Extração aprimorada de DNA de baixo peso molecular de águas residuais para avaliação abrangente da resistência antimicrobiana

Aqui, apresentamos uma técnica simples para avaliar a resistência antimicrobiana ambiental (AMR), aumentando a proporção de DNA extracelular de baixo peso molecular. O tratamento prévio com 20%-30% de PEG e 1,2 M NaCl permite a detecção de genes de AMR genômicos e transferidos horizontalmente. O protocolo se presta a um processo sem kit com otimização adicional.

A vigilância ambiental é reconhecida como uma importante ferramenta de avaliação da saúde pública na era pós-pandemia. A água, em particular as águas residuais, surgiu como a fonte de escolha para amostrar as cargas de patógenos no meio ambiente. As águas residuais de drenos abertos e estações de tratamento de água comunitárias são um reservatório de patógenos e genes de resistência antimicrobiana (AMR) e frequentemente entram em contato com humanos. Embora existam muitos métodos de rastreamento de AMR da água, isolar DNA de boa qualidade com alto rendimento de amostras heterogêneas continua sendo um desafio. Para compensar, os volumes de amostra geralmente precisam ser altos, criando restrições práticas. Além disso, o DNA ambiental é frequentemente fragmentado e as fontes de AMR (plasmídeos, fagos, DNA linear) consistem em DNA de baixo peso molecular. No entanto, poucos processos de extração se concentraram em métodos para extração de alto rendimento de DNA linear e de baixo peso molecular. Aqui, um método simples para extração linear de DNA de alto rendimento de pequenos volumes de águas residuais usando as propriedades de precipitação do polietilenoglicol (PEG) é relatado. Este estudo defende o aumento do rendimento geral de DNA de amostras de água coletadas para análises metagenômicas, enriquecendo a proporção de DNA linear. Além disso, o aprimoramento do DNA de baixo peso molecular supera o problema atual de subamostragem de AMR ambiental devido ao foco no DNA intracelular e de alto peso molecular. Espera-se que este método seja particularmente útil quando existe DNA extracelular, mas em baixas concentrações, como com efluentes de estações de tratamento. Também deve melhorar a amostragem ambiental de fragmentos do gene AMR que se espalham por meio da transferência horizontal de genes.

O SARS-CoV-2 e suas consequências sublinharam a importância da vigilância ambiental no monitoramento e previsão de surtos de doenças infecciosas ^1,2. Embora as pandemias virais sejam aparentes, o aumento da resistência antimicrobiana (RAM) é frequentemente descrito como uma pandemia insidiosa e que constitui uma das principais preocupações de saúde pública em todo o mundo ^3,4. Consequentemente, há uma necessidade urgente de estratégias coordenadas para entender a evolução e a disseminação da RAM. Corpos d'água, assim como águas residuais, podem servir como reservatórios tanto para patógenos quanto para AMR 5,6,7,8. As fontes de água compartilhadas são, portanto, uma fonte potente de transmissão de doenças entre os seres humanos, particularmente em países de baixa e média renda (LMIC), onde a falta de higiene e a superpopulação andam de mãos dadas ^9,10,11. O teste de fontes de água tem sido empregado há muito tempo para avaliar a saúde da comunidade 12,13,14. Recentemente, as águas residuais das estações de tratamento de esgoto urbano provaram ser um bom indicador antecipado de casos de COVID na clínica 1,2,15,16,17,18.

Em comparação com o monitoramento de doenças específicas, detectar e rastrear a RAM no ambiente representa um problema mais complexo. O grande número de antibióticos em uso, diversos genes de resistência, diferentes pressões de seleção local e transferência horizontal de genes entre bactérias dificultam a avaliação da verdadeira carga de RAM e, uma vez avaliada, correlacioná-la com observações clínicas 19,20,21,22. Como resultado, enquanto a vigilância concertada da RAM clínica está sendo realizada por várias organizações em todo o mundo ^3,23,24, o monitoramento ambiental da RAM ainda está em sua infância, revisado em 19,25,26.

Nos últimos anos, diferentes métodos de rastreamento de RAM ambiental foram relatados ^5,27, revisados em^28,29. O ponto de partida da maioria deles é a extração de DNA de boa qualidade de amostras ambientais heterogêneas, o que por si só é um desafio. Além disso, o DNA ambiental é tipicamente fragmentado devido à exposição a ambientes hostis. O DNA extracelular fragmentado há muito é reconhecido como um importante reservatório de genes AMR (revisado em 30,31,32), com o potencial adicional de entrar e sair de bactérias por meio da transferência horizontal de genes. Portanto, é importante que qualquer protocolo que vise medir a carga de AMR no ambiente deve coletar amostras de DNA linear e de baixo peso molecular da melhor maneira possível. Surpreendentemente, tem havido pouco foco no desenvolvimento de métodos específicos para extração de alto rendimento de DNA linear e de baixo peso molecular: este trabalho se concentra em abordar a lacuna.

