Ensaio de ligação de proximidade para estudar conflitos de transcrição-replicação derivados de oncogenes

Aqui, apresentamos um método sensível e específico para detectar conflitos de transcrição-replicação induzidos por oncogenes (TRCs) usando o ensaio de ligação de proximidade (PLA). Essa abordagem aproveita anticorpos específicos direcionados a PCNA e fosfo-CTD RNAPII, permitindo a avaliação da prevalência de TRC entre a transcrição da RNA polimerase II e a maquinaria de replicação do DNA.

Tanto a replicação do DNA quanto a transcrição do RNA utilizam o DNA genômico como modelo, necessitando da separação espacial e temporal desses processos. Os conflitos entre a maquinaria de replicação e transcrição, denominados conflitos de replicação de transcrição (TRCs), representam um risco considerável para a estabilidade do genoma, um fator crítico no desenvolvimento do câncer. Embora vários fatores que regulam essas colisões tenham sido identificados, a identificação das causas primárias continua difícil devido às ferramentas limitadas para visualização direta e interpretação clara. Neste estudo, visualizamos diretamente os TRCs usando um ensaio de ligação de proximidade (PLA), aproveitando anticorpos específicos para PCNA e CTD fosforilada da RNA polimerase II. Essa abordagem permite a medição precisa de TRCs entre os processos de replicação e transcrição mediados pela RNA polimerase II. O método é aprimorado por meio de primers de DNA conjugados covalentemente a esses anticorpos, juntamente com a amplificação por PCR usando sondas fluorescentes, fornecendo um meio altamente sensível e específico de detectar TRCs endógenos. A microscopia de fluorescência permite a visualização desses conflitos, oferecendo uma ferramenta poderosa para estudar os mecanismos de instabilidade do genoma associados ao câncer. Essa técnica aborda a lacuna na visualização direta do TRC, permitindo uma análise e compreensão mais abrangentes dos processos subjacentes que impulsionam a instabilidade do genoma nas células.

O genoma serve como modelo para processos biológicos essenciais, incluindo replicação e transcrição. Em células saudáveis, a transcrição do RNA e a maquinaria de replicação do DNA normalmente cooperam e são segregadas espacial e temporalmente 1,2,3,4. No entanto, sob condições patológicas, como a superexpressão de oncogenes, essa cooperação harmoniosa pode ser interrompida.

Os oncogenes geralmente conduzem a níveis elevados de transcrição, aumentando a probabilidade de colisões entre a maquinaria de transcrição e replicação⁵. Alguns oncogenes alteram a arquitetura da cromatina, tornando-a mais acessível para transcrição, mas potencialmente dificultando a progressão do garfo de replicação⁵. Além disso, a ativação do oncogene pode induzir estresse de replicação, acelerando o ciclo celular⁶. A atividade da RNA polimerase II (RNAPII) é significativamente elevada durante a transição de fase G1 / S devido à fosforilação de Rb da quinase dependente de ciclina (CDK), que libera fatores de transcrição E2F que promovem a transcrição de proteínas essenciais, incluindo ciclinas, CDKs e genes de manutenção⁷. A expressão gênica das histonas atinge o pico durante a fase S, coincidindo com a replicação do DNA⁸. Além disso, transcrever as transcrições completas de alguns genes muito longos requer mais de um ciclo celular⁹. A cada entrada na fase S, a atividade simultânea da maquinaria de transcrição e replicação nas mesmas regiões genômicas pode resultar em encontros prejudiciais, levando a conflitos. Esses conflitos são uma fonte intrínseca primária de instabilidade do genoma, que está intimamente associada à tumorigênese. Como a maquinaria de replicação se coordena com a transcrição de RNAPII para evitar conflitos prejudiciais e manter a estabilidade genômica continua sendo uma questão importante. Portanto, a visualização direta dos conflitos de transcrição-replicação associados a RNAPII (TRCs) tornou-se essencial para a compreensão dos mecanismos moleculares que resolvem esses conflitos e pode, eventualmente, estabelecer as bases para o aproveitamento desses conflitos para fins terapêuticos.

