Yerçekimi ve Ev Yapımı Mini Biyoreaktörler Altında Düşük Yapışkan Koşullar Kullanılarak Çeşitli Kondrositlerden Sferoidlerin Üretilmesi

Bu çalışma, hücreleri yerçekimi kullanarak düşük yapışma koşulları altında sferoidler halinde toplayarak ve ardından elde edilen sferoidleri mini biyoreaktörlerde kültürleyerek kondrositik sferoidlerin üretilmesi için bir yöntemi açıklamaktadır.

Kronik eklem hastalıklarında kıkırdak onarımı, hasarlı dokuları etkili bir şekilde yenilemek için gelişmiş hücre bazlı tedaviler gerektirir. Bu protokol, indüklenmiş pluripotent kök hücreleri (iPSC'ler) kondrosit bazlı sferoidlere ayırmak için adım adım bir yöntem sağlayarak doku mühendisliği ve hücre tedavisi uygulamalarını destekler. Farklılaşma süreci, hücreleri farklılaşmanın kritik aşamaları boyunca sırayla yönlendiren belirli ortamlarda kültürlenen iPSC'lerden başlayarak, kondrojenik soy bağlılığını teşvik etmek için dikkatli bir şekilde yapılandırılmıştır. Başlangıçta, iPSC'ler, bir dizi tanımlanmış ortam değişikliği kullanılarak kondrojenik soylara doğru indüksiyondan önce optimal birleşmeye ulaşmak için genişletilir. 10. günde, hücreler, olgun kondrositlerin temel belirteçlerini ifade eden kondrosit benzeri hücrelerin oluşumunu artıran kondrogenezi teşvik eden bir ortama geçirilir. 96 oyuklu agaroz kaplı plakalarda daha fazla agregasyon, daha sonra hücre dışı matris (ECM) birikimini teşvik eden bir mikro ortamı simüle etmek için tasarlanmış özel mini biyoreaktörlerde kültürlenen üç boyutlu sferoidlerin oluşumuna yol açar. Bu yaklaşım, doğal kıkırdak özelliklerini taklit eden kondrosit sferoidlerinin ölçeklenebilir üretimini mümkün kılarak, kıkırdak defektleri için hücre bazlı tedaviler geliştirmek için umut verici, tekrarlanabilir bir çözüm sunar ve kas-iskelet sistemi rejeneratif tıbbında klinik ve araştırma uygulamaları için geniş fayda sağlar.

Eklem hastalığının yaygınlığı, artan engelli hasta sayısı ve bakımları ile ilgili maliyetler nedeniyle önemli ekonomik yüklere yol açmaktadır. Hiyalin kıkırdak, sınırlı rejeneratif potansiyele sahip bir bağ avasküler dokusudur¹. Bazı steroid olmayan antienflamatuar ilaçların (NSAID'ler), glukokortikoidlerin ve kemoterapi veya radyoterapinin uzun süreli kullanımı, kıkırdağın rejeneratif kapasitesini daha da azaltabilir ve iyileşme yeteneğini neredeyse ortadan kaldırabilir². Bu, hücresel tedavi için otolog kıkırdak hücrelerinin elde edilmesini zorlaştırır.

Kondrositler de dahil olmak üzere üç boyutlu (3D) hücre yetiştirme teknolojisi, uzun zamandır önemli potansiyele sahip, gelişmekte olan bir araştırma alanı olarak kabul edilmektedir. Bu 3D yapılar hem temel biyolojik araştırmalar hem de rejeneratif tıptaki uygulamalar için incelenmektedir. Otolog kondrositlerden türetilen sferoidler, şu anda küresel olarak önemli ölçüde dikkat çeken bir durum olan kıkırdak dokusu dejenerasyonunu ele almak için terapötik vaatlerde bulunmaktadır³.

iPSC'lerden farklılaşan kondrositlerden türetilen sferoidler, kıkırdak onarımı için önemli avantajlar sunan primer kondrositlere umut verici bir alternatif oluşturur. iPSC'ler, kendini yenileme için neredeyse sınırsız bir kapasite sağlar ve geniş bir farklılaşma potansiyeline sahiptir, bu da hücre toplama için invaziv prosedürler olmadan klinik uygulamalar için yeterli miktarlarda kondrositlerin üretilmesine izin verir⁴. Ayrıca, geleneksel iki boyutlu (2B) kondrosit kültürlerinden kondrosferler gibi 3B kültür sistemlerine geçiş, fizyolojik olarak daha ilgili bir ortam yaratarak bu hücrelerin canlılığını ve işlevselliğini daha da artırır. Çalışmalar, 3D sferoidlerde kültürlenen kondrositlerin fenotiplerini daha iyi koruduğunu, daha düşük farklılaşma oranları ve kollajen tip II ve agrekan⁵ gibi temel hiyalin kıkırdak belirteçlerinin daha yüksek ekspresyon seviyeleri gösterdiğini göstermektedir.

