Amélioration de l’extraction de l’ADN de faible poids moléculaire des eaux usées pour une évaluation complète de la résistance aux antimicrobiens

Ici, nous présentons une technique simple pour évaluer la résistance aux antimicrobiens environnementaux (RAM) en augmentant la proportion d’ADN extracellulaire de faible poids moléculaire. Un traitement antérieur avec 20 à 30 % de PEG et 1,2 M de NaCl permet de détecter à la fois les gènes génomiques et les gènes AMR transférés horizontalement. Le protocole se prête à un processus sans kit avec une optimisation supplémentaire.

La surveillance environnementale est reconnue comme un outil important pour évaluer la santé publique dans l’ère post-pandémique. L’eau, en particulier les eaux usées, est devenue la source de choix pour échantillonner les charges d’agents pathogènes dans l’environnement. Les eaux usées provenant des drains à ciel ouvert et des usines de traitement de l’eau des collectivités sont un réservoir d’agents pathogènes et de gènes de résistance aux antimicrobiens (RAM), et entrent fréquemment en contact avec les humains. Bien qu’il existe de nombreuses méthodes pour suivre la résistance aux antimicrobiens dans l’eau, l’isolement d’ADN de bonne qualité à haut rendement à partir d’échantillons hétérogènes reste un défi. Pour compenser, les volumes d’échantillons doivent souvent être élevés, ce qui crée des contraintes pratiques. De plus, l’ADN environnemental est fréquemment fragmenté et les sources de RAM (plasmides, phages, ADN linéaire) sont constituées d’ADN de faible poids moléculaire. Pourtant, peu de procédés d’extraction se sont concentrés sur des méthodes d’extraction à haut rendement d’ADN linéaire et de faible poids moléculaire. Ici, une méthode simple d’extraction linéaire d’ADN à haut rendement à partir de petits volumes d’eaux usées en utilisant les propriétés de précipitation du polyéthylène glycol (PEG) est présentée. Cette étude plaide en faveur de l’augmentation des rendements globaux en ADN à partir d’échantillons d’eau collectés pour des analyses métagénomiques en enrichissant la proportion d’ADN linéaire. De plus, l’amélioration de l’ADN de faible poids moléculaire permet de surmonter le problème actuel du sous-échantillonnage de la résistance aux antimicrobiens dans l’environnement en raison de l’accent mis sur l’ADN de haut poids moléculaire et intracellulaire. Cette méthode devrait être particulièrement utile lorsque l’ADN extracellulaire existe, mais à de faibles concentrations, comme dans le cas des effluents des usines de traitement. Il devrait également améliorer l’échantillonnage environnemental des fragments de gènes de la résistance aux antimicrobiens qui se propagent par transfert horizontal de gènes.

Le SRAS-CoV-2 et ses conséquences ont souligné l’importance de la surveillance environnementale dans le suivi et la prévision des épidémies de maladies infectieuses ^1,2. Bien que les pandémies virales soient apparentes, l’augmentation de la résistance aux antimicrobiens (RAM) est souvent décrite comme une pandémie insidieuse qui constitue un problème de santé publique majeur dans le monde ^3,4. Par conséquent, il est urgent d’élaborer des stratégies coordonnées pour comprendre l’évolution et la propagation de la RAM. Les plans d’eau, ainsi que les eaux usées, peuvent servir de réservoirs pour les agents pathogènes et les RAM^{5, 6, 7 et 8}. Les sources d’eau partagées sont donc une source puissante de transmission de maladies parmi les humains, en particulier dans les pays à revenu faible et intermédiaire (PRFI) où le manque d’hygiène et la surpopulation vont de pair ^9,10,11. L’analyse des sources d’eau est utilisée depuis longtemps pour évaluer la santé communautaire 12,13,14. Récemment, les eaux usées des stations d’épuration urbaines se sont avérées être un bon indicateur précoce des cas de COVID dans les cliniques 1,2,15,16,17,18.

Par rapport à la surveillance de maladies spécifiques, la détection et le suivi de la résistance aux antimicrobiens dans l’environnement posent un problème plus complexe. Le grand nombre d’antibiotiques utilisés, la diversité des gènes de résistance, les différentes pressions de sélection locale et le transfert horizontal de gènes entre les bactéries rendent difficile l’évaluation de la charge réelle de la résistance aux antimicrobiens et, une fois évaluée, sa corrélation avec les observations cliniques 19,20,21,22. Par conséquent, alors que la surveillance concertée de la résistance aux antimicrobiens clinique est menée par plusieurs organisations à travers le monde ^3,23,24, la surveillance environnementale de la résistance aux antimicrobiens n’en est qu’à ses balbutiements, comme en témoigne 19,25,26.