Um método comum e simples para precipitar o DNA é combinar polietilenoglicol (PEG) e sais como cloreto de sódio (NaCl) ³³ . O PEG é um agente de aglomeração macromolecular usado para obter precipitação específica de tamanho de fragmentos de DNA^34,35. Quanto menor a concentração de PEG, maior o peso molecular do DNA que pode ser precipitado com eficiência. Muitos estudos utilizaram o PEG durante a extração ambiental de DNA e RNA ^1,2 (resumido na Tabela 1 17,33,36,37,38,39) seja na etapa final 33,36,37 ou para concentrar grandes amostras de água para extração de partículas virais como no SARS-CoV-2 ^15,40. No presente trabalho, verifica-se que as concentrações de PEG usadas anteriormente para extrações de DNA ambiental (em grande parte determinadas por protocolos de vigilância viral) não capturam DNA linear de baixo peso molecular. Portanto, eles perdem na amostragem de fragmentos curtos de DNA e são inadequados para avaliar o conteúdo de AMR com precisão. Este estudo explorou as propriedades do polietilenoglicol e do cloreto de sódio para precipitar efetivamente fragmentos de DNA linear de baixo peso molecular com alto rendimento que pode, no futuro, levar a um método de extração de DNA econômico. Este método pode ser usado para enriquecer a proporção de DNA fragmentado e de baixo peso molecular de amostras naturais complexas, capturando assim uma imagem mais precisa da RAM ambiental. Com um pouco mais de refinamento, a técnica se presta a uma aplicação fácil e de baixo custo por corporações municipais locais e outros órgãos governamentais para usar como uma ferramenta de vigilância com treinamento técnico mínimo.

1. Amostragem de águas residuais

1. Mergulhe um béquer de polipropileno de 500 mL no reservatório aberto do dreno ou da estação de tratamento de esgoto (STP) e colete ~ 300 mL de amostra de águas residuais.
2. Transfira ~ 250 mL da amostra para um frasco de polipropileno autoclavado de 250 mL.
3. Enrosque a tampa da garrafa e feche-a com um filme plástico. Mantenha a garrafa na posição vertical em um saco fechado.
4. Transporte a amostra na vertical em um recipiente fechado à temperatura ambiente.
5. Inativar a amostra a 70 °C em estufa de ar quente durante 4 h antes de a processar para extração de ADN.

