Estrazione avanzata di DNA a basso peso molecolare dalle acque reflue per una valutazione completa della resistenza agli antimicrobici

Qui, presentiamo una semplice tecnica per valutare la resistenza antimicrobica ambientale (AMR) aumentando la proporzione di DNA extracellulare a basso peso molecolare. Il trattamento precedente con PEG al 20%-30% e NaCl 1,2 M consente di rilevare sia i geni genomici che quelli AMR trasferiti orizzontalmente. Il protocollo si presta a un processo senza kit con un'ulteriore ottimizzazione.

La sorveglianza ambientale è riconosciuta come uno strumento importante per valutare la salute pubblica nell'era post-pandemica. L'acqua, in particolare le acque reflue, è emersa come fonte di scelta per campionare i carichi di agenti patogeni nell'ambiente. Le acque reflue provenienti da scarichi a cielo aperto e impianti di trattamento delle acque comunitarie sono un serbatoio di agenti patogeni e geni di resistenza antimicrobica (AMR) e spesso entrano in contatto con l'uomo. Sebbene esistano molti metodi per tracciare l'AMR dall'acqua, isolare DNA di buona qualità ad alte rese da campioni eterogenei rimane una sfida. Per compensare, i volumi di campione devono spesso essere elevati, creando vincoli pratici. Inoltre, il DNA ambientale è spesso frammentato e le fonti di AMR (plasmidi, fagi, DNA lineare) sono costituite da DNA a basso peso molecolare. Tuttavia, pochi processi di estrazione si sono concentrati su metodi per l'estrazione ad alto rendimento di DNA lineare e a basso peso molecolare. Qui, viene riportato un metodo semplice per l'estrazione lineare del DNA ad alto rendimento da piccoli volumi di acque reflue utilizzando le proprietà di precipitazione del polietilenglicole (PEG). Questo studio sostiene la necessità di aumentare la resa complessiva del DNA dai campioni d'acqua raccolti per le analisi metagenomiche, arricchendo la proporzione di DNA lineare. Inoltre, il miglioramento del DNA a basso peso molecolare supera l'attuale problema del sottocampionamento dell'AMR ambientale a causa di un'attenzione particolare al DNA intracellulare e ad alto peso molecolare. Si prevede che questo metodo sia particolarmente utile quando esiste DNA extracellulare ma a basse concentrazioni, come con gli effluenti degli impianti di trattamento. Dovrebbe anche migliorare il campionamento ambientale dei frammenti del gene AMR che si diffondono attraverso il trasferimento genico orizzontale.

Il SARS-CoV-2 e le sue conseguenze hanno sottolineato l'importanza della sorveglianza ambientale nel monitoraggio e nella previsione dei focolai di malattie infettive ^1,2. Sebbene le pandemie virali siano evidenti, l'aumento della resistenza antimicrobica (AMR) è spesso descritto come una pandemia insidiosa e che costituisce una delle principali preoccupazioni per la salute pubblica in tutto il mondo ^3,4. Di conseguenza, vi è un urgente bisogno di strategie coordinate per comprendere l'evoluzione e la diffusione della resistenza antimicrobica. I corpi idrici, così come le acque reflue, possono fungere da serbatoi sia per gli agenti patogeni che per l'AMR 5,6,7,8. Le fonti d'acqua condivise sono, quindi, una potente fonte di trasmissione di malattie tra gli esseri umani, in particolare nei paesi a basso e medio reddito (LMIC) dove scarsa igiene e sovrappopolazione vanno di pari passo ^9,10,11. L'analisi delle fonti d'acqua è stata a lungo impiegata per valutare la salute della comunità 12,13,14. Recentemente, le acque reflue degli impianti di trattamento delle acque reflue urbane si sono dimostrate un buon indicatore anticipato dei casi di COVID nella clinica 1,2,15,16,17,18.

Rispetto al monitoraggio di malattie specifiche, il rilevamento e il monitoraggio della resistenza antimicrobica nell'ambiente pone un problema più complesso. L'elevato numero di antibiotici in uso, i diversi geni di resistenza, le diverse pressioni di selezione locale e il trasferimento genico orizzontale tra i batteri rendono difficile valutare il vero carico di AMR e, una volta valutato, correlarlo con le osservazioni cliniche 19,20,21,22. Di conseguenza, mentre la sorveglianza concertata della resistenza antimicrobica clinica è in corso da parte di diverse organizzazioni in tutto il mondo ^3,23,24, il monitoraggio ambientale della resistenza antimicrobica è ancora agli inizi, rivisto nel 19,25,26.