Os conflitos de transcrição-replicação (TRCs) podem surgir em duas orientações: frontal, onde a transcrição e a replicação progridem uma em direção à outra, e codirecionais, onde se movem na mesma direção. As colisões frontais são muito mais destrutivas do que as codirecionais 10,11,12,13. A formação de híbridos de DNA-RNA (R-loops) foi identificada como um dos principais impulsionadores dos TRCs; assim, uma quantidade considerável de pesquisas inferiu a presença de TRCs avaliando a ocorrência de R-loops e suas regiões em resposta à replicação e/ou transcrição desregulada^10,11. No entanto, se o acúmulo de loops R derivados da transcrição serve como um obstáculo proporcional à replicação e se correlaciona diretamente com os TRCs permanece uma questão não resolvida. Os pesquisadores também investigaram os TRCs analisando a dinâmica do garfo de replicação. Por exemplo, a eletroforese em gel bidimensional de genes repórteres pode descobrir a pausa do replissoma específico do locus¹², enquanto os ensaios de fibra de DNA permitem que os pesquisadores examinem alterações na velocidade do garfo de replicação, densidade de origem e assimetria do garfo¹³. O avanço da tecnologia de sequenciamento de última geração levou ao desenvolvimento de vários métodos inovadores, como sequenciamento de fragmentos de Okazaki (Ok-seq) ^{14 , 15} , sequenciamento de local de iniciação (ini-seq) ^{16 , 17} , sequenciamento de fita nascente curta (SNS-seq) ¹⁸ , Repli-seq¹⁹ e sequenciamento de uso de polimerase (Pu-seq) ²⁰. Essas técnicas forneceram perfis de todo o genoma do uso da origem da replicação, direcionalidade do fork e terminação da replicação, revelando fatores-chave envolvidos na coordenação da replicação e transcrição. O TRIPn-seq é um dos poucos métodos capazes de detectar diretamente a co-ocupação da transcrição e replicação, expandindo significativamente nossa compreensão da organização dinâmica da replicação do DNA e da transcrição em condições fisiológicas e patológicas²¹. Apesar dos valiosos insights fornecidos por esses métodos baseados em sequenciamento, seu alto custo e natureza demorada limitam sua aplicação mais ampla. Portanto, é crucial estabelecer um método de detecção mais definitivo, altamente sensível, conveniente e rápido para visualizar e quantificar as TRCs no nível de uma única célula.

O ensaio de ligação de proximidade in situ (PLA), também conhecido como tecnologia Duolink PLA, é um método poderoso para avaliar a proximidade física de proteínas-alvo em seções de tecido ou culturas de células. Essa técnica gera um sinal apenas quando duas proteínas ou complexos de proteínas estão a 40 nm uma da outra. Requer dois anticorpos primários contra as proteínas-alvo, cada um de uma espécie diferente (por exemplo, camundongo/coelho, coelho/cabra ou camundongo/cabra). Depois de incubar a amostra com esses anticorpos primários, anticorpos secundários conhecidos como sondas PLA (um PLUS e um MINUS) são aplicados. Ao contrário dos anticorpos secundários regulares que se ligam às regiões constantes dos anticorpos primários, as sondas PLA estão covalentemente ligadas a primers de DNA específicos. Quando as proteínas-alvo estão próximas (menos de 40 nm), um oligonucleotídeo conector pode hibridizar com ambas as sondas PLA, facilitando a ligação enzimática de seus oligonucleotídeos ligados em uma molécula de DNA de comprimento total. Este DNA recém-formado serve como um marcador substituto para a interação proteica detectada e atua como um modelo para amplificação. O produto amplificado é então visualizado usando sondas de oligonucleotídeos marcadas com fluorescência. Se as proteínas estiverem separadas por mais de 40 nm, as sondas PLA não podem formar um molde de DNA, resultando em nenhum sinal detectável. O diagrama esquemático do PLA é representado na Figura 1. A proximidade e/ou interação são visualizadas por microscopia de fluorescência como pontos fluorescentes, e o número e a intensidade desses pontos podem ser quantificados. Desde sua invenção em 2002, o PLA tornou-se popular para monitorar interações proteicas devido à sua alta sensibilidade e especificidade. Ao contrário dos ensaios baseados em sequenciamento, o PLA requer apenas pequenas quantidades de amostras, tornando-o favorável para a análise de amostras escassas.

