Получение сфероидов из различных хондроцитов в условиях низкой адгезии под действием силы тяжести и самодельных мини-биореакторов

В данном исследовании описан метод получения хондроцитарных сфероидов путем агрегации клеток в сфероиды в условиях низкой адгезии с использованием силы тяжести с последующим культивированием полученных сфероидов в мини-биореакторах.

Восстановление хряща при хронических заболеваниях суставов требует передовой клеточной терапии для эффективной регенерации поврежденных тканей. Этот протокол представляет собой пошаговый метод дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) в сфероиды на основе хондроцитов, поддерживая применение тканевой инженерии и клеточной терапии. Процесс дифференцировки тщательно структурирован таким образом, чтобы способствовать приверженности хондрогенной линии, начиная с иПСК, культивируемых в определенных средах, которые последовательно направляют клетки через критические стадии дифференцировки. Первоначально ИПСК расширяют для достижения оптимального слияния перед индукцией к хондрогенной линии с использованием серии определенных изменений среды. К 10-му дню клетки переходят в среду, способствующую хондрогенезу, которая усиливает образование хондроцитоподобных клеток, экспрессирующих ключевые маркеры зрелых хондроцитов. Дальнейшая агрегация в 96-луночных пластинах, покрытых агарозой, приводит к образованию трехмерных сфероидов, которые затем культивируются в специализированных мини-биореакторах, предназначенных для моделирования микросреды, способствующей осаждению внеклеточного матрикса (ВКМ). Обеспечивая масштабируемое производство сфероидов хондроцитов, которые имитируют характеристики нативного хряща, этот подход предлагает многообещающее, воспроизводимое решение для разработки клеточных методов лечения дефектов хряща, обеспечивая широкую полезность для клинических и исследовательских применений в регенеративной медицине опорно-двигательного аппарата.

Распространенность заболеваний суставов приводит к значительному экономическому бремени из-за растущего числа нетрудоспособных пациентов и расходов, связанных с их лечением. Гиалиновый хрящ представляет собой соединительную аваскулярную ткань с ограниченным регенеративным потенциалом¹. Длительное использование некоторых нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВП), глюкокортикоидов, а также химиотерапии или лучевой терапии может еще больше снизить регенеративную способность хряща, практически уничтожая его способность к заживлению^. Это затрудняет получение аутологичных хрящевых клеток для клеточной терапии.

Технология трехмерного (3D) культивирования клеток, в том числе хондроцитов, уже давно признана новой областью исследований со значительным потенциалом. Эти 3D-структуры изучаются для применения как в фундаментальных биологических исследованиях, так и в регенеративной медицине. Сфероиды, полученные из аутологичных хондроцитов, являются терапевтическими перспективами для борьбы с дегенерацией хрящевой ткани, состоянием, которому в настоящее время уделяется^{значительное внимание во} всем мире.

Сфероиды, полученные из хондроцитов, дифференцированных от иПСК, представляют собой многообещающую альтернативу первичным хондроцитам, предлагая значительные преимущества для восстановления хряща. ИПСК обеспечивают практически безграничную способность к самообновлению и обладают широким потенциалом дифференцировки, что позволяет производить хондроциты в количествах, достаточных для клинического применения без инвазивных^{процедур сбора клеток}. Более того, переход от традиционных двумерных (2D) культур хондроцитов к 3D-системам культивирования, таким как хондросферы, еще больше повышает жизнеспособность и функциональность этих клеток за счет создания более физиологически значимой среды. Исследования показывают, что хондроциты, культивируемые в 3D-сфероидах, лучше сохраняют свой фенотип, демонстрируя более низкие темпы дедифференцировки и более высокие уровни экспрессии ключевых маркеров гиалинового хряща, таких как коллаген II типа и агрекан⁵.