Negli ultimi anni, sono stati segnalati diversi metodi per monitorare la resistenza antimicrobica ambientale ^5,27, rivisti in^28,29. Il punto di partenza della maggior parte di questi è l'estrazione di DNA di buona qualità da campioni ambientali eterogenei, di per sé una sfida. Inoltre, il DNA ambientale è tipicamente frammentato a causa dell'esposizione ad ambienti ostili. Il DNA extracellulare frammentato è stato a lungo riconosciuto come un importante serbatoio di geni AMR (rivisto in 30,31,32), con l'aggiunta del potenziale di entrare e uscire dai batteri attraverso il trasferimento genico orizzontale. Pertanto, è importante che qualsiasi protocollo che miri a misurare il carico di AMR nell'ambiente campiona nel miglior modo possibile il DNA lineare e a basso peso molecolare. Sorprendentemente, c'è stata poca attenzione allo sviluppo di metodi specifici per l'estrazione ad alto rendimento di DNA lineare e a basso peso molecolare: questo lavoro si concentra sull'affrontare il divario.

Un metodo comune e semplice per precipitare il DNA consiste nel combinare il polietilenglicole (PEG) e sali come il cloruro di sodio (NaCl)³³. Il PEG è un agente di affollamento macromolecolare utilizzato per ottenere precipitazioni di frammenti di DNA^34,35 in base alle dimensioni. Più bassa è la concentrazione di PEG, maggiore è il peso molecolare del DNA che può essere precipitato in modo efficiente. Molti studi hanno utilizzato il PEG durante l'estrazione ambientale di DNA e RNA ^1,2 (riassunto nella Tabella 1 17,33,36,37,38,39) sia nella fase finale 33,36,37 sia per concentrare grandi campioni d'acqua per l'estrazione di particelle virali come con SARS-CoV-2 ^15,40. Nel presente lavoro, si è scoperto che le concentrazioni di PEG utilizzate in precedenza per le estrazioni di DNA ambientale (in gran parte determinate da protocolli di sorveglianza virale) non catturano il DNA lineare a basso peso molecolare. Pertanto, perdono il campionamento di frammenti di DNA corti e non sono adatti a valutare accuratamente il contenuto di AMR. Questo studio ha sfruttato le proprietà del polietilenglicole e del cloruro di sodio per precipitare efficacemente frammenti di DNA lineare a basso peso molecolare ad una resa elevata che potrà, in futuro, portare a un metodo di estrazione del DNA economicamente vantaggioso. Questo metodo può essere utilizzato per arricchire la proporzione di DNA frammentato e a basso peso molecolare da campioni naturali complessi, catturando così un quadro più accurato della resistenza antimicrobica ambientale. Con un po' di ulteriore perfezionamento, la tecnica si presta ad un'applicazione facile ed economica da parte delle società municipali locali e di altri enti governativi da utilizzare come strumento di sorveglianza con una formazione tecnica minima.

1. Campionamento delle acque reflue

1. Immergere un becher di polipropilene da 500 mL nello scarico a cielo aperto o nel serbatoio dell'impianto di trattamento delle acque reflue (STP) e raccogliere ~300 mL di campione di acque reflue.
2. Trasferire ~250 mL del campione in un flacone in polipropilene autoclavato da 250 mL.
3. Avvitare il tappo della bottiglia e sigillarlo con una pellicola di plastica. Conservare il flacone in posizione verticale in un sacchetto chiuso.
4. Trasportare il campione in posizione verticale in un contenitore chiuso a temperatura ambiente.
5. Inattivare il campione a 70 °C in un forno ad aria calda per 4 ore prima di processarlo per l'estrazione del DNA.