2. Extração de DNA de amostras de águas residuais

1. Uma vez que a amostra de águas residuais é resfriada, vortex as amostras na velocidade máxima e deixe os detritos / lodo assentarem.
2. Transvase 27,5 mL de águas residuais em tubos de centrífuga de 50 mL e adicione 13,5 g de PEG-8000 (concentração final de 30%) e 3 g de NaCl (concentração final de 1,2 M) e misture bem até dissolver completamente.
3. Incubar a amostra durante a noite (~16-18 h) a 4 °C.
4. Centrifugue a amostra a 15.500 x g a 4 °C por 30 min.
5. Descarte o sobrenadante.
   NOTA: PEG-8000 a 30% é altamente viscoso e o pellet pode ser desalojado ao descartar o sobrenadante. O sobrenadante deve ser decantado lenta e cuidadosamente para garantir que o pellet não se perca. As etapas 2.6 a 2.23 são executadas usando o kit de extração de DNA do solo de acordo com as instruções do kit com algumas modificações.
6. Dissolva o pellet em 800 μL da solução de lise do kit e adicione a solução ao tubo de esferas de zircônio misturado.
   NOTA: Se estiver processando volumes maiores, agrupe os pellets do número desejado de tubos. Por exemplo, se estiver processando 160 mL de amostra; haverá quatro tubos de 50 mL contendo águas residuais com PEG e NaCl. Após centrifugação de todos os quatro tubos a 15.500 x g a 4 ° C por 30 min, descarte o sobrenadante de todos os quatro tubos. Adicione 200 μL de solução de CD1 a cada um, ressuspenda os pellets e agrupe-os em um tubo de esferas.
7. Prenda o tubo do cordão horizontalmente em um vórtice. Vortex o tubo na velocidade máxima por 20-30 min.
   NOTA: O vórtice prolongado garante a lise completa e homogeneização das amostras, o que melhora o rendimento do DNA.
8. Gire os tubos a 8.000 x g por 15 s para assentar os grânulos no fundo, remover a espuma e transferir o sobrenadante completamente do tubo para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Algumas contas também podem ser transferidas durante esta etapa.
9. Centrifugue o sobrenadante a 15.000 x g por 1 min.
10. Transfira o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga limpo de 2 mL. O sobrenadante ainda pode conter algumas partículas em suspensão.
11. Adicionar 200 μL de solução precipitante e vórtice à velocidade máxima durante 5 s. Incubar a 4 °C durante 5 min.
    NOTA: A incubação a 4 °C aumenta a eficiência da precipitação de proteínas e detritos celulares enquanto o DNA permanece em solução. É possível pausar o protocolo nesta etapa por até 2 h sem uma diminuição significativa no rendimento e na qualidade do DNA extraído.
12. Centrifugue a 15.000 x g por 1 min em temperatura ambiente (RT). Evite o pellet e transfira o sobrenadante transparente para um tubo de microcentrífuga limpo de 2 mL.
13. Adicione 600 μL de tampão de ligação por 700 μL de sobrenadante e vórtice na velocidade máxima por 5 s.
14. Carregue 700 μL do lisado em uma coluna de centrifugação de sílica, incube por 2 min e centrifugue a 15.000 x g por 1 min.
    NOTA: A incubação do lisado na coluna de sílica aumenta a ligação do DNA à coluna, resultando em melhor rendimento de DNA.
15. Rejeitar o fluxo e repetir o passo 2.14 até que todo o lisado tenha passado pela coluna de centrifugação.
16. Coloque cuidadosamente a coluna de centrifugação em um tubo de coleta limpo de 2 mL. Certifique-se de que nenhum fluxo seja respingado na coluna de rotação.
17. Adicione 500 μL de tampão de lavagem à coluna de centrifugação e centrifugue a coluna de centrifugação a 15.000 x g por 1 min.
18. Descarte o fluxo e retorne a coluna de centrifugação para o mesmo tubo de coleta de 2 mL.
19. Adicione 500 μL de tampão de lavagem de etanol à coluna de centrifugação. Centrifugue a 15.000 x g por 1 min.
20. Descarte o fluxo e coloque a coluna de centrifugação em um novo tubo de coleta de 2 mL.
21. Centrifugue a 16.000 x g por 2 min para remover o etanol residual. Coloque a coluna de centrifugação em um novo tubo de 1,5 mL.
22. Adicione 100 μL de tampão de eluição (pré-aquecido a 55 °C) no centro da membrana do filtro branco e incube por 5 min.
    NOTA: O tampão de eluição aquecido, juntamente com a incubação na membrana, aumenta a eficiência da eluição do DNA, especialmente do DNA de alto peso molecular.
23. Centrifugue a 15.000 x g por 1 min. Descarte a coluna de rotação.
24. Ao DNA eluído, adicione 10 μL de NaCl 3 M (1/10 volume de eluato de DNA) e 250 μL de etanol absoluto resfriado (2,5 volume de eluato de DNA). Inverta para misturar bem e gire o conteúdo a 8.000 x g por 15 s.
25. Incubar a mistura de ADN e etanol a -20 °C durante, pelo menos, 1 h.
    NOTA: A incubação da mistura de DNA-etanol pode ser aumentada para 16 h sem uma diminuição significativa no rendimento ou na qualidade do DNA extraído.
26. Centrifugue a 19.000 x g a 4 °C por 30 min. Descarte o sobrenadante por decantação.
27. Adicione 500 μL de etanol 70% resfriado ao pellet.
28. Centrifugue a 19.000 x g a 4 °C por 15 min. Descarte o sobrenadante por decantação.
29. Inverta e bata suavemente o tubo no papel de seda para remover o etanol residual por ação capilar.
30. Seque completamente o sedimento de ADN, mantendo os tubos abertos num bloco de aquecimento durante 5-10 min a 37 °C até que todo o etanol tenha evaporado.
31. Ressuspenda o pellet de DNA em 30-50 μL de água bidestilada autoclavada (ddH₂O). Incubar a 37 °C durante 5-10 min.
32. Gire o DNA a 8.000 x g por 15 s.
33. Selecione a aplicação de dsDNA nas configurações de Ácidos Nucleicos em um espectrofotômetro Nanodrop.
    1. Limpe o pedestal com papel de seda sem fiapos e água. Use ddH₂O para esvaziar o instrumento e, em seguida, carregue 2 μL da amostra de DNA no pedestal.
    2. Medir as relações de concentração e de absorvância (A260/280 e A260/230) para determinar a pureza.
34. Armazenar a amostra de ADN a -20 °C.