Несмотря на потенциал хондросфер, полученных из iPSC, стандартизированные протоколы для генерации высококачественных хондросфер остаются ограниченными. Вариабельность протоколов в разных исследованиях часто приводит к несоответствиям в качестве хондроцитов и составе внеклеточного матрикса, что влияет на их эффективность для терапевтического использования⁶. Здесь представлен усовершенствованный протокол, который стандартизирует генерацию сфероидов из хондроцитов, полученных из iPSC, с использованием доступных, изготовленных по индивидуальному заказу мини-биореакторов. Фаза культивирования в мини-биореакторе имеет важное значение, так как она обеспечивает контролируемую настройку с низким уровнем адгезии, которая оптимизирует распределение питательных веществ, созревание ECM и уплотнение сфероидов⁷. Эта фаза способствует устойчивой экспрессии основных маркеров хондроцитов, включая коллаген II типа, аггрекан и SOX9, а также композицию ВКМ, которая очень похожа на нативный хрящ. Регулярная смена среды и тщательный контроль условий окружающей среды – температуры,_CO2 и скорости вращения – еще больше обеспечивают жизнеспособность и созревание сфероидов хондроцитов. Этот протокол был оптимизирован для создания высококачественных хондросфер с сильной экспрессией маркеров гиалинового хряща экономически эффективным и масштабируемым способом, пригодных для исследований и клинического применения в области восстановления хряща.

Исследование прошло рецензирование и одобрение Этического комитета ФНКЦ ПКМ «ФНК им. Н.И. Лопухина» (протокол No 2019/02 от 9 апреля 2019 года). Все донорские образцы были получены в соответствии с принципами Хельсинкской декларации. Информированное согласие было получено от всех участников и/или их законных опекунов.

ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте стерильную технику на протяжении всего протокола. Нагрейте все питательные среды и растворы до 37 °C перед нанесением на клетки или сфероиды. Культивируйте клетки в инкубаторе с_CO2 при температуре 37 °C, с 5%_CO2 при влажности 80%. Схема протокола представлена на рисунке 1.

Рисунок 1: Протокол получения хондросфер из линии IPSRG4S iPSC. (A) Первоначально iPSCs культивируют в средах плюрипотентных стволовых клеток до тех пор, пока не будет достигнуто 80% слияние. (В) Чтобы индуцировать дифференцировку в направлении хондроцитарной линии, иПСК затем культивируют в среде А в течение 2 дней. Затем среду заменяют композицией, в которой отсутствует Chir 99021 и ингибитор рокиназы, и клетки культивируют в течение дополнительных 6 дней со сменой среды каждые 2 дня. (C) Затем клетки переносят в среду B для стимулирования хондрогенеза в течение следующих 10 дней. (D) Как только достигнуто достаточное количество клеток, процесс переходит к стадии производства сфероидов. (E) Клетки агрегируются в сфероиды в условиях низкой адгезии под действием силы тяжести. (F) Полученные сфероиды культивируются в мини-биореакторах со средой B. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

1. Превращение чашек Петри в мини-биореакторы

ПРИМЕЧАНИЕ: Подробности в предыдущей статье⁵.

1. Разрежьте центрифужные пробирки на кольца высотой 7-8 мм с помощью стерильных автоклавных ножниц (настройки автоклава: 121 °C (250 °F) при 15 фунтах на квадратный дюйм, 30 мин и поставтоклавная сушка в течение 20 мин).
2. Измельчите чашки Петри с низкой адгезией, необработанные или микробиологические на мелкие кусочки. Растворите примерно 1 г частиц пластика в 10 мл хлороформа на ночь, чтобы получить жидкий пластиковый раствор. Проводят эту процедуру в вытяжном шкафу.
3. Убедитесь, что жидкий пластик достаточно вязкий для пипетирования. Следите за тем, чтобы капли сохраняли сферическую форму, а не растекались по поверхности. Если раствор слишком жидкий, добавьте еще пластиковых частиц, обычно требуется 1-3 г. Если он слишком густой, добавьте дополнительно хлороформ, обычно требуется до 5 мл.
4. Сформируйте пластиковую ручку в центре стерильной чашки Петри со сверхнизкой адгезией диаметром 60 мм, используя один из двух эффективных методов, описанных ниже.
   1. Вариант 1: Поместите автоклавное пластиковое кольцо в центр чашки Петри, затем нанесите жидкий пластик внутрь кольца; на одну каплю потребуется около 100-200 μL капель жидкого пластика.
   2. Вариант 2: Нанесите такое же количество капель жидкого пластика непосредственно в центр чашки Петри без использования пластикового кольца.
5. Дайте посуде высохнуть без крышки в течение 2-3 часов в вытяжке с ламинарным потоком. После высыхания подвергните посуду воздействию ультрафиолета на 20-30 минут.