Estudos demonstraram que a expressão da mutação oncogênica KRAS G12D leva a conflitos de transcrição-replicação (TRCs)^22,23. Por exemplo, a pesquisa apresentada por Meng et ^al.23 indica que a expressão ectópica de KRAS G12D em células epiteliais ductais pancreáticas humanas (HPNE) aumenta as TRCs e as alças R relacionadas à TRC. Para permitir a detecção de colisões entre a transcrição de RNAPII e a maquinaria de replicação em linhagens celulares, fornecemos um protocolo desenvolvido especificamente para esse fim. O plasmídeo KRAS (G12D) e o controle vetorial são transfectados em células BEAS-2B epiteliais do pulmão humano, e a expressão de KRAS (G12D), juntamente com danos ao DNA (γH2AX), é verificada por Western blot. O acúmulo de R-loop é confirmado pela análise de dot blot S9.6, que juntos indicam o acúmulo de bloqueios de replicação e instabilidade do genoma em células que expressam KRAS (G12D). Finalmente, as células são fixadas em lâminas para o ensaio de PLA. Para detecção localizada de colisões, as células são primeiro coradas com anticorpos primários RNAPII e PCNA, seguidas de coloração com anticorpos secundários conjugados com sondas PLA. Uma molécula circular de DNA se forma por meio de ligação bem-sucedida, servindo como modelo para a amplificação subsequente do círculo rolante (RCA). As lâminas são então montadas com mídia de montagem apropriada e visualizadas sob um microscópio de fluorescência. As imagens podem ser analisadas usando ImageJ.

1. Produção e transdução de lentivírus em linhagem celular alvo

1. Produção de lentivírus²⁴
   1. Semeie células de empacotamento 293T a 3 × 10⁶ células por placa de 10 cm em meio Eagle modificado de Dulbecco com alto teor de glicose (DMEM; meio completo). Cultive células a 37 °C em uma incubadora umidificada de 5% de CO₂ por mais 18-20 h.
   2. Em dois tubos de 1,5 mL, prepare uma mistura de DNA de um total de 24 μg de DNA plasmidial em 500 μL de Opti-MEM (meio sérico reduzido) que contenha 9,2 μg de psPAX2, 2,8 μg de pMD2.G, juntamente com 12 μg de plasmídeo pLVX-KRAS ou vetor vazio, respectivamente.
      NOTA: Como as endotoxinas diminuem significativamente a eficiência da transfecção, recomenda-se remover a endotoxina do plasmídeo durante a purificação.
   3. Dilua 144 μL de polietilenimina (PEI; 1 mg/mL) em 1 mL de meio sérico reduzido, misture e incube por 5 min em temperatura ambiente (RT).
   4. Adicione 500 μL de PEI diluído gota a gota à mistura de DNA diluído enquanto agita suavemente o tubo. Incubar as misturas PEI/ADN durante 15 min a RT.
   5. Durante a incubação, aspire suavemente o meio das placas de 10 cm previamente semeadas. Substitua por 10 mL de DMEM completo fresco.
   6. Após a incubação, pipetar lentamente a mistura de transfecção DNA:PEI nas placas de 10 cm, tomando cuidado para não desprender as células.
      NOTA: O PEI é um reagente de transfecção comumente usado, mas sua concentração deve ser cuidadosamente otimizada para equilibrar a eficiência da transfecção e a citotoxicidade. Apesar do custo mais alto da Lipofectamine 3000 (reagente de transfecção), ela demonstrou maior eficiência de transfecção e menor citotoxicidade em comparação com a PEI em certas linhagens celulares, levando a uma melhor produção viral. A eletroporação é outra alternativa que utiliza pulsos elétricos para introduzir ácidos nucléicos nas células. Embora eficaz, requer equipamentos especializados e pode ser mais trabalhoso.
   7. Cultive as células por 18 h e, em seguida, substitua cuidadosamente o meio de transfecção por 10 mL frescos de meio DMEM Complete contendo 25 μM de cloroquina.
   8. Após 72 h de transfecção, colete o meio de cultura contendo a partícula do vírus. Remova as células 293T da embalagem centrifugando a 500 x g por 5 min.
   9. Recolher o sobrenadante e filtrá-lo através de um filtro de polietersulfona (PES) de 0,45 μm. Use o sobrenadante viral diretamente.
      NOTA: O sobrenadante viral deve ser aliquotado e congelado em nitrogênio líquido e mantido a -80 ° C para evitar a perda de título.
2. Infecção lentiviral de células-alvo
   1. Semeie 2 × 10⁶ células-alvo BEAS-2B em duas placas de 6 cm e cresça a 37 °C, 5% de CO₂ durante a noite. Após a transdução, certifique-se de que as células BEAS-2B sejam aproximadamente 70% confluentes.
   2. Remova cuidadosamente o meio antigo e adicione os 0,5 mL apropriados de KRAS ou partículas lentivirais vetoriais junto com 3 mL de meio RPMI-1640 completo fresco em duas placas, respectivamente.
   3. Cultive as células a 37 °C por 18-20 h em uma incubadora de CO_{5% 2} . Substitua o meio antigo contendo partículas lentivirais por 3,5 mL de meio de cultura completo pré-aquecido fresco. Após 72 h de transdução, recolher as células para o ensaio seguinte.
      NOTA: Se a incubação noturna com o vírus causar toxicidade, o tempo de incubação pode ser reduzido para 4 h. Para alcançar o equilíbrio entre a eficiência da transdução e a saúde celular, as seguintes estratégias precisam ser consideradas: (1) Otimizar a multiplicidade de infecções; (2) Use preparações virais de alta qualidade; (3) Utilizar policátions (como polibreno) para melhorar a eficiência, permitindo o uso de títulos virais mais baixos e reduzindo a toxicidade potencial; (4) Para estudos de longo prazo, considere o uso de sistemas de expressão induzíveis para controlar a expressão do transgene temporalmente, reduzindo a carga sobre as células e minimizando a toxicidade potencial.

