגובה לשכפול ו/או שעתוק לא מוסדר^10,11. עם זאת, האם הצטברות לולאות R שמקורן בשעתוק משמשת כמכשול פרופורציונלי לשכפול ומתאמת ישירות עם TRCs נותרה שאלה לא פתורה. חוקרים חקרו גם TRCs על ידי ניתוח דינמיקת מזלג שכפול. לדוגמה, אלקטרופורזה דו-ממדית של ג'ל של גנים מדווחים יכולה לחשוף רפליזום ספציפי ללוקוס^{המשהה 12}, בעוד שבדיקות סיבי DNA מאפשרות לחוקרים לבחון שינויים במהירות מזלג השכפול, צפיפות המקור ואסימטריית המזלג¹³. ההתקדמות של טכנולוגיית הריצוף של הדור הבא הובילה לפיתוח של מספר שיטות חדשניות, כגון ריצוף מקטעים של אוקזאקי (Ok-seq)^14,15, ריצוף אתר התחלה (ini-seq)^16,17, ריצוף גדיל קצר מתהווה (SNS-seq)¹⁸, Repli-seq¹⁹ וריצוף שימוש בפולימראז (Pu-seq)²⁰. טכניקות אלו סיפקו פרופילים ברחבי הגנום של שימוש במקור שכפול, כיווניות מזלג וסיום שכפול, וחשפו גורמי מפתח המעורבים בתיאום השכפול והשעתוק. TRIPn-seq היא אחת השיטות הבודדות המסוגלות לזהות ישירות תפוסה משותפת של שעתוק ושכפול, ולהרחיב משמעותית את הבנתנו לגבי הארגון הדינמי של שכפול ושעתוק DNA בתנאים פיזיולוגיים^{ופתולוגיים 21}. למרות התובנות החשובות שמספקות שיטות מבוססות ריצוף אלה, העלות הגבוהה והאופי עתיר הזמן שלהן מגבילים את היישום הרחב יותר שלהן. לכן, חיוני לבסס שיטת זיהוי מוגדרת, רגישה מאוד, נוחה ומהירה יותר כדי להמחיש ולכמת TRCs ברמת התא הבודד.

בדיקת קשירת הקרבה באתרה (PLA), הידועה גם בשם טכנולוגיית Duolink PLA, היא שיטה רבת עוצמה להערכת הקרבה הפיזית של חלבוני מטרה בקטעי רקמה או בתרביות תאים. טכניקה זו מייצרת אות רק כאשר שני חלבונים או קומפלקסים של חלבונים נמצאים בטווח של 40 ננומטר זה מזה. הוא דורש שני נוגדנים ראשוניים כנגד חלבוני המטרה, כל אחד ממין אחר (למשל, עכבר/ארנב, ארנב/עז או עכבר/עז). לאחר הדגירה של הדגימה עם הנוגדנים הראשוניים הללו, מוחלים נוגדנים משניים המכונים בדיקות PLA (אחד PLUS ואחד MINUS). בניגוד לנוגדנים משניים רגילים הנקשרים לאזורים הקבועים של נוגדנים ראשוניים, בדיקות PLA מקושרות קוולנטית לפריימרים ספציפיים של DNA. כאשר חלבוני המטרה נמצאים בסמיכות (פחות מ-40 ננומטר), אוליגונוקלאוטיד מחבר יכול להכליא עם שני בדיקות ה-PLA, מה שמקל על הקשירה האנזימטית של האוליגונוקלאוטידים המחוברים שלהם למולקולת DNA באורך מלא. ה-DNA החדש שנוצר משמש כסמן חלופי לאינטראקציה החלבונית שזוהתה ומשמש כתבנית להגברה. לאחר מכן המוצר המוגבר מודמיין באמצעות בדיקות אוליגונוקלאוטידים עם תווית פלואורסצנטית. אם החלבונים נמצאים במרחק של יותר מ-40 ננומטר זה מזה, בדיקות ה-PLA אינן יכולות ליצור תבנית DNA, וכתוצאה מכך אין אות שניתן לזהות. התרשים הסכמטי של PLA מתואר באיור 1. הקרבה ו/או האינטראקציה מדומות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי כנקודות פלואורסצנטיות, וניתן לכמת את מספרן ועוצמתן של נקודות אלה. מאז המצאתו בשנת 2002, PLA הפך פופולרי לניטור אינטראקציות חלבונים בשל רגישותו הגבוהה והספציפיות שלו. בניגוד למבחנים מבוססי ריצוף, PLA דורש רק כמויות קטנות של דגימות, מה שהופך אותו לנוח לניתוח דגימות נדירות.

