Verbesserte Extraktion von niedermolekularer DNA aus Abwasser zur umfassenden Bewertung von Antibiotikaresistenzen

Hier stellen wir eine einfache Technik zur Bewertung der antimikrobiellen Resistenz in der Umwelt (AMR) vor, indem der Anteil an niedermolekularer extrazellulärer DNA erhöht wird. Eine vorherige Behandlung mit 20%-30% PEG und 1,2 M NaCl ermöglicht den Nachweis sowohl genomischer als auch horizontal übertragener AMR-Gene. Das Protokoll eignet sich für einen kitfreien Prozess mit zusätzlicher Optimierung.

Die Umweltüberwachung gilt als wichtiges Instrument zur Bewertung der öffentlichen Gesundheit in der Zeit nach der Pandemie. Wasser, insbesondere Abwasser, hat sich als die Quelle der Wahl herauskristallisiert, um Proben von Krankheitserregern in der Umwelt zu nehmen. Abwässer aus offenen Abflüssen und kommunalen Wasseraufbereitungsanlagen sind ein Reservoir sowohl für Krankheitserreger als auch für Gene für antimikrobielle Resistenzen (AMR) und kommen häufig mit Menschen in Kontakt. Es gibt zwar viele Methoden, um AMR aus dem Wasser zu verfolgen, aber die Isolierung von qualitativ hochwertiger DNA mit hohen Ausbeuten aus heterogenen Proben bleibt eine Herausforderung. Um dies zu kompensieren, müssen die Probenvolumina oft hoch sein, was zu praktischen Einschränkungen führt. Darüber hinaus ist die Umwelt-DNA häufig fragmentiert, und die Quellen von AMR (Plasmide, Phagen, lineare DNA) bestehen aus niedermolekularer DNA. Dennoch haben sich nur wenige Extraktionsverfahren auf Methoden zur Extraktion von linearer und niedermolekularer DNA mit hoher Ausbeute konzentriert. Hier wird über eine einfache Methode zur linearen DNA-Extraktion mit hoher Ausbeute aus kleinen Abwassermengen unter Verwendung der Fällungseigenschaften von Polyethylenglykol (PEG) berichtet. Diese Studie plädiert dafür, die Gesamt-DNA-Ausbeute von Wasserproben zu erhöhen, die für metagenomische Analysen entnommen wurden, indem der Anteil der linearen DNA angereichert wird. Darüber hinaus überwindet die Verbesserung der niedermolekularen DNA das derzeitige Problem der Unterbeprobung von umweltbedingter AMR aufgrund der Fokussierung auf hochmolekulare und intrazelluläre DNA. Es wird erwartet, dass diese Methode besonders nützlich ist, wenn extrazelluläre DNA vorhanden ist, jedoch in geringen Konzentrationen, z. B. bei Abwässern aus Kläranlagen. Es sollte auch die Umweltprobenahme von AMR-Genfragmenten verbessern, die sich durch horizontalen Gentransfer ausbreiten.

SARS-CoV-2 und seine Folgen unterstrichen die Bedeutung der Umweltüberwachung für die Überwachung und Vorhersage von Ausbrüchen von Infektionskrankheiten ^1,2. Während Viruspandemien offensichtlich sind, wird die Zunahme von Antibiotikaresistenzen (AMR) oft als heimtückische Pandemie bezeichnet, die weltweit ein Hauptproblem für die öffentliche Gesundheit darstellt ^3,4. Folglich besteht ein dringender Bedarf an koordinierten Strategien, um die Entwicklung und Ausbreitung von AMR zu verstehen. Gewässer sowie Abwasser können sowohl für Krankheitserreger als auch für AMR 5,6,7,8 als Speicher dienen. Gemeinsam genutzte Wasserquellen sind daher eine starke Quelle für die Übertragung von Krankheiten unter Menschen, insbesondere in Ländern mit niedrigem und mittlerem Einkommen (LMIC), in denen schlechte Hygiene und Überbevölkerung Hand in Hand gehen ^9,10,11. Die Untersuchung von Wasserquellen wird seit langem eingesetzt, um die Gesundheit der Bevölkerung zu beurteilen 12,13,14. Kürzlich erwies sich das Abwasser aus städtischen Kläranlagen als guter Indikator für COVID-Fälle in der Klinik 1,2,15,16,17,18.

Im Vergleich zur Überwachung spezifischer Krankheiten stellt die Erkennung und Verfolgung von AMR in der Umwelt ein komplexeres Problem dar. Die große Anzahl der verwendeten Antibiotika, die unterschiedlichen Resistenzgene, der unterschiedliche lokale Selektionsdruck und der horizontale Gentransfer zwischen Bakterien machen es schwierig, die tatsächliche AMR-Belastung zu beurteilen und sie nach der Bewertung mit klinischen Beobachtungen zu korrelieren ^19,20,21,22. Während die konzertierte Überwachung klinischer AMR von mehreren Organisationen auf der ganzen Welt durchgeführt wird ^3,23,24, steckt die umweltbedingte AMR-Überwachung noch in den Kinderschuhen, wie in 19,25,26 überprüft.

In den letzten Jahren wurden verschiedene Methoden zur Verfolgung umweltbedingter AMR berichtet ^5,27, die in^28,29 überprüft wurden. Ausgangspunkt der meisten davon ist die Extraktion von DNA guter Qualität aus heterogenen Umweltproben, was an sich schon eine Herausforderung darstellt. Darüber hinaus ist die DNA der Umwelt in der Regel fragmentiert, da sie einer feindlichen Umgebung ausgesetzt ist. Fragmentierte extrazelluläre DNA ist seit langem als wichtiges Reservoir für AMR-Gene anerkannt (überprüft in^{30, 31, 32}), mit dem zusätzlichen Potenzial, Bakterien über horizontalen Gentransfer zu betreten und zu verlassen. Daher ist es wichtig, dass jedes Protokoll, das darauf abzielt, die AMR-Belastung in der Umwelt zu messen, so gut wie möglich lineare und niedermolekulare DNA beprobt. Überraschenderweise wurde wenig Wert auf die Entwicklung von Methoden gelegt, die speziell für die Extraktion von linearer und niedermolekularer DNA mit hoher Ausbeute spezifisch sind: Diese Arbeit konzentriert sich darauf, diese Lücke zu schließen.