2. Verificação de danos no ADN derivados do KRAS (G12D) e formação de R-loop

1. Confirme a expressão gênica e o dano ao DNA por ensaio WB
   1. Aspirar o meio de cultura das placas.
   2. Lave suavemente as células com 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) para remover qualquer meio residual ou detritos.
   3. Adicione um pequeno volume de 1x PBS para manter as células úmidas durante o processo de raspagem.
   4. Use um raspador de células, segurando-o em ângulo, e raspe suavemente as células da superfície em uma direção consistente.
      NOTA: Tenha cuidado para não aplicar muita pressão, o que pode danificar as células.
   5. Incline a placa e use uma pipeta para coletar a suspensão celular em um tubo e gire as células a 500 x g por 5 min. Descarte o sobrenadante.
   6. Prepare o tampão 1x RIPA diluindo o tampão 2x RIPA (consulte a Tabela 1) e adicione o coquetel inibidor de protease e o coquetel inibidor de fosfatase imediatamente antes do uso.
   7. Lisar o pellet celular com tampão RIPA pré-resfriado (1x) e incubar por 30 min no gelo. Remova os detritos centrifugando a 15.000 x g por 10 min. Colete o sobrenadante e meça a concentração de proteínas usando o teste de Bradford.
   8. Adicione 4 x tampão de carregamento de amostra de dodecil sulfato de sódio (SDS) ao sobrenadante e desnature as proteínas por 5 min a 95 ° C. Primeiro, separe 40 μg de proteína de cada amostra em um gel de eletroforese em gel de poliacrilamida SDS a 12,5% (PAGE) e, em seguida, transfira-o para membranas de nitrocelulose de 0,2 μm (consulte a Tabela de Materiais).
   9. Depois de terminar a transferência, bloqueie as membranas com tampão de bloqueio (5% de leite desnatado em solução salina tamponada com Tris contendo 0,1% de Tween 20 [TBST; Tabela 1]) por 1 h.
   10. Enxágue brevemente a membrana com TBST e, em seguida, incube a membrana com anticorpos primários contra FLAG-tag (diluição 1: 2500 em PBST) e γH2AX (diluição 1: 1000 em PBST) (ver Tabela de Materiais) durante a noite a 4 ° C.
   11. Remova os anticorpos primários e lave a membrana com TBST 3 vezes, de cada vez por 10 min.
   12. Mergulhe as membranas em anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano diluído (HRP) (1:5.000 em tampão TBST contendo 5% de leite desnatado) por 1 h em temperatura ambiente (RT).
   13. Lave a membrana com TBST 3 vezes, de cada vez por 10 min.
   14. Visualize os níveis de proteína por meio dos reagentes de quimioluminescência aprimorada (ECL) (consulte a Tabela de Materiais).
2. Detecção de R-loop por Dot blot²⁵​
   1. Aspirar o meio de cultura das placas.
   2. Lave suavemente as células com 1x PBS para remover qualquer meio residual ou detritos.
   3. Adicione um pequeno volume de 1x PBS para manter as células úmidas durante o processo de raspagem.
   4. Use um raspador de células, segurando-o em ângulo, e raspe suavemente as células da superfície em uma direção consistente.
      NOTA: Tenha cuidado para não aplicar muita pressão, o que pode danificar as células.
   5. Incline a placa e use uma pipeta para coletar a suspensão celular em um tubo e gire as células a 500 x g por 5 min. Descarte o sobrenadante.