2. Обработка посуды с культурой желатином

1. Приготовьте 0,1% раствор желатина, растворив порошкообразный желатин в дистиллированной воде при температуре 95 °C. Раствор последовательно пропустите через мембранные фильтры 0,45 мкм и 0,25 мкм, затем храните фильтрат при температуре 4 °C.
2. Непосредственно перед повторным посевом хондроцитов нанесите 3 мл раствора желатина на колбу 25 см² (рекомендуется до 15 г хрящевой ткани на колбу Т25). Инкубировать при комнатной температуре (RT) в течение 30 минут, удалить желатин, дважды промыть PBS и приступить к посеву клеток.

3. Выделение и культивирование хондроцитов

Хондроциты выделяются из хрящевых областей, не несущих вес, у пациентов, перенесших полную замену коленного сустава. Соберите все образцы в стерильных условиях и храните их в стерильных пробирках, заполненных DMEM, содержащим 200 Ед/мл раствора пенициллина/стрептомицина. Хранить хрящевую ткань в холодильнике при температуре 2-8 °C.

1. Начните ферментативную обработку в течение 2 дней после забора хрящей. Кусочки хрящей промыть в растворе Хэнкса с помощью 60 мм чашки Петри, затем разрезать хрящ на фрагменты диаметром примерно 1-2 мм с помощью автоклавных ножниц.
2. Переложите кусочки хряща в пробирки объемом 15 мл и расщепите их в 0,01% растворе коллагеназы типа II в DMEM, примерно 1 мл на 1 г хряща, в течение 8-12 ч в инкубаторе CO₂ , настроенном на 37 °C с 5% CO₂, 100% влажности, при непрерывном перемешивании на орбитальном шейкере при 150-200 об/мин.
3. После разложения промойте фрагменты хряща, добавив DMEM в пробирку объемом 15 мл, затем центрифугируйте при 300 × г в течение 10 минут. Ресуспендируйте фрагменты в питательной среде хондроцитов (дополнительная таблица 1) и высадите их на адгезивную колбу Т25, предварительно покрытую 0,1% раствором желатина.
4. Пассаж хондроцитов при достижении плотности слияния 80%.
   1. Для пассирования хондроциты промывают раствором Хэнкса, затем инкубируют клетки с 0,25% раствором трипсина при 37 °С в течение 5 мин.
   2. Чтобы инактивировать трипсин, добавьте равный объем DMEM + 10% FBS. Ресуспендируйте хондроциты в свежей питательной среде, затем распределите их в соотношении 1:3, высевая 20 000-30 000 клеток на 1 см² .
   3. Поместите колбу с культурой в инкубатор при температуре 37 °C с 5%_CO2 и 100% влажности.

4. Культивирование плюрипотентных стволовых клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: В сотрудничестве с Лабораторией стволовых клеток Группы молекулярных исследований мозга, Департамент нейробиологии, Институт А.И. Виртанена, Университет Восточной Финляндии, Куопио, Финляндия, в^{предыдущем исследовании была} успешно создана линия iPSCs IPSRG4S.

1. Культивируйте иПСК в 6-луночных планшетах, предварительно покрытых матрицей, содержащей внеклеточные белки ( рис. 1A). Используйте среду для плюрипотентных стволовых клеток (Дополнительная таблица 1).
2. Пассаж клеток на 80% конфлюенции, поддерживая соотношение 1:4 (50 000-75 000 клеток на 1 см² ). Примерно за 2-3 ч до отслойки перенесите иПСК в среду для плюрипотентных стволовых клеток, содержащих ингибитор рокиназы Y27632 в конечной концентрации 1 мкМ в течение 1 суток.
3. Промыть ИПСК раствором Хэнкса и инкубировать при 37 °C с 0,05% раствором трипсина. Чтобы инактивировать трипсин, добавьте равный объем DMEM + 10% FBS. Центрифугируйте клеточную суспензию при плотности 200 x g в течение 5 мин в пробирках объемом 15 мл.
4. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в свежей среде для плюрипотентных стволовых клеток. Для повышения жизнеспособности клеток добавляют в среду ингибитор рокиназы Y27632 в конечной концентрации 1 мкМ в течение 1 суток. Поместите планшет с культурой в инкубатор с_СО2 , установленный на 37 °C с 5%_СО2 и 100% влажности.