Eine gängige und einfache Methode zur Ausfällung von DNA ist die Kombination von Polyethylenglykol (PEG) und Salzen wie Natriumchlorid (NaCl)³³. PEG ist ein makromolekulares Crowding-Agenzmittel, das verwendet wird, um eine größenspezifische Präzipitation von DNA-Fragmenten^{zu erreichen 34,35}. Je niedriger die PEG-Konzentration, desto höher ist das Molekulargewicht der DNA, die effizient ausgefällt werden kann. In vielen Studien wurde PEG bei der Extraktion von DNA und RNA ^1,2 in der Umwelt (zusammengefasst in Tabelle 1 17,33,36,37,38,39) entweder im letzten Schritt 33,36,37 oder zur Konzentration großer Wasserproben zur Extraktion von Viruspartikeln wie bei SARS-CoV-2 ^{verwendet 15,40}. In der aktuellen Arbeit wurde festgestellt, dass die PEG-Konzentrationen, die zuvor für DNA-Extraktionen in der Umwelt verwendet wurden (weitgehend durch virale Überwachungsprotokolle bestimmt), keine lineare DNA mit niedrigem Molekulargewicht erfassen. Daher haben sie Nachsehen bei der Probenahme kurzer DNA-Fragmente und sind ungeeignet, um den AMR-Gehalt genau zu bestimmen. In dieser Studie wurden die Eigenschaften von Polyethylenglykol und Natriumchlorid genutzt, um lineare DNA-Fragmente mit niedrigem Molekulargewicht effektiv und mit hoher Ausbeute auszufällen, was in Zukunft zu einer kostengünstigen DNA-Extraktionsmethode führen kann. Diese Methode kann verwendet werden, um den Anteil an fragmentierter und niedermolekularer DNA aus komplexen natürlichen Proben anzureichern und so ein genaueres Bild der AMR in der Umwelt zu erhalten. Mit ein wenig weiterer Verfeinerung eignet sich die Technik für eine einfache und kostengünstige Anwendung durch lokale kommunale Unternehmen und andere Regierungsbehörden, um sie mit minimaler technischer Schulung als Überwachungsinstrument zu verwenden.

1. Probenahme von Abwasser

1. Tauchen Sie ein 500-ml-Polypropylen-Becherglas in den offenen Abfluss oder das Reservoir der Kläranlage (STP) und sammeln Sie ~300 mL Abwasserprobe.
2. Übertragen Sie ~250 mL der Probe in eine 250 mL Flasche aus autoklaviertem Polypropylen.
3. Schrauben Sie den Deckel der Flasche auf und verschließen Sie ihn mit einer Plastikfolie. Bewahren Sie die Flasche aufrecht in einem geschlossenen Beutel auf.
4. Transportieren Sie die Probe aufrecht in einem geschlossenen Behälter bei Umgebungstemperatur.
5. Die Probe wird 4 h lang bei 70 °C in einem Heißluftofen hitzeinaktiviert, bevor sie für die DNA-Extraktion verarbeitet wird.