iPSC'den türetilmiş kondrosferlerin potansiyeline rağmen, yüksek kaliteli kondrosferler üretmek için standartlaştırılmış protokoller sınırlı kalmaktadır. Çalışmalar arasındaki protokollerdeki değişkenlik genellikle kondrosit kalitesinde ve hücre dışı matriks bileşiminde tutarsızlıklara yol açar ve bu da terapötik kullanım için etkinliklerini etkiler⁶. Burada, uygun fiyatlı, özel yapım mini biyoreaktörler kullanarak iPSC'den türetilmiş kondrositlerden sferoid üretimini standartlaştıran rafine bir protokol sunulmaktadır. Mini biyoreaktör kültür fazı, besin dağılımını, ECM olgunlaşmasını ve küresel sıkıştırmayı⁷ optimize eden kontrollü, düşük yapışma ayarı sağladığı için çok önemlidir. Bu faz, doğal kıkırdağa çok benzeyen bir ECM bileşimi ile birlikte kollajen tip II, agrekan ve SOX9 dahil olmak üzere temel kondrosit belirteçlerinin sağlam ekspresyonunu destekler. Düzenli ortam değişiklikleri ve çevresel koşulların dikkatli bir şekilde kontrol edilmesi - sıcaklık, CO₂ ve dönme hızı - kondrosit sferoidlerinin canlılığını ve olgunlaşmasını daha da sağlar. Bu protokol, kıkırdak onarımında araştırma ve klinik uygulamalar için uygun, uygun maliyetli ve ölçeklenebilir bir şekilde hiyalin kıkırdak belirteçlerinin güçlü ifadesine sahip yüksek kaliteli kondrosferler oluşturmak için optimize edilmiştir.

Çalışma, LOPUKHIN FRCC PCM Etik Kurulu tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır (9 Nisan 2019 tarihli 2019/02 sayılı protokol). Tüm donör örnekleri Helsinki Bildirgesi ilkelerine uygun olarak elde edildi. Tüm katılımcılardan ve/veya yasal vasilerinden bilgilendirilmiş onam alındı.

NOT: Protokol boyunca steril tekniği koruyun. Tüm kültür ortamlarını ve çözeltilerini hücrelere veya sferoidlere uygulamadan önce 37 °C'ye ısıtın. Hücreleri bir CO₂ inkübatöründe 37 ° C'de,% 5 CO₂ % 80 nem ile yetiştirin. Protokol şeması Şekil 1'de gösterilmiştir.

Şekil 1: iPSC hattından kondrosfer üretme protokolü IPSRG4S. (A) Başlangıçta, iPSC'ler% 80 birleşmeye ulaşılana kadar pluripotent kök hücre ortamında kültürlenir. (B) Kondrositik çizgiye doğru farklılaşmayı indüklemek için, iPSC'ler daha sonra 2 gün boyunca ortam A'da kültürlenir. Ortam daha sonra Chir 99021 ve Rho kinaz inhibitörü içermeyen bir formülasyonla değiştirilir ve hücreler her 2 günde bir orta değişikliklerle 6 gün daha kültürlenir. (C) Hücreler daha sonra sonraki 10 gün boyunca kondrogenezi teşvik etmek için B ortamına aktarılır. (D) Yeterli hücre sayısı elde edildiğinde, süreç sferoidlerin üretim aşamasına ilerler. (E) Hücreler, yerçekimi altında düşük yapışkan koşullarda sferoidler halinde toplanır. (F) Elde edilen sferoidler, orta B ile mini biyoreaktörlerde kültürlenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

1. Petri kaplarının mini biyoreaktörlere dönüştürülmesi

NOT: Ayrıntılar bir önceki makalede^{yer almaktadır 5}.