5. Хондрогенная дифференцировка ИПСК

1. Инициируйте дифференцировку в направлении хондроцитарной линии путем культивирования клеток в среде А (дополнительная таблица 1) в течение первых 2 дней. На 3-й день замените среду А раствором, который исключает Chir 99021 и ингибитор рокиназы, сохраняя при этом все остальные компоненты без изменений. Меняйте среду каждые 2 дня с 3 по 9 день (рисунок 1В).
2. На 10-й день перенесите хондроцитоподобные клетки в среду B (дополнительная таблица 1), разработанную для облегчения хондрогенеза. Меняйте носитель каждые 2 дня в течение 10 дней (рисунок 1С).
3. Заранее приготовьте 96-луночный планшет для культивирования клеточной суспензии, покрыв каждую лунку 1,5% агарозой в дистиллированной воде. Растопите агарозу в микроволновке до закипания (около 60-90 с при 700 Вт). После того, как агароза разжижается, добавьте по 75 мкл агарозы в каждую лунку и дайте ей застыть при RT (примерно 15 минут).
4. Добавьте 150 мкл среды DMEM в каждую лунку и инкубируйте планшет в инкубаторе с_CO2 в течение не менее 12 часов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовленные планшеты можно хранить до 1 месяца в инкубаторе с_CO2 при температуре 37 °C, если среду в каждой лунке пополнять для компенсации испарения.
5. На 12-е сутки, после наблюдения фенотипических изменений, связанных с хондрогенезом, инициируют формирование сфероидов с использованием сгенерированных хондроцитоподобных клеток.
   Примечание: На данном этапе целесообразно провести анализ экспрессии ключевых хондроцитарных маркеров с помощью иммуноцитохимии (ИКЦ) и количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР) методом ^{2-ΔΔCT 9} для подтверждения успешной хондрогенной дифференцировки иПСК. Во время переноса из 6-луночного планшета в колбу для клеточных культур размером 75^см2 небольшая часть клеток может быть засеяна в 48-луночный планшет, что соответствует количеству анализируемых маркеров. Проведите анализ ICC на этих образцах, чтобы проверить экспрессию генов.

