In dieser Arbeit stellen wir eine sensitive und spezifische Methode zum Nachweis von onkogeninduzierten Transkriptions-Replikationskonflikten (TRCs) mit dem Proximity-Ligation-Assay (PLA) vor. Dieser Ansatz nutzt spezifische Antikörper, die auf PCNA- und Phospho-CTD-RNAPII abzielen, und ermöglicht so die Beurteilung der TRC-Prävalenz zwischen RNA-Polymerase-II-Transkription und DNA-Replikationsmaschinerie.

Sowohl die DNA-Replikation als auch die RNA-Transkription verwenden genomische DNA als Vorlage, was eine räumliche und zeitliche Trennung dieser Prozesse erforderlich macht. Konflikte zwischen der Replikations- und der Transkriptionsmaschinerie, die als Transkriptions-Replikationskonflikte (TRCs) bezeichnet werden, stellen ein erhebliches Risiko für die Genomstabilität dar, ein kritischer Faktor für die Krebsentstehung. Obwohl mehrere Faktoren identifiziert wurden, die diese Kollisionen regulieren, bleibt es schwierig, die Hauptursachen zu lokalisieren, da die Werkzeuge für eine direkte Visualisierung und klare Interpretation begrenzt sind. In dieser Studie visualisieren wir TRCs direkt mit einem Proximity-Ligation-Assay (PLA) unter Verwendung von Antikörpern, die spezifisch für PCNA und phosphorylierte CTD der RNA-Polymerase II sind. Dieser Ansatz ermöglicht eine präzise Messung von TRCs zwischen Replikations- und Transkriptionsprozessen, die durch RNA-Polymerase II vermittelt werden. Die Methode wird durch DNA-Primer, die kovalent an diese Antikörper konjugiert sind, in Verbindung mit der PCR-Amplifikation mit Fluoreszenzsonden weiter verbessert, was ein hochempfindliches und spezifisches Mittel zum Nachweis endogener TRCs bietet. Die Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht die Visualisierung dieser Konflikte und bietet ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung von Genominstabilitätsmechanismen, die mit Krebs verbunden sind. Diese Technik schließt die Lücke in der direkten TRC-Visualisierung und ermöglicht eine umfassendere Analyse und ein besseres Verständnis der zugrunde liegenden Prozesse, die zur Genominstabilität in Zellen führen.

Das Genom dient als Vorlage für essentielle biologische Prozesse, einschließlich Replikation und Transkription. In gesunden Zellen arbeiten RNA-Transkription und DNA-Replikationsmaschinerie typischerweise zusammen und sind räumlich und zeitlich getrennt 1,2,3,4. Unter pathologischen Bedingungen, wie z.B. einer Überexpression von Onkogenen, kann diese harmonische Zusammenarbeit jedoch gestört werden.

Onkogene führen häufig zu erhöhten Transkriptionswerten, was die Wahrscheinlichkeit von Kollisionen zwischen der Transkriptions- und der Replikationsmaschinerie erhöht⁵. Einige Onkogene verändern die Chromatinarchitektur, wodurch sie für die Transkription leichter zugänglich wird, aber möglicherweise das Fortschreiten der Replikationsgabel behindert^{wird 5}. Darüber hinaus kann die Aktivierung des Onkogens Replikationsstress induzieren, indem sie den Zellzyklus beschleunigt⁶. Die Aktivität der RNA-Polymerase II (RNAPII) ist während des G1/S-Phasenübergangs aufgrund der Cyclin-abhängigen Kinase (CDK)-Phosphorylierung von Rb signifikant erhöht, wodurch E2F-Transkriptionsfaktoren freigesetzt werden, die die Transkription essentieller Proteine, einschließlich Cycline, CDKs und Housekeeping-Gene, fördern⁷. Die Histon-Genexpression erreicht ihren Höhepunkt während der S-Phase, die mit der DNA-Replikation zusammenfällt⁸. Darüber hinaus erfordert die Transkription der Transkripte einiger sehr langer Gene in voller Länge mehr als einen Zellzyklus⁹. Bei jedem Eintritt in die S-Phase kann die gleichzeitige Aktivität von Transkriptions- und Replikationsmaschinerie in denselben genomischen Regionen zu nachteiligen Begegnungen führen, die zu Konflikten führen. Diese Konflikte sind eine der Hauptursachen für die Instabilität des Genoms, die eng mit der Tumorgenese verbunden ist. Wie die Replikationsmaschinerie mit der RNAPII-Transkription koordiniert wird, um schädliche Zusammenstöße zu verhindern und die genomische Stabilität aufrechtzuerhalten, bleibt eine wichtige Frage. Daher ist die direkte Visualisierung von RNAPII-assoziierten Transkriptions-Replikations-Konflikten (TRCs) für das Verständnis der molekularen Mechanismen, die diese Konflikte lösen, unerlässlich geworden und könnte schließlich die Grundlage für die Nutzung dieser Konflikte für therapeutische Zwecke legen.