1. Steril otoklav makası kullanarak santrifüj tüplerini 7-8 mm yüksekliğinde halkalar halinde dilimleyin (otoklav ayarları: 15 psi'de 121 °C (250 °F), 30 dakika ve otoklav sonrası 20 dakika kurutma).
2. Düşük yapışma özelliğine sahip, işlenmemiş veya mikrobiyolojik Petri kaplarını küçük parçalara ayırın. Sıvı bir plastik çözelti oluşturmak için yaklaşık 1 g plastik parçacığı gece boyunca 10 mL kloroformda çözün. Bu prosedürü bir çeker ocakta gerçekleştirin.
3. Sıvı plastiğin pipetleme için yeterince viskoz olduğunu doğrulayın. Damlacıkların yüzeye yayılmak yerine küresel bir şekli koruduğundan emin olun. Çözelti çok inceyse, genellikle 1-3 g gerektiren daha fazla plastik parçacık ekleyin. Çok kalınsa, genellikle 5 mL'ye kadar gerektiren ek kloroform ekleyin.
4. Aşağıda özetlenen iki etkili yöntemden birini kullanarak steril, ultra düşük yapışma özelliğine sahip 60 mm'lik bir Petri kabının ortasında plastik bir düğme oluşturun.
   1. Seçenek 1: Otoklavlanmış plastik halkayı Petri kabının ortasına yerleştirin, ardından halkanın içine sıvı plastik uygulayın; bir damla yaklaşık 100-200 μL damla sıvı plastik gerektirecektir.
   2. Seçenek 2: Plastik halkayı kullanmadan aynı sayıda sıvı plastik damlasını doğrudan Petri kabının ortasına uygulayın.
5. Bulaşıkların laminer akış başlığında 2-3 saat üstü açık olarak kurumasına izin verin. Kuruduktan sonra bulaşıkları 20-30 dakika ultraviyole radyasyona maruz bırakın.

2. Kültür yemeklerinin jelatin ile işlenmesi

1. Toz jelatini 95 °C'de damıtılmış suda çözerek %0.1'lik bir jelatin çözeltisi hazırlayın. Çözeltiyi sırayla 0.45 μm ve 0.25 μm membran filtrelerden geçirin, ardından süzüntüyü 4 °C'de saklayın.
2. Kondrosit yeniden tohumlamadan hemen önce, 3 mL jelatin solüsyonunu 25 cm2'lik şişeye uygulayın (T25 şişesi başına 15 g'a kadar kıkırdak dokusu önerilir). Oda sıcaklığında (RT) 30 dakika inkübe edin, jelatini çıkarın, PBS ile iki kez durulayın ve hücre tohumlamaya devam edin.

3. Kondrositlerin izolasyonu ve yetiştirilmesi

NOT: Kondrositler, total diz protezi yapılan hastalardan ağırlık taşımayan kıkırdak bölgelerinden izole edilir. Tüm örnekleri steril koşullar altında hasat edin ve 200 U / mL penisilin / streptomisin çözeltisi içeren DMEM ile doldurulmuş steril tüplerde saklayın. Kıkırdak dokusunu buzdolabında 2-8 °C'de saklayın.

1. Kıkırdak alımından sonraki 2 gün içinde enzimatik tedaviye başlayın. 60 mm Petri kapları kullanarak Hankıç parçalarını Hanks solüsyonunda yıkayın, ardından kıkırdağı otoklavlanmış makas kullanarak yaklaşık 1-2 mm çapında parçalar halinde kesin.
2. Kıkırdak parçalarını 15 mL'lik tüplere aktarın ve DMEM'de% 0.01 kollajenaz tip II çözeltisinde, 1 g kıkırdak başına yaklaşık 1 mL, 8-12 saat içinde% 5 CO₂,% 100 nem ile 37 ° C'ye ayarlanmış bir CO₂ inkübatörinde, 150-200 rpm'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde sürekli çalkalama altında sindirin.
3. Sindirimden sonra, kıkırdak parçalarını 15 mL'lik bir tüpe DMEM ekleyerek yıkayın, ardından 300 × g'da 10 dakika santrifüjleyin. Parçaları bir kondrosit kültür ortamında (Ek Tablo 1) yeniden süspanse edin ve bunları% 0.1 jelatin çözeltisi ile önceden kaplanmış yapışkan bir T25 şişesi üzerine tohumlayın.
4. % 80'lik bir birleşik yoğunluk elde edildiğinde geçiş kondrositleri.
   1. Geçiş için, kondrositleri Hanks solüsyonu ile yıkayın, daha sonra hücreleri% 0.25 tripsin solüsyonu ile 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
   2. Tripsini etkisiz hale getirmek için eşit miktarda DMEM +% 10 FBS ekleyin. Kondrositleri taze kültür ortamında yeniden süspanse edin, daha sonra 1^cm2'de 20.000-30.000 hücre tohumlayarak 1: 3 oranında dağıtın.
   3. Kültür şişesini 37 °C'de, %5 CO₂ ve %100 nem oranına sahip bir inkübatöre yerleştirin.