מחקרים הראו כי ביטוי המוטציה האונקוגנית KRAS G12D מוביל לקונפליקטים של שעתוק-שכפול (TRCs)^22,23. לדוגמה, מחקר שהוצג על ידי Meng et ^al.23 מצביע על כך שביטוי חוץ רחמי של KRAS G12D בתאי אפיתל צינור הלבלב האנושי (HPNE) משפר את TRCs ולולאות R הקשורות ל-TRC. כדי לאפשר זיהוי התנגשויות בין מכונות שעתוק RNAPII ושכפול בקווי תאים, אנו מספקים פרוטוקול שפותח במיוחד למטרה זו. הפלסמיד ובקרת הווקטור של KRAS (G12D) מועברים לתאי BEAS-2B אפיתל ריאה אנושיים, וביטוי KRAS (G12D), יחד עם נזק ל-DNA (γH2AX), מאומת על ידי Western blot. הצטברות לולאת R מאושרת על ידי ניתוח כתמי נקודות S9.6, אשר יחד מצביע על הצטברות של מחסומי שכפול וחוסר יציבות גנום בתאים המבטאים KRAS (G12D). לבסוף, התאים מקובעים על שקופיות לבדיקת PLA. לזיהוי מקומי של התנגשויות, התאים נצבעים תחילה בנוגדנים ראשוניים RNAPII ו-PCNA, ולאחר מכן צביעה בנוגדנים משניים מצומדים עם בדיקות PLA. מולקולת DNA מעגלית נוצרת באמצעות קשירה מוצלחת, המשמשת כתבנית להגברת מעגל מתגלגל לאחר מכן (RCA). לאחר מכן השקופיות מותקנות עם אמצעי הרכבה מתאימים ומודגמות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. ניתן לנתח את התמונות באמצעות ImageJ.