Transkriptions-Replikationskonflikte (TRCs) können in zwei Richtungen auftreten: frontal, wo Transkription und Replikation aufeinander zugehen, und kodirektional, wo sie sich in die gleiche Richtung bewegen. Frontalzusammenstöße sind weitaus zerstörerischer als kodirektionale Zusammenstöße 10,11,12,13. Die Bildung von DNA-RNA-Hybriden (R-Schleifen) wurde als einer der Haupttreiber von TRCs identifiziert; Daher hat eine beträchtliche Menge an Forschung das Vorhandensein von TRCs abgeleitet, indem das Auftreten von R-Schleifen und ihren Regionen als Reaktion auf dysregulierte Replikation und/oder Transkription untersucht wurde^10,11. Ob die Akkumulation von transkriptionsabgeleiteten R-Schleifen als proportionales Hindernis für die Replikation dient und direkt mit TRCs korreliert, bleibt jedoch eine ungeklärte Frage. Forscher haben TRCs auch untersucht, indem sie die Dynamik der Replikationsgabel analysiert haben. Zum Beispiel kann die zweidimensionale Gelelektrophorese von Reportergenen locusspezifische Replisom-Pausierungen aufdecken¹², während DNA-Faser-Assays es Forschern ermöglichen, Veränderungen in der Replikationsgabelgeschwindigkeit, der Ursprungsdichte und der Gabelasymmetrie zu untersuchen¹³. Die Weiterentwicklung der Next-Generation-Sequencing-Technologie hat zur Entwicklung mehrerer innovativer Methoden geführt, wie z. B. die Okazaki-Fragmentsequenzierung (Ok-seq)^14,15, die Sequenzierung der Initiationsstelle (ini-seq)^16,17, die Sequenzierung kurzer naszierender Strange (SNS-seq)¹⁸, Repli-seq¹⁹ und die Polymerase-Sequenzierung (Pu-seq)²⁰. Diese Techniken haben genomweite Profile der Verwendung des Replikatursprungs, der Gabelrichtungalität und der Replikationsbeendigung geliefert und Schlüsselfaktoren aufgedeckt, die an der Koordination von Replikation und Transkription beteiligt sind. TRIPn-seq ist eine der wenigen Methoden, die in der Lage sind, die gleichzeitige Belegung von Transkription und Replikation direkt zu detektieren und unser Verständnis der dynamischen Organisation von DNA-Replikation und Transkription unter physiologischen und pathologischen Bedingungen erheblich zu erweitern²¹. Trotz der wertvollen Erkenntnisse, die diese sequenzierungsbasierten Methoden liefern, schränken ihre hohen Kosten und ihre Zeitintensität ihre breitere Anwendung ein. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, eine definitivere, hochempfindlichere, bequemere und schnellere Nachweismethode zur Visualisierung und Quantifizierung von TRCs auf Einzelzellebene zu etablieren.

Der in situ Proximity-Ligation-Assay (PLA), auch bekannt als Duolink PLA-Technologie, ist eine leistungsstarke Methode zur Bewertung der physikalischen Nähe von Zielproteinen in Gewebeschnitten oder Zellkulturen. Diese Technik erzeugt nur dann ein Signal, wenn sich zwei Proteine oder Proteinkomplexe innerhalb von 40 nm voneinander befinden. Es werden zwei primäre Antikörper gegen die Zielproteine benötigt, die jeweils von einer anderen Spezies stammen (z. B. Maus/Kaninchen, Kaninchen/Ziege oder Maus/Ziege). Nach der Inkubation der Probe mit diesen Primärantikörpern werden Sekundärantikörper, sogenannte PLA-Sonden (ein PLUS und ein MINUS), aufgebracht. Im Gegensatz zu regulären Sekundärantikörpern, die an die konstanten Regionen der Primärantikörper binden, sind PLA-Sonden kovalent an spezifische DNA-Primer gebunden. Wenn sich die Zielproteine in unmittelbarer Nähe (weniger als 40 nm) befinden, kann ein Konnektor-Oligonukleotid mit beiden PLA-Sonden hybridisieren, was die enzymatische Ligation ihrer angehängten Oligonukleotide zu einem DNA-Molekül in voller Länge erleichtert. Diese neu gebildete DNA dient als Surrogatmarker für die nachgewiesene Proteininteraktion und dient als Template für die Amplifikation. Das amplifizierte Produkt wird dann mit fluoreszenzmarkierten Oligonukleotidsonden visualisiert. Wenn die Proteine mehr als 40 nm voneinander entfernt sind, können die PLA-Sonden keine DNA-Vorlage bilden, was zu keinem nachweisbaren Signal führt. Das schematische Diagramm von PLA ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Nähe und/oder Wechselwirkung werden durch die Fluoreszenzmikroskopie als fluoreszierende Punkte sichtbar gemacht, und die Anzahl und Intensität dieser Punkte kann quantifiziert werden. Seit seiner Erfindung im Jahr 2002 ist PLA aufgrund seiner hohen Sensitivität und Spezifität für die Überwachung von Proteininteraktionen beliebt geworden. Im Gegensatz zu sequenzierungsbasierten Assays benötigt PLA nur kleine Probenmengen, was es vorteilhaft für die Analyse knapper Proben macht.