2. Estrazione del DNA da campioni di acque reflue

1. Una volta che il campione di acque reflue si è raffreddato, agitare i campioni alla massima velocità e lasciare che i detriti/fanghi si depositino.
2. Decantare 27,5 mL di acque reflue in provette da centrifuga da 50 mL e aggiungere 13,5 g di PEG-8000 (concentrazione finale 30%) e 3 g di NaCl (concentrazione finale 1,2 M) e mescolare bene fino a completa dissoluzione.
3. Incubare il campione per una notte (~16-18 h) a 4 °C.
4. Centrifugare il campione a 15.500 x g a 4 °C per 30 minuti.
5. Scartare il surnatante.
   NOTA: PEG-8000 al 30% è altamente viscoso e il pellet può staccarsi durante lo scarto del surnatante. Il surnatante deve essere travasato lentamente e con attenzione per garantire che il pellet non vada perso. I passaggi da 2.6 a 2.23 vengono eseguiti utilizzando il kit di estrazione del DNA del suolo secondo le istruzioni del kit con alcune modifiche.
6. Sciogliere il pellet in 800 μl della soluzione di lisi del kit e aggiungere la soluzione alla provetta di perle di zirconio miscelate.
   NOTA: In caso di lavorazione di volumi maggiori, raggruppare i pellet dal numero di provette desiderato. Ad esempio, se si elaborano 160 ml di campione; ci saranno quattro provette da 50 mL contenenti acque reflue con PEG e NaCl. Dopo la centrifugazione di tutte e quattro le provette a 15.500 x g a 4 °C per 30 minuti, eliminare il surnatante da tutte e quattro le provette. Aggiungere 200 μl di soluzione CD1 a ciascuno, risospendere i pellet e riunirli in un unico tubo a sfere.
7. Fissare il tubo della perlina orizzontalmente su un vortice. Agitare il tubo alla massima velocità per 20-30 min.
   NOTA: Il vortice prolungato garantisce la completa lisi e omogeneizzazione dei campioni, migliorando la resa del DNA.
8. Centrifugare le provette a 8.000 x g per 15 s per depositare le perle sul fondo, rimuovere la schiuma e trasferire completamente il surnatante dalla provetta a una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL. Durante questa fase possono anche essere trasferite alcune perline.
9. Centrifugare il surnatante a 15.000 x g per 1 minuto.
10. Trasferire il surnatante in una provetta da microcentrifuga da 2 ml pulita. Il surnatante può contenere ancora alcune particelle sospese.
11. Aggiungere 200 μl di soluzione precipitante e agitare alla massima velocità per 5 s. Incubare a 4 °C per 5 min.
    NOTA: L'incubazione a 4 °C aumenta l'efficienza della precipitazione delle proteine e dei detriti cellulari mentre il DNA rimane in soluzione. È possibile mettere in pausa il protocollo in questa fase per un massimo di 2 ore senza una diminuzione significativa della resa e della qualità del DNA estratto.
12. Centrifugare a 15.000 x g per 1 min a temperatura ambiente (RT). Evitare il pellet e trasferire il surnatante limpido in una provetta da microcentrifuga da 2 ml pulita.
13. Aggiungere 600 μL di tampone legante per 700 μL di surnatante e agitare alla massima velocità per 5 s.
14. Caricare 700 μl di lisato su una colonna di centrifuga di silice, incubare per 2 minuti e centrifugare a 15.000 x g per 1 minuto.
    NOTA: L'incubazione del lisato su colonna di silice migliora il legame del DNA alla colonna, con conseguente migliore resa del DNA.
15. Scartare il flusso e ripetere il passaggio 2.14 fino a quando tutto il lisato è passato attraverso la colonna di centrifuga.
16. Posizionare con cautela la colonna centrifuga in una provetta di raccolta da 2 ml pulita. Assicurarsi che non vi siano schizzi di flusso sulla colonna di centrifuga.
17. Aggiungere 500 μl di tampone di lavaggio alla colonna di centrifuga e centrifugare la colonna di centrifuga a 15.000 x g per 1 minuto.
18. Eliminare il flusso continuo e riportare la colonna di centrifuga nella stessa provetta di raccolta da 2 mL.
19. Aggiungere 500 μl di tampone di lavaggio con etanolo alla colonna di centrifuga. Centrifugare a 15.000 x g per 1 min.
20. Eliminare il flusso continuo e inserire la colonna di centrifuga in una nuova provetta di raccolta da 2 mL.
21. Centrifugare a 16.000 x g per 2 minuti per rimuovere l'etanolo residuo. Posizionare la colonna di centrifuga in una nuova provetta da 1,5 mL.
22. Aggiungere 100 μl di tampone di eluizione (preriscaldato a 55 °C) al centro della membrana filtrante bianca e incubare per 5 minuti.
    NOTA: Il tampone di eluizione riscaldato, insieme all'incubazione sulla membrana, aumenta l'efficienza dell'eluizione del DNA, in particolare del DNA ad alto peso molecolare.
23. Centrifugare a 15.000 x g per 1 min. Eliminare la colonna di rotazione.
24. Al DNA eluito, aggiungere 10 μl di NaCl 3 M (1/10 di volume di eluato di DNA) e 250 μl di etanolo assoluto refrigerato (2,5 volume di eluato di DNA). Capovolgere per mescolare bene e centrifugare il contenuto a 8.000 x g per 15 s.
25. Incubare la miscela DNA-etanolo a -20 °C per almeno 1 ora.
    NOTA: L'incubazione della miscela DNA-etanolo può essere aumentata a 16 ore senza una diminuzione significativa della resa o della qualità del DNA estratto.
26. Centrifugare a 19.000 x g a 4 °C per 30 min. Scartare il surnatante per decantazione.
27. Aggiungere 500 μl di etanolo refrigerato al 70% al pellet.
28. Centrifugare a 19.000 x g a 4 °C per 15 min. Scartare il surnatante per decantazione.
29. Capovolgere e picchiettare delicatamente il tubo su carta velina per rimuovere l'etanolo residuo mediante azione capillare.
30. Asciugare completamente il pellet di DNA tenendo le provette aperte su un blocco riscaldante per 5-10 minuti a 37 °C fino a quando tutto l'etanolo non è evaporato.
31. Risospendere il pellet di DNA in 30-50 μL di acqua distillata in autoclave (ddH₂O). Incubare a 37 °C per 5-10 min.
32. Centrifuga il DNA a 8.000 x g per 15 s.
33. Selezionare l'applicazione dsDNA nelle impostazioni Acidi nucleici in uno spettrofotometro Nanodrop.
    1. Pulisci il piedistallo con carta velina priva di lanugine e acqua. Utilizzare ddH₂O per cancellare lo strumento e quindi caricare 2 μL del campione di DNA sul piedistallo.
    2. Misurare i rapporti di concentrazione e assorbanza (A260/280 e A260/230) per determinare la purezza.
34. Conservare il campione di DNA a -20 °C.