1. ייצור והעברה של Lentivirus לקו תאי יעד

1. ייצור Lentivirus²⁴
   1. תאי אריזה של זרע 293T ב-3 × 10⁶ תאים לצלחת של 10 ס"מ במדיום הנשר המותאם של דולבקו (DMEM; מדיום שלם). גדל תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח של 5% CO₂ למשך 18-20 שעות נוספות.
   2. בשני צינורות של 1.5 מ"ל, הכינו תערובת DNA של סך של 24 מיקרוגרם DNA פלסמיד ב-500 מיקרוליטר של Opti-MEM (מדיום סרום מופחת) המכיל 9.2 מיקרוגרם של psPAX2, 2.8 מיקרוגרם של pMD2.G, יחד עם 12 מיקרוגרם של פלסמיד pLVX-KRAS או וקטור ריק בהתאמה.
      הערה: מכיוון שאנדוטוקסינים מפחיתים משמעותית את יעילות ההעברה, מומלץ להסיר אנדוטוקסין מהפלסמיד במהלך הטיהור.
   3. יש לדלל 144 מיקרוליטר של פוליאתילנימין (PEI; 1 מ"ג/מ"ל) ב-1 מ"ל של מדיום סרום מופחת, לערבב ולדגור למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
   4. הוסף 500 מיקרוליטר של PEI מדולל טיפה לתערובת ה-DNA המדולל תוך כדי תנועה עדינה של הצינור. דגרו את תערובות PEI/DNA למשך 15 דקות ב-RT.
   5. במהלך הדגירה יש לשאוב בעדינות את המדיה מהצלחות בגודל 10 ס"מ שנזרעו בעבר. החלף ב -10 מ"ל של DMEM שלם טרי.
   6. לאחר הדגירה, פיפטה איטית את ה-DNA: תערובת טרנספקציה PEI על צלחות 10 ס"מ, תוך הקפדה לא לנתק את התאים.
      הערה: PEI הוא מגיב טרנספקציה נפוץ, אך יש לייעל בקפידה את ריכוזו כדי לאזן את יעילות הטרנספקציה והציטוטוקסיות. למרות העלות הגבוהה יותר של ליפופקטמין 3000 (מגיב טרנספקציה), הוא הוכיח יעילות טרנספקציה גבוהה יותר וציטוטוקסיות נמוכה יותר בהשוואה ל-PEI בשורות תאים מסוימות, מה שמוביל לשיפור בייצור הנגיף. אלקטרופורציה היא אלטרנטיבה נוספת המשתמשת בפולסים חשמליים כדי להכניס חומצות גרעין לתאים. למרות שהוא יעיל, הוא דורש ציוד מיוחד ויכול להיות עתיר עבודה.
   7. גדל את התאים במשך 18 שעות, ולאחר מכן החלף בזהירות את אמצעי הטרנספקציה ב-10 מ"ל טריים של מדיום DMEM Complete המכיל 25 מיקרומטר של כלורוקווין.
   8. לאחר 72 שעות של טרנספקציה, אסוף את מדיום התרבות המכיל את חלקיק הנגיף. הסר את האריזה תאי 293T על ידי צנטריפוגה ב-500 x גרם למשך 5 דקות.
   9. אסוף את הסופרנטנט וסנן אותו דרך מסנן פוליאתרסולפון (PES) של 0.45 מיקרומטר. השתמש ישירות בחומר העל-טבעי הנגיפי.
      הערה: יש להקפיא את הסופרנטנט הנגיפי ולהקפיא אותו בחנקן נוזלי ולשמור בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס כדי למנוע אובדן טיטר.
2. זיהום לנטי-ויראלי של תאי מטרה
   1. זרע 2 × 10⁶ תאי מטרה BEAS-2B בשתי צלחות של 6 ס"מ וגדל בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ בן לילה. לאחר ההעברה, ודא שתאי BEAS-2B הם כ-70% מתלכדים.
   2. הסר בזהירות את המדיום הישן והוסף את ה-0.5 מ"ל המתאים של חלקיקי KRAS או חלקיקי לנטי-ויראלים וקטוריים יחד עם 3 מ"ל של מדיום RPMI-1640 שלם טרי לשתי צלחות, בהתאמה.
   3. גדל את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 18-20 שעות באינקובטור של 5% CO₂ . החלף את המדיום הישן המכיל חלקיקים לנטי-ויראלים ב-3.5 מ"ל של מדיום תרבית שלם טרי שחומם מראש. לאחר התמרה של 72 שעות, אסוף את התאים לבדיקה הבאה.
      הערה: אם דגירה של לילה עם הנגיף גורמת לרעילות, ניתן לקצר את זמן הדגירה ל-4 שעות. כדי להשיג את האיזון בין יעילות התמרה לבריאות התא, יש לקחת בחשבון את האסטרטגיות הבאות: (1) אופטימיזציה של ריבוי הזיהום; (2) להשתמש בתכשירים ויראליים באיכות גבוהה; (3) להשתמש בפוליקונים (כגון פוליברן) כדי לשפר את היעילות, לאפשר שימוש בטיטרים נגיפיים נמוכים יותר ולהפחית את הרעילות הפוטנציאלית; (4) למחקרים ארוכי טווח, שקול להשתמש במערכות ביטוי השראת כדי לשלוט בביטוי טרנסגנים באופן זמני, להפחית את העומס על התאים ולמזער את הרעילות הפוטנציאלית.

