Antimikrobiyal Direncin Kapsamlı Değerlendirmesi için Atık Sudan Düşük Moleküler Ağırlıklı DNA'nın Gelişmiş Ekstraksiyonu

Burada, düşük moleküler ağırlıklı hücre dışı DNA oranını artırarak çevresel antimikrobiyal direnci (AMR) değerlendirmek için basit bir teknik sunuyoruz. % 20 -% 30 PEG ve 1.2 M NaCl ile önceki tedavi, hem genomik hem de yatay olarak transfer edilen AMR genlerinin saptanmasına izin verir. Protokol, ek optimizasyon ile kitsiz bir sürece uygundur.

Çevresel gözetim, pandemi sonrası dönemde halk sağlığını değerlendirmek için önemli bir araç olarak kabul edilmektedir. Su, özellikle atık su, çevredeki patojen yüklerini örneklemek için tercih edilen kaynak olarak ortaya çıkmıştır. Açık kanalizasyonlardan ve topluluk su arıtma tesislerinden gelen atık su, hem patojenlerin hem de antimikrobiyal direnç (AMR) genlerinin bir rezervuarıdır ve sıklıkla insanlarla temas eder. AMR'yi sudan izlemenin birçok yöntemi olsa da, heterojen numunelerden yüksek verimle iyi kaliteli DNA'yı izole etmek bir zorluk olmaya devam etmektedir. Telafi etmek için, numune hacimlerinin genellikle yüksek olması gerekir ve bu da pratik kısıtlamalar yaratır. Ek olarak, çevresel DNA sıklıkla parçalanır ve AMR kaynakları (plazmitler, fajlar, doğrusal DNA) düşük moleküler ağırlıklı DNA'dan oluşur. Yine de, az sayıda ekstraksiyon işlemi, doğrusal ve düşük moleküler ağırlıklı DNA'nın yüksek verimli ekstraksiyonu için yöntemlere odaklanmıştır. Burada, polietilen glikolün (PEG) çökeltme özelliklerini kullanarak küçük hacimli atık sudan yüksek verimli doğrusal DNA ekstraksiyonu için basit bir yöntem rapor edilmiştir. Bu çalışma, doğrusal DNA oranını zenginleştirerek metagenomik analizler için toplanan su örneklerinden elde edilen genel DNA verimini artırmak için bir durum ortaya koymaktadır. Ek olarak, düşük moleküler ağırlıklı DNA'nın iyileştirilmesi, yüksek moleküler ağırlıklı ve hücre içi DNA'ya odaklanma nedeniyle mevcut yetersiz örnekleme çevresel AMR sorununun üstesinden gelir. Bu yöntemin, hücre dışı DNA mevcut olduğunda, ancak arıtma tesislerinden gelen atık sular gibi düşük konsantrasyonlarda özellikle yararlı olması beklenmektedir. Ayrıca, yatay gen transferi yoluyla yayılan AMR gen parçalarının çevresel örneklemesini de geliştirmelidir.

SARS-CoV-2 ve sonrası, bulaşıcı hastalık salgınlarının izlenmesi ve tahmin edilmesinde çevresel sürveyansın öneminin altını çizdi ^1,2. Viral pandemiler belirgin olsa da, antimikrobiyal direncin (AMR) yükselişi genellikle sinsi bir pandemi olarak tanımlanır ve dünya çapında önde gelen bir halk sağlığı sorunu oluşturur ^3,4. Sonuç olarak, AMR'nin evrimini ve yayılmasını anlamak için koordineli stratejilere acil ihtiyaç vardır. Su kütleleri ve atık su, hem patojenler hem de AMR 5,6,7,8 için rezervuar görevi görebilir. Bu nedenle, paylaşılan su kaynakları, özellikle kötü hijyen ve aşırı nüfusun el ele gittiği düşük ve orta gelirli ülkelerde (LMIC) insanlar arasında güçlü bir hastalık bulaşma kaynağıdır ^9,10,11. Su kaynaklarının test edilmesi, toplum sağlığını değerlendirmek için uzun süredir kullanılmaktadır 12,13,14. Son zamanlarda, kentsel atık su arıtma tesislerinden gelen atık su,^klinik 1,2,15,16,17,18'deki COVID vakalarının iyi bir ön göstergesi olduğunu kanıtladı.

Belirli hastalıkların izlenmesiyle karşılaştırıldığında, ortamdaki AMR'nin tespit edilmesi ve izlenmesi daha karmaşık bir sorun teşkil eder. Kullanılan çok sayıda antibiyotik, çeşitli direnç genleri, farklı lokal seçim baskıları ve bakteriler arasında yatay gen transferi, gerçek AMR yükünü değerlendirmeyi ve bir kez değerlendirildikten sonra klinik gözlemlerle ilişkilendirmeyi zorlaştırmaktadır 19,20,21,22. Sonuç olarak, klinik AMR'nin uyumlu sürveyansı dünya çapında çeşitli kuruluşlar tarafından yürütülürken ^3,23,24, çevresel AMR izlemesi henüz emekleme aşamasındadır ve 19,25,26'da gözden geçirilmiştir.