Au cours des dernières années, différentes méthodes de suivi de la résistance aux antimicrobiens dans l’environnement ont été signalées ^5,27, examinées dans^28,29. Le point de départ de la plupart d’entre eux est l’extraction d’ADN de bonne qualité à partir d’échantillons environnementaux hétérogènes, ce qui constitue en soi un défi. De plus, l’ADN environnemental est généralement fragmenté en raison de l’exposition à un environnement hostile. L’ADN extracellulaire fragmenté est depuis longtemps reconnu comme un réservoir important de gènes AMR (examiné dans^{30, 31 et 32}), avec le potentiel supplémentaire d’entrer et de sortir des bactéries par transfert horizontal de gènes. Par conséquent, il est important que tout protocole visant à mesurer la charge de résistance aux antimicrobiens dans l’environnement échantillonne le mieux possible l’ADN linéaire et de faible poids moléculaire. Étonnamment, peu d’attention a été accordée au développement de méthodes spécifiques à l’extraction à haut rendement d’ADN linéaire et de faible poids moléculaire : ce travail se concentre sur la résolution de cette lacune.

Une méthode simple et courante pour précipiter l’ADN consiste à combiner du polyéthylène glycol (PEG) et des sels tels que le chlorure de sodium (NaCl)³³. Le PEG est un agent d’encombrement macromoléculaire utilisé pour obtenir une précipitation spécifique à la taille des fragments d’ADN^34,35. Plus la concentration de PEG est faible, plus le poids moléculaire de l’ADN qui peut être précipité efficacement est élevé. De nombreuses études ont utilisé le PEG lors de l’extraction environnementale de l’ADN et de l’ARN ^1,2 (résumés dans le tableau 1 17,33,36,37,38,39) soit à l’étape finale 33,36,37, soit pour concentrer de grands échantillons d’eau pour l’extraction de particules virales comme avec le SARS-CoV-2 ^15,40. Dans les travaux actuels, on constate que les concentrations de PEG utilisées précédemment pour les extractions d’ADN environnemental (largement déterminées par les protocoles de surveillance virale) ne capturent pas l’ADN linéaire de faible poids moléculaire. Par conséquent, ils ne permettent pas d’échantillonner de courts fragments d’ADN et ne conviennent pas à l’évaluation précise du contenu en RAM. Cette étude a exploité les propriétés du polyéthylène glycol et du chlorure de sodium pour précipiter efficacement des fragments d’ADN linéaires de faible poids moléculaire à un rendement élevé qui peut, à l’avenir, conduire à une méthode d’extraction d’ADN rentable. Cette méthode peut être utilisée pour enrichir la proportion d’ADN fragmenté et de faible poids moléculaire à partir d’échantillons naturels complexes, capturant ainsi une image plus précise de la RAM environnementale. Avec un peu plus de raffinement, la technique se prête à une application facile et peu coûteuse par les sociétés municipales locales et d’autres organismes gouvernementaux pour être utilisée comme outil de surveillance avec une formation technique minimale.

1. Échantillonnage des eaux usées

1. Trempez un bécher en polypropylène de 500 mL dans le drain à ciel ouvert ou le réservoir de la station d’épuration des eaux usées (STP) et prélevez ~300 mL d’échantillon d’eaux usées.
2. Transférez ~250 ml de l’échantillon dans une bouteille en polypropylène autoclavée de 250 ml.
3. Vissez le bouchon de la bouteille et fermez-le avec un film plastique. Gardez la bouteille à la verticale dans un sac fermé.
4. Transportez l’échantillon à la verticale dans un récipient fermé à température ambiante.
5. Inactiver thermiquement l’échantillon à 70 °C dans un four à air chaud pendant 4 h avant de le traiter pour l’extraction de l’ADN.