2. אימות נזק ל-DNA שמקורו ב-KRAS (G12D) והיווצרות לולאת R

1. אישור ביטוי גנים ונזק ל-DNA על ידי בדיקת WB
   1. שאפו את מדיום התרבות מהצלחות.
   2. שטפו בעדינות את התאים עם מי מלח 1x עם חוצץ פוספט (PBS) כדי להסיר שאריות של מדיום או פסולת.
   3. הוסף נפח קטן של 1x PBS כדי לשמור על לחות התאים בתהליך הגירוד.
   4. השתמש במגרד תאים, החזק אותו בזווית, וגרד בעדינות את התאים מפני השטח בכיוון עקבי.
      הערה: היזהר לא להפעיל לחץ רב מדי, שעלול לפגוע בתאים.
   5. הטה את הצלחת והשתמש בפיפטה כדי לאסוף את תרחיף התא לתוך צינור וסובב את התאים ב-500 x גרם למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט.
   6. הכן את מאגר ה-1x RIPA על ידי דילול מאגר ה-2x RIPA (ראה טבלה 1), והוסף את קוקטייל מעכב הפרוטאז וקוקטייל מעכב הפוספטאז מיד לפני השימוש.
   7. יש להניח את גלולת התא עם מאגר RIPA מקורר מראש (1x) ולדגור למשך 30 דקות על קרח. הסר את הפסולת על ידי צנטריפוגה ב-15,000 x גרם למשך 10 דקות. אסוף את הסופרנטנט ומדוד את ריכוז החלבון באמצעות מבחן ברדפורד.
   8. הוסף 4 x מאגר טעינת דגימה של נתרן דודציל סולפט (SDS) לסופרנטנט ונטרל את החלבונים למשך 5 דקות ב-95 מעלות צלזיוס. ראשית, הפרד 40 מיקרוגרם של חלבון מכל דגימה בג'ל אלקטרופורזה של ג'ל SDS-polyacrylamide (PAGE) של 12.5% ולאחר מכן העביר אותו לממברנות ניטרוצלולוזה של 0.2 מיקרומטר (ראה טבלת חומרים).
   9. לאחר סיום ההעברה, חסמו את הממברנות עם Blocking Buffer (5% חלב נטול שומן בתמיסת מלח Tris-buffered המכילה 0.1% Tween 20 [TBST; טבלה 1]) למשך שעה.
   10. שטפו לזמן קצר את הממברנה עם TBST, ולאחר מכן דגרו את הממברנה עם נוגדנים ראשוניים כנגד FLAG-tag (דילול 1: 2500 ב-PBST) ו-γH2AX (דילול 1:1000 ב-PBST) (ראה טבלת חומרים) למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
   11. הסר את הנוגדנים העיקריים, ושטוף את הממברנה עם TBST 3 פעמים, בכל פעם למשך 10 דקות.
   12. טבלו את הממברנות בנוגדנים משניים מצומדים לחזרת (HRP) מדולל (1:5,000 במאגר TBST המכיל 5% חלב דל שומן) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר (RT).
   13. שוטפים את הממברנה עם TBST 3 פעמים, בכל פעם למשך 10 דקות.
   14. דמיין את רמות החלבון באמצעות ריאגנטים כימילומינסנציה משופרים (ECL) (ראה טבלת חומרים).
2. זיהוי לולאת R על ידי כתם נקודה²⁵​
   1. שאפו את מדיום התרבות מהצלחות.
   2. שטפו בעדינות את התאים עם 1x PBS כדי להסיר שאריות של מדיום או פסולת.
   3. הוסף נפח קטן של 1x PBS כדי לשמור על לחות התאים בתהליך הגירוד.
   4. השתמש במגרד תאים, החזק אותו בזווית, וגרד בעדינות את התאים מפני השטח בכיוון עקבי.
      הערה: היזהר לא להפעיל לחץ רב מדי, שעלול לפגוע בתאים.
   5. הטה את הצלחת והשתמש בפיפטה כדי לאסוף את תרחיף התא לתוך צינור וסובב את התאים ב-500 x גרם למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט.
   6. Lyse 2 × 10⁶ תאים עם 300 מיקרוליטר של מאגר ליזה של תאים קרים כקרח (ראה טבלה 1). דגירה על קרח למשך 10 דקות. סובב ב-500 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס והשליך את הסופרנטנט. הגלולה מכילה גרעינים.