Studien haben gezeigt, dass die Expression der onkogenen KRAS G12D-Mutation zu Transkriptions-Replikationskonflikten (TRCs) ^führt22,23. Zum Beispiel deuten Forschungsergebnisse von Meng et ^al.23 darauf hin, dass die ektopische Expression von KRAS G12D in humanen duktalen Epithelzellen der Bauchspeicheldrüse (HPNE) TRCs und TRC-bezogene R-Schleifen verstärkt. Um die Detektion von Kollisionen zwischen RNAPII-Transkription und Replikationsmaschinerie in Zelllinien zu ermöglichen, stellen wir ein speziell für diesen Zweck entwickeltes Protokoll zur Verfügung. Das KRAS-Plasmid (G12D) und die Vektorkontrolle werden in humane BEAS-2B-Zellen des Lungenepithels transfiziert, und die Expression von KRAS (G12D) wird zusammen mit der DNA-Schädigung (γH2AX) durch Western Blot verifiziert. Die Akkumulation von R-Schleifen wird durch die S9.6-Dot-Blot-Analyse bestätigt, die zusammen auf die Akkumulation von Replikationsblockaden und Genominstabilität in Zellen hinweist, die KRAS (G12D) exprimieren. Abschließend werden die Zellen für den PLA-Assay auf Objektträgern fixiert. Für die lokalisierte Detektion von Kollisionen werden die Zellen zunächst mit RNAPII- und PCNA-Primärantikörpern gefärbt, gefolgt von der Färbung mit Sekundärantikörpern, die mit PLA-Sonden konjugiert sind. Durch erfolgreiche Ligation bildet sich ein zirkuläres DNA-Molekül, das als Vorlage für die anschließende Rolling-Circle-Amplifikation (RCA) dient. Anschließend werden die Objektträger mit entsprechenden Einbettmedien montiert und unter einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht. Die Bilder können mit ImageJ analysiert werden.

1. Produktion von Lentiviren und Transduktion in die Zielzelllinie

1. Produktion von Lentiviren²⁴
   1. 293T-Verpackungszellen bei 3 × 10⁶ Zellen pro 10-cm-Platte in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM; vollständiges Medium) mit hohem Glukosegehalt aussäen. Züchten Sie die Zellen bei 37 °C in einem befeuchteten 5 % CO₂ -Inkubator für weitere 18-20 Stunden.
   2. Bereiten Sie in zwei 1,5-ml-Röhrchen eine DNA-Mischung aus insgesamt 24 μg Plasmid-DNA in 500 μl Opti-MEM (reduziertes Serummedium) vor, die 9,2 μg psPAX2, 2,8 μg pMD2.G sowie 12 μg pLVX-KRAS-Plasmid bzw. leeren Vektor enthält.
      HINWEIS: Da Endotoxine die Transfektionseffizienz erheblich verringern, wird empfohlen, Endotoxin während der Reinigung aus dem Plasmid zu entfernen.
   3. 144 μl Polyethylenimin (PEI; 1 mg/ml) in 1 ml reduziertem Serummedium verdünnen, mischen und 5 Minuten bei Raumtemperatur (RT) inkubieren.
   4. Geben Sie 500 μl verdünntes PEI tropfenweise zur verdünnten DNA-Mischung, während Sie das Röhrchen vorsichtig schnippen. Inkubieren Sie die PEI/DNA-Mischungen 15 Minuten lang bei RT.
   5. Während der Inkubation wird das Medium vorsichtig von den zuvor ausgesäten 10 cm Platten abgesaugt. Ersetzen Sie es durch 10 ml frisches, vollständiges DMEM.
   6. Pipettieren Sie nach der Inkubation die DNA: PEI-Transfektionsmischung langsam auf die 10-cm-Platten, wobei Sie darauf achten, dass sich die Zellen nicht ablösen.
      HINWEIS: PEI ist ein häufig verwendetes Transfektionsreagenz, aber seine Konzentration muss sorgfältig optimiert werden, um ein Gleichgewicht zwischen Transfektionseffizienz und Zytotoxizität herzustellen. Trotz der höheren Kosten von Lipofectamine 3000 (Transfektionsreagenz) hat es im Vergleich zu PEI in bestimmten Zelllinien eine höhere Transfektionseffizienz und eine geringere Zytotoxizität gezeigt, was zu einer verbesserten Virusproduktion führt. Die Elektroporation ist eine weitere Alternative, bei der elektrische Impulse verwendet werden, um Nukleinsäuren in die Zellen einzubringen. Es ist zwar effektiv, erfordert aber spezielle Ausrüstung und kann arbeitsintensiver sein.
   7. Züchten Sie die Zellen 18 Stunden lang und ersetzen Sie dann vorsichtig das Transfektionsmedium durch frische 10 ml DMEM Complete-Medium mit 25 μM Chloroquin.
   8. Nach 72 Stunden Transfektion ist das Kulturmedium mit den Viruspartikeln zu entnehmen. Entfernen Sie die Verpackung 293T Zellen, indem Sie 5 Minuten lang bei 500 x g zentrifugieren.
   9. Der Überstand wird aufgefangen und durch einen 0,45 μm Polyethersulfon (PES)-Filter filtriert. Verwenden Sie den Virusüberstand direkt.
      HINWEIS: Der Virusüberstand sollte aliquotiert und in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80 °C aufbewahrt werden, um einen Titerverlust zu vermeiden.
2. Lentivirale Infektion von Zielzellen
   1. 2 × 10⁶ Zielzellen BEAS-2B in zwei 6 cm Platten säen und über Nacht bei 37 °C, 5% CO₂ wachsen. Stellen Sie bei der Transduktion sicher, dass die BEAS-2B-Zellen zu etwa 70 % konfluent sind.
   2. Entfernen Sie vorsichtig das alte Medium und geben Sie die entsprechenden 0,5 ml KRAS oder Vektor-Lentiviruspartikel zusammen mit 3 ml frischem vollständigem RPMI-1640-Medium in jeweils zwei Platten.
   3. Züchten Sie die Zellen bei 37 °C für 18-20 h in einem 5% CO₂ -Inkubator. Ersetzen Sie das alte Medium mit lentiviralen Partikeln durch 3,5 ml frisches, vorgewärmtes vollständiges Kulturmedium. Nach 72 Stunden Transduktion werden die Zellen für den folgenden Assay entnommen.
      HINWEIS: Wenn die Inkubation über Nacht mit dem Virus Toxizität verursacht, kann die Inkubationszeit auf 4 Stunden verkürzt werden. Um das Gleichgewicht zwischen Transduktionseffizienz und Zellgesundheit zu erreichen, müssen die folgenden Strategien in Betracht gezogen werden: (1) Optimierung der Infektionsvielfalt; (2) Verwenden Sie hochwertige virale Präparate; (3) Verwendung von Polykationen (z. B. Polybren) zur Verbesserung der Effizienz, wodurch niedrigere Virustiter ermöglicht und die potenzielle Toxizität verringert werden kann; (4) Für Langzeitstudien sollte die Verwendung von induzierbaren Expressionssystemen in Betracht gezogen werden, um die Transgenexpression zeitlich zu kontrollieren, die Belastung der Zellen zu verringern und die potenzielle Toxizität zu minimieren.