2. DNA-Extraktion aus Abwasserproben

1. Sobald die Abwasserprobe abgekühlt ist, wirbeln Sie die Proben mit maximaler Geschwindigkeit und lassen Sie den Schmutz/Schlamm absetzen.
2. 27,5 mL des Abwassers in 50 mL Zentrifugenröhrchen umfüllen und 13,5 g PEG-8000 (Endkonzentration 30%) und 3 g NaCl (Endkonzentration 1,2 M) dazugeben und gut mischen, bis es sich vollständig aufgelöst hat.
3. Inkubieren Sie die Probe über Nacht (~16-18 h) bei 4 °C.
4. Zentrifugieren Sie die Probe bei 15.500 x g bei 4 °C für 30 min.
5. Entsorgen Sie den Überstand.
   HINWEIS: PEG-8000 mit 30 % ist hochviskos und das Pellet kann sich lösen, wenn der Überstand weggeworfen wird. Der Überstand sollte langsam und vorsichtig dekantiert werden, um sicherzustellen, dass das Pellet nicht verloren geht. Die Schritte 2.6 bis 2.23 werden mit dem Boden-DNA-Extraktionskit gemäß den Anweisungen des Kits mit einigen Änderungen durchgeführt.
6. Lösen Sie das Pellet in 800 μl der Lyselösung des Kits auf und geben Sie die Lösung in das gemischte Zirkoniumperlenröhrchen.
   HINWEIS: Wenn Sie größere Mengen verarbeiten, sammeln Sie die Pellets aus der gewünschten Anzahl von Röhrchen. Zum Beispiel, wenn 160 ml Probe verarbeitet werden; Es wird vier 50-ml-Röhrchen geben, die Abwasser mit PEG und NaCl enthalten. Nach Zentrifugation aller vier Röhrchen bei 15.500 x g bei 4 °C für 30 min ist der Überstand aus allen vier Röhrchen zu entsorgen. Fügen Sie jeweils 200 μl CD1-Lösung hinzu, suspendieren Sie die Pellets erneut und vereinen Sie sie in einem Bead-Röhrchen.
7. Befestigen Sie das Perlenrohr waagerecht auf einem Wirbel. Wirbeln Sie das Rohr bei maximaler Geschwindigkeit für 20-30 min.
   HINWEIS: Längeres Vortexen gewährleistet eine vollständige Lyse und Homogenisierung der Proben, was die DNA-Ausbeute verbessert.
8. Drehen Sie die Röhrchen 15 s lang bei 8.000 x g herunter, um die Kügelchen am Boden abzusetzen, Schaumbildung zu entfernen und den Überstand vollständig aus dem Röhrchen in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zu übertragen. Einige Perlen können während dieses Schritts auch übertragen werden.
9. Zentrifugieren Sie den Überstand bei 15.000 x g für 1 min.
10. Übertragen Sie den Überstand in ein sauberes 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Der Überstand kann noch einige Schwebeteilchen enthalten.
11. 200 μl Fällungslösung zugeben und 5 s lang bei maximaler Geschwindigkeit vortexen. Bei 4 °C 5 min inkubieren.
    HINWEIS: Die Inkubation bei 4 °C erhöht die Effizienz der Ausfällung von Proteinen und Zelltrümmern, während die DNA in Lösung bleibt. Es ist möglich, das Protokoll in diesem Schritt für bis zu 2 Stunden zu pausieren, ohne dass die Ausbeute und Qualität der extrahierten DNA signifikant beeinträchtigt wird.
12. Zentrifugieren Sie bei 15.000 x g für 1 min bei Raumtemperatur (RT). Vermeiden Sie das Pellet und geben Sie den klaren Überstand in ein sauberes 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
13. 600 μl Bindungspuffer pro 700 μl Überstand zugeben und 5 s lang bei maximaler Geschwindigkeit vortexen.
14. Laden Sie 700 μl des Lysats auf eine Siliziumdioxid-Spin-Säule, inkubieren Sie 2 Minuten lang und zentrifugieren Sie 1 Minute lang bei 15.000 x g .
    HINWEIS: Die Inkubation von Lysat auf einer Kieselsäuresäule verbessert die Bindung der DNA an die Säule, was zu einer besseren DNA-Ausbeute führt.
15. Der Durchfluss wird verworfen und Schritt 2.14 wiederholt, bis das gesamte Lysat die Spinsäule durchlaufen hat.
16. Setzen Sie die Spin-Säule vorsichtig in ein sauberes 2-ml-Sammelröhrchen ein. Stellen Sie sicher, dass kein Durchfluss auf die Schleudersäule spritzt.
17. Geben Sie 500 μl Waschpuffer in die Schleudersäule und zentrifugieren Sie die Schleudersäule bei 15.000 x g für 1 min.
18. Entsorgen Sie den Durchfluss und geben Sie die Spin-Säule wieder in dasselbe 2-ml-Sammelröhrchen zurück.
19. Geben Sie 500 μl Ethanol-Waschpuffer in die Schleudersäule. Zentrifugieren Sie bei 15.000 x g für 1 min.
20. Entsorgen Sie den Durchfluss und setzen Sie die Spin-Säule in ein neues 2-ml-Entnahmeröhrchen ein.
21. Zentrifugieren Sie 2 min lang bei 16.000 x g , um Ethanolreste zu entfernen. Setzen Sie die Spin-Säule in ein neues 1,5-ml-Röhrchen ein.
22. 100 μl Elutionspuffer (auf 55 °C vorgeheizt) in die Mitte der weißen Filtermembran geben und 5 Minuten inkubieren.
    HINWEIS: Beheizter Elutionspuffer erhöht zusammen mit der Inkubation auf der Membran die Effizienz der DNA-Elution, insbesondere bei hochmolekularer DNA.
23. Zentrifugieren Sie bei 15.000 x g für 1 min. Verwerfen Sie die Spin-Spalte.
24. Zu der eluierten DNA werden 10 μl 3 M NaCl (1/10 Volumen DNA-Eluat) und 250 μl gekühltes absolutes Ethanol (2,5 Volumenkörper DNA-Eluat) hinzugefügt. Zum guten Vermischen invertieren und den Inhalt 15 s lang bei 8.000 x g herunterschleudern.
25. Das DNA-Ethanol-Gemisch wird mindestens 1 h lang bei -20 °C inkubiert.
    HINWEIS: Die Inkubation des DNA-Ethanol-Gemisches kann auf 16 Stunden erhöht werden, ohne dass die Ausbeute oder Qualität der extrahierten DNA signifikant abnimmt.
26. Zentrifugieren bei 19.000 x g bei 4 °C für 30 min. Den Überstand durch Dekantieren entsorgen.
27. Geben Sie 500 μl gekühltes 70%iges Ethanol in das Pellet.
28. Zentrifugieren bei 19.000 x g bei 4 °C für 15 min. Den Überstand durch Dekantieren entsorgen.
29. Drehen Sie die Tube um und klopfen Sie vorsichtig auf Seidenpapier, um Ethanolreste durch Kapillarwirkung zu entfernen.
30. Trocknen Sie das DNA-Pellet vollständig, indem Sie die Röhrchen 5-10 Minuten lang bei 37 °C auf einem Heizblock offen halten, bis das gesamte Ethanol verdampft ist.
31. Das DNA-Pellet wird in 30-50 μl autoklaviertem, doppelt destilliertem Wasser (ddH₂O) erneut suspendiert. Bei 37 °C 5-10 min inkubieren.
32. Schleudern Sie die DNA bei 8.000 x g für 15 s herunter.
33. Wählen Sie die dsDNA-Anwendung unter den Nukleinsäuren-Einstellungen in einem Nanodrop-Spektralphotometer aus.
    1. Reinigen Sie den Sockel mit fusselfreiem Seidenpapier und Wasser. Verwenden Sie ddH₂O, um das Instrument zu verblinden, und laden Sie dann 2 μl der DNA-Probe auf den Sockel.
    2. Messen Sie die Konzentration und das Absorptionsverhältnis (A260/280 und A260/230), um die Reinheit zu bestimmen.
34. Lagern Sie die DNA-Probe bei -20 °C.