   7. השתמש בקצה פתח רחב כדי להשעות מחדש כל כדור עם 300 מיקרוליטר של מאגר ליזה גרעיני מקורר מראש (ראה טבלה 1).
   8. הוסף 3 מיקרוליטר של 20 מ"ג/מ"ל פרוטאינאז K (ראה טבלת חומרים) לכל דגימה ועכל במשך 3-5 שעות ב-55 מעלות צלזיוס.
   9. הוסף 100 מיקרוליטר של מאגר פליטה (ראה טבלה 1) לכל צינור וערבב היטב.
   10. יש להוסיף 400 מיקרוליטר פנול: כלורופורם: אלכוהול איזואמיל (25:24:1 pH 8.0) לכל שפופרת. לאחר מערבולת נמרצת, צנטריפוגה ב-12,000 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי להפריד DNA מתכולת תאים אחרים.
   11. העבירו בזהירות את השלב המימי העליון לצינורות החדשים.
   12. זרז את ה-DNA על ידי הוספת נפח 1/10 של 3 M נתרן אצטט (pH 5.2) ונפח 2.5 של אתנול 100% מקורר מראש לדגימה. מערבבים היטב ודוגרים במשך 4 שעות או לילה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
       הערה: תוספת של גליקוגן (ראה טבלת חומרים) לדגימה יכולה להגביר את התאוששות ה-DNA ממשקעי אתנול. ריכוז הגליקוגן הסופי הוא כ-0.05-1 מיקרוגרם/מיקרוליטר.
   13. גלולה את ה-DNA על ידי צנטריפוגה ב-12,000 x גרם למשך 30 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור.
   14. שטפו את הגלולה עם 1 מ"ל אתנול 70% קר כקרח וצנטריפוגה שוב למשך 5-15 דקות ב-12,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס.
   15. השליכו את הסופרנטנט בזהירות כדי למנוע הפרעה לכדור הדנ"א.
   16. יבש את כדור ה-DNA באוויר למשך 5-10 דקות.
   17. ממיסים את גלולת ה-DNA על ידי הוספת 50 מיקרוליטר של מאגר TE מחומם מראש (pH8.0) ודגירה למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. מדוד את ריכוז ה-DNA של כל דגימה.
   18. הכן דילולים של DNA לריכוזים הרצויים במאגר TE (5 ננוגרם/מיקרוליטר עד 200 ננוגרם/מיקרוליטר). אתר באופן שווה 20 מיקרוליטר מכל דגימה על קרום ניילון טעון חיובי על ידי מנגנון כתמי נקודות.
       הערה: כדי לזהות לולאות R באמצעות בדיקת כתם נקודות, מומלץ ליישם כ-500 ננוגרם של DNA גנומי לכל נקודה. כמות זו הוכחה כמספקת רגישות מספקת לזיהוי הכלאות RNA-DNA בעת שימוש בנוגדנים חד שבטיים S9.6, הנקשר במיוחד למבנים אלה.
   19. לשתק את ה-DNA על ידי קישור צולב של ה-DNA לקרום הניילון (ראה טבלת חומרים) באמצעות הגדרת "קישור צולב אוטומטי" של UV (1,200 μJ x 100) (ראה טבלת חומרים).
   20. טבלו את הממברנות במאגר חוסם (ראה טבלה 1) למשך שעה בטמפרטורת החדר. ואז שוטפים בקצרה את הממברנות עם TBST.
   21. יש לדגור למשך הלילה על הממברנה עם נוגדן ראשוני (ראה טבלת חומרים) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הדילול של S9.6 הוא 1:1,000 ב-TBST המכיל 5% BSA.
   22. הסר את הנוגדן הראשוני ושטוף 3 פעמים עם TBST, ובכל פעם למשך 10 דקות.
   23. דגרו את הממברנה עם נוגדן משני מצומד HRP ב-5% BSA ב-TBST בטמפרטורת החדר למשך שעה.
   24. יש להסיר נוגדנים משניים ולשטוף 3 פעמים עם TBST, ובכל פעם למשך 10 דקות.
   25. דמיין את רמות לולאת ה-R באמצעות ריאגנטים ECL (כימילומינסנציה משופרת) ראה טבלת חומרים).