Son yıllarda, çevresel AMR'nin izlenmesi için farklı yöntemler rapor edilmiştir ^5,27, 28,29'da gözden geçirilmiştir. Bunların çoğunun başlangıç noktası, heterojen çevresel örneklerden iyi kalitede DNA'nın çıkarılmasıdır ve bu başlı başına bir zorluktur. Ek olarak, çevresel DNA, düşmanca çevreye maruz kalma nedeniyle tipik olarak parçalanır. Parçalanmış hücre dışı DNA, uzun zamandır AMR genlerinin önemli bir rezervuarı olarak kabul edilmektedir (^30,31,32'de gözden geçirilmiştir) ve yatay gen transferi yoluyla bakterilere girme ve bakterilerden ayrılma potansiyeli eklenmiştir. Bu nedenle, ortamdaki AMR yükünü ölçmeyi amaçlayan herhangi bir protokolün, doğrusal ve düşük moleküler ağırlıklı DNA'yı mümkün olan en iyi şekilde örneklemesi önemlidir. Şaşırtıcı bir şekilde, doğrusal ve düşük moleküler ağırlıklı DNA'nın yüksek verimli ekstraksiyonuna özgü yöntemlerin geliştirilmesine çok az odaklanılmıştır: bu çalışma boşluğu ele almaya odaklanmaktadır.

DNA'yı çökeltmek için yaygın ve basit bir yöntem, polietilen glikol (PEG) ve sodyum klorür (NaCl)³³ gibi tuzları birleştirmektir. PEG, DNA fragmanlarının^34,35 boyuta özgü çökelmesini sağlamak için kullanılan makromoleküler bir kalabalıklaştırma ajanıdır. PEG konsantrasyonu ne kadar düşükse, verimli bir şekilde çökeltilebilen DNA'nın moleküler ağırlığı o kadar yüksek olur. Birçok çalışma, DNA ve RNA ^1,2'nin çevresel ekstraksiyonu sırasında (Tablo 1 17,33,36,37,38,39'da özetlenmiştir) ya son adım 33,36,37'de veya SARS-CoV-2 15,40'ta olduğu gibi viral partiküllerin ekstraksiyonu için büyük su örneklerini konsantre etmek için PEG kullanmıştır. Mevcut çalışmada, daha önce çevresel DNA ekstraksiyonları için kullanılan PEG konsantrasyonlarının (büyük ölçüde viral sürveyans protokolleri tarafından belirlenir) düşük moleküler ağırlıklı doğrusal DNA'yı yakalamadığı bulunmuştur. Bu nedenle, kısa DNA fragmanlarının örneklenmesini kaybederler ve AMR içeriğini doğru bir şekilde değerlendirmek için uygun değildirler. Bu çalışma, polietilen glikol ve sodyum klorürün özelliklerini, düşük moleküler ağırlıklı doğrusal DNA parçalarını, gelecekte uygun maliyetli bir DNA ekstraksiyon yöntemine yol açabilecek yüksek bir verimle etkili bir şekilde çökeltmek için kullanmıştır. Bu yöntem, karmaşık doğal örneklerden parçalanmış ve düşük moleküler ağırlıklı DNA oranını zenginleştirmek ve böylece çevresel AMR'nin daha doğru bir resmini yakalamak için kullanılabilir. Biraz daha ayrıntılandırma ile teknik, yerel belediye şirketleri ve diğer devlet kurumları tarafından minimum teknik eğitimle bir gözetim aracı olarak kullanılmak üzere kolay ve düşük maliyetli bir uygulamaya uygundur.

1. Atık su örneklemesi

1. 500 mL'lik bir polipropilen kabı açık drenaj veya kanalizasyon arıtma tesisi (STP) rezervuarına batırın ve ~300 mL atık su numunesi toplayın.
2. Numunenin ~ 250 mL'sini 250 mL'lik otoklavlanmış polipropilen şişeye aktarın.
3. Şişenin kapağını vidalayın ve plastik bir filmle kapatın. Şişeyi kapalı bir torbada dik tutun.
4. Numuneyi ortam sıcaklığında kapalı bir kapta dik olarak taşıyın.
5. Numuneyi, DNA ekstraksiyonu için işlemeden önce 70 °C'de sıcak hava fırınında 4 saat ısıtın.