4. Pluripotent kök hücrelerin yetiştirilmesi

NOT: Moleküler Beyin Araştırma Grubu, Nörobiyoloji Anabilim Dalı Kök Hücre Laboratuvarı ile işbirliği içinde, A.I. Virtanen Enstitüsü, Doğu Finlandiya Üniversitesi, Kuopio, Finlandiya, bir iPSC hattı IPSRG4S, önceki bir çalışmada başarıyla oluşturulmuştur⁸.

1. iPSC'leri, hücre dışı proteinler içeren bir matris ile önceden kaplanmış 6 oyuklu plakalarda yetiştirin ( Şekil 1A). Pluripotent kök hücreler için bir ortam kullanın (Ek Tablo 1).
2. 1:4 oranını koruyarak (1^cm2 başına 50.000-75.000 hücre) %80 birleşmede geçiş hücreleri. Ayrılmadan yaklaşık 2-3 saat önce, iPSC'leri 1 gün boyunca 1 μM'lik bir nihai konsantrasyonda Rho kinaz inhibitörü Y27632 içeren pluripotent kök hücreler için ortama aktarın.
3. iPSC'leri Hanks solüsyonu ile yıkayın ve% 0.05 tripsin solüsyonu ile 37 ° C'de inkübe edin. Tripsini etkisiz hale getirmek için eşit miktarda DMEM +% 10 FBS ekleyin. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik tüplerde 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
4. Süpernatanı atın ve hücreleri pluripotent kök hücreler için taze bir ortamda yeniden süspanse edin. Hücre canlılığını arttırmak için, Rho kinaz inhibitörü Y27632'yi 1 gün boyunca 1 μM'lik bir nihai konsantrasyonda ortama ekleyin. Kültür plakasını %5 CO₂ ve %100 nem ile 37 °C'ye ayarlanmış bir CO₂ inkübatöre yerleştirin.

5. iPSC'lerin kondrojenik farklılaşması

1. İlk 2 gün boyunca Ortam A'daki (Ek Tablo 1) hücreleri kültürleyerek kondrositik soya doğru farklılaşmayı başlatın. 3. günde, Orta A'yı, diğer tüm bileşenleri değiştirmeden tutarken Chir 99021 ve Rho kinaz inhibitörünü içermeyen bir çözelti ile değiştirin. Ortamı 2 günde bir, 3 ila 9. günler arasında değiştirin (Şekil 1B).
2. 10. günde, kondrosit benzeri hücreleri, kondrogenezi kolaylaştırmak için formüle edilmiş Orta B'ye (Ek Tablo 1) aktarın. Ortamı 10 gün boyunca her 2 günde bir değiştirin (Şekil 1C).
3. Her bir kuyucuğu damıtılmış suda %1.5 agaroz ile kaplayarak önceden 96 oyuklu bir hücre süspansiyon kültürü plakası hazırlayın. Agarozu kaynayana kadar bir mikrodalgada eritin (700 W'ta yaklaşık 60-90 s). Agaroz sıvılaştırıldıktan sonra, her bir oyuğa 75 μL agaroz ekleyin ve RT'de sertleşmesine izin verin (yaklaşık 15 dakika).
4. Her oyuğa 150 μL DMEM ortamı ekleyin ve plakayı bir CO₂ inkübatörde en az 12 saat inkübe edin.
   NOT: Hazırlanan plakalar, buharlaşmayı telafi etmek için her bir oyuktaki ortam doldurulursa, 37 ° C'de bir CO₂ inkübatöründe 1 aya kadar saklanabilir.
5. 12. günde, kondrogenez ile ilişkili fenotipik değişiklikleri gözlemledikten sonra, üretilen kondrosit benzeri hücreleri kullanarak sferoid oluşumunu başlatın.
   NOT: Bu aşamada, iPSC'lerin başarılı kondrojenik farklılaşmasını doğrulamak için ^2-ΔΔCT yöntemi⁹ kullanılarak immünositokimya (ICC) ve kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) ile anahtar kondrositik belirteçlerin ekspresyonunun analiz edilmesi tavsiye edilir. 6 oyuklu plakadan 75^cm2'lik bir hücre kültürü şişesine geçiş sırasında, hücrelerin küçük bir kısmı, analiz edilecek işaretleyici sayısıyla eşleşen 48 oyuklu bir plakaya ekilebilir. Gen ekspresyonunu doğrulamak için bu numuneler üzerinde ICC analizi yapın.