6. Образование сфероидов из хондроцитоподобных клеток, полученных из iPSC

1. После получения хондроцитоподобных производных, клетки проходят при 80% конфлюенции. Отделите клетки от 6-луночных планшетов с помощью 0,05% раствора трипсина. Чтобы инактивировать трипсин, добавьте равный объем DMEM + 10% FBS, а затем перенесите клетки в пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при 200 x g в течение 5 минут.
2. Удалите надосадочную жидкость, повторно суспендируйте клетки в 1 мл среды B и переложите в колбу для клеточных культур размером 75 см² , предварительно покрытую 0,1% раствором желатина (рис. 1D). Как только клетки достигнут 80% конфлюенции в виде монослоя, снова отделите клетки трипсином и повторно суспендируйте в среде В, как описано.
3. Переведите ячейки в 96-луночный планшет, покрытый 1,5% агарозой, с плотностью 100 000 ячеек на лунку. Культивируйте в среде В, добавляя 150 мкл готовой среды на лунку (рис. 1D, 3A).
4. Поддерживайте клетки в 96-луночном планшете, покрытом 1,5% агарозой, в течение минимум 1 дня и максимум 3 дней до образования сфероидов (Рисунок 2B). Перенесите сфероиды из лунок с помощью наконечника пипетки объемом 1 мл с обрезанным концом, затем переложите в пробирку объемом 15 мл. Дайте сфероидам отстояться в течение 2-3 минут и удалите надосадочную жидкость.
5. Погрузите сфероиды в только что размороженный, неразбавленный матричный раствор базальной мембраны при температуре 4 °C. Через 30 мин соберите сфероиды путем пассивного осаждения в пробирке объемом 15 мл или путем щадящего центрифугирования при 100 x g в течение 1 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Матрикс следует разморозить на ночь на льду в холодильнике при температуре 2-8 °C. После первого оттаивания изготавливаются одноразовые аликвоты матрицы, чтобы избежать повторных циклов замораживания-оттаивания. Используются полипропиленовые или другие пробирки, совместимые с морозильными камерами, которые хранятся при температуре -70 °C или -20 °C. Следите за сроком годности партии/партии, который составляет 2 года с даты изготовления.
6. Перенесите сфероиды в мини-биореакторы и добавьте 6 мл среды B. Поместите мини-биореактор на орбитальный шейкер внутри инкубатора CO₂ , настроенного на 37 °C с 5% CO₂ и 100% влажностью и скоростью перемешивания 70-75 об/мин (рис. 1F).
7. Меняйте среду еженедельно или по мере необходимости при истощении среды или изменении цвета кислотно-основного индикатора. Для этого дают сфероидам осесть под действием силы тяжести в пробирке объемом 15 мл, а затем аккуратно удаляют надосадочную жидкость. Добавьте в пробирку свежую среду B и перенесите сфероиды обратно в мини-биореакторы.

Описанный протокол проиллюстрирован на рисунке 1. В данной методологии используются две различные питательные среды для дифференцировки иПСК в сфероиды хондроцитов в течение минимального периода времени в 1 месяц (рис. 2). Процесс дифференцировки инициируется, когда ИПСК достигают 75%-90% конфлюенции (Рисунок 1B). Ранние признаки хондрогенной дифференцировки проявляются примерно на 9-10-е сутки культивирования в среде А, что характеризуется тем, что клетки приобретают морфологию, характерную для хондроцитов. На 10-й день клетки переносят в среду B (рисунок 1C) и культивируют до тех пор, пока дифференцировка не будет завершена к 19-му дню (рисунок 3). На этом этапе 99% клеток были положительны на хондрогенные маркеры - Aggrecan (ACAN), Collagen type I (COL1A2), Collagen type II (COL2A1), SOX9 и не показали экспрессии плюрипотентных клеточных маркеров TRA-1-81 и OCT4. Стоит отметить, что высокий уровень экспрессии ключевых хондроцитарных маркеров не всегда наблюдается во всех случаях. Хондросферы с экспрессией генных маркеров не менее 90%-95% считаются высококачественными; поэтому рекомендуется провести дополнительный анализ экспрессии генов в образцах сфероидов, например, на 30-й день дифференцировки iPSC (рис. 4 и рис. 5).

Рисунок 2: Процесс формирования сфероидов в лунках 96-луночной пластины. (А) Начальная стадия формирования сфероида IPSRG4S хондроцитов; (B) Образуется IPSRG4S хондроцитарный сфероид на 2-й день культивирования в условиях низкой адгезии и силы тяжести. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Иммуногистохимический анализ хондроцитов, полученных из различных источников. (А-Л) Производные хондроцитов из иПСК, полученные на 19-й день от начала дифференцировки, демонстрируют сходные уровни экспрессии ключевых генов-маркеров хондроцитов (ACAN, E; COL2A1, G; SOX9, H) по сравнению с нативными культурами хондроцитов в пассаже 2 (ACAN, A; COL2A1, C; SOX9, D). Бактериологическое исследование ИПСК служило негативным контролем (ACAN, I; COL1A1, J; COL2A1, K; SOX9, L). Экспрессия коллагена I типа также сопоставима между образцами нативных хондроцитов (COL1A1, B) и хондроцитов, полученных из iPSCs (COL1A1, F). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Далее процесс был сосредоточен на определении оптимального количества хондроцитоподобных производных iPSC, необходимых для генерации сфероидов (на основе расчета, что для каждой лунки в 96-луночном планшете требуется 100 000 клеток для производства одного сфероида). Этот этап подготовки занял примерно 1 неделю (Рисунок 1D). В отличие от этого, генерация сфероидов из нативных хондроцитов включает в себя только получение оптимального количества хондроцитов, прежде чем непосредственно перейти к стадии производства сфероидов.