3. Precipitação de DNA linear amplificado por reação em cadeia da polimerase (PCR) para verificar a recuperação do DNA em uma variedade de pesos moleculares

1. Usando DNA genômico de E. coli MG155, amplifique fragmentos de genes por PCR para gerar um conjunto de fragmentos lineares dos seguintes genes: fusA, lacZ, gapA, rpsD, 16S rRNA, marR (consulte a Tabela 2 para sequências de primers e condições de PCR).
2. Purifique os produtos de PCR usando o kit de purificação de PCR e agrupe os produtos de PCR.
3. Divida os amplicons agrupados em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL com volumes iguais - rotule um tubo como 'DNA de entrada'.
4. Adicione PEG e NaCl de acordo com as condições desejadas (9%, 20%, 30% PEG-8000; 0,3 M, 1,2 M NaCl) a cada um dos tubos, exceto aquele rotulado como 'DNA de entrada' e perfaça o volume final para 1 mL.
5. Incubar os tubos durante a noite (~16-18 h) a 4 °C.
   NOTA: Para o resto das etapas até 3.16, 'DNA de entrada' é mantido inalterado na geladeira.
6. Girar os tubos numa microcentrífuga de mesa de acordo com a velocidade desejada (15.000 x g ou 20.000 x g) durante 1 h a 4 °C.
7. Remova cuidadosamente 900 μL do sobrenadante do lado oposto ao pellet usando uma micropipeta.
8. Primeira lavagem com etanol: Adicione 900 μL de etanol 70% resfriado ao pellet e misture invertendo suavemente os tubos.
9. Gire os tubos na mesma velocidade usada na etapa 3.6 (15.000 x g ou 20.000 x g) por 30 min a 4 °C.
10. Remover o sobrenadante por decantação.
11. Segunda lavagem com etanol: Adicione 500 μL de etanol 70% resfriado ao pellet.
12. Gire os tubos na mesma velocidade usada na etapa 3.6 (15.000 x g ou 20.000 x g) por 30 min a 4°C. Descarte o sobrenadante por decantação.
13. Inverta e bata suavemente o tubo no papel de seda para remover o etanol residual por ação capilar.
14. Secar completamente o sedimento de ADN, mantendo os tubos abertos num bloco de aquecimento durante 5-10 min a 37 °C até que todo o etanol evapore.
15. Ressuspenda o pellet em 20 μL de água bidestilada autoclavada.
16. Meça a concentração de DNA precipitada pelas diferentes condições e o 'DNA de entrada' usando um espectrofotômetro ou fluorômetro Nanodrop.
17. Carregue o DNA precipitado em um gel de agarose a 1% para visualização do DNA.

Estabelecimento de um protocolo para extração de DNA de alto rendimento de amostras de águas residuais
Uma versão modificada de protocolos previamente estabelecidos foi usada para a extração de DNA e RNA de alta qualidade de amostras de água¹⁷. As amostras foram provenientes de drenos abertos, bem como de estações de tratamento de esgoto na região de Delhi-NCR, no norte da Índia. Após o pré-processamento utilizando PEG e NaCl (Figura 1), as amostras foram processadas através de kits para extração de DNA do solo e água. Em todos os casos^{, foi observada} uma faixa proeminente de alto peso molecular, provavelmente correspondendo ao DNA bacteriano intracelular e um esfregaço de fundo, como é típico de amostras ambientais³⁷ (Figura 2).

Falta de extração eficiente de DNA de efluentes de estações de tratamento de esgoto (ETE)
Embora um rendimento razoável de DNA total tenha sido obtido de drenos abertos e afluentes de STP (Tabela 3), nenhum DNA pôde ser obtido do efluente final tratado; problemas com baixo rendimento também são descritos em trabalhos anteriores⁴¹ (Figura 3). Após o tratamento, que inclui cloração de águas residuais e, em alguns casos, tratamentos UV e ultrafiltração⁴², espera-se que a carga microbiana seja baixa e qualquer DNA residual (composto de DNA extracelular e fragmentado) seja diluído. A baixa concentração inicial de PEG usada na concentração da amostra e a precipitação de ácido nucleico poderiam excluir o DNA de baixo peso molecular. Em outras palavras, o DNA fragmentado pode ser perdido na etapa inicial de concentração.