2. Extraction d’ADN à partir d’échantillons d’eaux usées

1. Une fois l’échantillon d’eaux usées refroidi, vortex les échantillons à la vitesse maximale et laissez les débris/boues se déposer.
2. Décanter 27,5 ml des eaux usées dans des tubes à centrifuger de 50 ml et y ajouter 13,5 g de PEG-8000 (concentration finale 30%) et 3 g de NaCl (concentration finale 1,2 M) et bien mélanger jusqu’à dissolution complète.
3. Incuber l’échantillon pendant la nuit (~16-18 h) à 4 °C.
4. Centrifuger l’échantillon à 15 500 x g à 4 °C pendant 30 min.
5. Jetez le surnageant.
   REMARQUE : Le PEG-8000 à 30% est très visqueux et le granulé peut se déloger lors de la mise au rebut du surnageant. Le surnageant doit être transvasé lentement et soigneusement pour s’assurer que la pastille n’est pas perdue. Les étapes 2.6 à 2.23 sont effectuées à l’aide du kit d’extraction d’ADN du sol selon les instructions du kit, avec quelques modifications.
6. Dissoudre la pastille dans 800 μL de la solution de lyse du kit et ajouter la solution dans le tube à billes de zirconium mélangé.
   REMARQUE : Si vous traitez de plus grands volumes, regroupez les granulés du nombre souhaité de tubes. Par exemple, si vous traitez 160 mL d’échantillon ; il y aura quatre tubes de 50 mL contenant des eaux usées contenant du PEG et du NaCl. Après centrifugation des quatre tubes à 15 500 x g à 4 °C pendant 30 min, jeter le surnageant des quatre tubes. Ajoutez 200 μL de solution CD1 à chacun, remettez les pastilles en suspension et regroupez-les dans un tube à billes.
7. Fixez le tube de perle horizontalement sur un vortex. Vortex le tube à vitesse maximale pendant 20-30 min.
   REMARQUE : Le vortex prolongé assure la lyse et l’homogénéisation complètes des échantillons, ce qui améliore le rendement en ADN.
8. Faites tourner les tubes à 8 000 x g pendant 15 s pour déposer les billes au fond, retirez la mousse et transférez complètement le surnageant du tube dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml. Certaines perles peuvent également être transférées au cours de cette étape.
9. Centrifuger le surnageant à 15 000 x g pendant 1 min.
10. Transférez le surnageant dans un tube de microcentrifugation propre de 2 ml. Le surnageant peut encore contenir quelques particules en suspension.
11. Ajouter 200 μL de solution de précipitant et agiter à vitesse maximale pendant 5 s. Incuber à 4 °C pendant 5 min.
    REMARQUE : L’incubation à 4 °C augmente l’efficacité de la précipitation des protéines et des débris cellulaires pendant que l’ADN reste en solution. Il est possible d’interrompre le protocole à cette étape jusqu’à 2 h sans diminution significative du rendement et de la qualité de l’ADN extrait.
12. Centrifugeuse à 15 000 x g pendant 1 min à température ambiante (RT). Évitez la pastille et transférez le surnageant transparent dans un tube de microcentrifugation propre de 2 ml.
13. Ajouter 600 μL de tampon de liaison par 700 μL de surnageant et vortex à vitesse maximale pendant 5 s.
14. Chargez 700 μL de lysat sur une colonne de spin de silice, incubez pendant 2 min et centrifugez à 15 000 x g pendant 1 min.
    REMARQUE : L’incubation du lysat sur la colonne de silice améliore la liaison de l’ADN à la colonne, ce qui se traduit par un meilleur rendement en ADN.
15. Jetez l’écoulement et répétez l’étape 2.14 jusqu’à ce que tout le lysat ait traversé la colonne d’essorage.
16. Placez délicatement la colonne d’essorage dans un tube de collecte propre de 2 ml. Assurez-vous qu’aucun flux n’est éclaboussé sur la colonne d’essorage.
17. Ajoutez 500 μL de tampon de lavage dans la colonne d’essorage et centrifugez la colonne d’essorage à 15 000 x g pendant 1 min.
18. Jeter le liquide d’écoulement et remettre la colonne d’essorage dans le même tube de collecte de 2 ml.
19. Ajoutez 500 μL de tampon de lavage à l’éthanol dans la colonne d’essorage. Centrifugeuse à 15 000 x g pendant 1 min.
20. Jetez le liquide d’écoulement et placez la colonne d’essorage dans un nouveau tube de collecte de 2 ml.
21. Centrifuger à 16 000 x g pendant 2 min pour éliminer l’éthanol résiduel. Placez la colonne d’essorage dans un nouveau tube de 1,5 ml.
22. Ajouter 100 μL de tampon d’élution (préchauffé à 55 °C) au centre de la membrane filtrante blanche et incuber pendant 5 min.
    REMARQUE : Le tampon d’élution chauffé, ainsi que l’incubation sur la membrane, augmentent l’efficacité de l’élution de l’ADN, en particulier de l’ADN de haut poids moléculaire.
23. Centrifugeuse à 15 000 x g pendant 1 min. Jetez la colonne de rotation.
24. À l’ADN élué, ajouter 10 μL de NaCl 3 M (1/10 volume d’éluat d’ADN) et 250 μL d’éthanol absolu réfrigéré (2,5 volumes d’éluat d’ADN). Retournez pour bien mélanger et faites tourner le contenu à 8 000 x g pendant 15 s.
25. Incuber le mélange ADN-éthanol à -20 °C pendant au moins 1 h.
    REMARQUE : L’incubation du mélange ADN-éthanol peut être augmentée à 16 h sans diminution significative du rendement ou de la qualité de l’ADN extrait.
26. Centrifugeuse à 19 000 x g à 4 °C pendant 30 min. Jeter le surnageant par décantation.
27. Ajoutez 500 μL d’éthanol réfrigéré à 70 % dans la pastille.
28. Centrifugeuse à 19 000 x g à 4 °C pendant 15 min. Jeter le surnageant par décantation.
29. Retournez et tapotez doucement le tube sur du papier de soie pour éliminer l’éthanol résiduel par capillarité.
30. Séchez complètement la pastille d’ADN en gardant les tubes ouverts sur un bloc chauffant pendant 5 à 10 minutes à 37 °C jusqu’à ce que tout l’éthanol se soit évaporé.
31. Remettez en suspension la pastille d’ADN dans 30 à 50 μL d’eau double distillée autoclavée (ddH₂O). Incuber à 37 °C pendant 5 à 10 min.
32. Faites tourner l’ADN à 8 000 x g pendant 15 s.
33. Sélectionnez l’application dsDNA dans les paramètres Acides nucléiques d’un spectrophotomètre Nanodrop.
    1. Nettoyez le socle avec du papier de soie non pelucheux et de l’eau. Utilisez le ddH₂O pour effacer l’instrument, puis chargez 2 μL de l’échantillon d’ADN sur le socle.
    2. Mesurer les rapports de concentration et d’absorbance (A260/280 et A260/230) pour déterminer la pureté.
34. Conservez l’échantillon d’ADN à -20 °C.