3. Precipitazione di DNA lineare amplificato con reazione a catena della polimerasi (PCR) per verificare il recupero del DNA in una gamma di pesi molecolari

1. Utilizzando il DNA genomico di E. coli MG155, amplificare i frammenti genici mediante PCR per generare un pool di frammenti lineari dai seguenti geni: fusA, lacZ, gapA, rpsD, 16S rRNA, marR (vedere la Tabella 2 per le sequenze di primer e le condizioni di PCR).
2. Purificare i prodotti PCR utilizzando il kit di purificazione PCR e raggruppare i prodotti PCR.
3. Dividere gli ampliconi raggruppati in provette per microcentrifuga da 1,5 mL con volumi uguali ed etichettare una provetta come "DNA in ingresso".
4. Aggiungere PEG e NaCl secondo le condizioni desiderate (9%, 20%, 30% PEG-8000; 0,3 M, 1,2 M NaCl) a ciascuna delle provette, ad eccezione di quella etichettata come "DNA in ingresso", e portare il volume finale a 1 mL.
5. Incubare le provette per una notte (~16-18 h) a 4 °C.
   NOTA: Per il resto dei passaggi fino al 3.16, 'Input DNA' viene mantenuto invariato in frigorifero.
6. Centrifugare le provette in una microcentrifuga da tavolo secondo la velocità desiderata (15.000 x g o 20.000 x g) per 1 ora a 4 °C.
7. Rimuovere con cautela 900 μl di surnatante dal lato opposto al pellet utilizzando una micropipetta.
8. Primo lavaggio con etanolo: aggiungere 900 μl di etanolo refrigerato al 70% al pellet e mescolare capovolgendo delicatamente le provette.
9. Centrifugare i tubi alla stessa velocità utilizzata al punto 3.6 (15.000 x g o 20.000 x g) per 30 minuti a 4 °C.
10. Rimuovere il surnatante per decantazione.
11. Secondo lavaggio con etanolo: aggiungere 500 μl di etanolo refrigerato al 70% al pellet.
12. Centrifugare i tubi alla stessa velocità utilizzata al punto 3.6 (15.000 x g o 20.000 x g) per 30 minuti a 4°C. Scartare il surnatante per decantazione.
13. Capovolgere e picchiettare delicatamente il tubo su carta velina per rimuovere l'etanolo residuo mediante azione capillare.
14. Asciugare completamente il pellet di DNA tenendo le provette aperte su un blocco riscaldante per 5-10 minuti a 37 °C fino a quando tutto l'etanolo evapora.
15. Risospendere il pellet in 20 μl di acqua bidistillata autoclavata.
16. Misura la concentrazione di DNA precipitato dalle diverse condizioni e dal "DNA in ingresso" utilizzando uno spettrofotometro Nanodrop o un fluorimetro.
17. Caricare il DNA precipitato su un gel di agarosio all'1% per la visualizzazione del DNA.

Istituzione di un protocollo per l'estrazione ad alto rendimento del DNA da campioni di acque reflue
Una versione modificata di protocolli precedentemente stabiliti è stata utilizzata per l'estrazione di DNA e RNA di alta qualità da campioni d'acqua¹⁷. I campioni provenivano da scarichi a cielo aperto e da impianti di trattamento delle acque reflue nella regione di Delhi-NCR, nel nord dell'India. Dopo la pre-elaborazione con PEG e NaCl (Figura 1), i campioni sono stati elaborati attraverso kit per l'estrazione del DNA dal suolo e dall'acqua. In tutti i casi^{, è stata} osservata una banda prominente ad alto peso molecolare probabilmente corrispondente al DNA batterico intracellulare e uno striscio di fondo, come è tipico dei campioni ambientali³⁷ (Figura 2).

Mancanza di un'efficiente estrazione del DNA dagli effluenti degli impianti di trattamento delle acque reflue (STP)
Sebbene una ragionevole resa di DNA totale sia stata ottenuta da scarichi aperti e affluenti STP (Tabella 3), non è stato possibile ottenere DNA dall'effluente finale trattato; i problemi con la bassa resa sono descritti anche in lavori precedenti⁴¹ (Figura 3). Il post-trattamento, che comprende la clorazione delle acque reflue e, in alcuni casi, i trattamenti UV e di ultrafiltrazione⁴², si prevede che la carica microbica sia bassa e che il DNA residuo (costituito da DNA extracellulare e frammentato) venga diluito. La bassa concentrazione iniziale di PEG utilizzata nella concentrazione del campione e nella precipitazione dell'acido nucleico potrebbe escludere il DNA a basso peso molecolare. In altre parole, il DNA frammentato potrebbe essere perso nella fase iniziale di concentrazione.