O aumento das concentrações de PEG e NaCl leva à precipitação de DNA de menor peso molecular
Para testar se o aumento da concentração de PEG ajuda no enriquecimento do DNA de baixo peso molecular, foi gerado um padrão laboratorial de fragmentos de PCR de diferentes comprimentos, criando uma variedade de fragmentos lineares de DNA (Figura 4). O padrão foi submetido a quatro condições de precipitação diferentes - 9% PEG-8000 + 0,3 M NaCl (a combinação original), 9% PEG-8000 + 1,2 M NaCl (apenas aumento de sal), 30% PEG-8000 + 0,3 M NaCl (apenas aumento de PEG) e 30% de PEG-8000 + 1,2 M NaCl (aumento de sal e PEG). As condições foram escolhidas com base no protocolo padrão usado para vigilância do SARS-CoV-2¹⁷ e nas condições relatadas em um estudo de métodos modulares de extração de DNA de amostras ambientais³³. Duas velocidades de centrifugação diferentes - 15.000 x g e 20.000 x g - foram usadas com base nos efeitos das velocidades diferenciais na peletização de DNA⁴³. Ao aumentar as concentrações de PEG e NaCl para 30% e 1,2 M, respectivamente, a recuperação total de DNA aumentou em aproximadamente 70%, e fragmentos de DNA tão pequenos quanto 150 pares de bases (pb) foram efetivamente precipitados (Figura 5). A diferença de velocidade não teve muito efeito no rendimento (Figura 6A) e pode ser devido ao longo tempo de centrifugação utilizado. Como a recuperação total do DNA foi menor na combinação original de PEG / NaCl, foi possível que bandas de peso molecular mais baixas, embora presentes, estivessem em uma concentração abaixo do limite de visualização. Para testar isso, a quantidade de DNA de entrada para precipitação foi aumentada e um excesso de DNA correspondente a cada tratamento (1,5 mg) foi carregado no gel de agarose para visualização. Apenas o tratamento com PEG a 30% apresentou boa recuperação do menor peso molecular, ou seja, banda de 150 pb (Figura 6B).

A precipitação de DNA circular (DNA genômico bacteriano e plasmídico) não segue a mesma tendência
E. coli O DNA genômico e o plasmídeo MG155 (pRSV, ~ 4 kb) foram usados para precipitação com diferentes concentrações de PEG e NaCl. Ao contrário do DNA linear, não houve impacto significativo do aumento dos níveis de PEG e NaCl (Figura 7), sugerindo que os rendimentos de DNA circular e de alto peso molecular (normalmente DNA intracelular) não são afetados pelo aumento do PEG. Isso contrasta com observações anteriores com precipitação de proteína⁴⁴, onde a solubilidade diminuiu acentuadamente com a concentração de PEG. Dado que o PEG atua como um agente de aglomeração, supõe-se que a área de superfície da macromolécula disponível para interação desempenha um papel importante em sua eficácia como agente precipitante. Com o DNA linear, à medida que o tamanho aumenta, é razoável supor que a área disponível para interação também aumenta. Com o DNA circular, é possível que baixas concentrações de PEG já sejam suficientes para saturar a molécula, e aumentar ainda mais a concentração pode não aumentar a área de superfície efetiva para interação.

Baixo rendimento de DNA de águas residuais quando o pré-processamento da precipitação com PEG e NaCl é omitido
Para testar se o pré-processamento de águas residuais é crucial para a extração de DNA, 20 mL de águas residuais inativadas por calor (70 ° C, 4 h) foram enriquecidas com 10 mg de padrão linear previamente preparado e incubadas durante a noite a 4 ° C (a) sem PEG + NaCl, (b) com 9% de PEG + 0,3 M NaCl (combinação original) e (c) com 20% de PEG + 1,2 M de NaCl (aumento de PEG e sal). As amostras foram então processadas através do kit de solo para extração de DNA, conforme explicado no protocolo. Verificou-se que o rendimento do DNA extraído aumenta em 60% no pré-processamento de amostras de águas residuais com 9% de PEG + 0,3 M de NaCl quando comparado a nenhuma etapa de pré-processamento (Figura 8), indicando que o pré-processamento da precipitação de PEG e NaCl é vital para obter DNA de alto rendimento de amostras de águas residuais. Também é digno de nota que, embora o rendimento geral do DNA, incluindo DNA genômico de alto peso molecular (gDNA), seja menor quando alto PEG e sal são usados para precipitação, a proporção de DNA de baixo peso molecular é enriquecida (Figura 8). A diminuição no rendimento geral no cultivo de PEG e sal pode ser atribuída à natureza altamente viscosa do PEG, que pode levar à perda de pellets de DNA durante a remoção do sobrenadante. Isso fortalece o caso do método de extração de DNA passo a passo proposto (Figura 9), em que o DNA de alto peso molecular pode primeiro ser extraído usando baixa precipitação de PEG e NaCl, e o sobrenadante resultante pode ser submetido a outra rodada de pré-processamento com aumento de PEG e NaCl para extrair com eficiência o DNA de baixo peso molecular que escapou da primeira rodada de precipitação.