3. Précipitation de l’ADN linéaire amplifié par réaction en chaîne par polymérase (PCR) pour vérifier la récupération de l’ADN sur une gamme de poids moléculaires

1. À l’aide de l’ADN génomique d’E. coli MG155, amplifier les fragments de gènes par PCR pour générer un pool de fragments linéaires à partir des gènes suivants : fusA, lacZ, gapA, rpsD, ARNr 16S, marR (voir le tableau 2 pour les séquences d’amorces et les conditions de PCR).
2. Purifiez les produits PCR à l’aide du kit de purification PCR et regroupez les produits PCR entre eux.
3. Divisez les amplicons regroupés dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL de volumes égaux - étiquetez un tube comme « ADN d’entrée ».
4. Ajoutez du PEG et du NaCl selon les conditions souhaitées (9 %, 20 %, 30 % PEG-8000 ; 0,3 M, 1,2 M de NaCl) dans chacun des tubes, à l’exception de celui étiqueté « ADN d’entrée », et augmentez le volume final à 1 ml.
5. Incuber les tubes pendant la nuit (~16-18 h) à 4 °C.
   REMARQUE : Pour le reste des étapes jusqu’à 3.16, 'Input DNA' est conservé inchangé dans le réfrigérateur.
6. Faites tourner les tubes dans une microcentrifugeuse de table selon la vitesse souhaitée (15 000 x g ou 20 000 x g) pendant 1 h à 4 °C.
7. Retirez avec précaution 900 μL de surnageant du côté opposé à la pastille à l’aide d’une micropipette.
8. Premier lavage à l’éthanol : Ajoutez 900 μL d’éthanol à 70 % réfrigéré dans la pastille et mélangez en inversant doucement les tubes.
9. Faites tourner les tubes à la même vitesse que celle utilisée à l’étape 3.6 (15 000 x g ou 20 000 x g) pendant 30 min à 4 °C.
10. Retirer le surnageant par décantation.
11. Deuxième lavage à l’éthanol : Ajoutez 500 μL d’éthanol réfrigéré à 70 % dans le granulé.
12. Faites tourner les tubes à la même vitesse que celle utilisée à l’étape 3.6 (15 000 x g ou 20 000 x g) pendant 30 min à 4 °C. Jeter le surnageant par décantation.
13. Retournez et tapotez doucement le tube sur du papier de soie pour éliminer l’éthanol résiduel par capillarité.
14. Séchez complètement la pastille d’ADN en gardant les tubes ouverts sur un bloc chauffant pendant 5 à 10 minutes à 37 °C jusqu’à ce que tout l’éthanol s’évapore.
15. Remettre la pastille en suspension dans 20 μL d’eau bidistillée autoclave.
16. Mesurez la concentration d’ADN précipitée par les différentes conditions et l’ADN d’entrée à l’aide d’un spectrophotomètre Nanodrop ou d’un fluoromètre.
17. Chargez l’ADN précipité sur un gel d’agarose à 1 % pour la visualisation de l’ADN.

Mise en place d’un protocole d’extraction à haut rendement d’ADN à partir d’échantillons d’eaux usées
Une version modifiée des protocoles précédemment établis a été utilisée pour l’extraction d’ADN et d’ARN de haute qualité à partir d’échantillons d’eau¹⁷. Les échantillons provenaient de drains à ciel ouvert ainsi que de stations d’épuration des eaux usées de la région de Delhi-NCR, dans le nord de l’Inde. Après un prétraitement à l’aide de PEG et de NaCl (figure 1), les échantillons ont été traités à l’aide de kits d’extraction d’ADN du sol et de l’eau. Dans tous les cas, une bande proéminente de haut poids moléculaire correspondant probablement à de l’ADN bactérien intracellulaire et à un frottis de fond, comme c’est le cas pour les échantillons environnementaux^37, a été observée (figure 2).

Manque d’extraction efficace de l’ADN des effluents des stations d’épuration des eaux usées (STP)
Bien qu’un rendement raisonnable d’ADN total ait été obtenu à partir des drains à ciel ouvert et des influents des stations d’épuration des eaux usées (tableau 3), aucun ADN n’a pu être obtenu à partir de l’effluent final traité ; les problèmes liés au faible rendement sont également décrits dans des travaux antérieurs⁴¹ (figure 3). Après le traitement, qui comprend la chloration des eaux usées et, dans certains cas, les traitements par rayonnement ultraviolet et par ultrafiltration⁴², la charge microbienne devrait être faible et tout ADN résiduel (composé d’ADN extracellulaire et fragmenté) devrait être dilué. La faible concentration initiale de PEG utilisée dans la concentration de l’échantillon et la précipitation des acides nucléiques pourrait exclure l’ADN de faible poids moléculaire. En d’autres termes, l’ADN fragmenté pourrait être perdu lors de l’étape de concentration initiale.