   6. Lise 2 × 10⁶ células com 300 μL de tampão de lise celular gelado (ver Tabela 1). Incube no gelo por 10 min. Girar a 500 x g durante 5 min a 4 °C e rejeitar o sobrenadante. O pellet contém núcleos.
   7. Use uma ponta de orifício largo para ressuspender cada pellet com 300 μL de tampão de lise nuclear pré-resfriado (consulte a Tabela 1).
   8. Adicione 3 μL de proteinase K a 20 mg / mL (consulte a Tabela de Materiais) a cada amostra e digerir por 3-5 h a 55 ° C.
   9. Adicione 100 μL de tampão de eluição (consulte a Tabela 1) a cada tubo e misture bem.
   10. Adicione 400 μL de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (25:24:1 pH 8,0) a cada tubo. Após um vórtice vigoroso, centrifugue a 12.000 x g por 5 min a 4 ° C para separar o DNA de outro conteúdo celular.
   11. Transfira cuidadosamente a fase aquosa superior para os novos tubos.
   12. Precipitar o ADN adicionando 1/10 de volume de acetato de sódio 3 M (pH 5,2) e 2,5 de etanol a 100% pré-arrefecido à amostra. Misture bem e incube por 4 h ou durante a noite a -20 °C.
       NOTA: A adição de glicogênio (consulte a Tabela de Materiais) à amostra pode aumentar a recuperação de DNA da precipitação de etanol. A concentração final de glicogênio é de cerca de 0,05-1 μg/μL.
   13. Pulverizar o ADN centrifugando a 12.000 x g durante 30 min a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante sem perturbar o sedimento.
   14. Enxágue o pellet com 1 mL de etanol a 70% gelado e centrifugue novamente por 5-15 min a 12.000 x g a 4 ° C.
   15. Rejeitar cuidadosamente o sobrenadante para evitar perturbar o sedimento de ADN.
   16. Seque ao ar o pellet de DNA por 5-10 min.
   17. Dissolva o pellet de DNA adicionando 50 μL de tampão TE pré-aquecido (pH8.0) e incube por 30 min a 37 ° C. Meça a concentração de DNA de cada amostra.
   18. Preparar diluições de ADN para as concentrações desejadas em tampão TE (5 ng/μL a 200 ng/μL). Coloque uniformemente 20 μL de cada amostra em uma membrana de nylon carregada positivamente por um aparelho de dot-blot.
       NOTA: Para detectar R-loops usando um ensaio de dot blot, recomenda-se aplicar aproximadamente 500 ng de DNA genômico por ponto. Essa quantidade demonstrou fornecer sensibilidade suficiente para detectar híbridos de RNA-DNA ao usar o anticorpo monoclonal S9.6, que se liga especificamente a essas estruturas.
   19. Imobilize o DNA reticulando o DNA com a membrana de náilon (consulte a Tabela de Materiais) por meio da configuração de "Reticulação Automática" do reticulador UV (1.200 μJ x 100) (consulte a Tabela de Materiais).
   20. Mergulhe as membranas no tampão de bloqueio (consulte a Tabela 1) por 1 h em temperatura ambiente. Em seguida, enxágue brevemente as membranas com TBST.
   21. Durante a noite, incubar a membrana com anticorpo primário (ver Tabela de Materiais) a 4 ° C. A diluição de S9.6 é de 1:1.000 em TBST contendo 5% de BSA.
   22. Remova o anticorpo primário e lave 3 vezes com TBST e a cada vez por 10 min.
   23. Incubar a membrana com anticorpo secundário conjugado com HRP em 5% BSA em TBST à temperatura ambiente por 1 h.
   24. Remova o anticorpo secundário e lave 3 vezes com TBST e a cada vez por 10 min.
   25. Visualize os níveis de R-loop através dos reagentes ECL (Quimioluminescência Aprimorada) Consulte a Tabela de Materiais).