Figura 1: Pré-processamento de amostras de águas residuais. Esquema mostrando o fluxo de trabalho desde a coleta de amostras até a extração de DNA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Perfil de gel típico do DNA extraído de amostras de águas residuais. Um volume de 50-100 mL (conforme indicado na figura) de águas residuais amostradas de diferentes locais foi inativado por incubação a 70 ° C por 4 h. Em seguida, foi incubado com 9% de PEG e 0,3 M de NaCl durante a noite a 4 °C e, em seguida, processado para extrair DNA usando solo ou um kit de água. Aproximadamente 150 ng de DNA total extraído foram carregados em um gel de agarose a 1% junto com uma escada de 1 quilo-pares de bases (kb) como marcador e submetidos a eletroforese (90 V, 30 min). O DNA foi visualizado sob luz ultravioleta (UV) usando o corante SYBR SAFE. A tabela à direita detalha as fontes de coleta de amostras, o volume de águas residuais processadas e o kit usado para extração de DNA para cada pista. (ETE: Estação de Tratamento de Esgoto; UVR: Radiação Ultravioleta) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: As amostras de efluentes STP mostram baixos rendimentos totais de DNA. Um volume de 40 mL de águas residuais amostradas de afluentes e efluentes de ETE foi inativado por incubação a 70 °C por 4 h. Em seguida, foi incubado com 9% de PEG e 0,3 M de NaCl durante a noite a 4 ° C e, em seguida, processado para extrair DNA usando um kit de solo ou água ou um kit de extração de DNA genômico bacteriano. Aproximadamente 150 ng de DNA total extraído foram carregados em um gel de agarose a 1% junto com uma escada de 1 kb como marcador e submetidos à eletroforese (90 V, 30 min). O DNA foi visualizado sob luz ultravioleta (UV) usando o corante SYBR SAFE. A concentração de DNA extraído para as amostras de efluentes estava abaixo de 1 ng/mL de efluente e, portanto, não pôde ser visualizada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Geração de um padrão de tamanho de DNA linear para testar a eficácia da precipitação de DNA de baixo peso molecular. Cinco fragmentos de DNA de tamanhos diferentes foram gerados por amplificação por PCR usando DNA genômico de E. coli (MG1655) como modelo e primers e condições conforme descrito na Tabela 2. O DNA purificado (~ 1 μg) com o kit de purificação por PCR foi carregado em um gel de agarose a 1% junto com uma escada de 1 kb como marcador e submetido a eletroforese (90 V, 40 min). O DNA foi visualizado sob luz ultravioleta (UV) usando o corante SYBR SAFE. As pistas são rotuladas por nomes de genes a partir dos quais o fragmento foi amplificado e o tamanho esperado do amplicon. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: O DNA de baixo peso molecular é recuperado com eficiência apenas na concentração mais alta (30%) de PEG. O DNA de entrada (3,34 μg) do padrão de tamanho gerado anteriormente foi tratado com diferentes combinações de PEG e NaCl conforme indicado na figura e extraído conforme detalhado no protocolo. A velocidade de centrifugação utilizada foi de 15.000 x g. Para Input (pista 3) e NaCl 1,2 M + PEG 30% (pista 7), 0,8 μg de DNA foi carregado no gel. Para o restante, como o rendimento total foi baixo, a quantidade total de DNA extraído em 16 μL foi carregada e a escada de 1 kb foi carregada como marcador de tamanho em um gel de agarose a 1% e submetida a eletroforese (80 V, 45 min). O DNA foi visualizado sob luz ultravioleta (UV) usando o corante SYBR SAFE. A caixa branca destaca a banda mais baixa de 150 pb. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: A recuperação do DNA de baixo peso molecular é determinada por altas concentrações de PEG em vez de altas concentrações de sal. (A) O DNA de entrada (14 μg) do padrão de tamanho foi tratado com diferentes combinações de PEG e NaCl, conforme indicado na figura, e extraído usando precipitação de etanol, conforme detalhado no protocolo. A velocidade de centrifugação utilizada foi de 15.000 x g e 20.000 x g, conforme indicado na figura. Toda a quantidade de DNA de entrada e DNA extraído, juntamente com a escada de 1 kb, foi carregada em um gel de agarose a 1% e submetida a eletroforese (90 V, 30 min). O DNA foi visualizado sob luz ultravioleta (UV) usando o corante SYBR SAFE. (B) O DNA de entrada (15,67 μg) do padrão de tamanho gerado anteriormente foi tratado com diferentes combinações de PEG e NaCl, conforme indicado na figura, e extraído conforme detalhado no protocolo. A velocidade de centrifugação utilizada foi de 15.000 x g. O DNA extraído (1,5 μg) foi carregado em cada pista e a escada de 1 kb foi carregada como um marcador de tamanho em um gel de agarose a 1% e submetida a eletroforese (80 V, 45 min). O DNA foi visualizado sob luz ultravioleta (UV) usando o corante SYBR SAFE. A caixa branca destaca a banda mais baixa de 150 pb. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: A recuperação do DNA genômico e do DNA plasmidial não é significativamente afetada pelo aumento da concentração de PEG e NaCl. O DNA de entrada (9 μg; 4,5 μg de plasmídeo e 4,5 μg de DNA genômico) foi tratado com diferentes combinações de PEG e NaCl, conforme indicado na figura, e extraído conforme detalhado no protocolo. A velocidade de centrifugação utilizada foi de 15.000 x g. Toda a quantidade de DNA de entrada e DNA extraído, juntamente com a escada de 1 kb, foi carregada em um gel de agarose a 1% e submetida a eletroforese (90 V, 45 min). O DNA foi visualizado sob luz ultravioleta (UV) usando o corante SYBR SAFE. As caixas brancas indicam o DNA genômico e o DNA do plasmídeo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: O pré-processamento da precipitação com PEG e NaCl é crucial para a extração de DNA de alto rendimento de águas residuais. As águas residuais inativadas pelo calor (70 ° C, 4 h) (20 mL) foram enriquecidas com 10 mg de padrão linear previamente preparado e incubadas durante a noite a 4 ° C sem PEG e NaCl ou concentrações variáveis de PEG e NaCl, conforme indicado na figura. Em seguida, foi processado para extrair DNA usando um kit de solo. O DNA de entrada (4 μg) usado para cravação (pista 1) e o DNA extraído (4 μg) com etapa de pré-processamento de 9% PEG + 0,3 M NaCl (pista 3) foram carregados em um gel de agarose a 1%. Para o resto das condições, toda a quantidade de DNA extraído foi carregada no gel, uma vez que o rendimento era baixo. Uma escada de 1 kb também foi carregada como marcador de tamanho. O gel foi submetido à eletroforese (70 V, 2 h). O DNA foi visualizado sob luz ultravioleta (UV) usando o corante SYBR SAFE. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 9: Método passo a passo proposto de extração de DNA de águas residuais para enriquecer DNA de alto e baixo peso molecular. Fluxograma que descreve um método de duas etapas de extração de DNA de águas residuais com uma etapa inicial de pré-processamento usando baixa concentração de PEG e NaCl. O sobrenadante da primeira etapa é submetido a outra rodada de precipitação de pré-processamento com aumento de PEG e NaCl para extrair efetivamente DNA de alto e baixo peso molecular de águas residuais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1. Uso prévio de PEG e NaCl em estudos para extração de DNA de amostras ambientais. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2. Sequências de primers e condições de PCR para geração padrão. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 3. Rendimento e qualidade do DNA obtidos a partir de amostras de águas residuais durante um período de dois meses em 2023. Clique aqui para baixar esta tabela.