L'aumento delle concentrazioni di PEG e NaCl porta alla precipitazione di DNA a basso peso molecolare
Per verificare se l'aumento della concentrazione di PEG aiuta ad arricchire il DNA a basso peso molecolare, è stato generato uno standard di laboratorio di frammenti PCR di diverse lunghezze, creando una gamma di frammenti di DNA lineari (Figura 4). Lo standard è stato sottoposto a quattro diverse condizioni di precipitazione: 9% PEG-8000 + 0,3 M NaCl (la combinazione originale), 9% PEG-8000 + 1,2 M NaCl (solo sale in aumento), 30% PEG-8000 + 0,3 M NaCl (solo in aumento PEG) e 30% PEG-8000 + 1,2 M NaCl (in aumento sia di sale che in PEG). Le condizioni sono state scelte sulla base del protocollo standard utilizzato per la sorveglianza del SARS-CoV-2¹⁷ e delle condizioni riportate in uno studio di metodi modulari di estrazione del DNA da campioni ambientali³³. Sono state utilizzate due diverse velocità di centrifugazione - 15.000 x g e 20.000 x g - in base agli effetti delle velocità differenziali sulla pellettizzazione del DNA⁴³. Aumentando le concentrazioni di PEG e NaCl rispettivamente al 30% e a 1,2 M, il recupero totale del DNA è aumentato di circa il 70% e sono stati efficacemente precipitati frammenti di DNA fino a 150 paia di basi (bp) (Figura 5). La differenza di velocità non ha avuto molto effetto sulla resa (Figura 6A) e può essere dovuta al lungo tempo di centrifugazione utilizzato. Poiché il recupero totale del DNA era inferiore nella combinazione originale PEG/NaCl, era possibile che le bande di peso molecolare più basse, sebbene presenti, fossero a una concentrazione inferiore al limite di visualizzazione. Per testare ciò, la quantità di DNA in ingresso per la precipitazione è stata aumentata e un eccesso di DNA corrispondente a ciascun trattamento (1,5 mg) è stato caricato sul gel di agarosio per la visualizzazione. Solo il trattamento con PEG al 30% ha mostrato un buon recupero della banda del peso molecolare più basso, cioè 150 bp (Figura 6B).

La precipitazione del DNA circolare (DNA batterico genomico e plasmidico) non segue lo stesso andamento
Coli Il DNA genomico e il plasmide MG155 (pRSV, ~4 kb) sono stati utilizzati per la precipitazione con diverse concentrazioni di PEG e NaCl. A differenza del DNA lineare, non vi è stato alcun impatto significativo dell'aumento dei livelli di PEG e NaCl (Figura 7), suggerendo che le rese di DNA circolare e ad alto peso molecolare (tipicamente DNA intracellulare) non sono influenzate dall'aumento del PEG. Ciò è in contrasto con le precedenti osservazioni con la precipitazione delle proteine⁴⁴, dove la solubilità diminuiva bruscamente con la concentrazione di PEG. Dato che il PEG agisce come agente di affollamento, si ipotizza che l'area superficiale della macromolecola disponibile per l'interazione giochi un ruolo importante nella sua efficacia come agente precipitante. Con il DNA lineare, all'aumentare delle dimensioni, è ragionevole ipotizzare che aumenti anche l'area disponibile per l'interazione. Con il DNA circolare, è possibile che basse concentrazioni di PEG siano già sufficienti per saturare la molecola e un ulteriore aumento della concentrazione potrebbe non aumentare la superficie effettiva per l'interazione.

Scarsa resa di DNA dalle acque reflue quando si omette la precipitazione di pre-trattamento con PEG e NaCl
Per verificare se il pre-trattamento delle acque reflue è fondamentale per l'estrazione del DNA, 20 mL di acque reflue inattivate termicamente (70 °C, 4 ore) sono state addizionate con 10 mg di standard lineare precedentemente preparato e incubate per una notte a 4 °C (a) senza PEG + NaCl, (b) con PEG al 9% + 0,3 M NaCl (combinazione originale) e (c) con PEG al 20% + 1,2 M NaCl (aumento di PEG e sale). I campioni sono stati poi elaborati attraverso il kit del terreno per l'estrazione del DNA, come spiegato nel protocollo. È stato riscontrato che la resa del DNA estratto aumenta del 60% sui campioni di acque reflue pre-trattamento con il 9% di PEG + 0,3 M di NaCl rispetto a nessuna fase di pre-trattamento (Figura 8), indicando che la precipitazione di PEG e NaCl pre-trattamento è fondamentale per ottenere DNA ad alta resa da campioni di acque reflue. È anche interessante notare che mentre la resa complessiva di DNA, incluso il DNA genomico ad alto peso molecolare (gDNA), è inferiore quando si utilizzano PEG e sale elevati per la precipitazione, la proporzione di DNA a peso molecolare inferiore è arricchita (Figura 8). La diminuzione della resa complessiva dovuta all'aumento del PEG e del sale può essere attribuita alla natura altamente viscosa del PEG, che può portare alla perdita di pellet di DNA durante la rimozione del surnatante. Ciò rafforza la tesi a favore del metodo di estrazione del DNA a gradini proposto (Figura 9), in cui il DNA ad alto peso molecolare può essere estratto per la prima volta utilizzando una bassa precipitazione di PEG e NaCl e il surnatante risultante può essere sottoposto a un altro ciclo di pre-elaborazione con PEG e NaCl aumentati per estrarre in modo efficiente il DNA a basso peso molecolare che è sfuggito al primo ciclo di precipitazione.