3. Ensaio PLA

1. Preparação celular
   NOTA: A transdução de células com o oncogene KRAS G12D leva a um aumento nos TRCs, conforme evidenciado por um sinal positivo de PLA. Este método distingue efetivamente os TRCs orientados por oncogenes dos níveis de fundo sem a necessidade de seleção de antibióticos. No entanto, a implementação da seleção de antibióticos pós-transdução pode aumentar o sinal geral, enriquecendo a população de células transduzidas com sucesso, melhorando assim a sensibilidade e a especificidade do ensaio.
   1. Coloque vidros de cobertura de 12 mm de diâmetro em cada poço de uma placa de 12 poços.
   2. Semeie as células infectadas com lentivírus nesses poços 24 h após a infecção e mantenha as células em lamínulas em 500 μL de meio RPMI-1640 completo a 37 ° C com 5% de CO₂.
   3. Ótimo) Se o desenho experimental incluir a seleção de antibióticos para enriquecer as células transduzidas com sucesso, adicione o antibiótico apropriado ao meio de cultura nesta fase.
   4. Monitore as células para garantir que atinjam aproximadamente 60% de confluência 48-72 h após a infecção.
   5. Remova cuidadosamente o RPMI-1640 e pré-extraia as células com 0,5% de NP-40 frio por 4 min no gelo.
   6. Adicione 500 μL de tampão de fixação (consulte a Tabela 1) diretamente para fixar as células por 15 min em RT.
      NOTA: É aconselhável não lavar as células antes da etapa de fixação, pois isso pode fazer com que elas se desprendam da superfície em que estão crescendo, especialmente se a linha celular for sensível ao descolamento; portanto, adicionar diretamente a solução fixadora é frequentemente preferido.
   7. Pare a reação removendo o tampão de fixação e lavando cuidadosamente as células com 1x PBS 3 vezes.
   8. Aspire o PBS e adicione 500 μL de metanol 100% pré-resfriado às células.
   9. Permeabilize as células incubando a -20 °C por 15-30 min.
   10. Bloquear células com solução de bloco Duolink por 1 h em RT.
2. Coloração de anticorpos
   1. Dilua o anti-RNAPII de camundongo 8WG16 (1:500) e o anti-PCNA de coelho (D3H8P) (1:500) em tampão de diluição de anticorpos Duolink. Incubar as células com a mistura de anticorpos primários durante a noite a 4 °C numa câmara de humidade.
      NOTA: Execute o protocolo PLA usando apenas um dos anticorpos primários (anti-RNAPII ou anti-PCNA) omitindo o outro. Isso ajuda a identificar qualquer sinal de fundo resultante de interações inespecíficas dos anticorpos individuais ou sondas PLA.
   2. Remova cuidadosamente os anticorpos primários das lâminas usando uma folha de papel sem fiapos sem tocar nas células. Em seguida, lave as células 3 vezes com 1x PBS.
   3. Prepare as sondas de PLA (ou anticorpo secundário) de acordo com o procedimento a seguir (consulte a Tabela 2), misture e deixe descansar por 20 minutos em temperatura ambiente.
   4. Adicione a mistura de anticorpos secundários às lâminas e incube em uma câmara de umidade por 2 h em RT.
3. Ligadura e amplificação
   1. Descarte a mistura de anticorpos secundários e lave as lâminas duas vezes com 1x Buffer A cada por 5 min.
   2. Prepare a mistura de ligadura de acordo com o procedimento a seguir (ver Tabela 2).
   3. Aplicar 15 μL de mistura de ligação em cada lâmina de cobertura e incubar a 37 °C durante 30 min numa câmara de humidade.
   4. Lave as lâminas duas vezes com 1x Buffer A cada por 2 min.
   5. Prepare a mistura de amplificação de acordo com o procedimento a seguir (consulte a Tabela 2).
   6. Aplique 15 μL de AmpMistura de Amplificação em cada lâmina e incube por 100 min a 37 °C em uma câmara de umidade. Descarte a Mistura de Amplificação e lave duas vezes com 1x Buffer B cada por 10 min.
   7. Lave as lâminas uma vez com 0,01x tampão B por 1 min.
   8. Aspire o tampão B e monte as lâminas no meio de montagem Duolink In Situ com DAPI.
4. Análise de imagem e determinação de limiar:
   1. Quantifique o número de focos de PLA por ImageJ. O software de análise de imagem automatizado pode ajudar a quantificar os sinais de PLA de forma objetiva. Escolha um limite de 3 ou mais focos de PLA por núcleo como limite porque menos de 1% das células de controle adquirem 3 focos de PLA em condições imperturbáveis.
      NOTA: Como o limite é determinado experimentalmente pela análise de várias amostras e controles para levar em conta a variabilidade, configurações de imagem consistentes (por exemplo, tempo de exposição, ganho) devem ser mantidas em todas as amostras para garantir a comparabilidade.