2. Atık su örneklerinden DNA ekstraksiyonu

1. Atık su numunesi soğuduktan sonra, numuneleri maksimum hızda vorteksleyin ve döküntü/çamurun çökelmesine izin verin.
2. 27,5 mL atık suyu 50 mL'lik santrifüj tüplerine boşaltın ve üzerine 13,5 g PEG-8000 (son konsantrasyon %30) ve 3 g NaCl (son konsantrasyon 1,2 M) ekleyin ve tamamen eriyene kadar iyice karıştırın.
3. Numuneyi gece boyunca (~ 16-18 saat) 4 ° C'de inkübe edin.
4. Numuneyi 15.500 x g'da 4 °C'de 30 dakika santrifüjleyin.
5. Süpernatanı atın.
   NOT: %30'luk PEG-8000 oldukça viskozdur ve süpernatan atılırken pelet yerinden çıkabilir. Peletin kaybolmamasını sağlamak için süpernatant yavaş ve dikkatli bir şekilde boşaltılmalıdır. 2.6 ila 2.23 arasındaki adımlar, birkaç değişiklikle kit talimatlarına göre Toprak DNA ekstraksiyon kiti kullanılarak gerçekleştirilir.
6. Pelet, kitin lizis çözeltisinin 800 μL'sinde çözün ve çözeltiyi karışık zirkonyum boncuk tüpüne ekleyin.
   NOT: Daha büyük hacimlerde işlem yapıyorsanız, peletleri istenen sayıda tüpten toplayın. Örneğin, 160 mL numune işleniyorsa; PEG ve NaCl içeren atık su içeren dört adet 50 mL'lik tüp olacaktır. Dört tüpün tümünün 30 dakika boyunca 4 ° C'de 15.500 x g'da santrifüjlenmesinden sonra, dört tüpün hepsinden süpernatanı atın. Her birine 200 μL CD1 çözeltisi ekleyin, peletleri yeniden süspanse edin ve bunları bir boncuk tüpünde bir araya getirin.
7. Boncuk tüpünü bir girdap üzerine yatay olarak sabitleyin. Tüpü 20-30 dakika maksimum hızda vorteksleyin.
   NOT: Uzun süreli girdaplama, numunelerin tamamen parçalanmasını ve homojenizasyonunu sağlar, bu da DNA verimini artırır.
8. Boncukları dibe oturtmak, köpürmeyi gidermek ve süpernatanı tüpten tamamen 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için tüpleri 15 saniye boyunca 8.000 x g'da döndürün. Bu adım sırasında bazı boncuklar da aktarılabilir.
9. Süpernatanı 1 dakika boyunca 15.000 x g'da santrifüjleyin.
10. Süpernatanı temiz bir 2 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Süpernatan hala bazı asılı parçacıklar içerebilir.
11. 200 μL çökeltici çözelti ekleyin ve 5 saniye boyunca maksimum hızda girdaplayın. 4 °C'de 5 dakika inkübe edin.
    NOT: 4 ° C'de inkübasyon, DNA çözelti içinde kalırken proteinlerin ve hücresel kalıntıların çökelme verimliliğini arttırır. Ekstrakte edilen DNA'nın veriminde ve kalitesinde önemli bir azalma olmadan bu adımda protokolü 2 saate kadar duraklatmak mümkündür.
12. Oda sıcaklığında (RT) 1 dakika boyunca 15.000 x g'da santrifüjleyin. Peletten kaçının ve berrak süpernatanı temiz bir 2 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
13. 700 μL süpernatan başına 600 μL bağlayıcı tampon ekleyin ve 5 saniye boyunca maksimum hızda girdap yapın.
14. 700 μL lizatı bir silika spin kolonuna yükleyin, 2 dakika inkübe edin ve 1 dakika boyunca 15.000 x g'da santrifüjleyin.
    NOT: Lizatın silika kolon üzerinde inkübe edilmesi, DNA'nın kolona bağlanmasını artırarak daha iyi DNA verimi sağlar.
15. Akışı atın ve tüm lizat döndürme kolonundan geçene kadar adım 2.14'ü tekrarlayın.
16. Döndürme kolonunu dikkatlice 2 mL'lik temiz bir toplama tüpüne yerleştirin. Döndürme kolonuna herhangi bir akış sıçramadığından emin olun.
17. Sıkma kolonuna 500 μL yıkama tamponu ekleyin ve sıkma kolonunu 1 dakika boyunca 15.000 x g'da santrifüjleyin.
18. Akışı atın ve sıkma kolonunu aynı 2 mL toplama tüpüne geri koyun.
19. Döndürme kolonuna 500 μL etanol yıkama tamponu ekleyin. 1 dakika boyunca 15.000 x g'da santrifüjleyin.
20. Akışı atın ve döndürme kolonunu 2 mL'lik yeni bir toplama tüpüne yerleştirin.
21. Artık etanolü çıkarmak için 16.000 x g'da 2 dakika santrifüjleyin. Döndürme kolonunu 1,5 mL'lik yeni bir tüpe yerleştirin.
22. Beyaz filtre membranının ortasına 100 μL elüsyon tamponu (önceden 55 °C'ye ısıtılmış) ekleyin ve 5 dakika inkübe edin.
    NOT: Isıtılmış elüsyon tamponu, zar üzerinde inkübasyon ile birlikte, DNA elüsyonunun, özellikle yüksek moleküler ağırlıklı DNA'nın verimliliğini arttırır.
23. 1 dakika boyunca 15.000 x g'da santrifüjleyin. Döndürme sütununu atın.
24. Ayrıştırılmış DNA'ya 10 μL 3 M NaCl (1/10 hacim DNA elüat) ve 250 μL soğutulmuş mutlak etanol (2.5 hacim DNA elüat) ekleyin. İyice karıştırmak için ters çevirin ve içeriği 15 saniye boyunca 8.000 x g'da döndürün.
25. DNA-etanol karışımını -20 °C'de en az 1 saat inkübe edin.
    NOT: DNA-etanol karışımının inkübasyonu, ekstrakte edilen DNA'nın veriminde veya kalitesinde önemli bir azalma olmaksızın 16 saate çıkarılabilir.
26. 19.000 x g'da 4 °C'de 30 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı dekantasyon ile atın.
27. Pelete 500 μL soğutulmuş %70 etanol ekleyin.
28. 15 dakika boyunca 4 ° C'de 19.000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı dekantasyon ile atın.
29. Kılcal hareketle kalan etanolü çıkarmak için tüpü kağıt mendil üzerine ters çevirin ve hafifçe vurun.
30. Tüpleri bir ısıtma bloğunda 37 ° C'de 5-10 dakika boyunca tüm etanol buharlaşana kadar açık tutarak DNA peletini tamamen kurutun.
31. DNA peletini 30-50 μL otoklavlanmış çift damıtılmış su (_ddH2O) içinde yeniden süspanse edin. 37 °C'de 5-10 dakika inkübe edin.
32. DNA'yı 15 saniye boyunca 8.000 x g'da döndürün.
33. Bir Nanodrop spektrofotometresinde Nükleik Asitler ayarları altında dsDNA uygulamasını seçin.
    1. Kaideyi tüy bırakmayan kağıt mendil ve suyla temizleyin. Cihazı boşaltmakiçin ddH 2O'yu kullanın ve ardından kaide üzerine 2 μL DNA örneği yükleyin.
    2. Saflığı belirlemek için konsantrasyon ve absorbans oranlarını (A260/280 ve A260/230) ölçün.
34. DNA örneğini -20 °C'de saklayın.