2. Verifizierung von DNA-Schäden durch KRAS (G12D) und R-Schleifenbildung

1. Bestätigung der Genexpression und DNA-Schäden durch WB-Assay
   1. Aspirieren Sie das Kulturmedium von den Platten.
   2. Waschen Sie die Zellen vorsichtig mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), um Mediumsreste oder Ablagerungen zu entfernen.
   3. Fügen Sie ein kleines Volumen von 1x PBS hinzu, um die Zellen während des Schabevorgangs feucht zu halten.
   4. Verwenden Sie einen Zellschaber, halten Sie ihn in einem Winkel und kratzen Sie die Zellen vorsichtig in gleichmäßiger Richtung von der Oberfläche ab.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, nicht zu viel Druck auszuüben, da dies die Zellen beschädigen könnte.
   5. Kippen Sie die Platte und verwenden Sie eine Pipette, um die Zellsuspension in ein Röhrchen zu füllen und die Zellen 5 Minuten lang bei 500 x g zu drehen. Entsorgen Sie den Überstand.
   6. Bereiten Sie den 1x RIPA-Puffer vor, indem Sie den 2x RIPA-Puffer verdünnen (siehe Tabelle 1), und fügen Sie den Proteasehemmer-Cocktail und den Phosphatase-Hemmer-Cocktail unmittelbar vor der Verwendung hinzu.
   7. Das Zellpellet mit vorgekühltem RIPA-Puffer (1x) lysieren und 30 min auf Eis inkubieren. Entfernen Sie die Ablagerungen, indem Sie 10 Minuten lang bei 15.000 x g zentrifugieren. Sammeln Sie den Überstand und messen Sie die Proteinkonzentration mit dem Bradford-Assay.
   8. Geben Sie 4 x Natriumdodecylsulfat (SDS) Probenladepuffer in den Überstand und denaturieren Sie die Proteine für 5 min bei 95 °C. Trennen Sie zunächst 40 μg Protein aus jeder Probe in einem 12,5%igen SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Gel (PAGE) und überführen Sie es dann auf 0,2 μm Nitrozellulosemembranen (siehe Materialtabelle).
   9. Nach Beendigung des Transfers die Membranen mit Blocking Buffer (5 % fettfreie Milch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,1 % Tween 20 [TBST; Tabelle 1]) für 1 h.
   10. Die Membran wird kurz mit TBST gespült und dann über Nacht bei 4 °C mit Primärantikörpern gegen FLAG-tag (1:2500 Verdünnung in PBST) und γH2AX (1:1000 Verdünnung in PBST) (siehe Materialtabelle) inkubiert.
   11. Entfernen Sie die primären Antikörper und waschen Sie die Membran 3 Mal, jedes Mal 10 Minuten lang, mit TBST.
   12. Tauchen Sie die Membranen 1 h lang bei Raumtemperatur (RT) in verdünnte Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugierte Sekundärantikörper (1:5.000 in TBST-Puffer mit 5 % fettfreier Milch).
   13. Waschen Sie die Membran 3 Mal mit TBST, jedes Mal für 10 Minuten.
   14. Visualisieren Sie die Proteinspiegel mit den Reagenzien für die verstärkte Chemilumineszenz (ECL) (siehe Materialtabelle).
2. Detektion der R-Schleife durch Dot-Blot²⁵​
   1. Aspirieren Sie das Kulturmedium von den Platten.
   2. Waschen Sie die Zellen vorsichtig mit 1x PBS, um Medienreste oder Ablagerungen zu entfernen.
   3. Fügen Sie ein kleines Volumen von 1x PBS hinzu, um die Zellen während des Schabevorgangs feucht zu halten.
   4. Verwenden Sie einen Zellschaber, halten Sie ihn in einem Winkel und kratzen Sie die Zellen vorsichtig in gleichmäßiger Richtung von der Oberfläche ab.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, nicht zu viel Druck auszuüben, da dies die Zellen beschädigen könnte.
   5. Kippen Sie die Platte und verwenden Sie eine Pipette, um die Zellsuspension in ein Röhrchen zu füllen und die Zellen 5 Minuten lang bei 500 x g zu drehen. Entsorgen Sie den Überstand.