γH2AX serve como um biomarcador para danos ao DNA. A superexpressão de KRAS (G12D) prejudica a estabilidade genômica nessas células, como evidenciado pelo aumento do sinal γH2AX na análise de Western blot (Figura 2A). Além disso, o sinal intensificado de S9.6 dot blot em células que expressam KRAS (G12D) em comparação com controles vetoriais (Figura 2B) indica que a expressão oncogênica de KRAS leva ao acúmulo de loops R aberrantes, o que pode contribuir para a formação de quebra de DNA.

A Figura 3 apresenta imagens representativas do ensaio de ligadura de proximidade (PLA). Nessas imagens, pontos verdes brilhantes dentro dos núcleos indicam que a distância entre o complexo de replicação associado ao PCNA e o complexo de transcrição RNAPII é inferior a 40 nm. Nas células de controle vetorial, os pontos verdes são raramente detectados, enquanto nas células que expressam KRAS (G12D), são observados vários pontos verdes por núcleo. Isso sugere que a expressão oncogênica de KRAS aumenta a frequência de encontros entre RNAPII e complexos de replicação. Esses resultados de PLA se alinham com os achados dos ensaios de Western blot ( Figura 2A ) e dot blot ( Figura 2B ).

Em resumo, esses achados demonstram que o ensaio de ligação de proximidade detecta efetivamente conflitos induzidos por oncogenes entre RNAPII e maquinário de replicação. Essa capacidade tem um potencial significativo para aplicações futuras, permitindo a quantificação de TRCs em diversos tipos de amostras resultantes da expressão aberrante de oncogenes. Embora existam certas limitações, as perspectivas para este método são promissoras, especialmente com ajustes nas condições experimentais adaptadas a diferentes amostras.

Figura 1: Representação esquemática do ensaio de ligação de proximidade in situ . (1) Determine os parceiros de interação emparelhados de interesse. (2) Incubar a amostra com anticorpos primários emparelhados direcionados às proteínas desejadas, seguidos por anticorpos secundários conjugados com sondas de oligonucleotídeos. (3) São introduzidos oligos conectores, que são complementares aos oligos ligados a cada sonda PLA. Se as proteínas-alvo estiverem próximas o suficiente, as sequências de oligonucleotídeos ligadas às sondas PLA estarão próximas. (4) Se as proteínas-alvo estiverem próximas (normalmente <40 nm), os oligonucleotídeos nas sondas PLA entram em contato e podem ser ligados por uma DNA ligase para formar uma molécula circular de DNA. (5) Realize RCA usando uma polimerase para amplificar o DNA circular, criando uma fita de DNA longa e repetitiva. Hibridizar oligonucleotídeos marcados com fluorescência ao produto de DNA amplificado, permitindo a visualização. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Danos ao DNA e acúmulo de R-loop em células de expressão KRAS (G12D). (A) Análise representativa de Western blot de lisados de células inteiras de células BEAS-2B, ilustrando um aumento nos níveis de γH2AX após 72 h de expressão de KRAS G12D. O blot γH2AX foi usado para avaliar danos ao DNA, com ACTB servindo como controle de carga. O FLAG blot confirmou a expressão de KRAS G12D. (B) Análise representativa de dot blot da formação de R-loop em células BEAS-2B, comparando condições com e sem expressão de KRAS G12D. O anticorpo S9.6 foi empregado para detectar R-loops, enquanto um anticorpo anti-DNA foi usado para quantificar o DNA total. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Acúmulo de TRC em células de expressão KRAS (G12D). Imagens representativas do ensaio de PLA. Os focos verdes brilhantes nas células que expressam KRAS G12D indicam colisões entre PCNA e RNA Polimerase II (RNAPII). Imunocitoquímica O PLA demonstra altos TRCs em células que expressam KRAS G12D em comparação com células vetoriais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Preparação do tampão. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2: Preparação da reação de PLA. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 3: Solução de problemas para o ensaio de PLA. Clique aqui para baixar esta tabela.