3. Präzipitation von Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-amplifizierter linearer DNA zur Überprüfung der DNA-Rückgewinnung über einen Bereich von Molekulargewichten

1. Unter Verwendung genomischer DNA von E. coli MG155 amplifizieren Sie Genfragmente durch PCR, um einen Pool linearer Fragmente aus den folgenden Genen zu erzeugen: fusA, lacZ, gapA, rpsD, 16S rRNA, marR (siehe Tabelle 2 für Primersequenzen und PCR-Bedingungen).
2. Aufreinigung der PCR-Produkte mit dem PCR-Aufreinigungskit und Bündelung der PCR-Produkte miteinander.
3. Teilen Sie die gepoolten Amplikons in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit gleichem Volumen auf und beschriften Sie ein Röhrchen mit "Eingabe-DNA".
4. Geben Sie PEG und NaCl gemäß den gewünschten Bedingungen (9 %, 20 %, 30 % PEG-8000; 0,3 M, 1,2 M NaCl) in jedes der Röhrchen mit Ausnahme des mit "Input DNA" gekennzeichneten Röhrchens und füllen Sie das endgültige Volumen auf 1 ml.
5. Inkubieren Sie die Röhrchen über Nacht (~16-18 h) bei 4 °C.
   HINWEIS: Für den Rest der Schritte bis 3.16 wird 'Input DNA' unverändert im Kühlschrank aufbewahrt.
6. Die Röhrchen werden in einer Tisch-Mikrozentrifuge entsprechend der gewünschten Geschwindigkeit (15.000 x g oder 20.000 x g) 1 h bei 4 °C gedreht.
7. Entfernen Sie vorsichtig 900 μl des Überstands von der dem Pellet gegenüberliegenden Seite mit einer Mikropipette.
8. Erste Ethanolwäsche: Geben Sie 900 μl gekühltes 70%iges Ethanol in das Pellet und mischen Sie, indem Sie die Röhrchen vorsichtig umdrehen.
9. Die Röhrchen mit der gleichen Geschwindigkeit wie in Schritt 3.6 (15.000 x g oder 20.000 x g) für 30 min bei 4 °C drehen.
10. Entfernen Sie den Überstand durch Dekantieren.
11. Zweite Ethanolwäsche: Geben Sie 500 μl gekühltes 70%iges Ethanol in das Pellet.
12. Die Röhrchen mit der gleichen Geschwindigkeit wie in Schritt 3.6 (15.000 x g oder 20.000 x g) für 30 min bei 4°C drehen. Den Überstand durch Dekantieren entsorgen.
13. Drehen Sie die Tube um und klopfen Sie vorsichtig auf Seidenpapier, um Ethanolreste durch Kapillarwirkung zu entfernen.
14. Trocknen Sie das DNA-Pellet vollständig, indem Sie die Röhrchen 5-10 Minuten lang bei 37 °C auf einem Heizblock offen halten, bis das gesamte Ethanol verdampft ist.
15. Das Pellet wird in 20 μl autoklaviertem, doppelt destilliertem Wasser wieder suspendiert.
16. Messen Sie die Konzentration der DNA, die unter den verschiedenen Bedingungen ausgefällt wird, und die "Eingangs-DNA" mit einem Nanodrop-Spektralphotometer oder Fluorometer.
17. Laden Sie die gefällte DNA auf ein 1%iges Agarosegel zur DNA-Visualisierung.

Etablierung eines Protokolls für die Extraktion von DNA aus Abwasserproben mit hoher Ausbeute
Für die Extraktion von hochwertiger DNA und RNA aus Wasserproben wurde eine modifizierte Version von zuvor etablierten Protokollen verwendet¹⁷. Die Proben stammten aus offenen Abflüssen sowie aus Kläranlagen in der Region Delhi-NCR in Nordindien. Nach der Vorverarbeitung mit PEG und NaCl (Abbildung 1) wurden die Proben durch Kits zur Extraktion von DNA aus Boden und Wasser verarbeitet. In allen ^{Fällen wurde eine} prominente Bande mit hohem Molekulargewicht beobachtet, die wahrscheinlich der intrazellulären bakteriellen DNA und einem Hintergrundabstrich entspricht, wie er für Umweltproben^{typisch ist 37} (Abbildung 2).

Mangel an effizienter DNA-Extraktion aus den Abwässern von Kläranlagen
Obwohl eine angemessene Ausbeute an Gesamt-DNA aus offenen Abflüssen und STP-Zuflüssen gewonnen wurde (Tabelle 3), konnte keine DNA aus dem endbehandelten Abwasser gewonnen werden; Probleme mit geringer Ausbeute wurden auch in früheren Arbeiten beschrieben⁴¹ (Abbildung 3). Nach der Behandlung, die die Chlorierung des Abwassers und in einigen Fällen sowohl UV- als auch Ultrafiltrationsbehandlungen⁴² umfasst, wird erwartet, dass die mikrobielle Belastung gering ist, und die verbleibende DNA (bestehend aus extrazellulärer und fragmentierter DNA) wird verdünnt. Die anfänglich niedrige Konzentration von PEG, die bei der Probenkonzentration und der Nukleinsäurefällung verwendet wird, könnte möglicherweise niedermolekulare DNA ausschließen. Mit anderen Worten, die fragmentierte DNA könnte im ersten Konzentrationsschritt verloren gehen.