   6. 2 × 10⁶ Zellen werden mit 300 μl eiskaltem Zelllysepuffer lysiert (siehe Tabelle 1). 10 min auf Eis inkubieren. Bei 500 x g 5 min bei 4 °C schleudern und den Überstand wegwerfen. Das Pellet enthält Zellkerne.
   7. Verwenden Sie eine Spitze mit breiter Öffnung, um jedes Pellet mit 300 μl vorgekühltem Kernlysepuffer zu resuspendieren (siehe Tabelle 1).
   8. Geben Sie 3 μl 20 mg/ml Proteinase K (siehe Materialtabelle) zu jeder Probe und verdauen Sie sie 3-5 h lang bei 55 °C.
   9. Geben Sie 100 μl Elutionspuffer (siehe Tabelle 1) in jedes Röhrchen und mischen Sie es gründlich.
   10. 400 μl Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol (25:24:1 pH 8,0) in jedes Röhrchen geben. Nach einem kräftigen Vortex bei 12.000 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren, um die DNA von anderen Zellinhalten zu trennen.
   11. Übertragen Sie die obere wässrige Phase vorsichtig auf die neuen Röhrchen.
   12. Die DNA wird gefällt, indem der Probe 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und 2,5 Volumenvolk vorgekühltes 100%iges Ethanol zugesetzt werden. Gründlich mischen und 4 h oder über Nacht bei -20 °C inkubieren.
       HINWEIS: Die Zugabe von Glykogen (siehe Materialtabelle) zur Probe kann die DNA-Rückgewinnung aus der Ethanolfällung erhöhen. Die endgültige Glykogenkonzentration beträgt etwa 0,05-1 μg/μl.
   13. Pelletieren Sie die DNA, indem Sie sie 30 Minuten lang bei 4 °C bei 12.000 x g zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören.
   14. Spülen Sie das Pellet mit 1 mL eiskaltem 70%igem Ethanol und zentrifugieren Sie erneut für 5-15 min bei 12.000 x g bei 4 °C.
   15. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig, um eine Störung des DNA-Kügelchens zu vermeiden.
   16. Trocknen Sie das DNA-Pellet 5-10 Minuten lang an der Luft.
   17. Das DNA-Pellet wird durch Zugabe von 50 μl vorgewärmtem TE-Puffer (pH8,0) aufgelöst und 30 Minuten bei 37 °C inkubiert. Messen Sie die DNA-Konzentration jeder Probe.
   18. Bereiten Sie DNA-Verdünnungen auf die gewünschten Konzentrationen in TE-Puffer vor (5 ng/μl bis 200 ng/μl). Gleichmäßig 20 μl jeder Probe mit einem Dot-Blot-Gerät auf eine positiv geladene Nylonmembran aufsprühen.
       HINWEIS: Um R-Schleifen mit einem Dot-Blot-Assay nachzuweisen, wird empfohlen, ca. 500 ng genomische DNA pro Punkt aufzubringen. Es hat sich gezeigt, dass diese Menge eine ausreichende Sensitivität für den Nachweis von RNA-DNA-Hybriden bietet, wenn der monoklonale Antikörper S9.6 verwendet wird, der spezifisch an diese Strukturen bindet.
   19. Immobilisieren Sie die DNA, indem Sie die DNA mit der Nylonmembran vernetzen (siehe Materialtabelle) über die Einstellung "Auto Crosslink" des UV-Vernetzers (1.200 μJ x 100) (siehe Materialtabelle).
   20. Tauchen Sie die Membranen 1 h bei Raumtemperatur in Blocking Buffer (siehe Tabelle 1). Anschließend spülen Sie die Membranen kurz mit TBST ab.
   21. Die Membran wird über Nacht mit einem Primärantikörper (siehe Materialtabelle) bei 4 °C inkubiert. Die Verdünnung von S9.6 beträgt 1:1.000 in TBST mit 5 % BSA.
   22. Entfernen Sie den primären Antikörper und waschen Sie ihn 3 Mal lang mit TBST, jedes Mal 10 Minuten lang.
   23. Inkubieren Sie die Membran mit HRP-konjugierten Sekundärantikörpern in 5% BSA in TBST bei Raumtemperatur für 1 h.
   24. Den Sekundärantikörper entfernen und 3 Mal mit TBST waschen, jedes Mal 10 Minuten lang.
   25. Visualisieren Sie die R-Loop-Pegel über die ECL-Reagenzien (Enhanced Chemiluminescence) Siehe Materialtabelle).

