JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים טכניקה פשוטה להערכת עמידות אנטי-מיקרוביאלית סביבתית (AMR) על-ידי שיפור שיעור הדנ"א החוץ תאי בעל משקל מולקולרי נמוך. טיפול קודם עם 20%-30% PEG ו-1.2 M NaCl מאפשר זיהוי של גנים AMR גנומיים ואופקיים. הפרוטוקול משאיל את עצמו לתהליך ללא ערכה עם אופטימיזציה נוספת.

Abstract

מעקב סביבתי מוכר ככלי חשוב להערכת בריאות הציבור בעידן שלאחר המגפה. מים, במיוחד שפכים, התגלו כמקור הבחירה לדגום עומסים פתוגניים בסביבה. שפכים מנקז פתוח וממתקני טיהור מים קהילתיים הם מאגר של פתוגנים וגנים של עמידות מיקרוביאלית (AMR), ולעתים קרובות באים במגע עם בני אדם. בעוד שישנן שיטות רבות למעקב אחר AMR ממים, בידוד DNA באיכות טובה בתפוקות גבוהות מדגימות הטרוגניות נותר אתגר. כדי לפצות, נפחי הדגימה צריכים לעתים קרובות להיות גבוהים, מה שיוצר אילוצים מעשיים. בנוסף, דנ"א סביבתי הוא לעתים קרובות מקוטע, והמקורות של AMR (פלסמידים, פאגים, דנ"א ליניארי) מורכבים מדנ"א במשקל מולקולרי נמוך. עם זאת, תהליכי מיצוי מעטים התמקדו בשיטות למיצוי בתפוקה גבוהה של DNA ליניארי ובעל משקל מולקולרי נמוך. כאן, שיטה פשוטה למיצוי DNA ליניארי בעל תפוקה גבוהה מכמויות קטנות של שפכים באמצעות תכונות המשקעים של פוליאתילן גליקול (PEG) מדווחת. מחקר זה מציג טיעון להגדלת תפוקת הדנ"א הכוללת מדגימות מים שנאספו לצורך ניתוח מטאגנומי על ידי העשרת שיעור הדנ"א הלינארי. בנוסף, שיפור DNA במשקל מולקולרי נמוך מתגבר על הבעיה הנוכחית של תת-דגימה של AMR סביבתי עקב התמקדות בדנ"א בעל משקל מולקולרי גבוה ותוך תאי. שיטה זו צפויה להיות שימושית במיוחד כאשר קיים דנ"א חוץ-תאי אך בריכוזים נמוכים, כגון עם קולחים ממתקני טיהור. זה אמור גם לשפר את הדגימה הסביבתית של מקטעי גנים AMR המתפשטים באמצעות העברת גנים אופקית.

Introduction

SARS-CoV-2 ותוצאותיו הדגישו את חשיבות המעקב הסביבתי בניטור וחיזוי התפרצויות מחלות זיהומיות 1,2. בעוד שמגפות ויראליות ניכרות, עליית העמידות האנטי-מיקרוביאלית (AMR) מתוארת לעתים קרובות כמגיפה חתרנית וכזו המהווה דאגה מובילה לבריאות הציבור ברחבי העולם 3,4. כתוצאה מכך, יש צורך דחוף באסטרטגיות מתואמות כדי להבין את האבולוציה וההתפשטות של AMR. גופי מים, כמו גם שפכים, יכולים לשמש כמאגרים הן לפתוגנים והן ל- AMR 5,6,7,8. מקורות מים משותפים הם, אם כן, מקור רב עוצמה להעברת מחלות בקרב בני אדם, במיוחד במדינות בעלות הכנסה נמוכה ובינונית (LMIC) שבהן היגיינה ירודה והתפוצצות אוכלוסין הולכות יד ביד 9,10,11. בדיקות של מקורות מים כבר זמן רב משמש כדי להעריך את בריאות הקהילה 12,13,14. לאחרונה, שפכים ממתקני טיהור שפכים עירוניים הוכיחו את עצמם כאינדיקטור מתקדם טוב למקרי COVID במרפאה 1,2,15,16,17,18.

בהשוואה לניטור מחלות ספציפיות, איתור ומעקב אחר AMR בסביבה מהווה בעיה מורכבת יותר. המספר הגדול של אנטיביוטיקה בשימוש, גנים מגוונים של עמידות, לחצי ברירה מקומיים שונים והעברת גנים אופקית בין חיידקים מקשים על הערכת נטל AMR אמיתי, ולאחר ההערכה, לקשר אותו עם תצפיות קליניות 19,20,21,22. כתוצאה מכך, בעוד מעקב מרוכז אחר AMR קליני מתבצע על ידי מספר ארגונים ברחבי העולם 3,23,24, ניטור AMR סביבתי עדיין בחיתוליו, נסקר ב 19,25,26.