3. Bir dizi moleküler ağırlıkta DNA geri kazanımını kontrol etmek için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile amplifiye edilmiş doğrusal DNA'nın çökeltilmesi

1. E. coli MG155'ten genomik DNA kullanarak, aşağıdaki genlerden bir doğrusal parça havuzu oluşturmak için gen parçalarını PCR ile çoğaltın: fusA, lacZ, gapA, rpsD, 16S rRNA, marR (primer dizileri ve PCR koşulları için Tablo 2'ye bakınız).
2. PCR saflaştırma kitini kullanarak PCR ürünlerini saflaştırın ve PCR ürünlerini bir araya getirin.
3. Havuzlanmış amplikonları eşit hacimlerde 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine bölün - bir tüpü 'Giriş DNA'sı' olarak etiketleyin.
4. İstenilen koşullara göre (%9, %20, %30 PEG-8000; 0.3 M, 1.2 M NaCl) 'Input DNA' etiketli olan hariç tüplerin her birine PEG ve NaCl ekleyin ve son hacmi 1 mL'ye tamamlayın.
5. Tüpleri gece boyunca (~ 16-18 saat) 4 ° C'de inkübe edin.
   NOT: 3.16'ya kadar olan adımların geri kalanı için 'Giriş DNA'sı' buzdolabında değişmeden saklanır.
6. Tüpleri 4 ° C'de 1 saat boyunca istenen hıza (15.000 x g veya 20.000 x g) göre masa üstü bir mikrosantrifüjde döndürün.
7. Bir mikropipet kullanarak peletin karşı tarafından 900 μL süpernatanı dikkatlice çıkarın.
8. İlk etanol yıkama: Peletlere 900 μL soğutulmuş %70 etanol ekleyin ve tüpleri hafifçe ters çevirerek karıştırın.
9. Tüpleri adım 3.6'da (15.000 x g veya 20.000 x g) kullanılanla aynı hızda 4 °C'de 30 dakika boyunca döndürün.
10. Süpernatanı dekantasyon ile çıkarın.
11. İkinci etanol yıkama: Pelete 500 μL soğutulmuş %70 etanol ekleyin.
12. Tüpleri 3.6 ° C'de 30 dakika boyunca (15.000 x g veya 20.000 x g) kullanılanla aynı hızda döndürün. Süpernatanı dekantasyon ile atın.
13. Kılcal hareketle kalan etanolü çıkarmak için tüpü kağıt mendil üzerine ters çevirin ve hafifçe vurun.
14. Tüm etanol buharlaşana kadar tüpleri bir ısıtma bloğunda 37 ° C'de 5-10 dakika açık tutarak DNA peletini tamamen kurutun.
15. Peleti 20 μL otoklavlanmış çift damıtılmış suda tekrar süspanse edin.
16. Bir Nanodrop spektrofotometresi veya florometre kullanarak farklı koşullar tarafından çökeltilen DNA konsantrasyonunu ve 'Giriş DNA'sını' ölçün.
17. DNA görselleştirmesi için çökeltilmiş DNA'yı %1'lik bir agaroz jel üzerine yükleyin.

Atık su örneklerinden DNA'nın yüksek verimli ekstraksiyonu için bir protokolün oluşturulması
Su örneklerinden yüksek kaliteli DNA ve RNA'nın çıkarılması için önceden belirlenmiş protokollerin değiştirilmiş bir versiyonu kullanıldı¹⁷. Numuneler, Kuzey Hindistan'ın Delhi-NCR bölgesindeki açık kanalizasyonlardan ve atık su arıtma tesislerinden elde edildi. PEG ve NaCl (Şekil 1) kullanılarak ön işlemden sonra, numuneler DNA'nın topraktan ve sudan ekstraksiyonu için kitler aracılığıyla işlendi. Tüm vakalarda, muhtemelen hücre içi bakteri DNA'sına karşılık gelen belirgin bir yüksek moleküler ağırlıklı bant ve çevresel örneklerde³⁷ tipik olduğu gibi bir arka plan yayması ^{gözlenmiştir (}Şekil 2).

Atık su arıtma tesisi (STP) atık suyundan verimli DNA ekstraksiyonu eksikliği
Açık kanalizasyonlardan ve STP influentlerinden makul bir toplam DNA verimi elde edilmesine rağmen (Tablo 3), nihai arıtılmış atık sudan DNA elde edilemedi; düşük verim ile ilgili problemler önceki çalışmalarda da^{açıklanmıştır 41} (Şekil 3). Atık suyun klorlanmasını ve bazı durumlarda hem UV hem de ultrafiltrasyon işlemlerini⁴² içeren arıtma sonrası, mikrobiyal yükün düşük olması ve herhangi bir kalıntı DNA'nın (hücre dışı ve parçalanmış DNA'dan oluşan) seyreltilmesi beklenir. Numune konsantrasyonunda ve nükleik asit çökeltmesinde kullanılan başlangıçtaki düşük PEG konsantrasyonu, muhtemelen düşük moleküler ağırlıklı DNA'yı dışlayabilir. Başka bir deyişle, parçalanmış DNA ilk konsantrasyon adımında kaybolabilir.