Figura 1: Pre-trattamento di campioni di acque reflue. Schema che mostra il flusso di lavoro dalla raccolta del campione all'estrazione del DNA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Profilo gel tipico del DNA estratto da campioni di acque reflue. Un volume di 50-100 mL (come indicato nella figura) di acque reflue campionate da diversi siti è stato inattivato termicamente mediante incubazione a 70 °C per 4 ore. È stato quindi incubato con PEG al 9% e NaCl 0,3 M per una notte a 4 °C e quindi processato per estrarre il DNA utilizzando il suolo o un kit per l'acqua. Circa 150 ng di DNA totale estratto sono stati caricati su un gel di agarosio all'1% insieme a una scala da 1 kilo-coppie di basi (kb) come marcatore e sottoposti a elettroforesi (90 V, 30 min). Il DNA è stato visualizzato sotto la luce ultravioletta (UV) utilizzando il colorante SYBR SAFE. La tabella a destra descrive in dettaglio le fonti di raccolta dei campioni, il volume di acque reflue trattate e il kit utilizzato per l'estrazione del DNA per ogni corsia. (STP: Impianto di trattamento delle acque reflue; UVR: Radiazione ultravioletta) Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: I campioni di effluenti STP mostrano una scarsa resa totale del DNA. Un volume di 40 mL di acque reflue campionate dall'affluente e dall'effluente STP è stato inattivato termicamente mediante incubazione a 70 °C per 4 ore. È stato quindi incubato con PEG al 9% e NaCl 0,3 M per una notte a 4 °C e quindi elaborato per estrarre il DNA utilizzando un kit per suolo o acqua o un kit per l'estrazione del DNA genomico batterico. Circa 150 ng di DNA totale estratto sono stati caricati su un gel di agarosio all'1% insieme a una scala da 1 kb come marcatore e sottoposti a elettroforesi (90 V, 30 min). Il DNA è stato visualizzato sotto la luce ultravioletta (UV) utilizzando il colorante SYBR SAFE. La concentrazione di DNA estratto per i campioni di effluente era inferiore a 1 ng/mL di acque reflue e quindi non poteva essere visualizzata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Generazione di uno standard lineare di dimensione del DNA per testare l'efficacia della precipitazione del DNA a basso peso molecolare. Cinque frammenti di DNA di diverse dimensioni sono stati generati mediante amplificazione PCR utilizzando il DNA genomico di E. coli (MG1655) come modello e primer e condizioni come descritto nella Tabella 2. Il DNA purificato (~1 μg) con il kit di purificazione PCR è stato caricato su un gel di agarosio all'1% insieme a una scala da 1 kb come marcatore e sottoposto a elettroforesi (90 V, 40 min). Il DNA è stato visualizzato sotto la luce ultravioletta (UV) utilizzando il colorante SYBR SAFE. Le corsie sono etichettate dai nomi dei geni da cui il frammento è stato amplificato e dalla dimensione prevista dell'amplicona. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Il DNA a basso peso molecolare viene recuperato in modo efficiente solo alla concentrazione di PEG più alta (30%). Il DNA in ingresso (3,34 μg) rispetto allo standard dimensionale generato in precedenza è stato trattato con diverse combinazioni di PEG e NaCl come indicato nella figura ed estratto come dettagliato nel protocollo. La velocità di centrifugazione utilizzata era di 15.000 x g. Per l'input (corsia 3) e 1,2 M NaCl + 30% PEG (corsia 7), 0,8 μg di DNA sono stati caricati sul gel. Per il resto, poiché la resa totale era bassa, è stata caricata la quantità totale di DNA estratta in 16 μL e 1 kb ladder è stato caricato come marcatore dimensionale su un gel di agarosio all'1% e sottoposto a elettroforesi (80 V, 45 min). Il DNA è stato visualizzato sotto la luce ultravioletta (UV) utilizzando il colorante SYBR SAFE. Il riquadro bianco evidenzia la banda più bassa di 150 pb. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Il recupero del DNA a basso peso molecolare è determinato da alte concentrazioni di PEG piuttosto che da alte concentrazioni di sale. (A) Il DNA in ingresso (14 μg) rispetto allo standard di dimensioni è stato trattato con diverse combinazioni di PEG e NaCl, come indicato nella figura, ed estratto utilizzando la precipitazione dell'etanolo come descritto nel protocollo. La velocità di centrifugazione utilizzata è stata di 15.000 x g e 20.000 x g, come indicato in figura. L'intera quantità di DNA in ingresso e il DNA estratto, insieme a 1 kb di scala, sono stati caricati su un gel di agarosio all'1% e sottoposti a elettroforesi (90 V, 30 min). Il DNA è stato visualizzato sotto la luce ultravioletta (UV) utilizzando il colorante SYBR SAFE. (B) Il DNA in ingresso (15,67 μg) rispetto allo standard di dimensioni generato in precedenza è stato trattato con diverse combinazioni di PEG e NaCl, come indicato nella figura, ed estratto come dettagliato nel protocollo. La velocità di centrifugazione utilizzata era di 15.000 x g. Il DNA estratto (1,5 μg) è stato caricato in ciascuna corsia e la scala da 1 kb è stata caricata come marcatore dimensionale su un gel di agarosio all'1% e sottoposta a elettroforesi (80 V, 45 min). Il DNA è stato visualizzato sotto la luce ultravioletta (UV) utilizzando il colorante SYBR SAFE. Il riquadro bianco evidenzia la banda più bassa di 150 pb. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Il recupero del DNA genomico e del DNA plasmidico non è influenzato in modo significativo dall'aumento della concentrazione di PEG e NaCl. Il DNA in ingresso (9 μg; 4,5 μg di plasmide e 4,5 μg di DNA genomico) è stato trattato con diverse combinazioni di PEG e NaCl come indicato nella figura ed estratto come dettagliato nel protocollo. La velocità di centrifugazione utilizzata era di 15.000 x g. L'intera quantità di DNA in ingresso e il DNA estratto, insieme a una scala da 1 kb, è stata caricata su un gel di agarosio all'1% e sottoposta a elettroforesi (90 V, 45 min). Il DNA è stato visualizzato sotto la luce ultravioletta (UV) utilizzando il colorante SYBR SAFE. Le caselle bianche indicano il DNA genomico e il DNA plasmidico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: La precipitazione pre-processata con PEG e NaCl è fondamentale per l'estrazione ad alto rendimento del DNA dalle acque reflue. Le acque reflue inattivate termicamente (70 °C, 4 h) (20 mL) sono state addizionate con 10 mg di standard lineare precedentemente preparato e incubate per una notte a 4 °C senza PEG e NaCl o variando le concentrazioni di PEG e NaCl come indicato in figura. È stato quindi elaborato per estrarre il DNA utilizzando un kit per il terreno. Il DNA in ingresso (4 μg) utilizzato per lo spiking (corsia 1) e il DNA estratto (4 μg) con una fase di pre-elaborazione del 9% PEG + 0,3 M di NaCl (corsia 3) sono stati caricati su un gel di agarosio all'1%. Per il resto delle condizioni, l'intera quantità di DNA estratto è stata caricata sul gel poiché la resa era bassa. Una scala da 1 kb è stata caricata anche come indicatore di taglia. Il gel è stato sottoposto a elettroforesi (70 V, 2 h). Il DNA è stato visualizzato sotto la luce ultravioletta (UV) utilizzando il colorante SYBR SAFE. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 9: Metodo graduale proposto per l'estrazione del DNA dalle acque reflue per arricchire il DNA sia ad alto che a basso peso molecolare. Diagramma di flusso che illustra un metodo in due fasi di estrazione del DNA dalle acque reflue con una fase iniziale di pre-elaborazione utilizzando basse concentrazioni di PEG e NaCl. Il surnatante della prima fase viene sottoposto a un altro ciclo di precipitazione pre-processuale con aumento di PEG e NaCl per estrarre efficacemente il DNA ad alto e basso peso molecolare dalle acque reflue. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1. Uso precedente di PEG e NaCl in studi per l'estrazione di DNA da campioni ambientali. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2. Sequenze di primer e condizioni di PCR per la generazione standard. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 3. Resa e qualità del DNA ottenuti da campioni di acque reflue per un periodo di due mesi nel 2023. Clicca qui per scaricare questa tabella.