בשנים האחרונות דווח על שיטות שונות למעקב אחר AMR סביבתי 5,27, שנבדקוב-28,29. נקודת המוצא של רוב אלה היא הפקת DNA באיכות טובה מדגימות סביבתיות הטרוגניות, אתגר בפני עצמו. בנוסף, דנ"א סביבתי הוא בדרך כלל מקוטע בגלל חשיפה לסביבה עוינת. דנ"א חוץ-תאי מקוטע מוכר זה מכבר כמאגר חשוב של גני AMR (נסקר ב-30,31,32), עם פוטנציאל נוסף להיכנס ולצאת מחיידקים באמצעות העברת גנים אופקית. לכן, חשוב שכל פרוטוקול שמטרתו למדוד את עומס AMR בסביבה ידגום DNA ליניארי ובעל משקל מולקולרי נמוך בצורה הטובה ביותר האפשרית. באופן מפתיע, התמקד מעט בפיתוח שיטות ספציפיות למיצוי בעל תפוקה גבוהה של דנ"א ליניארי ובעל משקל מולקולרי נמוך: עבודה זו מתמקדת בטיפול בפער.

שיטה נפוצה ופשוטה לזירוז דנ"א היא שילוב פוליאתילן גליקול (PEG) ומלחים כגון נתרן כלורי (NaCl)33. PEG הוא חומר צפיפות מקרומולקולרי המשמש להשגת משקעים ספציפיים לגודל של מקטעי DNA34,35. ככל שריכוז ה-PEG נמוך יותר, כך המשקל המולקולרי של הדנ"א שניתן לזרז ביעילות גבוה יותר. מחקרים רבים השתמשו ב-PEG במהלך מיצוי סביבתי של דנ"א ורנ"א 1,2 (מסוכם בטבלה 1 17,33,36,37,38,39) בשלב הסופי 33,36,37 או כדי לרכז דגימות מים גדולות להפקת חלקיקים נגיפיים כמו ב-SARS-CoV-2 15,40. בעבודה הנוכחית נמצא כי ריכוזי ה-PEG ששימשו בעבר למיצוי דנ"א סביבתי (שנקבעו במידה רבה על ידי פרוטוקולי מעקב נגיפיים) אינם לוכדים דנ"א ליניארי בעל משקל מולקולרי נמוך. לכן, הם מפסידים דגימה של מקטעי דנ"א קצרים ואינם מתאימים להערכת תוכן AMR במדויק. מחקר זה ניצל את התכונות של פוליאתילן גליקול ונתרן כלורי כדי לזרז ביעילות מקטעי DNA ליניאריים בעלי משקל מולקולרי נמוך בתפוקה גבוהה שיכולה, בעתיד, להוביל לשיטת מיצוי DNA חסכונית. שיטה זו יכולה לשמש להעשרת היחס של DNA מקוטע ומשקל מולקולרי נמוך מדגימות טבעיות מורכבות, ובכך ללכוד תמונה מדויקת יותר של AMR סביבתי. עם קצת יותר חידוד, הטכניקה משאילה את עצמה ליישום קל ובעלות נמוכה על ידי תאגידים עירוניים מקומיים וגופים ממשלתיים אחרים לשימוש ככלי מעקב עם הכשרה טכנית מינימלית.

Protocol

1. דיגום שפכים

  1. טבלו פוליפרופילן בנפח 500 מ"ל במאגר הניקוז הפתוח או במתקן טיהור השפכים (STP) ואספו ~300 מ"ל של דגימת שפכים.
  2. העבר ~ 250 מ"ל של הדגימה לבקבוק פוליפרופילן אוטוקלאבד 250 מ"ל.
  3. הבריגו את פקק הבקבוק ואטמו אותו בסרט פלסטיק. שמרו את הבקבוק זקוף בשקית סגורה.
  4. העבירו את הדגימה זקופה במיכל סגור בטמפרטורת הסביבה.
  5. השבת בחום את הדגימה בטמפרטורה של 70°C בתנור אוויר חם למשך 4 שעות לפני עיבודה למיצוי DNA.

