Essai de ligature de proximité pour étudier les conflits de transcription-réplication dérivés de l’oncogène

Ici, nous présentons une méthode sensible et spécifique pour détecter les conflits de transcription-réplication (TRC) induits par l’oncogène à l’aide du test de ligature de proximité (PLA). Cette approche s’appuie sur des anticorps spécifiques ciblant le PCNA et le phospho-CTD RNAPII, permettant d’évaluer la prévalence du TRC entre la transcription de l’ARN polymérase II et la machinerie de réplication de l’ADN.

La réplication de l’ADN et la transcription de l’ARN utilisent toutes deux l’ADN génomique comme modèle, ce qui nécessite une séparation spatiale et temporelle de ces processus. Les conflits entre la machinerie de réplication et de transcription, appelés conflits de transcription-réplication (TRC), posent un risque considérable pour la stabilité du génome, un facteur critique dans le développement du cancer. Bien que plusieurs facteurs régulant ces collisions aient été identifiés, il reste difficile d’identifier les causes principales en raison des outils limités de visualisation directe et d’interprétation claire. Dans cette étude, nous visualisons directement les TRC à l’aide d’un test de ligature de proximité (PLA), en exploitant des anticorps spécifiques au PCNA et des CTD phosphorylés de l’ARN polymérase II. Cette approche permet une mesure précise des TRC entre les processus de réplication et de transcription médiés par l’ARN polymérase II. La méthode est encore améliorée grâce à des amorces d’ADN conjuguées de manière covalente à ces anticorps, associées à une amplification par PCR à l’aide de sondes fluorescentes, fournissant un moyen très sensible et spécifique de détecter les TRC endogènes. La microscopie à fluorescence permet de visualiser ces conflits, offrant ainsi un outil puissant pour étudier les mécanismes d’instabilité du génome associés au cancer. Cette technique comble le vide dans la visualisation directe de la TRC, permettant une analyse et une compréhension plus complètes des processus sous-jacents à l’origine de l’instabilité du génome dans les cellules.

Le génome sert de modèle pour les processus biologiques essentiels, y compris la réplication et la transcription. Dans les cellules saines, la transcription de l’ARN et la machinerie de réplication de l’ADN coopèrent généralement et sont séparées spatialement et temporellement 1,2,3,4. Cependant, dans des conditions pathologiques, telles que la surexpression d’oncogènes, cette coopération harmonieuse peut être perturbée.

Les oncogènes entraînent souvent des niveaux de transcription élevés, ce qui augmente la probabilité de collisions entre la transcription et la machinerie de réplication⁵. Certains oncogènes modifient l’architecture de la chromatine, ce qui la rend plus accessible pour la transcription, mais peut entraver la progression de la fourche de réplication⁵. De plus, l’activation de l’oncogène peut induire un stress de réplication en accélérant le cycle cellulaire⁶. L’activité de l’ARN polymérase II (RNAPII) est significativement élevée pendant la transition de phase G1/S en raison de la phosphorylation de Rb par la kinase dépendante des cyclines (CDK), qui libère des facteurs de transcription E2F qui favorisent la transcription des protéines essentielles, notamment les cyclines, les CDK et les gènes de maintien⁷. L’expression du gène des histones atteint son apogée pendant la phase S, coïncidant avec la réplication de l’ADN⁸. De plus, la transcription complète de certains gènes très longs nécessite plus d’un cycle cellulaire⁹. À chaque entrée dans la phase S, l’activité simultanée de la machinerie de transcription et de réplication dans les mêmes régions génomiques peut entraîner des rencontres préjudiciables, conduisant à des conflits. Ces conflits sont une source intrinsèque primaire d’instabilité du génome, qui est étroitement associée à la tumorigenèse. La façon dont la machinerie de réplication se coordonne avec la transcription de l’ARNAPII pour prévenir les conflits nuisibles et maintenir la stabilité génomique reste une question importante. Par conséquent, la visualisation directe des conflits de transcription-réplication (TRC) associés à l’ARNAPII est devenue essentielle pour comprendre les mécanismes moléculaires qui résolvent ces conflits et pourrait éventuellement jeter les bases de l’exploitation de ces conflits à des fins thérapeutiques.