6. Kondrosit benzeri iPSC'den türetilmiş hücrelerden sferoidlerin oluşumu

1. Kondrosit benzeri türevler elde edildikten sonra,% 80 birleşme hızında hücreler geçit sağlar. % 0.05'lik bir tripsin çözeltisi kullanarak hücreleri 6 oyuklu plakalardan ayırın. Tripsini inaktive etmek için, eşit hacimde DMEM +% 10 FBS ekleyin ve daha sonra hücreleri 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
2. Süpernatanı çıkarın, hücreleri 1 mL Ortam B'de yeniden süspanse edin ve% 0.1 jelatin çözeltisi ile önceden kaplanmış 75^cm2'lik bir hücre kültürü şişesine aktarın (Şekil 1D). Hücreler tek tabaka olarak% 80 birleşmeye ulaştığında, hücreleri tekrar tripsin ile ayırın ve tarif edildiği gibi Ortam B'de yeniden süspanse edin.
3. Hücreleri, oyuk başına 100.000 hücre yoğunluğunda% 1.5 agaroz ile kaplanmış 96 oyuklu bir plakaya aktarın. Kuyucuk başına 150 μL tam ortam ekleyerek Orta B'de yetiştirin (Şekil 1D, 3A).
4. % 1.5 agaroz ile kaplanmış 96 oyuklu plakadaki hücreleri, sferoidler oluşana kadar en az 1 gün ve en fazla 3 gün koruyun (Şekil 2B). Kesilmiş uçlu 1 mL'lik bir pipet ucu kullanarak sferoidleri kuyucuklardan aktarın, ardından 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Sferoidlerin 2-3 dakika oturmasına izin verin ve süpernatanı çıkarın.
5. Sferoidleri 4 °C'de tutulan taze çözülmüş, seyreltilmemiş bazal membran matris çözeltisine daldırın. 30 dakika sonra, 15 mL'lik bir tüpte pasif sedimantasyon veya 1 dakika boyunca 100 x g'da hafif santrifüjleme ile sferoidleri toplayın.
   NOT: Matris, 2-8 ° C'lik bir buzdolabında gece boyunca buz üzerinde çözülmelidir. İlk çözülmeden sonra, tekrarlanan donma-çözülme döngülerini önlemek için matrisin tek kullanımlık alikotları yapılır. Polipropilen veya diğer dondurucuya uyumlu tüpler -70 °C veya -20 °C'de kullanılır ve saklanır. Üretim tarihinden itibaren 2 yıl olan partinin/partinin son kullanma tarihine dikkat edin.
6. Sferoidleri mini biyoreaktörlere aktarın ve 6 mL Ortam B ekleyin. Mini biyoreaktörü, %5 CO₂ ve %100 nem ve 70-75 rpm çalkalama hızı ile 37 °C'ye ayarlanmış bir CO₂ inkübatörünün içindeki bir orbital çalkalayıcı üzerine yerleştirin (Şekil 1F).
7. Ortamı haftalık olarak veya asit-baz göstergesinin orta derecede tükenmesi veya renk değişiminin gerektirdiği şekilde değiştirin. Bunu yapmak için, sferoidlerin yerçekimi ile 15 mL'lik bir tüpe yerleşmesine izin verin ve ardından süpernatanı dikkatlice çıkarın. Tüpe taze Orta B ekleyin ve sferoidleri mini biyoreaktörlere geri aktarın.