3. בדיקת PLA

1. הכנת תאים
   הערה: התמרה של תאים עם האונקוגן KRAS G12D מובילה לעלייה ב-TRCs, כפי שמעיד אות PLA חיובי. שיטה זו מבדילה ביעילות בין TRCs מונעי אונקוגן לבין רמות רקע ללא צורך בבחירת אנטיביוטיקה. עם זאת, יישום ברירה אנטיביוטית לאחר התמרה יכול לשפר את האות הכולל על ידי העשרת אוכלוסיית התאים שהומרו בהצלחה, ובכך לשפר את הרגישות והספציפיות של הבדיקה.
   1. הניחו כוסות כיסוי בקוטר 12 מ"מ בכל באר של צלחת בת 12 בארות.
   2. זרעו את התאים הנגועים בנגיף הלנטי לבארות אלה 24 שעות לאחר ההדבקה, ושמרו על התאים על כוסות כיסוי ב-500 מיקרוליטר של מדיום RPMI-1640 שלם ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂.
   3. אופטימלי) אם תכנון הניסוי כולל בחירת אנטיביוטיקה להעשרה לתאים שעברו התמרה מוצלחת, הוסף את האנטיביוטיקה המתאימה למדיום התרבית בשלב זה.
   4. עקוב אחר התאים כדי לוודא שהם מגיעים לכ-60% מפגש 48-72 שעות לאחר ההדבקה.
   5. הסר בזהירות RPMI-1640 וחלץ מראש תאים עם 0.5% NP-40 קר למשך 4 דקות על קרח.
   6. הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר קיבוע (ראה טבלה 1) ישירות כדי לתקן את התאים למשך 15 דקות ב-RT.
      הערה: מומלץ לא לשטוף תאים לפני שלב הקיבוע מכיוון שהדבר עלול לגרום להם להתנתק מהמשטח עליו הם גדלים, במיוחד אם קו התאים רגיש לניתוק; לכן, הוספה ישירה של הפתרון המקבע עדיפה לעתים קרובות.
   7. עצור את התגובה על ידי הסרת מאגר הקיבוע ושטיפת התאים בזהירות עם 1x PBS 3 פעמים.
   8. שאפו מ-PBS והוסיפו 500 מיקרוליטר של 100% מתנול מקורר מראש לתאים.
   9. לחדור לתאים על ידי דגירה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך 15-30 דקות.
   10. חסום תאים עם פתרון בלוק Duolink למשך שעה אחת ב-RT.
2. צביעת נוגדנים
   1. דילול עכבר אנטי-RNAPII 8WG16 (1:500) וארנב אנטי-PCNA (D3H8P) (1:500) במאגר דילול נוגדנים של Duolink. דגרו את התאים עם תערובת הנוגדנים הראשונית למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בתא לחות.
      הערה: בצע את פרוטוקול PLA באמצעות אחד מהנוגדנים העיקריים בלבד (אנטי-RNAPII או אנטי-PCNA) תוך השמטת השני. זה עוזר לזהות כל אות רקע הנובע מאינטראקציות לא ספציפיות של הנוגדנים הבודדים או בדיקות PLA.
   2. הסר בעדינות את הנוגדנים העיקריים מהשקופיות באמצעות דף פסולת נייר נטול מוך מבלי לגעת בתאים. לאחר מכן, שטפו את התאים 3 פעמים עם 1x PBS.
   3. הכן בדיקות PLA (או נוגדן משני) לפי הנוהל הבא (ראה טבלה 2), ולאחר מכן ערבב והניח לעמוד למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
   4. הוסף את תערובת הנוגדנים המשנית לשקופיות ודגירה בתא לחות למשך שעתיים ב-RT.
3. קשירה והגברה
   1. השליכו את תערובת הנוגדנים המשנית ושטפו את השקופיות פעמיים עם 1x Buffer A כל אחת למשך 5 דקות.
   2. הכן את תערובת הקשירה לפי ההליך הבא (ראה טבלה 2).
   3. מרחו 15 מיקרוליטר של תערובת קשירה על כל שקופית כיסוי ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בתא לחות.
   4. שטפו את המגלשות פעמיים עם 1x Buffer A כל אחת למשך 2 דקות.
   5. הכן את Ampתערובת לפי ההליך הבא (ראה טבלה 2).
   6. מרחו 15 מיקרוליטר של תערובת הגברה על כל שקופית ודגרו למשך 100 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתא לחות. יש להשליך הגברה יש לערבב ולשטוף פעמיים עם מאגר B אחד כל אחד למשך 10 דקות.
   7. שטפו את השקופיות פעם אחת עם מאגר B 0.01x למשך דקה אחת.
   8. שאפו את המאגר B והרכיבו את השקופיות במדיום הרכבה Duolink In Situ עם DAPI.
4. ניתוח תמונה וקביעת סף:
   1. כמת את מספר מוקדי ה- PLA על ידי ImageJ. תוכנת ניתוח תמונה אוטומטית יכולה לסייע בכימות אותות PLA באופן אובייקטיבי. בחר סף של 3 מוקדי PLA או יותר לכל גרעין כסף מכיוון שפחות מ-1% מתאי הבקרה רוכשים 3 מוקדי PLA בתנאים לא מופרעים.
      הערה: מכיוון שהסף נקבע באופן ניסיוני על ידי ניתוח דגימות ובקרות מרובות כדי לקחת בחשבון את השונות, יש לשמור על הגדרות הדמיה עקביות (למשל, זמן חשיפה, רווח) בכל הדגימות כדי להבטיח השוואה.

γH2AX משמש כסמן ביולוגי לנזק ל-DNA. ביטוי יתר של KRAS (G12D) פוגע ביציבות הגנומית בתאים אלה, כפי שמעיד האות המוגבר γH2AX בניתוח כתמים מערביים (איור 2A). בנוסף, אות הכתם המוגבר של S9.6 נקודות בתאים המבטאים KRAS (G12D) בהשוואה לבקרות וקטוריות (איור 2B) מצביע על כך שביטוי KRAS אונקוגני מוביל להצטברות של לולאות R חריגות, מה שעשוי לתרום להיווצרות שבירת DNA.

איור 3 מציג תמונות מייצגות ממבחן קשירת הקרבה (PLA). בתמונות אלה, נקודות ירוקות בהירות בתוך הגרעינים מצביעות על כך שהמרחק בין קומפלקס השכפול הקשור ל-PCNA לבין קומפלקס השעתוק RNAPII הוא פחות מ-40 ננומטר. בתאי בקרה וקטורית, נקודות ירוקות כמעט ולא מזוהות, ואילו בתאים המבטאים KRAS (G12D), נצפות נקודות ירוקות מרובות לכל גרעין. זה מצביע על כך שביטוי KRAS אונקוגני מגביר את תדירות המפגשים בין RNAPII למתחמי שכפול. תוצאות PLA אלה תואמות את הממצאים ממבחני הכתם המערבי (איור 2A) וכתם הנקודות (איור 2B).