На последующем этапе клетки собирали с использованием раствора, содержащего этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА), и 100 000 клеток засеивали в каждую лунку 96-луночного U-образного планшета, предварительно покрытого 1,5% агарозой (рис. 1E). Затем клетки инкубировали в среде B в течение от 12 до 48 часов, чтобы способствовать образованию сфероидов. Каждая лунка поддерживала агрегацию клеток в единый сфероид. Как только сфероиды формировались, их покрывали свежеразмороженным внеклеточным матриксом и переносили в самодельные мини-биореакторы, содержащие среду B (рис. 1F). Эти биореакторы были размещены на орбитальном вибростенде, вращающемся со скоростью 70-75 оборотов в минуту. Сфероиды созрели в хондросферы с равномерным ростом и последовательным морфогенезом во всех образцах.

Хондросферы имеют ограниченный пролиферативный потенциал, в первую очередь увеличиваясь в размерах в течение первого месяца, причем производство белков внеклеточного матрикса стимулирует этот рост. После 2 месяцев выращивания максимальный достигнутый диаметр составлял 3-4 мм, при этом хондросферы обычно демонстрировали диаметр 1-2 мм (рис. 4E, J).

Более крупные органоиды демонстрировали рыхлую центральную зону, часто сопровождавшуюся полостями или некротическими областями. Органоиды, которые являются 1-месячной давностью, экспрессируют маркеры хондроцитов, включая аггрекан, коллаген II типа и SOX9 (Рисунок 4 и Рисунок 5). Оптимальная продолжительность выращивания высококачественных хондросфер составляла примерно 1 месяц.

Рисунок 4: Иммуногистохимический анализ сфероидов, полученных из хондроцитов различных источников. (А-Дж) Анализ ICC проводили на 30-е сутки от начала дифференцировки, когда сфероиды культивировали в мини-биореакторах. Экспрессия аггрекана и коллагена 2-го типа в сфероидах из нативных хондроцитов (ACAN, A; COL2A1, C) и хондроцитарных сфероидов, полученных из iPSCs (ACAN, F; COL2A1, H) находится на аналогичных уровнях. Тем не менее, сфероиды хондроцитарные сфероиды, полученные из iPSCs (COL1A1, G, SOX9, I), по сравнению с нативными хондроцитами (COL1A1, B; SOX9, D), характеризуются более высокими уровнями экспрессии коллагена 1-го типа и SOX9. Также показана морфология сфероидов, полученных из нативных хондроцитов (E), и хондроцитарных сфероидов, полученных из iPSCs (J) при культивировании в мини-биореакторе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5: Анализ количественной ПЦР уровней экспрессии ключевых хондрогенных маркеров в сфероидах. Проведенный анализ уровня экспрессии генов хондроцитов в хондросферах, полученных из нативных хондроцитов и хондроцитарных производных иПСК, подтверждает представленные выше результаты. На графиках указана статистическая значимость различий по критерию Тьюки - **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p ≤ 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Важно отметить, что при дифференцировке иПСК в хондроцитарную линию, конечная культура хондросфер больше похожа на ювенильный хрящ, характеризующийся большей эластичностью по сравнению с гиалиновым хрящом. Это контрастирует со сфероидами, полученными из нативных хондроцитов. Наличие смешанного фенотипа хондроцитов внутри сфероида, сочетающего гиалиновую и фиброзную ткань, способствует этому различию.

Дополнительная таблица 1: Состав сред. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

ИПСК представляют собой преобразующий инструмент в регенеративной медицине, предлагающий потенциал для создания специфических для пациента хондроцитов для восстановления хряща. Современные протоколы используют направленную дифференцировку через мезодермальные пути, при этом ключевые сигнальные молекулы, такие как TGF-β и BMP-2, способствуют приверженности хондроцитарной линии. Эти методы направлены на репликацию эмбрионального развития хряща, что позволяет производить компоненты внеклеточного матрикса, такие как коллаген II типа и аггрекан, необходимые для функциональной хрящевой ткани. Достижения в методах 3D-культивирования, включая пеллетные и суспензионные культуры, повысили способность поддерживать стабильный хондроцитарный фенотип при одновременном снижении дедифференцировки^10,11.