Les conflits de transcription-réplication (TRC) peuvent émerger de deux manières : frontale, où la transcription et la réplication progressent l’une vers l’autre, et codirectionnelle, où elles se déplacent dans la même direction. Les collisions frontales sont beaucoup plus destructrices que les collisions codirectionnelles 10,11,12,13. La formation d’hybrides ADN-ARN (R-loops) a été identifiée comme un facteur majeur des TRC ; ainsi, un nombre considérable de recherches ont déduit la présence de TRC en évaluant l’apparition de R-loops et de leurs régions en réponse à une réplication et/ou une transcription dérégulées^10,11. Cependant, la question de savoir si l’accumulation de R-loops dérivées de la transcription sert d’obstacle proportionnel à la réplication et est directement corrélée avec les TRC reste une question non résolue. Les chercheurs ont également étudié les TRC en analysant la dynamique de la fourche de réplication. Par exemple, l’électrophorèse sur gel bidimensionnelle des gènes rapporteurs peut révéler une pause de réplisome spécifique au locus¹², tandis que les tests de fibres d’ADN permettent aux chercheurs d’examiner les altérations de la vitesse de la fourche de réplication, de la densité d’origine et de l’asymétrie de la fourche¹³. Les progrès de la technologie de séquençage de nouvelle génération ont conduit au développement de plusieurs méthodes innovantes, telles que le séquençage de fragments d’Okazaki (Ok-seq)^14,15, le séquençage de site d’initiation (ini-seq)^16,17, le séquençage de brins naissants courts (SNS-seq)¹⁸, le Repli-seq¹⁹ et le séquençage par polymérase (Pu-seq)²⁰. Ces techniques ont fourni des profils à l’échelle du génome de l’utilisation de l’origine de la réplication, de la directionnalité de la fourche et de la terminaison de la réplication, révélant les facteurs clés impliqués dans la coordination de la réplication et de la transcription. TRIPn-seq est l’une des rares méthodes capables de détecter directement la cooccupation de la transcription et de la réplication, élargissant considérablement notre compréhension de l’organisation dynamique de la réplication et de la transcription de l’ADN dans des conditions physiologiques et pathologiques²¹. Malgré les informations précieuses fournies par ces méthodes basées sur le séquençage, leur coût élevé et leur nature chronophage limitent leur application à plus grande échelle. Par conséquent, il est crucial d’établir une méthode de détection plus définitive, très sensible, pratique et rapide pour visualiser et quantifier les CRT au niveau de la cellule unique.

Le test de ligature de proximité (PLA) in situ , également connu sous le nom de technologie Duolink PLA, est une méthode puissante pour évaluer la proximité physique des protéines cibles dans des coupes de tissus ou des cultures cellulaires. Cette technique ne génère un signal que lorsque deux protéines ou complexes protéiques se trouvent à moins de 40 nm l’une de l’autre. Il nécessite deux anticorps primaires contre les protéines cibles, chacun provenant d’une espèce différente (par exemple, souris/lapin, lapin/chèvre ou souris/chèvre). Après l’incubation de l’échantillon avec ces anticorps primaires, des anticorps secondaires connus sous le nom de sondes PLA (une PLUS et une MOINS) sont appliqués. Contrairement aux anticorps secondaires ordinaires qui se lient aux régions constantes des anticorps primaires, les sondes PLA sont liées de manière covalente à des amorces d’ADN spécifiques. Lorsque les protéines cibles sont à proximité immédiate (moins de 40 nm), un oligonucléotide connecteur peut s’hybrider avec les deux sondes PLA, facilitant la ligature enzymatique de leurs oligonucléotides attachés en une molécule d’ADN pleine longueur. Cet ADN nouvellement formé sert de marqueur de substitution pour l’interaction protéique détectée et agit comme un modèle pour l’amplification. Le produit amplifié est ensuite visualisé à l’aide de sondes oligonucléotidiques marquées par fluorescence. Si les protéines sont distantes de plus de 40 nm, les sondes PLA ne peuvent pas former de matrice d’ADN, ce qui n’entraîne aucun signal détectable. Le schéma de principe de l’APL est illustré à la figure 1. La proximité et/ou l’interaction sont visualisées par la microscopie à fluorescence sous forme de points fluorescents, et le nombre et l’intensité de ces points peuvent être quantifiés. Depuis son invention en 2002, le PLA est devenu populaire pour la surveillance des interactions protéiques en raison de sa sensibilité et de sa spécificité élevées. Contrairement aux tests basés sur le séquençage, le PLA ne nécessite que de petites quantités d’échantillons, ce qui le rend favorable à l’analyse d’échantillons rares.