לסיכום, ממצאים אלה מדגימים כי בדיקת קשירת הקרבה מזהה ביעילות קונפליקטים הנגרמים על ידי אונקוגן בין RNAPII למכונות שכפול. יכולת זו טומנת בחובה פוטנציאל משמעותי ליישומים עתידיים, ומאפשרת כימות של TRCs על פני סוגי דגימות מגוונים הנובעים מביטוי אונקוגן חריג. אמנם קיימות מגבלות מסוימות, אך הסיכויים לשיטה זו מבטיחים, במיוחד עם התאמות לתנאי הניסוי המותאמים לדגימות שונות.

איור 1: ייצוג סכמטי של בדיקת קשירת קרבה באתרה . (1) קבע את שותפי האינטראקציה הזוגיים של מעניין. (2) לדגור את הדגימה עם נוגדנים ראשוניים מזווגים המכוונים לחלבונים הרצויים, ואחריהם נוגדנים משניים מצומדים עם בדיקות אוליגונוקלאוטיד. (3) מוצגים אוליגוס מחברים, המשלימים את האוליגו המחוברים לכל בדיקת PLA. אם חלבוני המטרה קרובים מספיק, רצפי האוליגונוקלאוטידים המחוברים לבדיקות ה-PLA יהיו בסמיכות. (4) אם חלבוני המטרה נמצאים בסמיכות (בדרך כלל <40 ננומטר), האוליגונוקלאוטידים בבדיקות ה-PLA באים במגע ויכולים להיקשר על ידי ליגאז DNA ליצירת מולקולת DNA מעגלית. (5) בצע RCA באמצעות פולימראז כדי להגביר את ה-DNA המעגלי, וליצור גדיל DNA ארוך שחוזר על עצמו. הכלאה של אוליגונוקלאוטידים עם תווית פלואורסצנטית לתוצר ה-DNA המוגבר, המאפשר הדמיה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: נזק ל-DNA והצטברות לולאת R בתאי ביטוי KRAS (G12D). (A) ניתוח כתמים מערביים מייצג של ליזטים של תאים שלמים מתאי BEAS-2B, הממחיש עלייה ברמות γH2AX לאחר 72 שעות של ביטוי KRAS G12D. כתם γH2AX שימש להערכת נזק ל-DNA, כאשר ACTB שימש כבקרת הטעינה. כתם ה-FLAG אישר את הביטוי של KRAS G12D. (B) ניתוח כתמי נקודות מייצג של היווצרות לולאת R בתאי BEAS-2B, השוואת תנאים עם ובלי ביטוי KRAS G12D. הנוגדן S9.6 שימש לאיתור לולאות R, בעוד שנוגדנים נגד DNA שימשו לכימות ה-DNA הכולל. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: הצטברות של TRC בתאי ביטוי KRAS (G12D). תמונות מייצגות מבדיקת PLA. המוקדים הירוקים הבהירים בתאים המבטאים KRAS G12D מצביעים על התנגשויות בין PCNA ל-RNA Polymerase II (RNAPII). אימונוציטוכימיה PLA מדגימה TRCs גבוהים בתאים המבטאים KRAS G12D בהשוואה לתאי וקטור. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: הכנת מאגר. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

טבלה 2: הכנת תגובת PLA. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

טבלה 3: פתרון בעיות עבור בדיקת PLA. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

מנגנון השעתוק RNAPII יכול ליצור מכשול להתקדמות מזלג שכפול ה-DNA^26,27, ולקדם TRCs ונזק ל-DNA, במיוחד בתאי סרטן^28,29. פענוח החלבונים המווסתים TRCs והבנת המנגנונים המפורטים יכולים לסייע לנו להבין כיצד אירועים מזיקים אלה מתרחשים ולהנחות את הפיתוח של גישות טיפוליות חדשות בעתיד. לכן, כדי להבין באופן מלא את TRCs, שיטות מהירות ואמינות לזיהוי TRC הן חיוניות.

כאן, אנו מתארים הליך לבחינת השכיחות של קונפליקטים של שעתוק-שכפול (TRCs) באמצעות בדיקת PLA באתר . גישה זו מאפשרת הערכה קלה של תדר TRC בנוכחות איתות אונקוגני בתוך התאים. זה לא דורש ציוד יקר או כמויות גדולות של חומר מוצא. הפרוטוקול שלנו כולל גם כתם נקודה S9.6 וכתם מערבי כדי לאשר את הספציפיות של אות ה-TRC הנגזר מביטוי KRAS (G12D).