2. הפקת DNA מדגימות שפכים

  1. לאחר קירור דגימת השפכים, מערבלים את הדגימות במהירות מרבית ומניחים לפסולת/בוצה לשקוע.
  2. דקנט 27.5 מ"ל של השפכים בצינורות צנטריפוגות 50 מ"ל ולהוסיף 13.5 גרם של PEG-8000 (ריכוז סופי 30%) ו 3 גרם של NaCl (ריכוז סופי 1.2 M) אליו ולערבב היטב עד מומס לחלוטין.
  3. לדגור את הדגימה לילה (~ 16-18 שעות) ב 4 ° C.
  4. צנטריפוגה הדגימה ב 15,500 x גרם ב 4 ° C במשך 30 דקות.
  5. השליכו את הסופרנטנט.
    הערה: PEG-8000 ב-30% הוא צמיג מאוד, והגלולה יכולה להיזרק בזמן השלכת הסופרנטנט. יש לנטרל את הסופרנאטנט לאט ובזהירות כדי להבטיח שהגלולה לא תאבד. שלבים 2.6 עד 2.23 מבוצעים באמצעות ערכת מיצוי DNA קרקע בהתאם להוראות הערכה עם מספר שינויים.
  6. ממיסים את הגלולה ב 800 μL של תמיסת הליזיס של הערכה ומוסיפים את התמיסה לצינור חרוזי הזירקוניום המעורב.
    הערה: אם אתה מעבד נפחים גדולים יותר, אחסן את הכדוריות ממספר הצינורות הרצוי. לדוגמה, אם עיבוד 160 מ"ל של דגימה; יהיו ארבעה צינורות 50 מ"ל המכילים שפכים עם PEG ו- NaCl. לאחר צנטריפוגה של כל ארבעת הצינורות ב 15,500 x גרם ב 4 ° C במשך 30 דקות, להשליך supernatant מכל ארבעת הצינורות. הוסף 200 μL של תמיסת CD1 לכל אחד, להשהות מחדש את הכדוריות, ולאגד אותם יחד בצינור חרוז אחד.
  7. הדקו את צינור החרוז בצורה אופקית על מערבולת. מערבלים את הצינור במהירות מרבית למשך 20-30 דקות.
    הערה: מערבולות ממושכות מבטיחות ליזה מלאה והומוגניזציה של הדגימות, מה שמשפר את תפוקת ה- DNA.
  8. סובבו את הצינורות במהירות של 8,000 x גרם במשך 15 שניות כדי למקם את החרוזים בתחתית, הסירו קצף, והעבירו את הסופרנאטנט לחלוטין מהצינור לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל. חלק מהחרוזים עשויים גם להיות מועברים במהלך שלב זה.
  9. צנטריפוגה את supernatant ב 15,000 x גרם במשך 1 דקה.
  10. מעבירים את הסופרנאטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה נקי בנפח 2 מ"ל. הסופרנאטנט עדיין עשוי להכיל כמה חלקיקים מרחפים.
  11. הוסף 200 μL של תמיסה משקעת ומערבולת במהירות מקסימלית במשך 5 שניות. יש לדגור ב-4°C למשך 5 דקות.
    הערה: דגירה ב 4 ° C מגביר את היעילות של משקעים של חלבונים ופסולת התא בעוד DNA נשאר בתמיסה. ניתן להשהות את הפרוטוקול בשלב זה למשך עד שעתיים ללא ירידה משמעותית בתפוקה ובאיכות הדנ"א המופק.
  12. צנטריפוגה במהירות 15,000 x גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר (RT). הימנעו מהגלולה והעבירו את הסופרנאטנט השקוף לצינור מיקרוצנטריפוגה נקי של 2 מ"ל.
  13. הוסף 600 μL של חיץ קשירה לכל 700 μL של supernatant ומערבולת במהירות מרבית למשך 5 שניות.
  14. יש להעמיס 700 μL של הליזט על עמוד ספין סיליקה, לדגור במשך 2 דקות, ולצנטריפוגה ב 15,000 x גרם במשך 1 דקה.
    הערה: דגירה של ליזט על עמודת סיליקה משפרת את קשירת הדנ"א לעמודה, וכתוצאה מכך תפוקת דנ"א טובה יותר.
  15. מחק את הזרימה וחזור על שלב 2.14 עד שכל הליזט יעבור דרך עמודת הסיבוב.
  16. מניחים בזהירות את עמוד הסחיטה לתוך צינור איסוף נקי של 2 מ"ל. ודא שלא ניתזה זרימה על עמוד הסיבוב.
  17. הוסף 500 μL של חיץ כביסה לעמוד הסחיטה וצנטריפוגה את עמוד הסחיטה ב- 15,000 x גרם למשך דקה אחת.
  18. מחק את הזרימה והחזיר את עמודת הספין לאותו צינור איסוף של 2 מ"ל.
  19. הוסף 500 μL של חיץ אתנול לשטיפת עמוד הסחיטה. צנטריפוגה במהירות 15,000 x גרם למשך דקה.
  20. השליכו את עמוד הזרימה והכניסו את עמוד הסחרור לצינור איסוף חדש של 2 מ"ל.
  21. צנטריפוגה ב 16,000 x גרם במשך 2 דקות כדי להסיר אתנול שיורי. הכנס את עמוד הסחרור לצינור חדש בנפח 1.5 מ"ל.
  22. מוסיפים 100 μL של חיץ אלוציה (מחומם מראש ל-55°C) למרכז קרום הפילטר הלבן ודגרים במשך 5 דקות.
    הערה: חיץ אלוציה מחומם, יחד עם דגירה על הממברנה, מגביר את היעילות של שאיבת DNA, במיוחד DNA במשקל מולקולרי גבוה.
  23. צנטריפוגה במהירות 15,000 x גרם למשך דקה. מחק את עמודת הסיבוב.
  24. לדנ"א המדולל, יש להוסיף 10 μL של 3 M NaCl (1/10 נפח של DNA eluate) ו-250 μL של אתנול מוחלט מקורר (2.5 נפח של DNA eluate). הפוך כדי לערבב היטב ולסובב את התוכן ב 8,000 x גרם במשך 15 שניות.
  25. לדגור על תערובת DNA-אתנול ב -20 ° C במשך 1 שעה לפחות.
    הערה: ניתן להגדיל את הדגירה של תערובת DNA-אתנול ל -16 שעות ללא ירידה משמעותית בתשואה או באיכות של ה- DNA המופק.
  26. צנטריפוגה ב-19,000 x גרם ב-4°C למשך 30 דקות. השליכו את הסופרנאטנט על ידי הקנטה.
  27. מוסיפים 500 μL של אתנול 70% צונן לכדור.
  28. צנטריפוגה ב-19,000 x גרם ב-4°C למשך 15 דקות. השליכו את הסופרנאטנט על ידי הקנטה.
  29. הפוך והקש בעדינות על הצינור על נייר טישו כדי להסיר שאריות אתנול על ידי פעולה נימית.
  30. יבש את כדורית ה- DNA לחלוטין על ידי שמירה על צינורות פתוחים על בלוק חימום במשך 5-10 דקות ב 37 ° C עד שכל אתנול התאדה.
  31. להשהות מחדש את גלולת הדנ"א ב 30-50 μL של מים מזוקקים כפול autoclaved (ddH2O). יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 5-10 דקות.
  32. סובבו את הדנ"א במהירות של 8,000 x גרם למשך 15 שניות.
  33. בחר ביישום dsDNA תחת ההגדרות חומצות גרעין בספקטרופוטומטר ננו-טיפה.
    1. נקו את הכן עם נייר טישו ללא סיבים ומים. השתמש ב- ddH2O כדי לרוקן את המכשיר ולאחר מכן טען 2 μL של דגימת ה- DNA על הדום.
    2. מדוד את יחסי הריכוז והספיגה (A260/280 ו- A260/230) כדי לקבוע את הטוהר.
  34. אחסן את דגימת ה- DNA ב -20 ° C.