3. PLA-Assay

1. Vorbereitung der Zellen
   HINWEIS: Die Transduktion von Zellen mit dem KRAS-G12D-Onkogen führt zu einem Anstieg der TRCs, was durch ein positives PLA-Signal belegt wird. Diese Methode unterscheidet effektiv zwischen onkogengesteuerten TRCs und Hintergrundwerten, ohne dass eine Antibiotikaauswahl erforderlich ist. Die Implementierung einer Antibiotikaauswahl nach der Transduktion kann jedoch das Gesamtsignal verbessern, indem die Population der erfolgreich transduzierten Zellen angereichert wird, wodurch die Sensitivität und Spezifität des Assays verbessert wird.
   1. Platzieren Sie Deckgläser mit einem Durchmesser von 12 mm in jeder Vertiefung einer 12-Well-Platte.
   2. Die mit Lentiviren infizierten Zellen werden 24 Stunden nach der Infektion in diese Vertiefungen eingepflanzt und die Zellen auf Deckgläsern in 500 μl vollständigem RPMI-1640-Medium bei 37 °C und 5 % CO₂ aufbewahrt.
   3. Optimal) Wenn das Versuchsdesign die Auswahl von Antibiotika zur Anreicherung für erfolgreich transduzierte Zellen umfasst, fügen Sie dem Kulturmedium in diesem Stadium das geeignete Antibiotikum hinzu.
   4. Überwachen Sie die Zellen, um sicherzustellen, dass sie 48-72 Stunden nach der Infektion eine Konfluenz von etwa 60 % erreichen.
   5. RPMI-1640 vorsichtig entfernen und die Zellen mit 0,5 % NP-40 kalt für 4 min auf Eis vorextrahieren.
   6. Geben Sie 500 μl Fixierungspuffer (siehe Tabelle 1) direkt hinzu, um die Zellen 15 Minuten lang bei RT zu fixieren.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, die Zellen vor dem Fixierungsschritt nicht zu waschen, da dies dazu führen kann, dass sie sich von der Oberfläche, auf der sie wachsen, lösen, insbesondere wenn die Zelllinie empfindlich auf Ablösung reagiert. Daher wird oft die direkte Zugabe der Fixierlösung bevorzugt.
   7. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie den Fixierungspuffer entfernen und die Zellen 3 Mal vorsichtig mit 1x PBS waschen.
   8. Aspirieren Sie PBS und geben Sie 500 μl vorgekühltes 100%iges Methanol in die Zellen.
   9. Permeabilisieren Sie die Zellen, indem Sie sie 15-30 Minuten lang bei -20 °C inkubieren.
   10. Blockzellen mit Duolink-Blocklösung für 1 h bei RT.
2. Färbung von Antikörpern
   1. Verdünnen Sie Maus-Anti-RNAPII 8WG16 (1:500) und Kaninchen-Anti-PCNA(D3H8P) (1:500) in Duolink-Antikörperverdünnungspuffer. Inkubieren Sie die Zellen mit dem Primärantikörpergemisch über Nacht bei 4 °C in einer Feuchtigkeitskammer.
      HINWEIS: Führen Sie das PLA-Protokoll nur mit einem der primären Antikörper (entweder anti-RNAPII oder anti-PCNA) durch, während Sie den anderen weglassen. Dies hilft bei der Identifizierung von Hintergrundsignalen, die aus unspezifischen Wechselwirkungen der einzelnen Antikörper oder PLA-Sonden resultieren.
   2. Entfernen Sie die primären Antikörper vorsichtig mit einem fusselfreien Papierblatt von den Objektträgern, ohne die Zellen zu berühren. Waschen Sie dann die Zellen 3 Mal mit 1x PBS.
   3. Bereiten Sie PLA-Sonden (oder Sekundärantikörper) gemäß dem folgenden Verfahren vor (siehe Tabelle 2), mischen Sie sie und lassen Sie sie 20 Minuten bei Raumtemperatur stehen.
   4. Geben Sie den sekundären Antikörpermix zu den Objektträgern und inkubieren Sie ihn 2 h lang in einer Feuchtigkeitskammer bei RT.
3. Ligation und Amplifikation
   1. Verwerfen Sie den sekundären Antikörpermix und waschen Sie die Objektträger zweimal mit je 1x Puffer A für 5 min.
   2. Bereiten Sie die Ligaturmischung nach dem folgenden Verfahren vor (siehe Tabelle 2).
   3. Tragen Sie 15 μl Ligationsmischung auf jeden Objektträger auf und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 37 °C in einer Feuchtigkeitskammer.
   4. Waschen Sie die Objektträger zweimal mit je 1x Puffer A für 2 min.
   5. Bereiten Sie die Amplifikationsmischung nach dem folgenden Verfahren vor (siehe Tabelle 2).
   6. Tragen Sie 15 μl Amplifikationsmischung auf jeden Objektträger auf und inkubieren Sie 100 Minuten lang bei 37 °C in einer Feuchtigkeitskammer. Discard Amplification Mix und zweimal mit 1x Puffer B für 10 min waschen.
   7. Waschen Sie die Objektträger einmal mit 0,01x Puffer B für 1 min.
   8. Saugen Sie den Puffer B ab und montieren Sie die Objektträger in Duolink In Situ Einbettmedium mit DAPI.
4. Bildanalyse und Schwellenbestimmung:
   1. Quantifizieren Sie die Anzahl der PLA-Foki mit ImageJ. Automatisierte Bildanalysesoftware kann bei der objektiven Quantifizierung von PLA-Signalen helfen. Wählen Sie einen Schwellenwert von 3 oder mehr PLA-Foki pro Zellkern als Schwellenwert, da weniger als 1% der Kontrollzellen unter ungestörten Bedingungen 3 PLA-Foki erwerben.
      HINWEIS: Da der Schwellenwert experimentell durch die Analyse mehrerer Proben und Kontrollen bestimmt wird, um die Variabilität zu berücksichtigen, müssen konsistente Bildgebungseinstellungen (z. B. Belichtungszeit, Verstärkung) für alle Proben beibehalten werden, um die Vergleichbarkeit zu gewährleisten.