Биореакторы имеют несколько ключевых преимуществ для культивирования сфероидов хондроцитов по сравнению с другими системами¹². Биореакторы эффективно способствуют росту 3D-сфероидов, имитируя условия in vivo. Они позволяют развивать пространственно распределенные взаимодействия между клетками и клетками, которые имеют важное значение для функциональных свойств хрящевой ткани. Кроме того, биореакторы могут быть адаптированы для обеспечения контролируемой микросреды, включая такие параметры, как скорость переноса кислорода, поток питательных веществ и напряжение сдвига, которые имеют решающее значение для поддержания дифференцировки хондроцитов^{и производства} внеклеточного матрикса.

Мини-биореакторы значительно более доступны по цене, чем коммерчески доступные биореакторы. В них используются легкодоступные материалы и более простые процессы сборки, что делает их доступными для лабораторий с ограниченным финансированием, таких как классические биореакторы. Мини-биореакторы хорошо подходят для небольших исследований с высокой производительностью, которые позволяют исследователям одновременно тестировать несколько переменных, таких как различные питательные среды, факторы роста или протоколы дифференцировки.

Использование самодельных мини-биореакторов гарантирует, что каждый органоид подвергается воздействию постоянной среды, снижая риск скопления людей или нежелательной адгезии. Качество и стадия созревания клеток имеют важное значение для успеха протокола, при этом хондрогенная дифференцировка требует слияния 75%-90% для^{iPSCs 14}. Если плотность посева слишком низкая, может произойти дифференцировка иПСК в нехондрогенные типы клеток. Во время дифференцировки необходимо регулярное поступление свежей среды в клетки и сфероиды, так как истощение питательных веществ может значительно ухудшить качество органоидов.

Некоторые изменения в протоколе могут быть разрешены при условии, что они не изменяют фундаментальных принципов процедуры. Инертные материалы, такие как фторопласт, полиэтилен или полипропилен, могут быть использованы для создания ручки в центре мини-биореактора. Если для приготовления жидкого пластика используется микробиологическая чашка Петри, подвергните полученные мини-биореакторы тестированию на цитотоксичность, чтобы проверить их пригодность для культивирования хондроцитов. Чашки Петри различного диаметра также могут служить базами мини-биореакторов; Однако скорость вращения должна быть отрегулирована соответствующим образом, так как оптимальные скорости зависят от среднего объема. Например, для 8 мл среды в чашке Петри 6 см идеальная скорость вращения составляет 70-75 оборотов в минуту.

Повышенная экспрессия гена COL1A2 наблюдалась в сфероидах хондроцитов, полученных из iPSC, по сравнению со сфероидами, сформированными из нативных хондроцитов, что указывает на наличие клеток со смешанным фенотипом (рис. 5). Эта смешанная экспрессия генов предполагает гибридную тканевую структуру, охватывающую особенности как гиалинового, так и волокнистого хряща. Такая структура может быть полезной, так как она может повысить упругость тканей, хотя другие исследования показывают, что компоненты сыворотки могут способствовать синтезу коллагена I типа, способствуя^{фиброзным} эффектам.

Протокол предусматривает замену среды каждые 5-7 дней в течение месяца созревания сфероидов в мини-биореакторах, подчеркивая критическую важность строгой стерильной практики. Для снижения риска заражения микоплазмой может быть включена профилактическая доза противомикробных препаратов. Самодельные мини-биореакторы имеют явные преимущества по сравнению с коммерческими альтернативами, в частности, с точки зрения доступности, простоты доступа и компактной конструкции. Их компактность позволяет удобно обслуживать несколько блоков на одном орбитальном шейкере в инкубаторе. В отличие от этого, размещение сопоставимого количества мини-биореакторов с перемешиванием в инкубаторе часто оказывается сложной задачей с точки зрения логистики.

Авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского научного фонда #22-15-00250.