3. משקעים של תגובת שרשרת פולימראז (PCR) - DNA ליניארי מוגבר לבדיקת התאוששות DNA על פני מגוון משקלים מולקולריים

  1. באמצעות DNA גנומי מ- E. coli MG155, להגביר מקטעי גנים על ידי PCR כדי ליצור מאגר של מקטעים ליניאריים מהגנים הבאים: fusA, lacZ, gapA, rpsD, 16S rRNA, marR (ראה טבלה 2 עבור רצפי פריימר ותנאי PCR).
  2. לטהר את מוצרי ה-PCR באמצעות ערכת טיהור ה-PCR ולאגד את מוצרי ה-PCR יחד.
  3. חלקו את האמפליקונים המאוחדים לצינורות מיקרוצנטריפוגות בנפח 1.5 מ"ל בעלי נפחים שווים - תייגו צינור אחד כ'דנ"א קלט'.
  4. הוסף PEG ו- NaCl בהתאם לתנאים הרצויים (9%, 20%, 30% PEG-8000; 0.3 M, 1.2 M NaCl) לכל אחד מהצינורות למעט זה שכותרתו 'קלט DNA' והשלם את הנפח הסופי ל- 1 מ"ל.
  5. לדגור את הצינורות לילה (~ 16-18 שעות) ב 4 ° C.
    הערה: בשאר השלבים עד 3.16, 'DNA קלט' נשמר ללא שינוי במקרר.
  6. סובבו את הצינורות במיקרו-צנטריפוגה שולחנית בהתאם למהירות הרצויה (15,000 x גרם או 20,000 x גרם) למשך שעה אחת ב-4°C.
  7. בזהירות להסיר 900 μL של supernatant מהצד מול הגלולה באמצעות micropipette.
  8. שטיפת אתנול ראשונה: הוסיפו 900 μL אתנול 70% צונן לגלולה וערבבו על ידי היפוך עדין של הצינורות.
  9. סובב את הצינורות באותה מהירות שבה נעשה שימוש בשלב 3.6 (15,000 x גרם או 20,000 x גרם) למשך 30 דקות ב- 4 ° C.
  10. הסר את supernatant על ידי decantation.
  11. שטיפת אתנול שנייה: הוסיפו לכדורית 500 מיקרוליטר אתנול 70% מקורר.
  12. סובב את הצינורות באותה מהירות שבה נעשה שימוש בשלב 3.6 (15,000 x גרם או 20,000 x גרם) למשך 30 דקות ב-4°C. השליכו את הסופרנאטנט על ידי הקנטה.
  13. הפוך והקש בעדינות על הצינור על נייר טישו כדי להסיר שאריות אתנול על ידי פעולה נימית.
  14. יבש את כדורית ה- DNA לחלוטין על ידי שמירה על צינורות פתוחים על בלוק חימום במשך 5-10 דקות ב 37 ° C עד שכל אתנול מתאדה.
  15. להשהות מחדש את הגלולה ב 20 μL של מים מזוקקים כפול autoclaved.
  16. למדוד את ריכוז הדנ"א המואץ על ידי התנאים השונים ואת 'דנ"א הקלט' באמצעות ספקטרופוטומטר ננו-טיפה או פלואורומטר.
  17. טען את ה- DNA המואץ על ג'ל אגרוז 1% להדמיית DNA.