L’augmentation des concentrations de PEG et de NaCl entraîne la précipitation de l’ADN de faible poids moléculaire
Pour tester si l’augmentation de la concentration de PEG aide à enrichir l’ADN de faible poids moléculaire, un étalon de laboratoire de fragments de PCR de différentes longueurs a été généré, créant une gamme de fragments d’ADN linéaires (Figure 4). L’étalon a été soumis à quatre conditions de précipitation différentes : 9 % de PEG-8000 + 0,3 M de NaCl (la combinaison d’origine), 9 % de PEG-8000 + 1,2 M de NaCl (augmentation du sel uniquement), 30 % de PEG-8000 + 0,3 M de NaCl (augmentation du PEG uniquement) et 30 % de PEG-8000 + 1,2 M de NaCl (augmentation du sel et du PEG). Les conditions ont été choisies en fonction du protocole standard utilisé pour la surveillance du SRAS-CoV-2¹⁷ et des conditions rapportées dans une étude des méthodes modulaires d’extraction d’ADN à partir d’échantillons environnementaux³³. Deux vitesses de centrifugation différentes - 15 000 x g et 20 000 x g - ont été utilisées sur la base des effets des vitesses différentielles sur la granulation d’ADN⁴³. En augmentant les concentrations de PEG et de NaCl à 30 % et 1,2 M, respectivement, la récupération totale de l’ADN a augmenté d’environ 70 %, et des fragments d’ADN aussi petits que 150 paires de bases (pb) ont été efficacement précipités (figure 5). La différence de vitesse n’a pas eu beaucoup d’effet sur le rendement (figure 6A) et peut être due au long temps de centrifugation utilisé. Étant donné que la récupération totale de l’ADN était plus faible dans la combinaison PEG/NaCl originale, il était possible que les bandes de poids moléculaire inférieur, bien que présentes, aient été à une concentration inférieure à la limite de visualisation. Pour tester cela, la quantité d’ADN d’entrée pour la précipitation a été augmentée, et un excès d’ADN correspondant à chaque traitement (1,5 mg) a été chargé sur le gel d’agarose pour la visualisation. Seul le traitement avec 30 % de PEG a montré une bonne récupération du poids moléculaire le plus bas, c’est-à-dire la bande de 150 pb (Figure 6B).

La précipitation de l’ADN circulaire (ADN génomique bactérien et plasmidique) ne suit pas la même tendance
E. coli L’ADN génomique et le plasmide MG155 (pRSV, ~4 kb) ont été utilisés pour la précipitation avec différentes concentrations de PEG et de NaCl. Contrairement à l’ADN linéaire, l’augmentation des niveaux de PEG et de NaCl n’a pas eu d’impact significatif (figure 7), ce qui suggère que les rendements d’ADN circulaire et de haut poids moléculaire (généralement de l’ADN intracellulaire) ne sont pas affectés par l’augmentation du PEG. Cela contraste avec les observations antérieures avec la précipitation de protéines⁴⁴, où la solubilité diminuait fortement avec la concentration de PEG. Étant donné que le PEG agit comme un agent d’encombrement, on suppose que la surface de la macromolécule disponible pour l’interaction joue un rôle important dans son efficacité en tant qu’agent précipitant. Avec l’ADN linéaire, à mesure que la taille augmente, il est raisonnable de supposer que la surface disponible pour l’interaction augmente également. Avec l’ADN circulaire, il est possible que de faibles concentrations de PEG soient déjà suffisantes pour saturer la molécule, et une augmentation supplémentaire de la concentration peut ne pas augmenter la surface effective d’interaction.

Faible rendement en ADN des eaux usées lors du prétraitement des précipitations avec du PEG et du NaCl
Pour vérifier si le prétraitement des eaux usées est crucial pour l’extraction de l’ADN, 20 mL d’eaux usées inactivées à la chaleur (70 °C, 4 h) ont été enrichis avec 10 mg d’étalon linéaire préalablement préparé et incubés pendant une nuit à 4 °C (a) sans PEG + NaCl, (b) avec 9 % de PEG + 0,3 M de NaCl (combinaison originale), et (c) avec 20 % de PEG + 1,2 M de NaCl (augmentation du PEG et du sel). Les échantillons ont ensuite été traités à travers le kit de sol pour l’extraction de l’ADN, comme expliqué dans le protocole. Il a été constaté que le rendement de l’ADN extrait augmente de 60 % sur les échantillons d’eaux usées de prétraitement avec 9 % de PEG + 0,3 M de NaCl par rapport à l’absence d’étape de prétraitement (Figure 8), ce qui indique que le prétraitement des précipitations de PEG et de NaCl est essentiel pour obtenir de l’ADN à haut rendement à partir d’échantillons d’eaux usées. Il convient également de noter que si le rendement global en ADN, y compris l’ADN génomique de haut poids moléculaire (ADNg), est plus faible lorsque des concentrations élevées de PEG et de sel sont utilisées pour la précipitation, la proportion d’ADN de faible poids moléculaire est enrichie (figure 8). La diminution du rendement global lors de l’augmentation du PEG et du sel peut être attribuée à la nature très visqueuse du PEG, qui peut entraîner la perte de pastilles d’ADN lors de l’élimination du surnageant. Cela renforce les arguments en faveur de la méthode d’extraction de l’ADN par étapes proposée (figure 9), dans laquelle l’ADN de haut poids moléculaire peut d’abord être extrait à l’aide d’une faible précipitation de PEG et de NaCl, et le surnageant résultant peut être soumis à un autre cycle de prétraitement avec une augmentation de PEG et de NaCl pour extraire efficacement l’ADN de faible poids moléculaire qui s’est échappé de la première série de précipitations.