Des études ont démontré que l’expression de la mutation oncogène KRAS G12D entraîne des conflits de transcription-réplication (^TRCs)22,23. Par exemple, les recherches présentées par Meng et ^al.23 indiquent que l’expression ectopique de KRAS G12D dans les cellules épithéliales canalaires pancréatiques humaines (HPNE) améliore les TRC et les R-loops liés au TRC. Pour permettre la détection des collisions entre la transcription des ARNAPII et les machines de réplication dans les lignées cellulaires, nous fournissons un protocole spécifiquement développé à cet effet. Le plasmide KRAS (G12D) et le contrôle vectoriel sont transfectés dans les cellules épithéliales pulmonaires humaines BEAS-2B, et l’expression de KRAS (G12D), ainsi que les dommages à l’ADN (γH2AX), sont vérifiés par Western blot. L’accumulation de la boucle R est confirmée par l’analyse par transfert de points S9.6, qui indiquent ensemble l’accumulation de blocages routiers de réplication et l’instabilité du génome dans les cellules exprimant KRAS (G12D). Enfin, les cellules sont fixées sur des lames pour le dosage du PLA. Pour la détection localisée des collisions, les cellules sont d’abord colorées avec des anticorps primaires ARNAPII et PCNA, puis colorées avec des anticorps secondaires conjugués à des sondes PLA. Une molécule d’ADN circulaire se forme par ligature réussie, servant de modèle pour l’amplification ultérieure en cercle roulant (RCA). Les lames sont ensuite montées à l’aide d’un support de montage approprié et visualisées au microscope à fluorescence. Les images peuvent être analysées à l’aide d’ImageJ.

1. Production et transduction du lentivirus dans la lignée cellulaire cible

1. Production de lentivirus²⁴
   1. Semez les cellules d’emballage 293T à 3 × 10 à⁶ cellules par plaque de 10 cm dans un milieu modifié Eagle de Dulbecco à haute teneur en glucose (DMEM ; milieu complet). Cultivez des cellules à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5 % de CO₂ pendant 18 à 20 heures supplémentaires.
   2. Dans deux tubes de 1,5 ml, préparez un mélange d’ADN d’un total de 24 μg d’ADN plasmidique dans 500 μL d’Opti-MEM (milieu sérique réduit) contenant respectivement 9,2 μg de psPAX2, 2,8 μg de pMD2.G, ainsi que 12 μg de plasmide pLVX-KRAS ou de vecteur vide.
      REMARQUE : Étant donné que les endotoxines diminuent considérablement l’efficacité de la transfection, il est recommandé d’éliminer les endotoxines du plasmide pendant la purification.
   3. Diluer 144 μL de polyéthylénimine (PEI ; 1 mg/mL) dans 1 mL de milieu sérique réduit, mélanger et incuber pendant 5 min à température ambiante (RT).
   4. Ajoutez 500 μL de PEI dilué goutte à goutte au mélange d’ADN dilué tout en effleurant doucement le tube. Incuber les mélanges PEI/ADN pendant 15 min à RT.
   5. Pendant l’incubation, aspirez doucement le substrat des plaques de 10 cm préalablement ensemencées. Remplacer par 10 ml de DMEM complet frais.
   6. Après l’incubation, pipetez lentement le mélange de transfection ADN :PEI sur les plaques de 10 cm, en veillant à ne pas détacher les cellules.
      REMARQUE : L’IPE est un réactif de transfection couramment utilisé, mais sa concentration doit être soigneusement optimisée pour équilibrer l’efficacité de la transfection et la cytotoxicité. Malgré le coût plus élevé de la lipofectamine 3000 (réactif de transfection), elle a démontré une efficacité de transfection plus élevée et une cytotoxicité plus faible par rapport à l’IPE dans certaines lignées cellulaires, ce qui a permis d’améliorer la production virale. L’électroporation est une autre alternative qui utilise des impulsions électriques pour introduire des acides nucléiques dans les cellules. Bien qu’efficace, il nécessite un équipement spécialisé et peut demander plus de main-d’œuvre.
   7. Faites pousser les cellules pendant 18 h, puis remplacez soigneusement le milieu de transfection par 10 ml de milieu DMEM Complete frais contenant 25 μM de chloroquine.
   8. Après 72 h de transfection, prélever le milieu de culture contenant la particule virale. Retirer l’emballage des cellules 293T par centrifugation à 500 x g pendant 5 min.
   9. Récupérez le surnageant et filtrez-le à travers un filtre en polyéthersulfone (PES) de 0,45 μm. Utilisez directement le surnageant viral.
      REMARQUE : Le surnageant viral doit être aliquote et congelé dans de l’azote liquide et maintenu à -80 °C pour éviter la perte de titre.
2. Infection lentivirale des cellules cibles
   1. Ensemencez 2 × 10⁶ cellules cibles BEAS-2B dans deux plaques de 6 cm et cultivez à 37 °C, 5 % de CO₂ pendant la nuit. Lors de la transduction, assurez-vous que les cellules BEAS-2B sont confluentes à environ 70 %.
   2. Retirez délicatement l’ancien milieu et ajoutez les 0,5 ml appropriés de KRAS ou de particules lentivirales vectorielles ainsi que 3 ml de milieu RPMI-1640 complet frais dans deux plaques, respectivement.
   3. Cultivez les cellules à 37 °C pendant 18 à 20 h dans un incubateur à 5 % de CO₂ . Remplacez l’ancien milieu contenant des particules lentivirales par 3,5 mL de milieu de culture complet frais et préchauffé. Après 72 h de transduction, prélever les cellules pour le dosage suivant.
      REMARQUE : Si l’incubation d’une nuit avec le virus provoque une toxicité, le temps d’incubation peut être raccourci à 4 h. Pour atteindre l’équilibre entre l’efficacité de la transduction et la santé cellulaire, les stratégies suivantes doivent être envisagées : (1) Optimiser la multiplicité de l’infection ; (2) Utiliser des préparations virales de haute qualité ; (3) Utiliser des polycations (tels que le polybrène) pour améliorer l’efficacité, permettre l’utilisation de titres viraux plus faibles et réduire la toxicité potentielle ; (4) Pour les études à long terme, envisager d’utiliser des systèmes d’expression inductibles pour contrôler l’expression des transgènes dans le temps, réduisant ainsi la charge sur les cellules et minimisant la toxicité potentielle.