Steigende Konzentrationen von PEG und NaCl führen zur Ausfällung von DNA mit niedrigerem Molekulargewicht
Um zu testen, ob eine Erhöhung der PEG-Konzentration zur Anreicherung von DNA mit niedrigerem Molekulargewicht beiträgt, wurde ein Laborstandard von PCR-Fragmenten unterschiedlicher Länge erstellt, wodurch eine Reihe linearer DNA-Fragmente erstellt wurde (Abbildung 4). Der Standard wurde vier verschiedenen Ausfällungsbedingungen unterzogen - 9 % PEG-8000 + 0,3 M NaCl (die ursprüngliche Kombination), 9 % PEG-8000 + 1,2 M NaCl (nur Salzaufwirbelung), 30 % PEG-8000 + 0,3 M NaCl (nur Anhebung von PEG) und 30 % PEG-8000 + 1,2 M NaCl (Anhebung von Salz und PEG). Die Bedingungen wurden auf der Grundlage des Standardprotokolls ausgewählt, das für die SARS-CoV-2-Überwachung verwendet wird¹⁷ und auf der Grundlage von Bedingungen, die in einer Studie über modulare Methoden der DNA-Extraktion aus Umweltproben^{berichtet wurden 33}. Es wurden zwei unterschiedliche Zentrifugationsgeschwindigkeiten - 15.000 x g und 20.000 x g - verwendet, basierend auf den Auswirkungen unterschiedlicher Geschwindigkeiten auf die DNA-Pelletierung⁴³. Bei Erhöhung der PEG- und NaCl-Konzentrationen auf 30 % bzw. 1,2 M stieg die Gesamtrückgewinnung der DNA um etwa 70 %, und DNA-Fragmente mit einer Größe von nur 150 Basenpaaren (bp) wurden effektiv ausgefällt (Abbildung 5). Der Geschwindigkeitsunterschied hatte keinen großen Einfluss auf die Ausbeute (Abbildung 6A) und könnte auf die lange Zentrifugationszeit zurückzuführen sein. Da die Gesamt-DNA-Wiederfindung in der ursprünglichen PEG/NaCl-Kombination geringer war, war es möglich, dass die niedrigeren Molekulargewichtsbanden, obwohl vorhanden, eine Konzentration unterhalb der Visualisierungsgrenze aufwiesen. Um dies zu testen, wurde die Menge an Eingangs-DNA für die Fällung erhöht, und ein Überschuss an DNA, der jeder Behandlung entsprach (1,5 mg), wurde zur Visualisierung auf das Agarosegel geladen. Nur die Behandlung mit 30 % PEG zeigte eine gute Wiederfindung des niedrigsten Molekulargewichts, d. h. der 150 bp-Bande (Abbildung 6B).

Die Ausfällung von zirkulärer DNA (bakterielle Genom- und Plasmid-DNA) folgt nicht dem gleichen Trend
E. coli MG155 genomische DNA und Plasmid (pRSV, ~4 kb) wurden für die Präzipitation mit unterschiedlichen PEG- und NaCl-Konzentrationen verwendet. Anders als bei linearer DNA gab es keine signifikanten Auswirkungen der Erhöhung der PEG- und NaCl-Spiegel (Abbildung 7), was darauf hindeutet, dass die Ausbeute an zirkulärer und hochmolekularer DNA (typischerweise intrazelluläre DNA) durch eine Erhöhung der PEG nicht beeinflusst wird. Dies steht im Gegensatz zu früheren Beobachtungen mit Proteinfällung⁴⁴, bei denen die Löslichkeit mit der PEG-Konzentration stark abnahm. Angesichts der Tatsache, dass PEG als Crowding-Agent wirkt, wird die Hypothese aufgestellt, dass die für die Wechselwirkung verfügbare Oberfläche des Makromoleküls eine wichtige Rolle für seine Wirksamkeit als Fällungsmittel spielt. Bei linearer DNA ist es vernünftig anzunehmen, dass mit zunehmender Größe auch die für die Interaktion verfügbare Fläche zunimmt. Bei zirkulärer DNA ist es möglich, dass niedrige PEG-Konzentrationen bereits ausreichen, um das Molekül zu sättigen, und eine weitere Erhöhung der Konzentration erhöht möglicherweise nicht die effektive Oberfläche für die Interaktion.

Schlechte Ausbeute an DNA aus Abwasser, wenn die Vorverarbeitung von Fällungen mit PEG und NaCl unterbleibt
Um zu testen, ob die Voraufbereitung von Abwasser für die DNA-Extraktion entscheidend ist, wurden 20 ml hitzeinaktiviertes (70 °C, 4 h) Abwasser mit 10 mg zuvor hergestelltem linearem Standard versetzt und über Nacht bei 4 °C (a) ohne PEG + NaCl, (b) mit 9 % PEG + 0,3 M NaCl (ursprüngliche Kombination) und (c) mit 20 % PEG + 1,2 M NaCl (erhöhtes PEG und Salz) inkubiert. Die Proben wurden dann durch das Bodenkit für die DNA-Extraktion verarbeitet, wie im Protokoll erläutert. Es wurde festgestellt, dass die Ausbeute an extrahierter DNA bei der Vorverarbeitung von Abwasserproben mit 9 % PEG + 0,3 M NaCl um 60 % im Vergleich zu keinem Vorverarbeitungsschritt steigt (Abbildung 8), was darauf hindeutet, dass die Vorverarbeitung von PEG- und NaCl-Fällung entscheidend ist, um DNA mit hoher Ausbeute aus Abwasserproben zu erhalten. Bemerkenswert ist auch, dass die Gesamtausbeute an DNA, einschließlich hochmolekularer genomischer DNA (gDNA), zwar geringer ist, wenn hohe PEG und Salz für die Ausfällung verwendet werden, der Anteil der DNA mit niedrigerem Molekulargewicht jedoch angereichert ist (Abbildung 8). Der Rückgang der Gesamtausbeute bei der Aufzucht von PEG und Salz ist auf die hochviskose Natur von PEG zurückzuführen, die beim Entfernen des Überstands zum Verlust von DNA-Pellets führen kann. Dies stärkt die Argumente für die vorgeschlagene schrittweise DNA-Extraktionsmethode (Abbildung 9), bei der hochmolekulare DNA zunächst mit geringer PEG- und NaCl-Fällung extrahiert werden kann und der resultierende Überstand einer weiteren Vorverarbeitungsrunde mit erhöhtem PEG und NaCl unterzogen werden kann, um die niedermolekulare DNA, die der ersten Ausfällungsrunde entkommen ist, effizient zu extrahieren.