Figure 1 : Prétraitement d’échantillons d’eaux usées. Schéma montrant le flux de travail, de la collecte de l’échantillon à l’extraction de l’ADN. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Profil de gel typique de l’ADN extrait d’échantillons d’eaux usées. Un volume de 50 à 100 mL (comme l’indique la figure) d’eaux usées échantillonnées à différents sites a été inactivé par incubation à 70 °C pendant 4 h. Il a ensuite été incubé avec 9 % de PEG et 0,3 M de NaCl pendant la nuit à 4 °C, puis traité pour extraire l’ADN à l’aide de sol ou d’un kit d’eau. Environ 150 ng de l’ADN total extrait ont été chargés sur un gel d’agarose à 1 % avec une échelle de paires de bases de 1 kilo-base (kb) comme marqueur et soumis à une électrophorèse (90 V, 30 min). L’ADN a été visualisé sous la lumière ultraviolette (UV) à l’aide du colorant SYBR SAFE. Le tableau de droite détaille les sources de collecte d’échantillons, le volume d’eaux usées traitées et le kit utilisé pour l’extraction de l’ADN pour chaque voie. (STP : Station d’épuration des eaux usées ; S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Les échantillons d’effluents de STP montrent de faibles rendements totaux en ADN. Un volume de 40 mL d’eaux usées prélevé dans l’influent et l’effluent de l’usine de traitement des eaux usées a été inactivé par incubation à 70 °C pendant 4 h. Il a ensuite été incubé avec 9 % de PEG et 0,3 M de NaCl pendant la nuit à 4 °C, puis traité pour extraire l’ADN à l’aide d’un kit de sol ou d’eau ou d’un kit d’extraction d’ADN génomique bactérien. Environ 150 ng de l’ADN total extrait ont été chargés sur un gel d’agarose à 1 % avec une échelle de 1 kb comme marqueur et soumis à une électrophorèse (90 V, 30 min). L’ADN a été visualisé sous la lumière ultraviolette (UV) à l’aide du colorant SYBR SAFE. La concentration d’ADN extrait pour les échantillons d’effluents était inférieure à 1 ng/mL d’eaux usées et n’a donc pas pu être visualisée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Génération d’un étalon de taille d’ADN linéaire pour tester l’efficacité de la précipitation d’ADN de faible poids moléculaire. Cinq fragments d’ADN de tailles différentes ont été générés par amplification par PCR à l’aide de l’ADN génomique d’E. coli (MG1655) comme matrice et des amorces et des conditions décrites dans le tableau 2. L’ADN purifié (~1 μg) avec le kit de purification PCR a été chargé sur un gel d’agarose à 1 % avec une échelle de 1 kb comme marqueur et soumis à une électrophorèse (90 V, 40 min). L’ADN a été visualisé sous la lumière ultraviolette (UV) à l’aide du colorant SYBR SAFE. Les voies sont étiquetées par les noms de gènes à partir desquels le fragment a été amplifié et la taille d’amplicon attendue. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : L’ADN de faible poids moléculaire n’est récupéré efficacement qu’à la concentration de PEG la plus élevée (30 %). L’ADN d’entrée (3,34 μg) de l’étalon de taille généré précédemment a été traité avec différentes combinaisons de PEG et de NaCl, comme indiqué dans la figure, et extrait comme indiqué dans le protocole. La vitesse de centrifugation utilisée était de 15 000 x g. Pour l’entrée (voie 3) et 1,2 M NaCl + 30 % PEG (voie 7), 0,8 μg d’ADN a été chargé sur le gel. Pour le reste, comme le rendement total était faible, la quantité totale d’ADN extraite dans 16 μL a été chargée et une échelle de 1 kb a été chargée comme marqueur de taille sur un gel d’agarose à 1 % et soumise à une électrophorèse (80 V, 45 min). L’ADN a été visualisé sous la lumière ultraviolette (UV) à l’aide du colorant SYBR SAFE. L’encadré blanc met en évidence la bande la plus basse de 150 pb. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : La récupération de l’ADN de faible poids moléculaire est déterminée par des concentrations élevées de PEG plutôt que par des concentrations élevées de sel. (A) L’ADN d’entrée (14 μg) de l’étalon de taille a été traité avec différentes combinaisons de PEG et de NaCl, comme indiqué dans la figure, et extrait à l’aide d’une précipitation d’éthanol, comme il est indiqué dans le protocole. La vitesse de centrifugation utilisée était de 15 000 x g et 20 000 x g, comme indiqué sur la figure. La quantité totale d’ADN d’entrée et d’ADN extrait, ainsi qu’une échelle de 1 kb, a été chargée sur un gel d’agarose à 1 % et soumise à une électrophorèse (90 V, 30 min). L’ADN a été visualisé sous la lumière ultraviolette (UV) à l’aide du colorant SYBR SAFE. (B) L’ADN d’entrée (15,67 μg) de l’étalon de taille généré précédemment a été traité avec différentes combinaisons de PEG et de NaCl, comme indiqué sur la figure, et extrait comme indiqué dans le protocole. La vitesse de centrifugation utilisée était de 15 000 x g. L’ADN extrait (1,5 μg) a été chargé dans chaque couloir et une échelle de 1 kb a été chargée comme marqueur de taille sur un gel d’agarose à 1 % et soumise à une électrophorèse (80 V, 45 min). L’ADN a été visualisé sous la lumière ultraviolette (UV) à l’aide du colorant SYBR SAFE. L’encadré blanc met en évidence la bande la plus basse de 150 pb. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : La récupération de l’ADN génomique et de l’ADN plasmidique n’est pas significativement affectée par l’augmentation de la concentration de PEG et de NaCl. L’ADN d’entrée (9 μg ; 4,5 μg de plasmide et 4,5 μg d’ADN génomique) a été traité avec différentes combinaisons de PEG et de NaCl, comme indiqué dans la figure, et extrait comme détaillé dans le protocole. La vitesse de centrifugation utilisée était de 15 000 x g. La quantité totale d’ADN d’entrée et d’ADN extrait, ainsi qu’une échelle de 1 kb, ont été chargées sur un gel d’agarose à 1 % et soumises à une électrophorèse (90 V, 45 min). L’ADN a été visualisé sous la lumière ultraviolette (UV) à l’aide du colorant SYBR SAFE. Les cases blanches indiquent l’ADN génomique et l’ADN plasmidique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8 : Le prétraitement des précipitations avec du PEG et du NaCl est crucial pour l’extraction à haut rendement de l’ADN des eaux usées. Les eaux usées inactivées par la chaleur (70 °C, 4 h) (20 mL) ont été enrichies avec 10 mg d’étalon linéaire préalablement préparé et incubées pendant la nuit à 4 °C sans PEG ni NaCl ni concentrations variables de PEG et de NaCl, comme l’indique la figure. Il a ensuite été traité pour extraire l’ADN à l’aide d’un kit de sol. L’ADN d’entrée (4 μg) utilisé pour l’enrichissement (voie 1) et l’ADN extrait (4 μg) avec une étape de prétraitement de 9 % de PEG + 0,3 M de NaCl (voie 3) ont été chargés sur un gel d’agarose à 1 %. Pour le reste des conditions, la totalité de la quantité d’ADN extrait a été chargée sur le gel car le rendement était faible. Une échelle de 1 kb a également été chargée comme marqueur de taille. Le gel a été soumis à une électrophorèse (70 V, 2 h). L’ADN a été visualisé sous la lumière ultraviolette (UV) à l’aide du colorant SYBR SAFE. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 9 : Méthode proposée d’extraction par étapes de l’ADN des eaux usées pour enrichir l’ADN de haut et de bas poids moléculaire. Organigramme illustrant une méthode en deux étapes d’extraction de l’ADN des eaux usées avec une étape initiale de prétraitement utilisant une faible concentration de PEG et de NaCl. Dès la première étape, le surnageant est soumis à une autre série de précipitations de prétraitement avec une augmentation du PEG et du NaCl pour extraire efficacement l’ADN de haut et de bas poids moléculaire des eaux usées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1. Utilisation antérieure du PEG et du NaCl dans des études d’extraction d’ADN à partir d’échantillons environnementaux. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2. Séquences d’amorces et conditions de PCR pour la génération standard. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 3. Le rendement et la qualité de l’ADN obtenus à partir d’échantillons d’eaux usées sur une période de deux mois en 2023. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