2. Vérification des dommages à l’ADN dérivés de KRAS (G12D) et de la formation de la boucle R

1. Confirmer l’expression des gènes et les dommages à l’ADN par le test WB
   1. Aspirez le milieu de culture des plaques.
   2. Lavez délicatement les cellules avec 1 solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour éliminer tout milieu résiduel ou débris.
   3. Ajoutez un petit volume de 1x PBS pour garder les cellules humides pendant le processus de grattage.
   4. Utilisez un grattoir à cellules, en le tenant en biais, et grattez doucement les cellules de la surface dans une direction constante.
      REMARQUE : Veillez à ne pas appliquer trop de pression, ce qui pourrait endommager les cellules.
   5. Inclinez la plaque et utilisez une pipette pour recueillir la suspension des cellules dans un tube et faites tourner les cellules à 500 x g pendant 5 min. Jetez le surnageant.
   6. Préparez le tampon 1x RIPA en diluant le tampon 2x RIPA (voir tableau 1), et ajoutez le cocktail d’inhibiteurs de protéase et le cocktail d’inhibiteurs de phosphatase immédiatement avant l’utilisation.
   7. Lyser la pastille cellulaire avec un tampon RIPA pré-refroidi (1x) et incuber pendant 30 min sur de la glace. Retirez les débris en centrifugeant à 15 000 x g pendant 10 min. Prélever le surnageant et mesurer la concentration en protéines à l’aide du test de Bradford.
   8. Ajouter 4 tampons de chargement d’échantillon de dodécylsulfate de sodium (SDS) au surnageant et dénaturer les protéines pendant 5 min à 95 °C. Tout d’abord, séparez 40 μg de protéines de chaque échantillon dans un gel d’électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) à 12,5 %, puis transférez-le sur des membranes de nitrocellulose de 0,2 μm (voir le tableau des matériaux).
   9. Une fois le transfert terminé, bloquez les membranes avec un tampon bloquant (5 % de lait écrémé dans une solution saline tamponnée Tris contenant 0,1 % de Tween 20 [TBST ; Tableau 1]) pendant 1 h.
   10. Rincer brièvement la membrane avec du TBST, puis incuber la membrane avec des anticorps primaires contre FLAG-tag (dilution 1:2500 dans le PBST) et γH2AX (dilution 1:1000 dans le PBST) (voir le tableau des matériaux) pendant une nuit à 4 °C.
   11. Retirez les anticorps primaires et lavez la membrane avec du TBST 3 fois, à chaque fois pendant 10 minutes.
   12. Immergez les membranes dans des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort diluée (HRP) (1:5 000 dans un tampon TBST contenant 5 % de lait écrémé) pendant 1 h à température ambiante (RT).
   13. Lavez la membrane avec du TBST 3 fois, à chaque fois pendant 10 min.
   14. Visualisez les niveaux de protéines via les réactifs de chimiluminescence améliorée (ECL) (voir le tableau des matériaux).
2. Détection de R-loop par Dot blot²⁵​
   1. Aspirez le milieu de culture des plaques.
   2. Lavez délicatement les cellules avec 1x PBS pour éliminer tout milieu résiduel ou débris.
   3. Ajoutez un petit volume de 1x PBS pour garder les cellules humides pendant le processus de grattage.
   4. Utilisez un grattoir à cellules, en le tenant en biais, et grattez doucement les cellules de la surface dans une direction constante.
      REMARQUE : Veillez à ne pas appliquer trop de pression, ce qui pourrait endommager les cellules.
   5. Inclinez la plaque et utilisez une pipette pour recueillir la suspension des cellules dans un tube et faites tourner les cellules à 500 x g pendant 5 min. Jetez le surnageant.