  

תוצאות

קביעת פרוטוקול למיצוי DNA בתפוקה גבוהה מדגימות שפכים
גרסה שונה של פרוטוקולים שנקבעו בעבר שימשה להפקת DNA ו- RNA באיכות גבוהה מדגימות מים17. הדגימות נלקחו מנקז פתוח וכן ממתקני טיהור שפכים באזור דלהי-NCR בצפון הודו. לאחר עיבוד מקדים באמצעות PEG ו-NaCl (איור 1), הדגימות עובדו באמצעות ערכות להפקת דנ"א מאדמה וממים. בכל המקרים נצפתה רצועה בולטת בעלת משקל מולקולרי גבוה שככל הנראה מתאימה לדנ"א חיידקי תוך-תאי וכתם רקע, כפי שאופייני לדגימות סביבתיות37 (איור 2).

היעדר שאיבת DNA יעילה משפכי מכון טיהור שפכים (STP)
אף על פי שהתקבלה תפוקה סבירה של דנ"א כולל מנקז פתוח ומשפעת STP (טבלה 3), לא ניתן היה לקבל דנ"א מהשפכים המטופלים הסופיים; בעיות עם תפוקה נמוכה תוארו גם בעבודה קודמת41 (איור 3). לאחר הטיפול, הכולל הכלרה של שפכים, ובמקרים מסוימים גם טיפולי UV וגם אולטרה-סינון42, העומס המיקרוביאלי צפוי להיות נמוך, וכל שאריות DNA (המורכבות מדנ"א חוץ-תאי ומקוטע) ידוללו. הריכוז הנמוך הראשוני של PEG המשמש בריכוז הדגימות ובמשקעים של חומצות גרעין עשוי להוציא DNA במשקל מולקולרי נמוך. במילים אחרות, הדנ"א המקוטע עלול ללכת לאיבוד בשלב הריכוז הראשוני.

עלייה בריכוזים של PEG ו-NaCl מובילה למשקעים של DNA במשקל מולקולרי נמוך יותר
כדי לבדוק אם הגדלת ריכוז ה-PEG מסייעת בהעשרת דנ"א במשקל מולקולרי נמוך יותר, נוצר תקן מעבדה של מקטעי PCR באורכים שונים, היוצר מגוון של מקטעי דנ"א ליניאריים (איור 4). התקן היה נתון לארבעה תנאי משקעים שונים - 9% PEG-8000 + 0.3 M NaCl (השילוב המקורי), 9% PEG-8000 + 1.2 M NaCl (העלאת מלח בלבד), 30% PEG-8000 + 0.3 M NaCl (העלאת PEG בלבד) ו- 30% PEG-8000 + 1.2 M NaCl (העלאת מלח ו- PEG). התנאים נבחרו בהתבסס על הפרוטוקול הסטנדרטי המשמש למעקב אחר SARS-CoV-217 ועל סמך תנאים שדווחו במחקר של שיטות מודולריות של מיצוי DNA מדגימות סביבתיות33. שתי מהירויות צנטריפוגה שונות - 15,000 x g ו- 20,000 x g - שימשו בהתבסס על ההשפעות של מהירויות דיפרנציאליות על כדורי DNA43. עם העלאת ריכוזי ה-PEG וה-NaCl ל-30% ו-1.2 מיליון, בהתאמה, ההתאוששות הכוללת של הדנ"א גדלה בכ-70%, ומקטעי דנ"א קטנים כמו 150 זוגות בסיסים (bp) הואצו ביעילות (איור 5). ההבדל במהירות לא השפיע רבות על היבול (איור 6A) וייתכן שהוא נובע מזמן השימוש הארוך בצנטריפוגה. מאחר ששחזור הדנ"א הכולל היה נמוך יותר בשילוב המקורי של PEG/NaCl, ייתכן שפסי משקל מולקולריים נמוכים יותר, למרות שהיו קיימים, היו בריכוז מתחת לגבול ההדמיה. כדי לבדוק זאת, כמות ה- DNA הקלט למשקעים הוגדלה, ועודף DNA המתאים לכל טיפול (1.5 מ"ג) הועמס על ג'ל האגרוז להדמיה. רק הטיפול עם 30% PEG הראה התאוששות טובה של המשקל המולקולרי הנמוך ביותר, כלומר פס של 150 bp (איור 6B).

משקעים של דנ"א מעגלי (דנ"א גנומי חיידקי ופלסמיד) אינם עוקבים אחר אותה מגמה
אי קולי MG155 DNA גנומי ופלסמיד (pRSV, ~ 4 kb) שימשו למשקעים עם ריכוזי PEG ו- NaCl שונים. שלא כמו עם דנ"א ליניארי, לא הייתה השפעה משמעותית של העלאת רמות PEG ו-NaCl (איור 7), מה שמרמז על כך שתשואות של דנ"א מעגלי ובעל משקל מולקולרי גבוה (בדרך כלל דנ"א תוך-תאי) אינן מושפעות מהעלאת PEG. זאת בניגוד לתצפיות קודמות עם משקעים חלבוניים44, שם המסיסות ירדה בתלילות עם ריכוז PEG. בהתחשב בכך ש-PEG פועל כחומר צפיפות, משערים כי שטח הפנים של המקרומולקולה הזמין לאינטראקציה ממלא תפקיד חשוב ביעילותו כגורם מזרז. עם דנ"א ליניארי, ככל שהגודל גדל, סביר להניח שגם השטח הזמין לאינטראקציה גדל. עם דנ"א מעגלי, ייתכן שריכוזי PEG נמוכים כבר מספיקים כדי להרוות את המולקולה, והעלאה נוספת של הריכוז עשויה שלא להגדיל את שטח הפנים האפקטיבי לאינטראקציה.