La résistance aux antimicrobiens est l’une des 10 principales menaces pour la santé aujourd’hui, selon l’OMS, et la surveillance environnementale de la résistance aux antimicrobiens est reconnue comme un outil important dans le monde entier. Comme nous l’avons mentionné dans l’introduction, un registre complet de la résistance aux antimicrobiens dans l’environnement comprend de l’ADN de faible poids moléculaire, fragmenté et extracellulaire. Le protocole de prétraitement rapporté ici, utilisant une forte concentration de PEG combinée à du sel (30% de PEG et 1,2 M de NaCl), permet d’obtenir ce résultat en enrichissant la proportion d’ADN de faible poids moléculaire sans affecter l’extraction de fractions de poids moléculaire supérieur (principalement de l’ADN génomique et plasmidique). Cela contraste avec les méthodes de concentration précédentes utilisant des protocoles de PEG plus faibles et de kits directs (sans prétraitement) qui sont lourds en raison de la nécessité de traiter de gros volumes. Le prétraitement avec des concentrations de PEG plus faibles s’est avéré inefficace pour récupérer l’ADN de faible poids moléculaire (« faible » fait référence aux bandes d’ADN inférieures à 600 pb ici). Lorsqu’aucun PEG n’est utilisé pendant le prétraitement, l’extraction de l’ADN est médiocre, ce qui fait que seulement 10 % de l’ADN d’entrée est récupéré, contre 70 % lorsque le PEG et le NaCl sont utilisés (figure 8). En plus de l’ajout de PEG et de NaCl, une autre étape importante est l’élimination de l’éthanol résiduel après l’extraction de l’ADN du kit afin d’obtenir de l’ADN pur pour le traitement en aval. Il est important de déterminer le volume initial d’eau nécessaire pour obtenir une quantité totale d’au moins ~300 ng à 5 mg d’ADN dans un volume de 30 à 50 ml lors de l’élution. Contrairement à 1 L ou plus d’eau qui est généralement traitée pour l’extraction de l’ADN des eaux usées^27,41, il a été constaté qu’avec l’étape de prétraitement proposée ici, seulement 27,5 à 40 ml suffisent pour obtenir de l’ADN de haute qualité pour le traitement en aval. Les eaux usées contiennent également des particules et des matières organiques, qui peuvent contenir des cellules bactériennes adsorbées et de l’ADN extracellulaire. Par conséquent, la désorption des cellules et de l’ADN accompagnée de la lyse cellulaire est une étape importante pour augmenter le rendement en ADN. Des concentrations élevées de PEG rendent l’échantillon visqueux et peuvent entraver les étapes de lyse et de désorption pour l’extraction de l’ADN, comme mentionné précédemment. Pour éviter cela, une méthode d’extraction de l’ADN par étapes a été proposée, comme indiqué dans l’organigramme (figure 9). Cette méthode sera utile pour extraire à la fois l’ADN intracellulaire de haut poids moléculaire (Figure 7) et l’ADN fragmenté et circulaire extracellulaire de faible poids moléculaire.