Belirtilen protokol Şekil 1'de gösterilmiştir. Bu metodoloji, iPSC'lerin en az 1 aylık bir süre boyunca kondrosit sferoidlerine farklılaşmasını sağlamak için iki farklı kültür ortamı kullanır (Şekil 2). Farklılaşma süreci, iPSC'ler %75-%90 birleşme sağladığında başlatılır (Şekil 1B). Kondrojenik farklılaşmanın erken göstergeleri, kondrositlerin bir morfoloji özelliğini benimseyen hücreler tarafından işaretlenen A ortamında ekimin 9-10. günlerinde ortaya çıkar. 10. günde, hücreler ortam B'ye aktarılır (Şekil 1C) ve farklılaşma 19. güne kadar tamamlanana kadar kültürlenir (Şekil 3). Bu aşamada, hücrelerin% 99'u kondrojenik belirteçler için pozitifti - Aggrekan (ACAN), Kollajen tip I (COL1A2), kollajen tip II (COL2A1), SOX9 ve pluripotent hücre belirteçleri TRA-1-81 ve OCT4 ekspresyonu göstermedi. Anahtar kondrositik belirteçlerin yüksek düzeyde ekspresyonunun her durumda her zaman gözlenmediğine dikkat etmek önemlidir. En az %90-95 gen belirteç ekspresyonuna sahip kondrosferler yüksek kaliteli olarak kabul edilir; bu nedenle, örneğin iPSC farklılaşmasının 30. gününde sferoid örneklerinde ek gen ekspresyon analizi önerilir (Şekil 4 ve Şekil 5).

Şekil 2: 96 oyuklu bir plakanın kuyucuklarında küresel oluşum süreci. (A) Kondrositik sferoid oluşumunun ilk aşaması IPSRG4S (B) Düşük yapışkanlı, yerçekimi koşulları altında yetiştiriciliğin 2. gününde kondrositik IPSRG4S sferoid oluşturmuştur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Çeşitli kaynaklardan elde edilen kondrositlerin immünohistokimyasal analizi. (A-L) Farklılaşmanın başlangıcından itibaren 19. günde elde edilen iPSC'lerden kondrosit türevleri, anahtar kondrosit işaretleyici genlerinin benzer ekspresyon seviyelerini gösterir (ACAN, E; COL2A1, G; SOX9, H) pasaj 2'deki doğal kondrosit kültürleriyle karşılaştırıldığında (ACAN, A; COL2A1, C; SOX9, D). iPSC'lerin kültürü negatif bir kontrol görevi gördü (ACAN, I; COL1A1, J; COL2A1, K; SOX9, L). Tip I kollajen ekspresyonu, doğal kondrositler (COL1A1, B) ve iPSC'lerden türetilmiş kondrosit örnekleri (COL1A1, F) arasında da karşılaştırılabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Süreç daha sonra, sferoid üretimi için gerekli olan kondrosit benzeri iPSC türevlerinin optimal sayısını belirlemeye odaklandı (96 oyuklu plakadaki her bir oyuğun tek bir sferoid üretmek için 100.000 hücreye ihtiyaç duyduğu hesaplamasına dayanarak). Bu hazırlık aşamasının tamamlanması yaklaşık 1 hafta sürdü (Şekil 1D). Buna karşılık, doğal kondrositlerden sferoidler üretmek, doğrudan sferoid üretim adımına geçmeden önce yalnızca optimal sayıda kondrosit elde etmeyi içerir.

Sonraki aşamada, hücreler etilendiamintetraasetik asit (EDTA) içeren bir çözelti kullanılarak toplandı ve %1.5 agaroz ile önceden kaplanmış 96 oyuklu, U-dipli bir kültür plakasının her bir oyuğuna 100.000 hücre ekildi (Şekil 1E). Hücreler daha sonra sferoid oluşumunu teşvik etmek için 12 saat ila 48 saat boyunca B ortamında inkübe edildi. Her kuyu, hücrelerin tek bir sferoidde toplanmasını destekledi. Sferoidler oluştuktan sonra, taze çözülmüş hücre dışı matris ile kaplandılar ve ortam B içeren ev yapımı mini biyoreaktörlere aktarıldılar (Şekil 1F). Bu biyoreaktörler, 70-75 rpm'de dönen bir orbital çalkalayıcı üzerine yerleştirildi. Sferoidler, tüm örneklerde tek tip büyüme ve tutarlı morfogenez ile kondrosferlere olgunlaştı.

Kondrosferler sınırlı proliferatif potansiyele sahiptir, esas olarak ilk ay boyunca boyut olarak genişler ve bu büyümeyi yönlendiren hücre dışı matris proteinlerinin üretimi ile birlikte. 2 aylık ekimden sonra, ulaşılan maksimum çap 3-4 mm idi ve kondrosferler tipik olarak 1-2 mm'lik bir çap sergiliyordu (Şekil 4E,J).