תפוקה ירודה של DNA משפכים בעת עיבוד מראש של משקעים עם PEG ו- NaCl מושמטת
כדי לבדוק אם עיבוד מקדים של שפכים חיוני להפקת DNA, 20 מ"ל של שפכים מומתים בחום (70°C, 4 שעות) הוזנקו עם 10 מ"ג של תקן ליניארי שהוכן קודם לכן והודגרו במשך הלילה ב-4°C (א) ללא PEG + NaCl, (ב) עם 9% PEG + 0.3 M NaCl (שילוב מקורי), ו-(ג) עם 20% PEG + 1.2 M NaCl (PEG מוגבר ומלח). לאחר מכן עובדו הדגימות באמצעות ערכת הקרקע לצורך מיצוי DNA, כפי שמוסבר בפרוטוקול. נמצא כי תפוקת הדנ"א המופק עולה ב-60% בדגימות שפכים לפני עיבוד עם 9% PEG + 0.3 M NaCl בהשוואה ללא שלב עיבוד מקדים (איור 8), מה שמצביע על כך שעיבוד מקדים של משקעים מסוג PEG ו-NaCl חיוני לקבלת דנ"א בעל תפוקה גבוהה מדגימות שפכים. ראוי גם לציין כי בעוד שתפוקת הדנ"א הכוללת, כולל דנ"א גנומי בעל משקל מולקולרי גבוה (gDNA), נמוכה יותר כאשר משתמשים ב-PEG גבוה ובמלח למשקעים, שיעור הדנ"א בעל משקל מולקולרי נמוך מועשר (איור 8). ניתן לייחס את הירידה בתפוקה הכוללת בהעלאת PEG ומלח לאופי צמיגי מאוד של PEG, אשר יכול להוביל לאובדן כדורי DNA בעת הסרת הסופרנטנט. זה מחזק את הטיעון של שיטת מיצוי הדנ"א המוצעת בשלב (איור 9), שבה דנ"א בעל משקל מולקולרי גבוה יכול להיות מופק תחילה באמצעות משקעים נמוכים של PEG ו-NaCl, והסופרנאטנט שנוצר יכול להיות נתון לסבב נוסף של עיבוד מקדים עם PEG ו-NaCl מוגברים כדי לחלץ ביעילות את הדנ"א בעל המשקל המולקולרי הנמוך שנמלט מסבב המשקעים הראשון.