Abbildung 1: Vorverarbeitung von Abwasserproben. Schematische Darstellung des Arbeitsablaufs von der Probenentnahme bis zur DNA-Extraktion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Typisches Gelprofil von DNA, die aus Abwasserproben extrahiert wurde. Ein Volumen von 50-100 mL (wie in der Abbildung dargestellt) Abwasser, das an verschiedenen Standorten entnommen wurde, wurde durch Inkubation bei 70 °C für 4 h wärmeinaktiviert. Es wurde dann über Nacht bei 4 °C mit 9 % PEG und 0,3 M NaCl inkubiert und dann zur DNA-Extraktion entweder aus Erde oder einem Wasserkit verarbeitet. Etwa 150 ng der extrahierten Gesamt-DNA wurden auf ein 1%iges Agarosegel zusammen mit einer 1-Kilo-Basen-Paar-Leiter (kb) als Marker geladen und einer Elektrophorese unterzogen (90 V, 30 min). Die DNA wurde unter ultraviolettem (UV) Licht mit dem Farbstoff SYBR SAFE sichtbar gemacht. In der Tabelle auf der rechten Seite sind die Probenentnahmequellen, das Volumen des verarbeiteten Abwassers und das für die DNA-Extraktion verwendete Kit für jede Spur aufgeführt. (STP: Kläranlage; UVR: Ultraviolette Strahlung) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: STP-Abwasserproben zeigen geringe Gesamt-DNA-Ausbeuten. Ein Volumen von 40 mL Abwasser, das aus dem Zulauf und dem Abwasser der Kläranlage entnommen wurde, wurde durch Inkubation bei 70 °C für 4 h wärmeinaktiviert. Es wurde dann über Nacht bei 4 °C mit 9 % PEG und 0,3 M NaCl inkubiert und dann zur DNA-Extraktion mit einem Boden- oder Wasser-Kit oder einem bakteriellen genomischen DNA-Extraktionskit verarbeitet. Etwa 150 ng der extrahierten Gesamt-DNA wurden auf ein 1%iges Agarosegel zusammen mit einer 1-kb-Leiter als Marker geladen und einer Elektrophorese (90 V, 30 min) unterzogen. Die DNA wurde unter ultraviolettem (UV) Licht mit dem Farbstoff SYBR SAFE sichtbar gemacht. Die Konzentration der extrahierten DNA für die Abwasserproben lag unter 1 ng/ml Abwasser und konnte daher nicht visualisiert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Generierung eines linearen DNA-Größenstandards, um die Wirksamkeit der niedermolekularen DNA-Fällung zu testen. Fünf unterschiedlich große DNA-Fragmente wurden durch PCR-Amplifikation unter Verwendung von genomischer DNA von E. coli (MG1655) als Template sowie Primern und Bedingungen, wie in Tabelle 2 beschrieben, erzeugt. Die mit dem PCR-Aufreinigungskit aufgereinigte DNA (~1 μg) wurde zusammen mit einer 1 kb-Leiter als Marker auf ein 1%iges Agarosegel geladen und einer Elektrophorese (90 V, 40 min) unterzogen. Die DNA wurde unter ultraviolettem (UV) Licht mit dem Farbstoff SYBR SAFE sichtbar gemacht. Die Lanes sind durch Gennamen, aus denen das Fragment amplifiziert wurde, und die erwartete Amplikongröße gekennzeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: DNA mit niedrigem Molekulargewicht wird nur bei der höchsten (30%) PEG-Konzentration effizient zurückgewonnen. Die Eingangs-DNA (3,34 μg) aus dem zuvor generierten Größenstandard wurde mit verschiedenen Kombinationen von PEG und NaCl behandelt, wie in der Abbildung gezeigt, und extrahiert, wie im Protokoll beschrieben. Die verwendete Zentrifugationsgeschwindigkeit betrug 15.000 x g. Für Input (Spur 3) und 1,2 M NaCl + 30% PEG (Spur 7) wurden 0,8 μg DNA auf das Gel geladen. Da die Gesamtausbeute gering war, wurde für den Rest die Gesamtmenge der in 16 μl extrahierten DNA geladen und 1 kb Leiter als Größenmarker auf ein 1%iges Agarosegel geladen und einer Elektrophorese unterzogen (80 V, 45 min). Die DNA wurde unter ultraviolettem (UV) Licht mit dem Farbstoff SYBR SAFE sichtbar gemacht. Das weiße Feld zeigt das niedrigste Band von 150 bp. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Die Wiederfindung von niedermolekularer DNA wird eher durch hohe PEG-Konzentrationen als durch hohe Salzkonzentrationen bestimmt. (A) Die Eingangs-DNA (14 μg) aus dem Größenstandard wurde mit verschiedenen Kombinationen von PEG und NaCl behandelt, wie in der Abbildung gezeigt, und mittels Ethanolfällung extrahiert, wie im Protokoll beschrieben. Die verwendete Zentrifugationsgeschwindigkeit betrug 15.000 x g und 20.000 x g, wie in der Abbildung dargestellt. Die gesamte Menge der eingegebenen und der extrahierten DNA wurde zusammen mit der 1-kb-Leiter auf ein 1%iges Agarosegel geladen und einer Elektrophorese (90 V, 30 min) unterzogen. Die DNA wurde unter ultraviolettem (UV) Licht mit dem Farbstoff SYBR SAFE sichtbar gemacht. (B) Die Eingangs-DNA (15,67 μg) aus dem zuvor erzeugten Größenstandard wurde mit verschiedenen Kombinationen von PEG und NaCl behandelt, wie in der Abbildung gezeigt, und wie im Protokoll beschrieben extrahiert. Die verwendete Zentrifugationsgeschwindigkeit betrug 15.000 x g. Extrahierte DNA (1,5 μg) wurde in jede Spur geladen und 1 kb Leiter wurde als Größenmarker auf ein 1%iges Agarosegel geladen und einer Elektrophorese unterzogen (80 V, 45 min). Die DNA wurde unter ultraviolettem (UV) Licht mit dem Farbstoff SYBR SAFE sichtbar gemacht. Das weiße Feld zeigt das niedrigste Band von 150 bp. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7: Die Rückgewinnung von genomischer DNA und Plasmid-DNA wird durch eine Erhöhung der PEG- und NaCl-Konzentration nicht signifikant beeinflusst. Die Eingangs-DNA (9 μg; 4,5 μg Plasmid und 4,5 μg genomische DNA) wurde mit verschiedenen Kombinationen von PEG und NaCl behandelt, wie in der Abbildung gezeigt, und extrahiert, wie im Protokoll beschrieben. Die verwendete Zentrifugationsgeschwindigkeit betrug 15.000 x g. Die gesamte Menge an Eingangs-DNA und extrahierter DNA wurde zusammen mit einer 1-kb-Leiter auf ein 1%iges Agarosegel geladen und einer Elektrophorese (90 V, 45 min) unterzogen. Die DNA wurde unter ultraviolettem (UV) Licht mit dem Farbstoff SYBR SAFE sichtbar gemacht. Die weißen Kästchen zeigen die genomische DNA und die Plasmid-DNA an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 8: Die Vorverarbeitung der Fällung mit PEG und NaCl ist entscheidend für die Extraktion von DNA aus Abwässern mit hoher Ausbeute. Hitzeinaktiviertes (70 °C, 4 h) Abwasser (20 mL) wurde mit 10 mg zuvor hergestelltem linearem Standard versetzt und über Nacht bei 4 °C ohne PEG und NaCl oder mit unterschiedlichen PEG- und NaCl-Konzentrationen, wie in der Abbildung gezeigt, inkubiert. Es wurde dann verarbeitet, um DNA mit einem Bodenkit zu extrahieren. Die für das Spiking verwendete Eingangs-DNA (4 μg) und die extrahierte DNA (4 μg) mit einem Vorverarbeitungsschritt von 9 % PEG + 0,3 M NaCl (Spur 3) wurden auf ein 1 %iges Agarosegel geladen. Für den Rest der Bedingungen wurde die gesamte Menge der extrahierten DNA auf das Gel geladen, da die Ausbeute gering war. Als Größenmarkierung wurde auch eine 1 kb Leiter geladen. Das Gel wurde einer Elektrophorese (70 V, 2 h) unterzogen. Die DNA wurde unter ultraviolettem (UV) Licht mit dem Farbstoff SYBR SAFE sichtbar gemacht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 9: Vorgeschlagene schrittweise Methode zur DNA-Extraktion aus Abwasser, um sowohl hochmolekulare als auch niedermolekulare DNA anzureichern. Flussdiagramm, das eine zweistufige Methode zur DNA-Extraktion aus Abwasser mit einem ersten Vorverarbeitungsschritt unter Verwendung niedriger PEG- und NaCl-Konzentrationen darstellt. Der Überstand aus dem ersten Schritt wird einer weiteren Runde der Vorverarbeitungsfällung mit erhöhtem PEG und NaCl unterzogen, um sowohl hochmolekulare als auch niedermolekulare DNA effektiv aus dem Abwasser zu extrahieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1. Vorherige Verwendung von PEG und NaCl in Studien zur DNA-Extraktion aus Umweltproben. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2. Primersequenzen und PCR-Bedingungen für die Standardgenerierung. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 3. DNA-Ausbeute und -Qualität, die über einen Zeitraum von zwei Monaten im Jahr 2023 aus Abwasserproben gewonnen wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