L’une des limites actuelles de ce protocole en termes de coût est le traitement continu de l’ADN enrichi de faible poids moléculaire à travers un kit pour améliorer la qualité. Cette limitation peut potentiellement être contournée en utilisant d’autres méthodes de nettoyage de l’ADN, comme l’extraction au phénol-chloroforme. Une autre limitation pratique est la manipulation de concentrations élevées de PEG, car la pastille peut être perdue en raison de la viscosité élevée de la solution. Actuellement, un prétraitement à l’aide de PEG et de NaCl est effectué, suivi d’une version modifiée d’un protocole de kit existant, c’est-à-dire que le kit est toujours utilisé pour la purification finale de l’ADN. Une purification sans kit de l’ADN, qui donne un rendement d’ADN élevé mais de faible pureté (non rapporté ici), est en cours d’optimisation pour améliorer la qualité de l’ADN extrait. En raison de la nature visqueuse des solutions PEG, il faut viser une concentration optimale de PEG, capable de produire une gamme complète de tailles d’ADN tout en étant manipulée confortablement. L’abaissement de la concentration à 20 % (figure 6B) a permis d’obtenir un résultat intermédiaire aux efficacités d’extraction de PEG faible (9 %) et élevé (30 %) ; Cela vaudra peut-être la peine d’y donner suite dans le cadre de travaux futurs.

Le PEG est couramment utilisé lors des différentes étapes de l’extraction de l’ADN à partir d’échantillons environnementaux. Cependant, l’utilisation du PEG n’a pas été normalisée pour l’extraction de l’ADN dans le contexte de la surveillance de la RAM. La surveillance des eaux usées implique la détection de la résistance aux antimicrobiens dans de nombreux créneaux différents, y compris les stations d’épuration et les effluents et les drains ouverts et fermés ^8,27. Bien que l’information sur la résistance aux antimicrobiens dans l’affluent fournisse des renseignements cruciaux sur la résistance qui circule dans la communauté, la présence de gènes de résistance aux antimicrobiens dans l’effluent est tout aussi importante pour mesurer et potentiellement prédire l’émergence d’éclosions de résistance. Les échantillons d’effluents ont généralement une faible charge microbienne car la plupart des cellules sont tuées pendant le processus de traitement, ce qui entraîne un très faible rendement en ADN cellulaire. Cependant, les effluents contiennent de l’ADN extracellulaire flottant comprenant à la fois de l’ADN génomique de haut poids moléculaire et un plasmide de faible poids moléculaire, des phagémides et de l’ADN fragmenté. Les gènes AMR présents dans l’ADN de faible poids moléculaire (fragmenté et plasmide/phagémides) peuvent être transférés aux cellules vivantes restantes dans l’effluent, entraînant la dissémination de la résistance 30,41,45. Par conséquent, il est important de détecter l’ADN extracellulaire de faible poids moléculaire dans les eaux usées. Les autres méthodes employées pour l’extraction de l’ADN des eaux usées lors de l’évaluation de la résistance aux antimicrobiens n’assurent généralement pas l’enrichissement initial de l’ADN de faible poids moléculaire. Cette approche d’extraction d’ADN à partir des eaux usées peut être utilisée pour fournir des informations sur un résistome complet de l’environnement.

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Nous reconnaissons le soutien financier de la Fondation Rockefeller (numéro de subvention de la Fondation Rockefeller 2021 HTH 018) dans le cadre de l’équipe APSI India (Alliance for Pathogen Surveillance Innovations https://data.ccmb.res.in/apsi/team/). Nous reconnaissons également l’aide financière fournie par Axis Bank pour soutenir cette recherche et par la Trivedi School of Biosciences de l’Université Ashoka pour l’équipement et d’autres soutiens.