figure-results-5463
איור 1: עיבוד מקדים של דגימות שפכים. סכמטי המציג את זרימת העבודה מאיסוף דגימות ועד מיצוי DNA. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5904
איור 2: פרופיל ג'ל טיפוסי של דנ"א המופק מדגימות שפכים. נפח של 50-100 מ"ל (כפי שמצוין באיור) של שפכים שנדגמו מאתרים שונים היה מנוטרל בחום על ידי דגירה ב 70 ° C במשך 4 שעות. לאחר מכן הוא הודגר עם 9% PEG ו-0.3 M NaCl למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C ולאחר מכן עובד כדי לחלץ DNA באמצעות אדמה או ערכת מים. כ-150 ננוגרם של דנ"א שהופק הועמס על ג'ל אגרוז 1% יחד עם סולם זוגות בסיס של קילו אחד (kb) כסמן ועבר אלקטרופורזה (90 וולט, 30 דקות). DNA הודגם תחת אור אולטרה סגול (UV) באמצעות הצבע SYBR SAFE. הטבלה מימין מפרטת את מקורות איסוף הדגימות, נפח השפכים המעובדים והערכה המשמשת להפקת DNA עבור כל נתיב. (STP: מכון טיהור שפכים; UVR: קרינה אולטרה סגולה) לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6883
איור 3: דגימות שפכי STP מראות תפוקת דנ"א כוללת ירודה. נפח של 40 מ"ל שפכים שנדגמו משפכים ושפכים של STP היו מנוטרלים בחום על ידי דגירה בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות. לאחר מכן הוא הודגר עם 9% PEG ו-0.3 M NaCl למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C ולאחר מכן עובד כדי לחלץ DNA באמצעות ערכת אדמה או מים או ערכת מיצוי DNA גנומית חיידקית. כ-150 ננוגרם של דנ"א כולל שהופק הועמס על ג'ל אגרוז 1% יחד עם סולם 1 קילובייט כסמן ועבר אלקטרופורזה (90 וולט, 30 דקות). DNA הודגם תחת אור אולטרה סגול (UV) באמצעות הצבע SYBR SAFE. ריכוז הדנ"א המופק עבור דגימות הקולחים היה מתחת ל-1 ננוגרם/מ"ל של שפכים ולכן לא ניתן היה לדמיין זאת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-7840
איור 4: יצירת תקן גודל דנ"א ליניארי לבדיקת היעילות של משקעי דנ"א בעלי משקל מולקולרי נמוך. חמישה מקטעי DNA בגדלים שונים נוצרו על ידי הגברת PCR באמצעות E . coli (MG1655) DNA גנומי כתבנית ופריימרים ותנאים כמתואר בטבלה 2. DNA מטוהר (~ 1 מיקרוגרם) עם ערכת טיהור PCR הועמס על ג'ל אגרוז 1% יחד עם סולם 1 קילובייט כסמן והיה נתון לאלקטרופורזה (90 V, 40 דקות). DNA הודגם תחת אור אולטרה סגול (UV) באמצעות הצבע SYBR SAFE. הנתיבים מסומנים בשמות גנים שמהם הוגבר הקטע ובגודל האמפליקון הצפוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-8690
איור 5: דנ"א בעל משקל מולקולרי נמוך משוחזר ביעילות רק בריכוז ה-PEG הגבוה ביותר (30%). קלט DNA (3.34 מיקרוגרם) מהתקן בגודל שנוצר בעבר טופל בשילובים שונים של PEG ו- NaCl כפי שמצוין באיור וחולץ כמפורט בפרוטוקול. מהירות הצנטריפוגה בה נעשה שימוש הייתה 15,000 x גרם. עבור קלט (נתיב 3) ו- 1.2 M NaCl + 30% PEG (נתיב 7), 0.8 מיקרוגרם DNA הועמס על הג'ל. עבור השאר, מכיוון שהתשואה הכוללת הייתה נמוכה, הכמות הכוללת של DNA שהופקה ב -16 μL הועמסה וסולם 1 קילובייט הועמס כסמן גודל על ג'ל אגרוז 1% והיה נתון לאלקטרופורזה (80 V, 45 דקות). DNA הודגם תחת אור אולטרה סגול (UV) באמצעות הצבע SYBR SAFE. התיבה הלבנה מדגישה את הפס הנמוך ביותר של 150 bp. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-9664
איור 6: התאוששות דנ"א במשקל מולקולרי נמוך נקבעת על-ידי ריכוזי PEG גבוהים ולא על-ידי ריכוזי מלח גבוהים. (A) קלט דנ"א (14 מיקרוגרם) מהתקן בגודל טופל בשילובים שונים של PEG ו-NaCl, כפי שמצוין באיור, והופק באמצעות משקעי אתנול כמפורט בפרוטוקול. מהירות הצנטריפוגה בה נעשה שימוש הייתה 15,000 x g ו- 20,000 x g, כפי שמצוין באיור. כל כמות הקלט DNA ו- DNA שחולץ, יחד עם סולם 1 קילובייט, הועמסו על ג'ל אגרוז 1% והיו נתונים לאלקטרופורזה (90 V, 30 דקות). DNA הודגם תחת אור אולטרה סגול (UV) באמצעות הצבע SYBR SAFE. (B) קלט DNA (15.67 מיקרוגרם) מהתקן בגודל שנוצר קודם לכן טופל בשילובים שונים של PEG ו-NaCl, כפי שמצוין באיור, וחולץ כמפורט בפרוטוקול. מהירות הצנטריפוגה בה נעשה שימוש הייתה 15,000 x גרם. DNA שהופק (1.5 מיקרוגרם) הועמס לכל נתיב וסולם 1 קילובייט הועמס כסמן גודל על ג'ל אגרוז 1% ועבר אלקטרופורזה (80 וולט, 45 דקות). DNA הודגם תחת אור אולטרה סגול (UV) באמצעות הצבע SYBR SAFE. התיבה הלבנה מדגישה את הפס הנמוך ביותר של 150 bp. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-10987
איור 7: התאוששות הדנ"א הגנומי והפלסמיד אינה מושפעת באופן משמעותי מעלייה בריכוז PEG ו-NaCl. קלט DNA (9 מיקרוגרם; 4.5 מיקרוגרם פלסמיד ו-4.5 מיקרוגרם דנ"א גנומי) טופל בשילובים שונים של PEG ו-NaCl כפי שמצוין באיור וחולץ כמפורט בפרוטוקול. מהירות הצנטריפוגה בה נעשה שימוש הייתה 15,000 x גרם. כל כמות הקלט DNA ו- DNA שחולץ, יחד עם סולם 1 קילובייט, הועמסו על ג'ל אגרוז 1% ועברו אלקטרופורזה (90 V, 45 דקות). DNA הודגם תחת אור אולטרה סגול (UV) באמצעות הצבע SYBR SAFE. הקופסאות הלבנות מציינות את הדנ"א הגנומי ואת הדנ"א הפלסמיד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-11860
איור 8: עיבוד מקדים של משקעים עם PEG ו-NaCl חיוני להפקת דנ"א משפכים בעלי תפוקה גבוהה. שפכים מומתים בחום (70°C, 4 שעות) (20 מ"ל) הוזנקו ב-10 מ"ג של תקן ליניארי שהוכן קודם לכן והודגרו במשך הלילה ב-4°C ללא PEG ו-NaCl או ריכוזי PEG ו-NaCl משתנים כפי שמצוין באיור. לאחר מכן הוא עובד כדי לחלץ DNA באמצעות ערכת אדמה. קלט DNA (4 מיקרוגרם) המשמש לדוקרציה (נתיב 1), ו- DNA שהופק (4 מיקרוגרם) עם שלב עיבוד מקדים של 9% PEG + 0.3 M NaCl (נתיב 3) הועמס על ג'ל אגרוז 1%. בשאר התנאים, כל כמות הדנ"א שחולץ הועמסה על הג'ל מכיוון שהתשואה הייתה נמוכה. סולם של 1 קילובייט הועמס גם הוא כסמן גודל. הג'ל היה נתון לאלקטרופורזה (70 V, 2 שעות). DNA הודגם תחת אור אולטרה סגול (UV) באמצעות הצבע SYBR SAFE. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-12884
איור 9: שיטה מדורגת מוצעת להפקת דנ"א משפכים כדי להעשיר דנ"א במשקל מולקולרי גבוה ונמוך. תרשים זרימה המתאר שיטה דו-שלבית של מיצוי DNA משפכים עם שלב עיבוד מקדים ראשוני באמצעות ריכוז PEG ו-NaCl נמוך. הסופרנאטנט מהצעד הראשון נתון לסבב נוסף של משקעים טרום עיבוד עם PEG מוגבר ו- NaCl כדי לחלץ ביעילות דנ"א במשקל מולקולרי גבוה ונמוך משפכים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1. שימוש קודם ב-PEG וב-NaCl במחקרים להפקת DNA מדגימות סביבתיות. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 2. רצפי פריימר ותנאי PCR ליצירה סטנדרטית. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 3. תפוקת DNA ואיכותו המתקבלים מדגימות שפכים במשך חודשיים בשנת 2023. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Discussion