Daha büyük organoidler, genellikle boşluklar veya nekrotik alanların eşlik ettiği gevşek bir merkezi bölge sergiledi. 1 aylık organoidler, agrekan, kollajen tip II ve SOX9 dahil olmak üzere kondrosit belirteçlerini eksprese etti (Şekil 4 ve Şekil 5). Yüksek kaliteli kondrosferlerin optimal yetiştirme süresi yaklaşık 1 aydı.

Şekil 4: Çeşitli kaynaklardan elde edilen kondrositlerden üretilen sferoidlerin immünohistokimyasal analizi. (A-J) ICC analizi, sferoidlerin mini biyoreaktörlerde kültürlendiği farklılaşmanın başlangıcından itibaren 30. günde gerçekleştirildi. Doğal kondrositlerden (ACAN, A; COL2A1, C) ve iPSC'lerden türetilen kondrositik sferoidler (ACAN, F; COL2A1, H) benzer seviyelerdedir. Bununla birlikte, iPSC'lerden (COL1A1, G, SOX9, I) türetilen sferoidler, doğal kondrositlere (COL1A1, B; SOX9, D), kollajen tip 1 ve SOX9'un daha yüksek ekspresyon seviyeleri ile karakterize edilir. Mini biyoreaktör yetiştiriciliği sırasında doğal kondrositlerden (E) türetilen sferoidlerin ve iPSC'lerden (J) türetilen kondrositik sferoidlerin morfolojisi de gösterilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: sferoidlerde anahtar kondrojenik belirteçlerin ekspresyon seviyelerinin qPCR analizi. Doğal kondrositlerden ve iPSC'lerin kondrositik türevlerinden üretilen kondrosferlerdeki kondrositik genlerin ekspresyon seviyesinin bu analizi, yukarıda sunulan sonuçları doğrulamaktadır. Grafikler, Tukey testi ile farklılıkların istatistiksel anlamlılığını göstermektedir - **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p ≤ 0.0001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

İPSC'lerin kondrositik soya farklılaşması sırasında, kondrosferlerin nihai kültürünün, hiyalin kıkırdağa kıyasla daha fazla elastikiyet ile karakterize edilen juvenil kıkırdağa daha benzer olduğuna dikkat etmek önemlidir. Bu, doğal kondrositlerden elde edilen sferoidlerle çelişir. Sferoid içinde, hiyalin ve fibröz dokuyu birleştiren karışık bir kondrosit fenotipinin varlığı bu farka katkıda bulunur.

Ek Tablo 1: Ortamın bileşimi. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

iPSC'ler, rejeneratif tıpta dönüştürücü bir araçtır ve kıkırdak onarımı için hastaya özgü kondrositler üretme potansiyeli sunar. Mevcut protokoller, kondrositik soy bağlılığını destekleyen TGF-β ve BMP-2 gibi anahtar sinyal molekülleri ile mezodermal yollar yoluyla yönlendirilmiş farklılaşmadan yararlanır. Bu yöntemler, fonksiyonel kıkırdak dokusu için gerekli olan kollajen tip II ve agrekan gibi hücre dışı matriks bileşenlerinin üretimini sağlayarak embriyonik kıkırdak gelişimini çoğaltmayı amaçlar. Pelet ve süspansiyon kültürleri de dahil olmak üzere 3D kültürleme tekniklerindeki gelişmeler, farklılaşmayı azaltırken stabil bir kondrositik fenotipi koruma yeteneğini geliştirmiştir^10,11.

Biyoreaktörler, diğer sistemlere kıyasla kondrosit sferoidlerinin yetiştirilmesi için birkaç önemli avantaj sağlar¹². Biyoreaktörler, in vivo koşulları taklit ederek 3D sferoidlerin büyümesini etkili bir şekilde kolaylaştırır. Kıkırdak dokusunun fonksiyonel özellikleri için gerekli olan uzamsal olarak dağılmış hücre-matris ve hücre-hücre etkileşimlerinin geliştirilmesini sağlarlar. Ayrıca biyoreaktörler, kondrosit farklılaşmasını ve hücre dışı matris üretimini sürdürmek için kritik olan oksijen transfer hızları, besin akışı ve kesme gerilimi gibi parametreler dahil olmak üzere kontrollü bir mikro ortam sağlayacak şekilde uyarlanabilir¹³.