A RAM é uma das 10 principais ameaças à saúde atualmente, conforme listado pela OMS, e a vigilância ambiental da RAM é reconhecida como uma ferramenta importante em todo o mundo. Conforme mencionado na introdução, um registro abrangente de AMR ambiental inclui DNA de baixo peso molecular, fragmentado e extracelular. O protocolo de pré-processamento relatado aqui usando uma alta concentração de PEG combinado com sal (30% de PEG e 1,2 M de NaCl) alcança esse resultado enriquecendo a proporção de DNA de baixo peso molecular sem afetar a extração de frações de maior peso molecular (em grande parte DNA genômico e plasmidial). Isso contrasta com os métodos anteriores de concentração que usam protocolos de PEG mais baixo e kit direto (sem pré-processamento), que são complicados devido à necessidade de processamento de grandes volumes. O pré-processamento com concentrações mais baixas de PEG foi ineficiente na recuperação de DNA de baixo peso molecular ('baixo' refere-se a bandas de DNA abaixo de 600 pb aqui). Quando nenhum PEG é usado durante o pré-processamento, a extração de DNA é pobre, resultando em apenas 10% do DNA de entrada sendo recuperado, em oposição a 70% quando PEG e NaCl são usados (Figura 8). Além da adição de PEG e NaCl, outro passo importante é a remoção do etanol residual pós-extração de DNA do kit para obter DNA puro para processamento a jusante. É importante determinar o volume inicial de água necessário para obter uma quantidade total de pelo menos ~ 300 ng a 5 mg de DNA em um volume de 30-50 mL após a eluição. Em contraste com 1 L ou mais de água que normalmente é processada para extração de DNA de águas residuais^27,41, verificou-se que, com a etapa de pré-processamento proposta aqui, apenas 27,5-40 mL são suficientes para obter DNA de alta qualidade para processamento a jusante. As águas residuais também contêm partículas e matéria orgânica, que podem conter células bacterianas adsorvidas e DNA extracelular. Portanto, a dessorção de células e DNA acompanhada de lise celular é um passo importante para aumentar o rendimento do DNA. Altas concentrações de PEG tornam a amostra viscosa e podem dificultar as etapas de lise e dessorção para extração de DNA, conforme mencionado anteriormente. Para evitar isso, foi proposto um método passo a passo de extração de DNA, conforme descrito no fluxograma (Figura 9). Este método será útil na extração de DNA intracelular de alto peso molecular (Figura 7) e DNA extracelular fragmentado e circular de baixo peso molecular.