   6. Lyse 2 × 10⁶ cellules avec 300 μL de tampon de lyse cellulaire glacé (voir tableau 1). Incuber sur glace pendant 10 min. Essorer à 500 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant. La pastille contient des noyaux.
   7. À l’aide d’une pointe à large orifice, remettre en suspension chaque pastille avec 300 μL de tampon de lyse nucléaire pré-refroidi (voir le tableau 1).
   8. Ajouter 3 μL de 20 mg/mL de protéinase K (voir le tableau des matériaux) à chaque échantillon et digérer pendant 3 à 5 h à 55 °C.
   9. Ajouter 100 μL de tampon d’élution (voir le tableau 1) dans chaque tube et bien mélanger.
   10. Ajouter 400 μL de phénol : chloroforme et alcool isoamylique (25:24:1 pH 8,0) dans chaque tube. Après un vortex vigoureux, centrifuger à 12 000 x g pendant 5 min à 4 °C pour séparer l’ADN du reste du contenu cellulaire.
   11. Transférez avec précaution la phase aqueuse supérieure dans les nouveaux tubes.
   12. Précipitez l’ADN en ajoutant à l’échantillon 1/10 volume d’acétate de sodium 3M (pH 5,2) et 2,5 volume d’éthanol 100 % pré-refroidi. Bien mélanger et incuber pendant 4 h ou toute la nuit à -20 °C.
       REMARQUE : L’ajout de glycogène (voir le tableau des matériaux) à l’échantillon peut augmenter la récupération de l’ADN à partir de la précipitation de l’éthanol. La concentration finale de glycogène est d’environ 0,05-1 μg/μL.
   13. Granuler l’ADN par centrifugation à 12 000 x g pendant 30 min à 4 °C. Jetez le surnageant sans déranger la pastille.
   14. Rincez le granulé avec 1 ml d’éthanol glacé à 70 % et centrifugez-le à nouveau pendant 5 à 15 minutes à 12 000 x g à 4 °C.
   15. Jetez le surnageant avec précaution pour éviter de déranger la pastille d’ADN.
   16. Faites sécher la pastille d’ADN à l’air libre pendant 5 à 10 minutes.
   17. Dissoudre la pastille d’ADN en ajoutant 50 μL de tampon TE préchauffé (pH 8,0) et incuber pendant 30 min à 37 °C. Mesurez la concentration d’ADN de chaque échantillon.
   18. Préparez des dilutions de l’ADN aux concentrations souhaitées dans le tampon TE (5 ng/μL à 200 ng/μL). Placez uniformément 20 μL de chaque échantillon sur une membrane en nylon chargée positivement à l’aide d’un appareil dot-blot.
       REMARQUE : Pour détecter les R-loops à l’aide d’un test de transfert de points, il est recommandé d’appliquer environ 500 ng d’ADN génomique par point. Il a été démontré que cette quantité offre une sensibilité suffisante pour détecter les hybrides ARN-ADN lors de l’utilisation de l’anticorps monoclonal S9.6, qui se lie spécifiquement à ces structures.
   19. Immobiliser l’ADN en réticulant l’ADN à la membrane de nylon (voir le tableau des matériaux) via le réglage de la réticulation UV « Auto Crosslink » (1 200 μJ x 100) (voir le tableau des matériaux).
   20. Immerger les membranes dans un tampon de blocage (voir tableau 1) pendant 1 h à température ambiante. Ensuite, rincez brièvement les membranes avec du TBST.
   21. Pendant la nuit, incuber la membrane avec l’anticorps primaire (voir le tableau des matériaux) à 4 °C. La dilution de S9.6 est de 1:1 000 dans du TBST contenant 5 % de BSA.
   22. Retirer l’anticorps primaire et laver 3 fois avec du TBST, et à chaque fois pendant 10 min.
   23. Incuber la membrane avec un anticorps secondaire conjugué à la HRP dans 5 % de BSA dans du TBST à température ambiante pendant 1 h.
   24. Retirer l’anticorps secondaire et laver 3 fois avec du TBST, et à chaque fois pendant 10 min.
   25. Visualiser les niveaux de la boucle R via les réactifs ECL (Enhanced Chemiluminescence) Voir le tableau des matériaux).