A maquinaria de transcrição RNAPII pode criar um obstáculo à progressão do garfo de replicação do DNA^26,27, promovendo TRCs e danos ao DNA, especialmente em células cancerígenas^28,29. Decifrar as proteínas que regulam as TRCs e entender os mecanismos detalhados pode nos ajudar a compreender como esses eventos prejudiciais ocorrem e orientar o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas no futuro. Portanto, para entender completamente os TRCs, métodos rápidos e confiáveis para detecção de TRC são essenciais.

Aqui, descrevemos um procedimento para examinar a incidência de conflitos de replicação de transcrição (TRCs) usando um ensaio de PLA in situ . Essa abordagem permite uma estimativa fácil da frequência de TRC na presença de sinalização oncogênica dentro das células. Não requer equipamentos caros ou grandes quantidades de material de partida. Nosso protocolo também inclui S9.6 dot blot e Western blot para confirmar a especificidade do sinal TRC derivado da expressão KRAS (G12D).

Este ensaio baseia-se no reconhecimento de complexos de replicação e transcrição de RNAPII por pares de conjugados anticorpo-oligonucleotídeo (sondas PLA), que juntos produzem círculos de DNA que servem como modelos para reações localizadas de amplificação de círculos rolantes. A exigência de reconhecimento duplo das proteínas-alvo aumenta a seletividade, eliminando qualquer reatividade cruzada que não seja compartilhada pelos pares de anticorpos, garantindo resultados inequívocos e reprodutíveis. Portanto, a especificidade e a forte afinidade dos anticorpos são essenciais para o sucesso do ensaio de PLA. É fundamental otimizar as condições de desempenho do anticorpo dentro da amostra, que inclui (i) condições de fixação e permeabilização celular, (ii) solução de bloqueio e (iii) diluição primária de anticorpos. Controles negativos apropriados são cruciais, pois (i) controles knockdown podem verificar a especificidade dos anticorpos primários e (ii) controles com isotipo IgG podem testar a especificidade das sondas PLA.

Muitos dos problemas comuns com o ensaio de PLA são identificados. Isso inclui a ausência do sinal esperado e a presença de um sinal de fundo inespecífico. Um resumo das possíveis causas e soluções para esses problemas é fornecido na Tabela 3.

Notavelmente, este método só pode confirmar a proximidade física entre PCNA e RNA polimerase II; no entanto, essa proximidade não implica necessariamente a ocorrência de quebras prejudiciais de DNA. Outra limitação importante é que esse método não pode fornecer informações sobre os loci específicos da cromatina onde esses dois complexos interagem. Compreender completamente as quebras de DNA associadas à transcrição requer uma análise mais sofisticada. Aproveitando a tecnologia de sequenciamento de última geração, o desenvolvimento do TRIPn-seq é um dos poucos métodos capazes de identificar com precisão a co-ocupação de transcrição e replicação, aplicável a qualquer célula em proliferação^{21 , 29} . No entanto, apesar da informatividade desse método, seu alto custo e tempo intensivo limitam sua acessibilidade.

Em resumo, nossos estudos indicam que o PLA in situ é uma abordagem eficiente para determinar a proximidade da replicação e da maquinaria de transcrição de RNAPII em células fixas, com resolução quantitativa e espacial. O uso específico de anticorpos PCNA e RNAPII (8WG16) tem se mostrado eficaz para estudar TRCs em células BEAS-2B. Além dos TRCs associados à transcrição de RNAPII, o ensaio de PLA in situ também pode ser usado para investigar RNAPI e TRCs associados a RNAPIII em ambientes clínicos e de pesquisa, desde que controles e ajustes apropriados sejam aplicados.

Um estudo publicado recentemente^introduziu uma nova estratégia terapêutica para cânceres caracterizados por DNA extracromossômico (ecDNA). Os pesquisadores aumentaram os conflitos de transcrição-replicação (TRCs) para explorar vulnerabilidades em células cancerígenas positivas para ecDNA, direcionando-as seletivamente enquanto poupam células normais. Avaliar o status do TRC usando o método PLA pode fornecer informações valiosas sobre a estabilidade genômica das células cancerígenas de um paciente. O monitoramento do status da TRC durante o tratamento pode ajudar a avaliar a eficácia das terapias direcionadas às TRCs. Portanto, a integração da avaliação TRC baseada em PLA em abordagens de medicina personalizada é promissora para melhorar o diagnóstico, prognóstico e monitoramento do tratamento do câncer, oferecendo uma compreensão mais profunda da dinâmica molecular dentro de tumores individuais.

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Este trabalho foi apoiado pelo financiamento inicial da Universidade do Sul da China.