Uma limitação atual deste protocolo em termos de despesas é o processamento contínuo de DNA enriquecido de baixo peso molecular por meio de um kit para melhorar a qualidade. Essa limitação pode ser contornada usando outros métodos de limpeza de DNA, como a extração de fenol-clorofórmio. Outra limitação prática é lidar com altas concentrações de PEG, pois o pellet pode ser perdido devido à alta viscosidade da solução. Atualmente, o pré-processamento usando PEG e NaCl é realizado, seguido por uma versão modificada de um protocolo de kit existente, ou seja, o kit ainda é usado para purificação final do DNA. Uma purificação de DNA sem kit, que dá um alto rendimento de DNA, mas de baixa pureza (não relatado aqui), está sendo otimizada para melhorar a qualidade do DNA extraído. Devido à natureza viscosa das soluções de PEG, deve-se buscar uma concentração ideal de PEG que possa produzir uma gama completa de tamanhos de DNA e ainda ser manuseada confortavelmente. A redução da concentração para 20% (Figura 6B) alcançou um resultado intermediário para as eficiências de extração de PEG baixo (9%) e alto (30%); Pode valer a pena acompanhar isso em trabalhos futuros.

O PEG é usado rotineiramente durante diferentes etapas da extração de DNA de amostras ambientais. No entanto, o uso de PEG não foi padronizado para extração de DNA no contexto da vigilância da RAM. A vigilância de águas residuais envolve a detecção de resistência antimicrobiana em diversos nichos, incluindo ETEs (afluentes e efluentes) e drenos abertos e fechados ^8,27. Embora as informações sobre a RAM no afluente forneçam informações cruciais sobre a resistência que circula na comunidade, a presença de genes da RAM no efluente é igualmente importante para medir e potencialmente prever o surgimento de surtos de resistência. As amostras de efluentes geralmente têm baixa carga microbiana, pois a maioria das células é morta durante o processo de tratamento, resultando em um rendimento de DNA celular muito baixo. No entanto, os efluentes contêm DNA extracelular flutuante compreendendo DNA genômico de alto peso molecular e plasmídeo de baixo peso molecular, faguemídeos e DNA fragmentado. Os genes AMR presentes no DNA de baixo peso molecular (fragmentado e plasmídeo / faguemídeos) podem ser transferidos para as células vivas restantes no efluente, levando à disseminação de resistência^{30 , 41 , 45} . Portanto, é importante detectar DNA extracelular de baixo peso molecular em águas residuais. Outros métodos empregados para extração de DNA de águas residuais durante a avaliação da RAM normalmente não garantem o enriquecimento inicial do DNA de baixo peso molecular. Essa abordagem de extração de DNA de águas residuais pode ser usada para fornecer informações sobre um resistoma abrangente do ambiente.

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Reconhecemos o apoio financeiro da Fundação Rockefeller (Rockefeller Foundation Grant Number 2021 HTH 018) como parte da equipe da APSI Índia (Alliance for Pathogen Surveillance Innovations https://data.ccmb.res.in/apsi/team/). Também reconhecemos a ajuda financeira fornecida pelo Axis Bank no apoio a esta pesquisa e pela Trivedi School of Biosciences da Ashoka University para equipamentos e outros suportes.