AMR ist heute eine der 10 größten Gesundheitsbedrohungen, wie von der WHO aufgeführt, und die Umweltüberwachung für AMR ist weltweit als wichtiges Instrument anerkannt. Wie in der Einleitung erwähnt, umfasst eine umfassende Aufzeichnung von umweltbedingter AMR niedermolekulare, fragmentierte und extrazelluläre DNA. Das hier beschriebene Vorverarbeitungsprotokoll mit einer hohen Konzentration von PEG in Kombination mit Salz (30 % PEG und 1,2 M NaCl) erreicht dieses Ergebnis, indem es den Anteil an niedermolekularer DNA anreichert, ohne die Extraktion von Fraktionen mit höherem Molekulargewicht (hauptsächlich genomische und Plasmid-DNA) zu beeinträchtigen. Dies steht im Gegensatz zu früheren Konzentrationsmethoden mit niedrigerem PEG und direkten Kit-Protokollen (ohne Vorverarbeitung), die aufgrund der Notwendigkeit, große Volumina zu verarbeiten, umständlich sind. Die Vorverarbeitung mit niedrigeren PEG-Konzentrationen war ineffizient bei der Rückgewinnung von niedermolekularer DNA ("niedrig" bezieht sich hier auf DNA-Banden unter 600 bp). Wenn während der Vorverarbeitung keine PEG verwendet wird, ist die DNA-Extraktion schlecht, was dazu führt, dass nur 10 % der Eingangs-DNA zurückgewonnen werden, im Gegensatz zu 70 % bei der Verwendung von PEG und NaCl (Abbildung 8). Neben der Zugabe von PEG und NaCl ist ein weiterer wichtiger Schritt die Entfernung von Ethanolresten nach der DNA-Extraktion aus dem Kit, um reine DNA für die nachgelagerte Verarbeitung zu erhalten. Es ist wichtig, das anfängliche Wasservolumen zu bestimmen, das benötigt wird, um eine Gesamtmenge von mindestens ~300 ng bis 5 mg DNA in einem Volumen von 30-50 ml nach der Elution zu erhalten. Im Gegensatz zu 1 l oder mehr Wasser, das typischerweise für die DNA-Extraktion aus Abwasser aufbereitet wird^27,41, wurde festgestellt, dass mit dem hier vorgeschlagenen Vorverarbeitungsschritt lediglich 27,5-40 ml ausreichen, um hochwertige DNA für die nachgelagerte Verarbeitung zu erhalten. Das Abwasser enthält auch Feinstaub und organische Stoffe, die adsorbierte Bakterienzellen und extrazelluläre DNA enthalten können. Daher ist die Desorption von Zellen und DNA zusammen mit der Zelllyse ein wichtiger Schritt zur Steigerung der DNA-Ausbeute. Hohe PEG-Konzentrationen machen die Probe viskos und können, wie bereits erwähnt, die Lyse- und Desorptionsschritte für die DNA-Extraktion behindern. Um dies zu vermeiden, wurde eine schrittweise Methode der DNA-Extraktion vorgeschlagen, die im Flussdiagramm dargestellt ist (Abbildung 9). Diese Methode wird bei der Extraktion sowohl intrazellulärer hochmolekularer DNA (Abbildung 7) als auch extrazellulärer fragmentierter und zirkulärer DNA mit niedrigem Molekulargewicht hilfreich sein.