Artan PEG ve NaCl konsantrasyonları, daha düşük moleküler ağırlıklı DNA'nın çökelmesine yol açar
Artan PEG konsantrasyonunun düşük moleküler ağırlıklı DNA'yı zenginleştirmeye yardımcı olup olmadığını test etmek için, bir dizi doğrusal DNA parçası oluşturulan, farklı uzunluklarda PCR fragmanlarından oluşan bir laboratuvar standardı oluşturuldu (Şekil 4). Standart, dört farklı yağış koşuluna tabi tutuldu - %9 PEG-8000 + 0.3 M NaCl (orijinal kombinasyon), %9 PEG-8000 + 1.2 M NaCl (sadece tuzu yükselterek), %30 PEG-8000 + 0.3 M NaCl (sadece PEG'i yükselterek) ve %30 PEG-8000 + 1.2 M NaCl (hem tuzu hem de PEG'yi yükselterek). Koşullar, SARS-CoV-2 sürveyansı¹⁷ için kullanılan standart protokole ve çevresel örneklerden³³ modüler DNA ekstraksiyonu yöntemlerine ilişkin bir çalışmada bildirilen koşullara göre seçildi. İki farklı santrifüjleme hızı - 15.000 x g ve 20.000 x g - diferansiyel hızların DNA peletleme⁴³ üzerindeki etkilerine bağlı olarak kullanıldı. PEG ve NaCl konsantrasyonları sırasıyla %30 ve 1.2 M'ye yükseltildiğinde, DNA'nın toplam geri kazanımı yaklaşık %70 oranında artmış ve 150 baz çifti (bp) kadar küçük DNA fragmanları etkili bir şekilde çökelmiştir (Şekil 5). Hızdaki farkın verim üzerinde fazla bir etkisi olmadı (Şekil 6A) ve kullanılan uzun santrifüjleme süresinden kaynaklanıyor olabilir. Orijinal PEG / NaCl kombinasyonunda toplam DNA geri kazanımı daha düşük olduğundan, daha düşük moleküler ağırlık bantlarının, mevcut olmasına rağmen, görselleştirme sınırının altında bir konsantrasyonda olması mümkündü. Bunu test etmek için, çökeltme için giriş DNA'sı miktarı arttırıldı ve görselleştirme için agaroz jel üzerine her tedaviye karşılık gelen fazla DNA (1.5 mg) yüklendi. Sadece %30 PEG ile yapılan tedavi, en düşük moleküler ağırlığın, yani 150 bp bandının iyi bir şekilde geri kazanıldığını gösterdi (Şekil 6B).

Dairesel DNA'nın (bakteri genomik ve plazmit DNA) çökelmesi aynı eğilimi takip etmez
E. coli MG155 genomik DNA ve plazmid (pRSV, ~4 kb) farklı PEG ve NaCl konsantrasyonları ile çökeltme için kullanıldı. Doğrusal DNA'dan farklı olarak, PEG ve NaCl seviyelerini yükseltmenin önemli bir etkisi yoktu (Şekil 7), bu da dairesel ve yüksek moleküler ağırlıklı DNA'nın (tipik olarak hücre içi DNA) verimlerinin PEG'in yükselmesinden etkilenmediğini düşündürmektedir. Bu, çözünürlüğün PEG konsantrasyonu ile dik bir şekilde azaldığı protein çökeltmesi⁴⁴ ile yapılan önceki gözlemlerin aksine. PEG'nin bir kalabalıklaştırıcı ajan olarak hareket ettiği göz önüne alındığında, etkileşim için mevcut olan makromolekülün yüzey alanının, bir çökeltici ajan olarak etkinliğinde önemli bir rol oynadığı varsayılmaktadır. Doğrusal DNA ile, boyut arttıkça, etkileşim için mevcut alanın da arttığını varsaymak mantıklıdır. Dairesel DNA ile, düşük PEG konsantrasyonlarının molekülü doyurmak için zaten yeterli olması mümkündür ve konsantrasyonun daha da yükseltilmesi, etkileşim için etkili yüzey alanını artırmayabilir.

PEG ve NaCl ile ön işleme tabi çökeltme ihmal edildiğinde atık sudan düşük DNA verimi
Ön işleme atık suyunun DNA ekstraksiyonu için çok önemli olup olmadığını test etmek için, 20 mL ısıyla inaktive edilmiş (70 °C, 4 saat) atık su, 10 mg önceden hazırlanmış doğrusal standart ile çivilendirildi ve gece boyunca 4 °C'de inkübe edildi (a) PEG + NaCl olmadan, (b) %9 PEG + 0.3 M NaCl (orijinal kombinasyon) ile ve (c) %20 PEG + 1.2 M NaCl (artan PEG ve tuz). Numuneler daha sonra protokolde açıklandığı gibi DNA ekstraksiyonu için toprak kitinden geçirildi. Ekstrakte edilen DNA'nın veriminin, %9 PEG + 0,3 M NaCl içeren ön işleme atık su numunelerinde, hiçbir ön işlem adımı olmamasına kıyasla %60 oranında arttığı bulunmuştur (Şekil 8), bu da PEG ve NaCl çökeltmesinin ön işlemesinin atık su örneklerinden yüksek verimli DNA elde etmek için hayati önem taşıdığını göstermektedir. Ayrıca, yüksek moleküler ağırlıklı genomik DNA (gDNA) dahil olmak üzere genel DNA veriminin, çökeltme için yüksek PEG ve tuz kullanıldığında daha düşük olmasına rağmen, daha düşük moleküler ağırlıklı DNA oranının zenginleştirildiği de dikkat çekicidir (Şekil 8). PEG ve tuzun yükseltilmesindeki toplam verimdeki düşüş, PEG'in yüksek viskoziteli doğasına bağlanabilir, bu da süpernatanı uzaklaştırırken DNA peletinin kaybına yol açabilir. Bu, önerilen aşamalı DNA ekstraksiyon yöntemi (Şekil 9) için durumu güçlendirir, burada yüksek moleküler ağırlıklı DNA ilk olarak düşük PEG ve NaCl çökeltmesi kullanılarak ekstrakte edilebilir ve elde edilen süpernatant, ilk yağış turundan kaçan düşük moleküler ağırlıklı DNA'yı verimli bir şekilde çıkarmak için artan PEG ve NaCl ile başka bir ön işleme turuna tabi tutulabilir.