γH2AX dient als Biomarker für DNA-Schäden. Eine Überexpression von KRAS (G12D) beeinträchtigt die genomische Stabilität in diesen Zellen, wie das erhöhte γH2AX-Signal in der Western-Blot-Analyse zeigt (Abbildung 2A). Darüber hinaus deutet das verstärkte S9.6-Dot-Blot-Signal in KRAS (G12D)-exprimierenden Zellen im Vergleich zu Vektorkontrollen (Abbildung 2B) darauf hin, dass die onkogene KRAS-Expression zur Akkumulation von aberranten R-Schleifen führt, die zur Bildung von DNA-Brüchen beitragen können.

Abbildung 3 zeigt repräsentative Bilder aus dem Proximity-Ligation-Assay (PLA). In diesen Bildern zeigen hellgrüne Punkte innerhalb der Zellkerne an, dass der Abstand zwischen dem PCNA-assoziierten Replikationskomplex und dem RNAPII-Transkriptionskomplex weniger als 40 nm beträgt. In Vektorkontrollzellen werden grüne Punkte kaum nachgewiesen, während in Zellen, die KRAS (G12D) exprimieren, mehrere grüne Punkte pro Zellkern beobachtet werden. Dies deutet darauf hin, dass die onkogene KRAS-Expression die Häufigkeit von Begegnungen zwischen RNAPII und Replikationskomplexen erhöht. Diese PLA-Ergebnisse stimmen mit den Ergebnissen des Western-Blot- (Abbildung 2A) und des Dot-Blot-Assays (Abbildung 2B) überein.

Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass der Proximity-Ligation-Assay Onkogen-induzierte Konflikte zwischen RNAPII und Replikationsmaschinerie effektiv erkennt. Diese Fähigkeit birgt ein erhebliches Potenzial für zukünftige Anwendungen, da sie die Quantifizierung von TRCs über verschiedene Probentypen hinweg ermöglicht, die aus der aberranten Onkogenexpression resultieren. Obwohl es gewisse Einschränkungen gibt, sind die Aussichten für diese Methode vielversprechend, insbesondere mit Anpassungen der experimentellen Bedingungen, die auf verschiedene Proben zugeschnitten sind.

Abbildung 1: Schematische Darstellung des in situ Proximity-Ligationsassays. (1) Bestimmen Sie die gepaarten Interaktionspartner von interessant. (2) Inkubieren Sie die Probe mit gepaarten Primärantikörpern, die auf die gewünschten Proteine abzielen, gefolgt von Sekundärantikörpern, die mit Oligonukleotidsonden konjugiert sind. (3) Es werden Konnektor-Oligos eingeführt, die komplementär zu den Oligos sind, die an jeder PLA-Sonde angebracht sind. Wenn die Zielproteine nahe genug beieinander liegen, befinden sich die Oligonukleotidsequenzen, die an die PLA-Sonden gebunden sind, in unmittelbarer Nähe. (4) Wenn sich die Zielproteine in unmittelbarer Nähe befinden (typischerweise <40 nm), kommen die Oligonukleotide auf den PLA-Sonden in Kontakt und können von einer DNA-Ligase ligiert werden, um ein zirkuläres DNA-Molekül zu bilden. (5) Führen Sie RCA mit einer Polymerase durch, um die zirkuläre DNA zu amplifizieren, wodurch ein langer, sich wiederholender DNA-Strang entsteht. Hybridisieren Sie fluoreszenzmarkierte Oligonukleotide mit dem amplifizierten DNA-Produkt, was eine Visualisierung ermöglicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: DNA-Schädigung und R-Loop-Akkumulation in KRAS (G12D)-Expressionszellen. (A) Repräsentative Western-Blot-Analyse von Ganzzelllysaten aus BEAS-2B-Zellen, die einen Anstieg der γH2AX-Spiegel nach 72 h der KRAS G12D-Expression zeigt. Der γH2AX-Blot wurde verwendet, um DNA-Schäden zu beurteilen, wobei ACTB als Belastungskontrolle diente. Der FLAG-Blot bestätigte die Expression von KRAS G12D. (B) Repräsentative Dot-Blot-Analyse der R-Loop-Bildung in BEAS-2B-Zellen unter Vergleich von Bedingungen mit und ohne KRAS G12D-Expression. Der S9.6-Antikörper wurde zum Nachweis von R-Schleifen eingesetzt, während ein Anti-DNA-Antikörper zur Quantifizierung der Gesamt-DNA verwendet wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Akkumulation von TRC in KRAS (G12D) Expressionszellen. Repräsentative Bilder aus dem PLA-Assay. Die hellgrünen Herde in KRAS G12D-exprimierenden Zellen deuten auf Kollisionen zwischen PCNA und RNA-Polymerase II (RNAPII) hin. Immunzytochemie PLA zeigt hohe TRCs in KRAS G12D-exprimierenden Zellen im Vergleich zu Vektorzellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Vorbereitung des Puffers. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Vorbereitung der PLA-Reaktion. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 3: Fehlerbehebung für PLA-Assays. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Die RNAPII-Transkriptionsmaschinerie kann das Fortschreiten der DNA-Replikationsgabel behindern^26,27 und TRCs und DNA-Schäden fördern, insbesondere in Krebszellen^28,29. Die Entschlüsselung der Proteine, die die TRCs regulieren, und das Verständnis der detaillierten Mechanismen können uns helfen zu verstehen, wie diese schädlichen Ereignisse ablaufen, und die Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze in der Zukunft leiten. Um TRCs vollständig zu verstehen, sind daher schnelle und zuverlässige Methoden zur TRC-Detektion unerlässlich.