Eine derzeitige Einschränkung dieses Protokolls in Bezug auf die Kosten ist die kontinuierliche Verarbeitung von angereicherter niedermolekularer DNA durch ein Kit zur Qualitätsverbesserung. Diese Einschränkung kann möglicherweise mit anderen Methoden der DNA-Aufreinigung, wie der Phenol-Chloroform-Extraktion, umgangen werden. Eine weitere praktische Einschränkung ist der Umgang mit hohen PEG-Konzentrationen, da das Pellet aufgrund der hohen Viskosität der Lösung verloren gehen kann. Derzeit wird eine Vorverarbeitung mit PEG und NaCl durchgeführt, gefolgt von einer modifizierten Version eines bestehenden Kit-Protokolls, d.h. das Kit wird weiterhin für die endgültige DNA-Aufreinigung verwendet. Eine kit-freie Aufreinigung von DNA, die eine hohe DNA-Ausbeute bei geringer Reinheit liefert (hier nicht berichtet), wird optimiert, um die Qualität der extrahierten DNA zu verbessern. Aufgrund der viskosen Beschaffenheit von PEG-Lösungen ist eine optimale PEG-Konzentration anzustreben, die eine breite Palette von DNA-Größen ergeben kann und dennoch komfortabel gehandhabt werden kann. Eine Senkung der Konzentration auf 20 % (Abbildung 6B) führte zu einem Ergebnis, das zwischen den Extraktionseffizienzen von niedrigem (9 %) und hohem (30 %) PEG lag; Dies könnte es wert sein, in zukünftigen Arbeiten weiterverfolgt zu werden.

PEG wird routinemäßig in verschiedenen Schritten der DNA-Extraktion aus Umweltproben eingesetzt. Die Verwendung von PEG für die DNA-Extraktion im Rahmen der AMR-Überwachung ist jedoch nicht standardisiert. Die Abwasserüberwachung umfasst den Nachweis von Antibiotikaresistenzen in vielen verschiedenen Nischen, einschließlich STPs (Zu- und Abflüssen) sowie offenen und geschlossenen Abflüssen ^8,27. Während die Informationen über AMR im Zufluss wichtige Informationen über die in der Gemeinschaft zirkulierende Resistenz liefern, ist das Vorhandensein von AMR-Genen im Abwasser ebenso wichtig, um das Auftreten von Resistenzausbrüchen zu messen und möglicherweise vorherzusagen. Abwasserproben weisen in der Regel eine geringe mikrobielle Belastung auf, da die meisten Zellen während des Behandlungsprozesses abgetötet werden, was zu einer sehr geringen Ausbeute an zellulärer DNA führt. Abwässer enthalten jedoch extrazelluläre, frei schwebende DNA, die sowohl hochmolekulare genomische DNA als auch niedermolekulare Plasmide, Phagenmide und fragmentierte DNA umfasst. AMR-Gene, die in niedermolekularer DNA vorhanden sind (sowohl fragmentierte als auch Plasmide/Phagenmide), können auf die verbleibenden lebenden Zellen im Abwasser übertragen werden, was zur Verbreitung von Resistenzen führt 30,41,45. Daher ist es wichtig, niedermolekulare extrazelluläre DNA im Abwasser nachzuweisen. Andere Methoden, die für die DNA-Extraktion aus Abwasser bei der Beurteilung von AMR eingesetzt werden, gewährleisten in der Regel keine anfängliche Anreicherung von DNA mit niedrigem Molekulargewicht. Dieser Ansatz der DNA-Extraktion aus Abwasser kann genutzt werden, um Informationen über einen umfassenden Widerstand der Umwelt zu erhalten.

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Wir danken für die finanzielle Unterstützung durch die Rockefeller Foundation (Rockefeller Foundation Grant Number 2021 HTH 018) als Teil des APSI India Teams (Alliance for Pathogen Surveillance Innovations https://data.ccmb.res.in/apsi/team/). Wir danken auch der finanziellen Unterstützung durch die Axis Bank zur Unterstützung dieser Forschung und der Trivedi School of Biosciences an der Ashoka University für Ausrüstung und andere Unterstützung.