Şekil 1: Atık su numunelerinin ön işlenmesi. Numune alımından DNA ekstraksiyonuna kadar iş akışını gösteren şematik. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Atık su örneklerinden ekstrakte edilen DNA'nın tipik jel profili. Farklı bölgelerden numune alınan 50-100 mL atık su hacmi (şekilde gösterildiği gibi), 4 saat boyunca 70 ° C'de inkübasyon ile ısıyla inaktive edildi. Daha sonra gece boyunca 4 ° C'de% 9 PEG ve 0.3 M NaCl ile inkübe edildi ve daha sonra toprak veya bir su kiti kullanılarak DNA'yı çıkarmak için işlendi. Ekstrakte edilen yaklaşık 150 ng toplam DNA, bir markör olarak 1 kilo-baz çifti (kb) merdiveni ile birlikte% 1'lik bir agaroz jel üzerine yüklendi ve elektroforeze tabi tutuldu (90 V, 30 dk). DNA, SYBR SAFE boyası kullanılarak ultraviyole (UV) ışık altında görüntülendi. Sağdaki tablo, numune toplama kaynaklarını, işlenen atık su hacmini ve her şerit için DNA ekstraksiyonu için kullanılan kiti detaylandırır. (STP: Atık Su Arıtma Tesisi; UVR: Ultraviyole Radyasyon) Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: STP atık su numuneleri, düşük toplam DNA verimini göstermektedir. STP giriş ve çıkış suyundan numune alınan 40 mL atık su hacmi, 4 saat boyunca 70 ° C'de inkübasyon ile ısıyla inaktive edildi. Daha sonra gece boyunca 4 ° C'de% 9 PEG ve 0.3 M NaCl ile inkübe edildi ve daha sonra bir toprak veya su kiti veya bir bakteriyel genomik DNA ekstraksiyon kiti kullanılarak DNA'yı çıkarmak için işlendi. Ekstrakte edilen yaklaşık 150 ng toplam DNA, markör olarak 1 kb merdiven ile birlikte %1'lik bir agaroz jel üzerine yüklendi ve elektroforeze tabi tutuldu (90 V, 30 dk). DNA, SYBR SAFE boyası kullanılarak ultraviyole (UV) ışık altında görüntülendi. Atık su numuneleri için ekstrakte edilen DNA konsantrasyonu 1 ng/mL atık suyun altındaydı ve bu nedenle görselleştirilemedi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Düşük moleküler ağırlıklı DNA çökelmesinin etkinliğini test etmek için doğrusal bir DNA boyutu standardının oluşturulması. Tablo 2'de açıklandığı gibi şablon olarak E. coli (MG1655) genomik DNA ve primerler ve koşullar kullanılarak PCR amplifikasyonu ile beş farklı boyutta DNA fragmanı oluşturuldu. PCR saflaştırma kiti ile saflaştırılan DNA (~1 μg), markör olarak 1 kb merdiven ile birlikte %1'lik agaroz jel üzerine yüklendi ve elektroforeze (90 V, 40 dk) tabi tutuldu. DNA, SYBR SAFE boyası kullanılarak ultraviyole (UV) ışık altında görüntülendi. Şeritler, parçanın amplifiye edildiği gen isimleri ve beklenen amplikon boyutu ile etiketlenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Düşük moleküler ağırlıklı DNA, yalnızca en yüksek (%30) PEG konsantrasyonunda verimli bir şekilde geri kazanılır. Daha önce oluşturulan boyut standardından giriş DNA'sı (3.34 μg), şekilde belirtildiği gibi farklı PEG ve NaCl kombinasyonları ile muamele edildi ve protokolde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi ekstrakte edildi. Kullanılan santrifüj hızı 15.000 x g idi. Giriş (şerit 3) ve 1.2 M NaCl +% 30 PEG (şerit 7) için jel üzerine 0.8 μg DNA yüklendi. Geri kalanı için ise toplam verim düşük olduğu için 16 μL'de ekstrakte edilen toplam DNA miktarı yüklenmiş ve %1'lik agaroz jel üzerine boyut markörü olarak 1 kb'lık merdiven yüklenerek elektroforeze (80 V, 45 dk) tabi tutulmuştur. DNA, SYBR SAFE boyası kullanılarak ultraviyole (UV) ışık altında görüntülendi. Beyaz kutu, 150 bp'lik en düşük bandı vurgular. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Düşük moleküler ağırlıklı DNA'nın geri kazanımı, yüksek tuz konsantrasyonları yerine yüksek PEG ile belirlenir. (A) Boyut standardından giriş DNA'sı (14 μg), şekilde gösterildiği gibi farklı PEG ve NaCl kombinasyonları ile muamele edildi ve protokolde detaylandırıldığı gibi etanol çökeltme kullanılarak ekstrakte edildi. Kullanılan santrifüj hızı, şekilde gösterildiği gibi 15.000 x g ve 20.000 x g idi. Giriş DNA'sının tamamı ve ekstrakte edilen DNA, 1 kb merdiven ile birlikte,% 1'lik bir agaroz jel üzerine yüklendi ve elektroforeze tabi tutuldu (90 V, 30 dk). DNA, SYBR SAFE boyası kullanılarak ultraviyole (UV) ışık altında görüntülendi. (B) Daha önce oluşturulan boyut standardından giriş DNA'sı (15.67 μg), şekilde belirtildiği gibi farklı PEG ve NaCl kombinasyonları ile muamele edildi ve protokolde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi ekstrakte edildi. Kullanılan santrifüj hızı 15.000 x g idi. Ekstrakte edilen DNA (1.5 μg) her bir şeride yüklendi ve 1 kb'lık merdiven %1'lik agaroz jel üzerine boyut markörü olarak yüklendi ve elektroforeze (80 V, 45 dk) tabi tutuldu. DNA, SYBR SAFE boyası kullanılarak ultraviyole (UV) ışık altında görüntülendi. Beyaz kutu, 150 bp'lik en düşük bandı vurgular. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Genomik DNA ve plazmit DNA'nın geri kazanımı, artan PEG ve NaCl konsantrasyonundan önemli ölçüde etkilenmez. Giriş DNA'sı (9 μg; 4.5 μg plazmit ve 4.5 μg genomik DNA), şekilde gösterildiği gibi farklı PEG ve NaCl kombinasyonları ile muamele edildi ve protokolde detaylandırıldığı gibi ekstrakte edildi. Kullanılan santrifüj hızı 15.000 x g idi. Giriş DNA'sının tamamı ve ekstrakte edilen DNA, 1 kb merdiven ile birlikte,% 1'lik bir agaroz jel üzerine yüklendi ve elektroforeze tabi tutuldu (90 V, 45 dk). DNA, SYBR SAFE boyası kullanılarak ultraviyole (UV) ışık altında görüntülendi. Beyaz kutular genomik DNA ve plazmit DNA'yı gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 8: PEG ve NaCl ile ön işleme çökeltmesi, atık sudan DNA'nın yüksek verimli ekstraksiyonu için çok önemlidir. Isıyla inaktive edilmiş (70 ° C, 4 saat) atık su (20 mL), 10 mg önceden hazırlanmış doğrusal standart ile çivilendi ve şekilde gösterildiği gibi PEG ve NaCl veya değişen PEG ve NaCl konsantrasyonları olmadan 4 ° C'de gece boyunca inkübe edildi. Daha sonra bir toprak kiti kullanılarak DNA'yı çıkarmak için işlendi. Spiking için kullanılan giriş DNA'sı (4 μg) (şerit 1) ve %9 PEG + 0.3 M NaCl (şerit 3) ön işlem adımı ile ekstrakte edilen DNA (4 μg) %1'lik bir agaroz jel üzerine yüklendi. Koşulların geri kalanı için, verim düşük olduğu için ekstrakte edilen DNA miktarının tamamı jel üzerine yüklendi. Boyut işaretleyici olarak 1 kb'lık bir merdiven de yüklendi. Jel elektroforeze (70 V, 2 saat) tabi tutuldu. DNA, SYBR SAFE boyası kullanılarak ultraviyole (UV) ışık altında görüntülendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 9: Hem yüksek hem de düşük moleküler ağırlıklı DNA'yı zenginleştirmek için atık sudan DNA ekstraksiyonu için önerilen adım adım yöntem. Düşük PEG ve NaCl konsantrasyonu kullanan bir ilk ön işleme adımı ile atık sudan iki aşamalı bir DNA ekstraksiyonu yöntemini gösteren akış şeması. İlk adımdan itibaren süpernatant, atık sudan hem yüksek hem de düşük moleküler ağırlıklı DNA'yı etkili bir şekilde çıkarmak için artan PEG ve NaCl ile başka bir ön işleme çökeltme turuna tabi tutulur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1. Çevresel örneklerden DNA ekstraksiyonu çalışmalarında PEG ve NaCl'nin önceden kullanılması. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 2. Standart üretim için primer dizileri ve PCR koşulları. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 3. 2023 yılında iki aylık bir süre içinde atık su örneklerinden elde edilen DNA verimi ve kalitesi. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