La resistenza antimicrobica è oggi una delle prime 10 minacce per la salute, come elencato dall'OMS, e la sorveglianza ambientale per la resistenza antimicrobica è riconosciuta come uno strumento importante in tutto il mondo. Come accennato nell'introduzione, una registrazione completa dell'AMR ambientale include il DNA a basso peso molecolare, frammentato ed extracellulare. Il protocollo di pre-processazione qui riportato utilizzando un'alta concentrazione di PEG combinato con sale (30% PEG e 1,2 M NaCl) raggiunge questo risultato arricchendo la proporzione di DNA a basso peso molecolare senza influire sull'estrazione di frazioni a peso molecolare più elevato (in gran parte DNA genomico e plasmidico). Ciò è in contrasto con i precedenti metodi di concentrazione che utilizzano PEG più bassi e protocolli di kit diretti (senza pre-elaborazione) che sono ingombranti a causa della necessità di elaborare grandi volumi. La pre-elaborazione con concentrazioni di PEG più basse è risultata inefficiente nel recupero del DNA a basso peso molecolare ("basso" si riferisce a bande di DNA inferiori a 600 bp qui). Quando non viene utilizzato alcun PEG durante la pre-elaborazione, l'estrazione del DNA è scarsa, con il risultato che solo il 10% del DNA in input viene recuperato rispetto al 70% quando vengono utilizzati PEG e NaCl (Figura 8). Oltre all'aggiunta di PEG e NaCl, un altro passo importante è la rimozione dell'etanolo residuo dopo l'estrazione del DNA dal kit per ottenere DNA puro per l'elaborazione a valle. È importante determinare il volume iniziale di acqua necessario per ottenere una quantità totale di almeno ~300 ng a 5 mg di DNA in un volume di 30-50 mL dopo l'eluizione. A differenza di 1 litro o più di acqua che viene tipicamente processata per l'estrazione del DNA dalle acque reflue^27,41, si è scoperto che con la fase di pre-elaborazione qui proposta, solo 27,5-40 ml sono sufficienti per ottenere DNA di alta qualità per l'elaborazione a valle. Le acque reflue contengono anche particolato e materia organica, che può contenere cellule batteriche adsorbite e DNA extracellulare. Pertanto, il desorbimento delle cellule e del DNA accompagnato dalla lisi cellulare è un passo importante per aumentare la resa del DNA. Alte concentrazioni di PEG rendono il campione viscoso e possono ostacolare le fasi di lisi e desorbimento per l'estrazione del DNA, come accennato in precedenza. Per evitare ciò, è stato proposto un metodo graduale di estrazione del DNA, come delineato nel diagramma di flusso (Figura 9). Questo metodo sarà utile per estrarre sia il DNA intracellulare ad alto peso molecolare (Figura 7), sia il DNA extracellulare frammentato e circolare a basso peso molecolare.