3. Dosage du PLA

1. Préparation cellulaire
   REMARQUE : La transduction des cellules avec l’oncogène KRAS G12D entraîne une augmentation des TRC, comme en témoigne un signal PLA positif. Cette méthode permet de distinguer efficacement les TRC induits par les oncogènes des niveaux de fond sans qu’il soit nécessaire de sélectionner des antibiotiques. Cependant, la mise en œuvre de la sélection d’antibiotiques après la transduction peut améliorer le signal global en enrichissant la population de cellules transduites avec succès, améliorant ainsi la sensibilité et la spécificité du test.
   1. Placez des verres de couverture de 12 mm de diamètre dans chaque puits d’une plaque à 12 puits.
   2. Ensemencez les cellules infectées par le lentivirus dans ces puits 24 h après l’infection, et maintenez les cellules sur des verres de couverture dans 500 μL de milieu RPMI-1640 complet à 37 °C avec 5 % de CO₂.
   3. Si le plan expérimental comprend une sélection d’antibiotiques à enrichir pour obtenir des cellules transduites avec succès, ajoutez l’antibiotique approprié au milieu de culture à ce stade.
   4. Surveillez les cellules pour vous assurer qu’elles atteignent une confluence d’environ 60 % 48 à 72 heures après l’infection.
   5. Retirez soigneusement le RPMI-1640 et préextrayez les cellules avec du NP-40 froid à 0,5 % pendant 4 min sur de la glace.
   6. Ajoutez 500 μL de tampon de fixation (voir tableau 1) directement pour fixer les cellules pendant 15 min à RT.
      REMARQUE : Il est conseillé de ne pas laver les cellules avant l’étape de fixation car cela peut les faire se détacher de la surface sur laquelle elles se développent, surtout si la lignée cellulaire est sensible au détachement ; Par conséquent, il est souvent préférable d’ajouter directement la solution fixatrice.
   7. Arrêtez la réaction en retirant le tampon de fixation et en lavant soigneusement les cellules avec 1x PBS 3 fois.
   8. Aspirez le PBS et ajoutez 500 μL de méthanol 100 % pré-refroidi dans les cellules.
   9. Perméabiliser les cellules en les incubant à -20 °C pendant 15 à 30 min.
   10. Cellules de bloc avec la solution de bloc Duolink pendant 1 h à RT.
2. Coloration des anticorps
   1. Diluer l’anti-ARNAPII de souris 8WG16 (1:500) et l’anti-PCNA de lapin (D3H8P) (1:500) dans un tampon de dilution d’anticorps Duolink. Incuber les cellules avec le mélange d’anticorps primaires pendant une nuit à 4 °C dans une chambre humide.
      REMARQUE : Effectuez le protocole PLA en utilisant un seul des anticorps primaires (anti-ARNAPII ou anti-PCNA) en omettant l’autre. Cela permet d’identifier tout signal de fond résultant d’interactions non spécifiques des anticorps individuels ou des sondes PLA.
   2. Retirez délicatement les anticorps primaires des lames à l’aide d’une feuille de papier usagé non pelucheuse sans toucher les cellules. Ensuite, lavez les cellules 3 fois avec 1x PBS.
   3. Préparez les sondes PLA (ou anticorps secondaires) selon la procédure suivante (voir tableau 2), puis mélangez et laissez reposer pendant 20 min à température ambiante.
   4. Ajouter le mélange d’anticorps secondaires sur les lames et incuber dans une chambre d’humidité pendant 2 h à RT.
3. Ligature et amplification
   1. Jetez le mélange d’anticorps secondaires et lavez les lames deux fois avec 1 tampon A chacune pendant 5 min.
   2. Préparez le mélange de ligature selon la procédure suivante (voir tableau 2).
   3. Appliquez 15 μL de mélange de ligature sur chaque lame de couverture et incubez à 37 °C pendant 30 min dans une chambre d’humidité.
   4. Lavez les lames deux fois avec 1 tampon A chacune pendant 2 min.
   5. Préparez le mixage d’amplification selon la procédure suivante (voir Tableau 2).
   6. Appliquez 15 μL d’Amplification Mix sur chaque lame et incubez pendant 100 min à 37 °C dans une chambre d’humidité. Jetez l’amplification Mixez et lavez deux fois avec 1x Buffer B chacun pendant 10 min.
   7. Lavez les lames une fois avec une mémoire tampon B 0,01x pendant 1 min.
   8. Aspirez le tampon B et montez les diapositives dans le support de montage Duolink In Situ avec DAPI.
4. Analyse d’images et détermination du seuil :
   1. Quantifiez le nombre de foyers de PLA par ImageJ. Les logiciels d’analyse d’images automatisés peuvent aider à quantifier objectivement les signaux PLA. Choisissez un seuil de 3 foyers PLA ou plus par noyau comme seuil, car moins de 1 % des cellules témoins acquièrent 3 foyers PLA dans des conditions non perturbées.
      REMARQUE : Étant donné que le seuil est déterminé expérimentalement en analysant plusieurs échantillons et en les témoins pour tenir compte de la variabilité, des paramètres d’imagerie uniformes (p. ex., temps d’exposition, gain) doivent être maintenus pour tous les échantillons afin d’assurer la comparabilité.