AMR, Dünya Sağlık Örgütü tarafından listelendiği üzere günümüzde en önemli 10 sağlık tehdidinden biridir ve AMR için çevresel gözetim dünya çapında önemli bir araç olarak kabul edilmektedir. Giriş bölümünde belirtildiği gibi, kapsamlı bir çevresel AMR kaydı, düşük moleküler ağırlıklı, parçalanmış ve hücre dışı DNA'yı içerir. Burada tuz (%30 PEG ve 1.2 M NaCl) ile birleştirilmiş yüksek konsantrasyonda PEG kullanılarak rapor edilen ön işleme protokolü, bu sonucu, daha yüksek moleküler ağırlıklı fraksiyonların (büyük ölçüde genomik ve plazmid DNA) ekstraksiyonunu etkilemeden düşük moleküler ağırlıklı DNA oranını zenginleştirerek elde eder. Bu, büyük hacimlerin işlenmesi ihtiyacı nedeniyle hantal olan daha düşük PEG ve doğrudan kit protokolleri (ön işleme olmadan) kullanan önceki konsantrasyon yöntemlerinin aksine. Daha düşük PEG konsantrasyonları ile ön işleme, düşük moleküler ağırlıklı DNA'nın geri kazanılmasında verimsizdi ('düşük', burada 600 bp'nin altındaki DNA bantlarını ifade eder). Ön işleme sırasında hiçbir PEG kullanılmadığında, DNA ekstraksiyonu zayıftır, bu da PEG ve NaCl kullanıldığında %70'in aksine, giriş DNA'sının yalnızca %10'unun geri kazanılmasına neden olur (Şekil 8). PEG ve NaCl ilavesine ek olarak, bir diğer önemli adım, sonraki işleme için saf DNA elde etmek için kitten DNA ekstraksiyonu sonrası artık etanolün çıkarılmasıdır. Elüsyon üzerine 30-50 mL'lik bir hacimde toplam en az ~ 300 ng ila 5 mg DNA elde etmek için gereken başlangıç su hacmini belirlemek önemlidir. Atık sudan DNA ekstraksiyonu için tipik olarak işlenen 1 L veya daha fazla suyun^27,41 aksine, burada önerilen ön işleme adımıyla, sonraki işleme için yüksek kaliteli DNA elde etmek için sadece 27,5-40 mL'nin yeterli olduğu bulunmuştur. Atık su ayrıca adsorbe edilmiş bakteri hücreleri ve hücre dışı DNA içerebilen partikül ve organik madde içerir. Bu nedenle, hücre lizizi ile birlikte hücrelerin ve DNA'nın desorpsiyonu, DNA verimini artırmak için önemli bir adımdır. Yüksek PEG konsantrasyonları, numuneyi viskoz hale getirir ve daha önce belirtildiği gibi DNA ekstraksiyonu için lizis ve desorpsiyon adımlarını engelleyebilir. Bunu önlemek için, akış şemasında belirtildiği gibi adım adım bir DNA ekstraksiyonu yöntemi önerilmiştir (Şekil 9). Bu yöntem, hem hücre içi yüksek moleküler ağırlıklı DNA'nın (Şekil 7) hem de hücre dışı düşük moleküler ağırlıklı parçalanmış ve dairesel DNA'nın çıkarılmasında yardımcı olacaktır.