Una limitazione attuale di questo protocollo in termini di spesa è la continua elaborazione di DNA arricchito a basso peso molecolare attraverso un kit per migliorare la qualità. Questa limitazione può essere potenzialmente aggirata utilizzando altri metodi di purificazione del DNA, come l'estrazione fenolo-cloroformio. Un'altra limitazione pratica è la gestione di alte concentrazioni di PEG poiché il pellet può andare perso a causa dell'elevata viscosità della soluzione. Attualmente, viene eseguita la pre-elaborazione utilizzando PEG e NaCl, seguita da una versione modificata di un protocollo di kit esistente, ovvero il kit è ancora utilizzato per la purificazione finale del DNA. Una purificazione del DNA senza kit, che fornisce un'elevata resa di DNA ma di bassa purezza (non riportata qui), è in fase di ottimizzazione per migliorare la qualità del DNA estratto. A causa della natura viscosa delle soluzioni PEG, è necessario puntare a una concentrazione ottimale di PEG in grado di produrre una gamma completa di dimensioni del DNA e tuttavia di essere maneggiata comodamente. Abbassando la concentrazione al 20% (Figura 6B) si ottiene un risultato intermedio rispetto alle efficienze di estrazione di PEG basso (9%) e alto (30%); Potrebbe valere la pena approfondire questo aspetto in un lavoro futuro.

Il PEG viene utilizzato di routine durante le diverse fasi dell'estrazione del DNA da campioni ambientali. Tuttavia, l'uso del PEG non è stato standardizzato per l'estrazione del DNA nel contesto della sorveglianza AMR. La sorveglianza delle acque reflue comporta il rilevamento della resistenza antimicrobica in molte nicchie diverse, tra cui STP (affluenti ed effluenti) e scarichi aperti e chiusi ^8,27. Mentre le informazioni sulla resistenza antimicrobica nell'affluente forniscono informazioni cruciali sulla resistenza che circola nella comunità, la presenza di geni AMR nell'effluente è altrettanto importante per misurare e potenzialmente prevedere l'emergere di focolai di resistenza. I campioni di effluente hanno in genere una bassa carica microbica poiché la maggior parte delle cellule viene uccisa durante il processo di trattamento, con conseguente resa di DNA cellulare molto bassa. Tuttavia, gli effluenti contengono DNA extracellulare fluttuante che comprende sia DNA genomico ad alto peso molecolare che plasmidi a basso peso molecolare, fagemidi e DNA frammentato. I geni AMR presenti nel DNA a basso peso molecolare (sia frammentato che plasmidi/fagemidi) possono essere trasferiti alle cellule vive rimanenti nell'effluente, portando alla disseminazione della resistenza 30,41,45. Pertanto, è importante rilevare il DNA extracellulare a basso peso molecolare nelle acque reflue. Altri metodi impiegati per l'estrazione del DNA dalle acque reflue durante la valutazione dell'AMR in genere non garantiscono l'arricchimento iniziale del DNA a basso peso molecolare. Questo approccio di estrazione del DNA dalle acque reflue può essere utilizzato per fornire informazioni su un resistoma completo dell'ambiente.

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Riconosciamo il sostegno finanziario della Rockefeller Foundation (Rockefeller Foundation Grant Number 2021 HTH 018) come parte del team APSI India (Alliance for Pathogen Surveillance Innovations https://data.ccmb.res.in/apsi/team/). Riconosciamo anche l'aiuto finanziario fornito da Axis Bank a sostegno di questa ricerca e dalla Trivedi School of Biosciences dell'Università di Ashoka per attrezzature e altro supporto.