γH2AX sert de biomarqueur des dommages à l’ADN. La surexpression de KRAS (G12D) altère la stabilité génomique dans ces cellules, comme en témoigne l’augmentation du signal γH2AX dans l’analyse par transfert Western (figure 2A). De plus, l’intensification du signal de transfert de points S9.6 dans les cellules exprimant KRAS (G12D) par rapport aux contrôles vectoriels (Figure 2B) indique que l’expression oncogène de KRAS conduit à l’accumulation de R-loops aberrantes, ce qui peut contribuer à la formation de cassures de l’ADN.

La figure 3 présente des images représentatives du test de ligature de proximité (PLA). Sur ces images, des points vert vif à l’intérieur des noyaux indiquent que la distance entre le complexe de réplication associé au PCNA et le complexe de transcription ARNAPII est inférieure à 40 nm. Dans les cellules de lutte antivectorielle, les points verts sont à peine détectés, tandis que dans les cellules exprimant KRAS (G12D), plusieurs points verts par noyau sont observés. Cela suggère que l’expression oncogénique de KRAS augmente la fréquence des rencontres entre les ARNAPII et les complexes de réplication. Ces résultats concordent avec les résultats des analyses par transfert Western (figure 2A) et par transfert de points (figure 2B).

En résumé, ces résultats démontrent que le test de ligature de proximité détecte efficacement les conflits induits par l’oncogène entre l’ARNAPII et la machinerie de réplication. Cette capacité présente un potentiel important pour des applications futures, permettant la quantification des TRC dans divers types d’échantillons résultant de l’expression aberrante d’oncogènes. Bien qu’il existe certaines limites, les perspectives de cette méthode sont prometteuses, en particulier avec des ajustements aux conditions expérimentales adaptés aux différents échantillons.

Figure 1 : Représentation schématique d’un test de ligature de proximité in situ. (1) Déterminez les partenaires d’interaction appariés d’intéressants. (2) Incuber l’échantillon avec des anticorps primaires appariés ciblant les protéines souhaitées, suivis d’anticorps secondaires conjugués à des sondes oligonucléotidiques. (3) Des oligos de connecteur sont introduits, qui sont complémentaires aux oligos attachés à chaque sonde PLA. Si les protéines cibles sont suffisamment proches, les séquences d’oligonucléotides attachées aux sondes PLA seront à proximité. (4) Si les protéines cibles sont à proximité immédiate (généralement <40 nm), les oligonucléotides des sondes PLA entrent en contact et peuvent être ligaturés par une ADN ligase pour former une molécule d’ADN circulaire. (5) Effectuez l’ACR à l’aide d’une polymérase pour amplifier l’ADN circulaire, créant ainsi un long brin d’ADN répétitif. Hybrider des oligonucléotides marqués par fluorescence au produit d’ADN amplifié, permettant la visualisation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Dommages à l’ADN et accumulation de la boucle R dans les cellules d’expression de KRAS (G12D). (A) Analyse représentative par transfert de Western de lysats de cellules entières de cellules BEAS-2B, illustrant une augmentation des niveaux de γH2AX après 72 h d’expression de KRAS G12D. Le transfert γH2AX a été utilisé pour évaluer les dommages à l’ADN, l’ACTB servant de contrôle de la charge. Le transfert FLAG a confirmé l’expression de KRAS G12D. (B) Analyse par transfert de points représentatifs de la formation de la boucle R dans les cellules BEAS-2B, comparant les conditions avec et sans expression de KRAS G12D. L’anticorps S9.6 a été utilisé pour détecter les boucles R, tandis qu’un anticorps anti-ADN a été utilisé pour quantifier l’ADN total. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Accumulation de TRC dans les cellules d’expression de KRAS (G12D). Images représentatives du test PLA. Les foyers vert vif dans les cellules exprimant KRAS G12D indiquent des collisions entre la PCNA et l’ARN polymérase II (RNAPII). L’immunocytochimie PLA présente des TRCs élevés dans les cellules exprimant KRAS G12D par rapport aux cellules vectrices. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Préparation du tampon. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Préparation de la réaction PLA. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 3 : Dépannage du dosage du PLA. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

La machinerie de transcription de l’ARNAPII peut créer un obstacle à la progression de la fourche de réplication de l’ADN^26,27, favorisant les TRC et les dommages à l’ADN, en particulier dans les cellules cancéreuses^28,29. Déchiffrer les protéines qui régulent les CRT et comprendre les mécanismes détaillés peut nous aider à comprendre comment ces événements néfastes se produisent et guider le développement de nouvelles approches thérapeutiques à l’avenir. Par conséquent, pour bien comprendre les TRC, des méthodes rapides et fiables de détection des TRC sont essentielles.