Mini biyoreaktörler, ticari olarak temin edilebilen biyoreaktörlerden önemli ölçüde daha ekonomiktir. Hazır malzemeler ve daha basit montaj süreçleri kullanırlar, bu da onları klasik biyoreaktörler gibi sınırlı finansmana sahip laboratuvarlar için erişilebilir hale getirir. Mini biyoreaktörler, araştırmacıların farklı kültür ortamları, büyüme faktörleri veya farklılaşma protokolleri gibi birden fazla değişkeni aynı anda test etmesine olanak tanıyan küçük ölçekli, yüksek verimli çalışmalar için çok uygundur.

Ev yapımı mini biyoreaktörlerin kullanılması, her organoidin tutarlı bir ortama maruz kalmasını sağlayarak kalabalıklaşma veya istenmeyen yapışma risklerini azaltır. Hücrelerin kalitesi ve olgunlaşma aşaması protokol başarısı için gereklidir ve kondrojenik farklılaşma, iPSC'ler için %75-90'lık bir birleşme gerektirir¹⁴. Tohumlama yoğunluğu çok düşükse, kondrojenik olmayan hücre tiplerine iPSC farklılaşması meydana gelebilir. Farklılaşma sırasında, besin tükenmesi organoid kalitesini önemli ölçüde tehlikeye atabileceğinden, hücrelere ve sferoidlere düzenli olarak taze ortam temini önemlidir.

Protokolde bazı değişikliklere, prosedürün temel ilkelerini değiştirmedikleri sürece izin verilebilir. Floroplastik, polietilen veya polipropilen gibi inert malzemeler, mini biyoreaktörün merkezinde bir düğme oluşturmak için kullanılabilir. Sıvı plastiği hazırlamak için mikrobiyolojik bir Petri kabı kullanılıyorsa, elde edilen mini biyoreaktörleri kondrosit kültürüne uygunluklarını doğrulamak için sitotoksisite testine tabi tutun. Çeşitli çaplardaki petri kapları da mini biyoreaktör bazları olarak işlev görebilir; Bununla birlikte, optimum hızlar orta hacme bağlı olduğundan, dönüş hızı buna göre ayarlanmalıdır. Örneğin, 6 cm'lik bir Petri kabındaki 8 mL ortam için ideal dönüş hızı 70-75 rpm'dir.

iPSC'den türetilmiş kondrosit sferoidlerinde, doğal kondrositlerden oluşturulan sferoidlere kıyasla COL1A2 geninin ekspresyonu gözlenmiştir, bu da karışık fenotipe sahip hücrelerin varlığını göstermektedir (Şekil 5). Bu karışık gen ekspresyonu, hem hiyalin hem de fibröz kıkırdağın özelliklerini kapsayan hibrit bir doku yapısını önerir. Böyle bir yapı, doku direncini artırabileceği için avantajlı olabilir, ancak diğer çalışmalar serum bileşenlerinin tip I kollajen sentezini teşvik ederek fibrotik etkilere katkıda bulunabileceğini düşündürmektedir¹⁵.

Protokol, mini biyoreaktörlerde sferoidlerin bir ay süren olgunlaşması boyunca ortamın her 5-7 günde bir değiştirilmesini belirtir ve titiz steril uygulamaların kritik önemini vurgular. Mikoplazma kontaminasyonu riskini azaltmak için, profilaktik bir antimikrobiyal dozu dahil edilebilir. Ev yapımı mini biyoreaktörler, özellikle satın alınabilirlik, erişim kolaylığı ve kompakt tasarım açısından ticari alternatiflere göre belirgin avantajlar sunar. Kompakt yapıları, bir inkübatör içindeki tek bir orbital çalkalayıcı üzerinde birden fazla ünitenin uygun şekilde korunmasına izin verir. Buna karşılık, bir inkübatörde karşılaştırılabilir sayıda karıştırılmış mini biyoreaktörü barındırmak genellikle lojistik olarak zor olur.

Yazarlar, araştırmanın potansiyel bir çıkar çatışması olarak yorumlanabilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişkinin yokluğunda yapıldığını beyan ederler.

Araştırma, Rusya Bilim Vakfı tarafından #22-15-00250 nolu tahsisat ile desteklenmiştir.