Bu protokolün masraf açısından mevcut bir sınırlaması, kaliteyi artırmak için bir kit aracılığıyla zenginleştirilmiş düşük moleküler ağırlıklı DNA'nın sürekli işlenmesidir. Bu sınırlama, fenol-kloroform ekstraksiyonu gibi diğer DNA temizleme yöntemleri kullanılarak potansiyel olarak atlanabilir. Diğer bir pratik sınırlama, çözeltinin yüksek viskozitesi nedeniyle pelet kaybolabileceğinden, yüksek PEG konsantrasyonlarının kullanılmasıdır. Şu anda, PEG ve NaCl kullanılarak ön işleme gerçekleştirilmekte, ardından mevcut bir kit protokolünün değiştirilmiş bir versiyonu takip edilmektedir, yani kit, nihai DNA saflaştırması için hala kullanılmaktadır. Yüksek DNA verimi veren ancak düşük saflıkta (burada rapor edilmemiştir) kitsiz bir DNA saflaştırması, ekstrakte edilen DNA'nın kalitesini iyileştirmek için optimize edilmektedir. PEG çözeltilerinin viskoz doğası nedeniyle, çok çeşitli DNA boyutları verebilen ve yine de rahatça ele alınabilen optimal bir PEG konsantrasyonu hedeflenmelidir. Konsantrasyonun %20'ye düşürülmesi (Şekil 6B), düşük (%9) ve yüksek (%30) PEG ekstraksiyon verimliliklerine orta düzeyde bir sonuç elde etti; Bu, gelecekteki çalışmalarda takip etmeye değer olabilir.

PEG, çevresel örneklerden DNA ekstraksiyonunun farklı aşamaları sırasında rutin olarak kullanılır. Bununla birlikte, PEG kullanımı, AMR sürveyansı bağlamında DNA ekstraksiyonu için standartlaştırılmamıştır. Atık su gözetimi, STP'ler (giriş ve çıkış suyu) ve açık ve kapalı kanalizasyonlar dahil olmak üzere birçok farklı nişte antimikrobiyal direncin tespit edilmesini gerektirir ^8,27. Giriş suyundaki AMR ile ilgili bilgiler, toplumda dolaşan direnç hakkında önemli bilgiler sağlarken, atık sudaki AMR genlerinin varlığı, direnç salgınlarının ortaya çıkışını ölçmek ve potansiyel olarak tahmin etmek için eşit derecede önemlidir. Atık su numuneleri tipik olarak düşük mikrobiyal yüke sahiptir, çünkü çoğu hücre arıtma işlemi sırasında öldürülür ve bu da çok düşük hücresel DNA verimi ile sonuçlanır. Bununla birlikte, atık sular, hem yüksek moleküler ağırlıklı genomik DNA hem de düşük moleküler ağırlıklı plazmid, fakemidler ve parçalanmış DNA içeren hücre dışı serbest yüzen DNA içerir. Düşük moleküler ağırlıklı DNA'da (hem parçalanmış hem de plazmid/fages) bulunan AMR genleri, atık sudaki kalan canlı hücrelere aktarılabilir ve bu da direncin yayılmasına yol açar^30,41,45. Bu nedenle, atık sudaki düşük moleküler ağırlıklı hücre dışı DNA'yı tespit etmek önemlidir. AMR'yi değerlendirirken atık sudan DNA ekstraksiyonu için kullanılan diğer yöntemler tipik olarak düşük moleküler ağırlıklı DNA'nın ilk zenginleştirmesini sağlamaz. Atık sudan DNA ekstraksiyonunun bu yaklaşımı, çevrenin kapsamlı bir direnci hakkında bilgi sağlamak için kullanılabilir.

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

APSI Hindistan ekibinin (Alliance for Pathogen Surveillance Innovations https://data.ccmb.res.in/apsi/team/) bir parçası olarak Rockefeller Vakfı'ndan (Rockefeller Vakfı Hibe Numarası 2021, HTH 018) finansman desteğini kabul ediyoruz. Ayrıca, bu araştırmayı desteklemek için Axis Bank tarafından sağlanan mali yardımı ve ekipman ve diğer destekler için Ashoka Üniversitesi'ndeki Trivedi Biyolojik Bilimler Okulu'nu da kabul ediyoruz.