Ici, nous décrivons une procédure pour examiner l’incidence des conflits de transcription-réplication (TRC) à l’aide d’un test PLA in situ . Cette approche permet d’estimer facilement la fréquence du TRC en présence d’une signalisation oncogénique au sein des cellules. Il ne nécessite pas d’équipement coûteux ni de grandes quantités de matériau de départ. Notre protocole inclut également le transfert de points S9.6 et le transfert Western pour confirmer la spécificité du signal TRC dérivé de l’expression de KRAS (G12D).

Ce test repose sur la reconnaissance des complexes de réplication et de transcription des ARNAPII par des paires de conjugués anticorps-oligonucléotides (sondes PLA), qui produisent ensemble des cercles d’ADN qui servent de modèles pour des réactions d’amplification localisées en cercle roulant. L’exigence d’une double reconnaissance des protéines cibles améliore la sélectivité en éliminant toute réactivité croisée qui n’est pas partagée par les paires d’anticorps, garantissant ainsi des résultats sans ambiguïté et reproductibles. Par conséquent, la spécificité et la forte affinité des anticorps sont essentielles pour le succès du test PLA. Il est essentiel d’optimiser les conditions de performance des anticorps dans l’échantillon, ce qui comprend (i) les conditions de fixation et de perméabilisation des cellules, (ii) la solution bloquante et (iii) la dilution primaire des anticorps. Des contrôles négatifs appropriés sont cruciaux, car (i) les contrôles knockdown peuvent vérifier la spécificité des anticorps primaires, et (ii) les contrôles avec l’isotype IgG peuvent tester la spécificité des sondes PLA.

De nombreux problèmes courants liés au dosage du PLA sont identifiés. Il s’agit notamment de l’absence du signal attendu et de la présence d’un signal de fond non spécifique. Le tableau 3 présente un résumé des causes possibles et des solutions à ces problèmes.

Notamment, cette méthode ne peut que confirmer la proximité physique entre le PCNA et l’ARN polymérase II ; cependant, cette proximité n’implique pas nécessairement l’apparition de cassures d’ADN préjudiciables. Une autre limitation clé est que cette méthode ne peut pas fournir d’informations sur les loci spécifiques de la chromatine où ces deux complexes interagissent. Pour bien comprendre les cassures de l’ADN associées à la transcription, il faut une analyse plus sophistiquée. Tirant parti de la technologie de séquençage de nouvelle génération, le développement de TRIPn-seq est l’une des rares méthodes capables de déterminer avec précision la co-occupation de la transcription et de la réplication, applicable à toutes les cellules en prolifération^21,29. Cependant, malgré le caractère informatif de cette méthode, son coût élevé et sa nature chronophage limitent son accessibilité.

En résumé, nos études indiquent que le PLA in situ est une approche efficace pour déterminer la proximité de la réplication et de la machinerie de transcription des ARNAPII dans les cellules fixes, avec une résolution à la fois quantitative et spatiale. L’utilisation spécifique d’anticorps PCNA et RNAPII (8WG16) s’est avérée efficace pour l’étude des TRC dans les cellules BEAS-2B. En plus des TRC associés à la transcription RNAPII, le test PLA in situ peut également être utilisé pour étudier les TRC RNAPI et associés à RNAPIII dans des contextes cliniques et de recherche, à condition que des contrôles et des ajustements appropriés soient appliqués.

Une étude récemment publiée³⁰ a présenté une nouvelle stratégie thérapeutique pour les cancers caractérisés par l’ADN extrachromosomique (ADNec). Les chercheurs ont augmenté les conflits de transcription-réplication (TRC) pour exploiter les vulnérabilités des cellules cancéreuses positives à l’ADNec, en les ciblant sélectivement tout en épargnant les cellules normales. L’évaluation du statut du TRC à l’aide de la méthode PLA pourrait fournir des informations précieuses sur la stabilité génomique des cellules cancéreuses d’un patient. La surveillance de l’état du CRT pendant le traitement peut aider à évaluer l’efficacité des traitements ciblant les CRT. Par conséquent, l’intégration de l’évaluation TRC basée sur le PLA dans les approches de médecine personnalisée est prometteuse pour améliorer le diagnostic du cancer, le pronostic et le suivi du traitement en offrant une compréhension plus approfondie de la dynamique moléculaire au sein des tumeurs individuelles.

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Ce travail a été soutenu par le financement de démarrage de l’Université de Chine du Sud.