In dieser Arbeit beschreiben wir ein Verfahren, um die Inzidenz von Transkriptions-Replikationskonflikten (TRCs) mit Hilfe eines in situ PLA-Assays zu untersuchen. Dieser Ansatz ermöglicht eine einfache Abschätzung der TRC-Häufigkeit in Gegenwart von onkogenen Signalwegen innerhalb der Zellen. Es werden keine teuren Geräte oder große Mengen an Ausgangsmaterial benötigt. Unser Protokoll umfasst auch S9.6 Dot Blot und Western Blot, um die Spezifität des TRC-Signals zu bestätigen, das von der KRAS-Expression (G12D) abgeleitet wird.

Dieser Assay beruht auf der Erkennung von Replikations- und RNAPII-Transkriptionskomplexen durch Paare von Antikörper-Oligonukleotid-Konjugaten (PLA-Sonden), die zusammen DNA-Kreise erzeugen, die als Matrizen für lokalisierte Rolling-Circle-Amplifikationsreaktionen dienen. Die Forderung nach doppelter Erkennung der Zielproteine erhöht die Selektivität, indem jede Kreuzreaktivität eliminiert wird, die nicht von den Antikörperpaaren geteilt wird, wodurch eindeutige und reproduzierbare Ergebnisse gewährleistet werden. Daher sind die Spezifität und die starke Affinität der Antikörper essentiell für den Erfolg des PLA-Assays. Es ist von entscheidender Bedeutung, die Bedingungen für die Antikörperleistung in der Probe zu optimieren, einschließlich (i) Zellfixierungs- und Permeabilisierungsbedingungen, (ii) Blockierungslösung und (iii) Primärantikörperverdünnung. Geeignete Negativkontrollen sind von entscheidender Bedeutung, da (i) Knockdown-Kontrollen die Spezifität der primären Antikörper überprüfen können und (ii) Kontrollen mit Isotyp IgG die Spezifität der PLA-Sonden testen können.

Viele der häufigsten Probleme mit PLA-Assays wurden identifiziert. Dazu gehören das Fehlen des erwarteten Signals und das Vorhandensein eines unspezifischen Hintergrundsignals. Eine Zusammenfassung der möglichen Ursachen und Lösungen für diese Probleme ist in Tabelle 3 enthalten.

Bemerkenswert ist, dass diese Methode nur die physikalische Nähe zwischen PCNA und RNA-Polymerase II bestätigen kann; Diese Nähe bedeutet jedoch nicht notwendigerweise, dass schädliche DNA-Brüche auftreten. Eine weitere wichtige Einschränkung besteht darin, dass diese Methode keine Informationen über die spezifischen Chromatin-Loci liefern kann, an denen diese beiden Komplexe interagieren. Das vollständige Verständnis von transkriptionsassoziierten DNA-Brüchen erfordert eine ausgefeiltere Analyse. Durch die Nutzung der Next-Generation-Sequencing-Technologie ist die Entwicklung von TRIPn-seq eine der wenigen Methoden, die in der Lage sind, die Transkriptions- und Replikations-Co-Occupancy genau zu lokalisieren und auf alle proliferierenden Zellen anwendbar zu sein^21,29. Trotz der Aussagekraft dieser Methode schränken die hohen Kosten und die Zeitintensität ihre Zugänglichkeit ein.

Zusammenfassend zeigen unsere Studien, dass in situ PLA ein effizienter Ansatz ist, um die Nähe von Replikation und RNAPII-Transkriptionsmaschinerie in fixierten Zellen sowohl mit quantitativer als auch mit räumlicher Auflösung zu bestimmen. Die spezifische Verwendung von PCNA- und RNAPII-Antikörpern (8WG16) hat sich bei der Untersuchung von TRCs in BEAS-2B-Zellen als wirksam erwiesen. Zusätzlich zu RNAPII-Transkriptions-assoziierten TRCs kann der in situ PLA-Assay auch zur Untersuchung von RNAPI und RNAPIII-assoziierten TRCs in klinischen und Forschungsumgebungen verwendet werden, sofern geeignete Kontrollen und Anpassungen vorgenommen werden.

In einer kürzlich veröffentlichten Studie³⁰ wurde eine neuartige therapeutische Strategie für Krebserkrankungen vorgestellt, die durch extrachromosomale DNA (ecDNA) gekennzeichnet sind. Die Forscher erhöhten die Transkriptions-Replikationskonflikte (TRCs), um Schwachstellen in ecDNA-positiven Krebszellen auszunutzen, indem sie selektiv auf sie abzielten, während normale Zellen verschont blieben. Die Beurteilung des TRC-Status mit der PLA-Methode könnte wertvolle Einblicke in die genomische Stabilität der Krebszellen eines Patienten liefern. Die Überwachung des TRC-Status während der Behandlung kann dazu beitragen, die Wirksamkeit von Therapien zu bewerten, die auf TRCs abzielen. Daher ist die Integration der PLA-basierten TRC-Bewertung in personalisierte medizinische Ansätze vielversprechend, um die Krebsdiagnose, -prognose und -überwachung zu verbessern, indem sie ein tieferes Verständnis der molekularen Dynamik innerhalb einzelner Tumore ermöglicht.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Diese Arbeit wurde durch die Startup-Finanzierung der University of South China unterstützt.