בדיקה זו מסתמכת על זיהוי קומפלקסים של שכפול ושעתוק RNAPII על ידי זוגות של מצומדי נוגדנים-אוליגונוקלאוטידים (בדיקות PLA), המייצרים יחד מעגלי DNA המשמשים כתבניות לתגובות הגברה מקומיות של מעגל מתגלגל. הדרישה לזיהוי כפול של חלבוני המטרה משפרת את הסלקטיביות על ידי ביטול כל תגובתיות צולבת שאינה משותפת לזוגות הנוגדנים, ומבטיחה תוצאות חד משמעיות וניתנות לשחזור. לכן, הספציפיות והזיקה החזקה של הנוגדנים חיוניים להצלחת בדיקת ה-PLA. זה קריטי לייעל את התנאים לביצועי הנוגדנים בתוך הדגימה, הכוללים (i) תנאי קיבוע וחדירות תאים, (ii) תמיסת חסימה ו-(iii) דילול נוגדנים ראשוני. בקרות שליליות מתאימות הן קריטיות, שכן (i) בקרות נוק-דאון יכולות לאמת את הספציפיות של הנוגדנים הראשוניים, ו-(ii) בקרות עם איזוטיפ IgG יכולות לבדוק את הספציפיות של בדיקות ה-PLA.

רבות מהבעיות הנפוצות בבדיקת PLA מזוהות. אלה כוללים היעדר האות הצפוי ונוכחות של אות רקע לא ספציפי. סיכום של הסיבות והפתרונות האפשריים לבעיות אלה מסופק בטבלה 3.

יש לציין כי שיטה זו יכולה לאשר רק את הקרבה הפיזית בין PCNA ל-RNA פולימראז II; עם זאת, קרבה זו אינה מרמזת בהכרח על התרחשות של שברי DNA מזיקים. מגבלה מרכזית נוספת היא ששיטה זו אינה יכולה לספק מידע על מיקומי הכרומטין הספציפיים שבהם שני הקומפלקסים הללו מתקשרים. הבנה מלאה של הפסקות DNA הקשורות לשעתוק דורשת ניתוח מתוחכם יותר. תוך מינוף טכנולוגיית הריצוף של הדור הבא, הפיתוח של TRIPn-seq הוא אחת השיטות הבודדות המסוגלות לאתר במדויק תפוסה משותפת של שעתוק ושכפול, החלה על כל תאים מתרבים^21,29. עם זאת, למרות האינפורמטיביות של שיטה זו, עלותה הגבוהה ואופייה עתיר הזמן מגבילים את נגישותה.

לסיכום, המחקרים שלנו מצביעים על כך ש-PLA באתרו היא גישה יעילה לקביעת הקרבה של מכונות שכפול ושעתוק RNAPII בתאים קבועים, ברזולוציה כמותית ומרחבית כאחד. השימוש הספציפי בנוגדנים PCNA ו-RNAPII (8WG16) הוכח כיעיל לחקר TRCs בתאי BEAS-2B. בנוסף ל-TRCs הקשורים לשעתוק RNAPII, ניתן להשתמש במבחן ה-PLA באתרו גם כדי לחקור TRCs הקשורים ל-RNAPI ו-RNAPIII במסגרות קליניות ומחקריות, בתנאי שיוחלו בקרות והתאמות מתאימות.

מחקר³⁰ שפורסם לאחרונה הציג אסטרטגיה טיפולית חדשה לסרטן המאופיין ב-DNA חוץ-כרומוזומלי (ecDNA). החוקרים הגדילו את קונפליקטי השעתוק-שכפול (TRCs) כדי לנצל פגיעויות בתאי סרטן חיוביים ל-ecDNA, תוך התמקדות סלקטיבית בהם תוך שמירה על תאים נורמליים. הערכת מצב TRC באמצעות שיטת PLA יכולה לספק תובנות חשובות לגבי היציבות הגנומית של תאי הסרטן של המטופל. ניטור מצב TRC במהלך הטיפול עשוי לסייע בהערכת היעילות של טיפולים המכוונים ל-TRCs. לכן, שילוב הערכת TRC מבוססת PLA בגישות רפואה מותאמת אישית טומן בחובו הבטחה לשיפור אבחון הסרטן, הפרוגנוסטיקה וניטור הטיפול על ידי הצעת הבנה מעמיקה יותר של הדינמיקה המולקולרית בתוך גידולים בודדים.

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

עבודה זו נתמכה על ידי מימון הסטארט-אפים של אוניברסיטת דרום סין.