AMR הוא אחד מעשרת האיומים הבריאותיים המובילים כיום, כפי שצוין על ידי ארגון הבריאות העולמי, ומעקב סביבתי אחר AMR מוכר ככלי חשוב ברחבי העולם. כפי שהוזכר במבוא, תיעוד מקיף של AMR סביבתי כולל דנ"א בעל משקל מולקולרי נמוך, מקוטע וחוץ-תאי. פרוטוקול העיבוד המקדים שדווח כאן באמצעות ריכוז גבוה של PEG בשילוב עם מלח (30% PEG ו-1.2 M NaCl) משיג תוצאה זו על ידי העשרת שיעור הדנ"א בעל משקל מולקולרי נמוך מבלי להשפיע על מיצוי שברים בעלי משקל מולקולרי גבוה יותר (בעיקר דנ"א גנומי ופלסמיד). זאת בניגוד לשיטות ריכוז קודמות המשתמשות בפרוטוקולי PEG נמוכים יותר וקיט ישיר (ללא עיבוד מקדים) המסורבלים בשל הצורך בעיבוד נפחים גדולים. עיבוד מקדים עם ריכוזי PEG נמוכים יותר לא היה יעיל בשחזור דנ"א במשקל מולקולרי נמוך ("נמוך" מתייחס כאן לפסי דנ"א מתחת ל-600 bp). כאשר לא נעשה שימוש ב-PEG במהלך עיבוד מקדים, מיצוי הדנ"א גרוע, וכתוצאה מכך רק 10% מהדנ"א הקלט משוחזר, לעומת 70% כאשר משתמשים ב-PEG וב-NaCl (איור 8). בנוסף לתוספת של PEG ו- NaCl, צעד חשוב נוסף הוא הסרת שאריות אתנול לאחר מיצוי DNA מהערכה כדי לקבל DNA טהור לעיבוד במורד הזרם. חשוב לקבוע את נפח המים הראשוני הדרוש כדי לקבל כמות כוללת של לפחות ~ 300 ng עד 5 מ"ג DNA בנפח של 30-50 מ"ל עם ההדבקה. בניגוד ל-1 ליטר או יותר של מים המעובדים בדרך כלל להפקת דנ"א משפכים27,41, נמצא כי בשלב העיבוד המקדים המוצע כאן, די ב-27.5-40 מ"ל בלבד כדי לקבל דנ"א איכותי לעיבוד במורד הזרם. שפכים מכילים גם חלקיקים וחומר אורגני, אשר יכולים להכיל תאי חיידקים נספגים ו- DNA חוץ-תאי. לפיכך, ספיחת תאים ודנ"א המלווה בליזה של התא היא צעד חשוב להגדלת תפוקת ה- DNA. ריכוזי PEG גבוהים הופכים את הדגימה לצמיגה ויכולים לעכב את שלבי הליזה והספיחה למיצוי DNA, כאמור. כדי להימנע מכך, הוצעה שיטה מדורגת למיצוי דנ"א, כפי שמתואר בתרשים הזרימה (איור 9). שיטה זו תסייע בחילוץ דנ"א תוך-תאי בעל משקל מולקולרי גבוה (איור 7), ודנ"א חוץ-תאי בעל משקל מולקולרי נמוך מקוטע ומעגלי.

אחת המגבלות הנוכחיות של פרוטוקול זה במונחים של הוצאות היא המשך עיבוד של DNA מועשר במשקל מולקולרי נמוך באמצעות ערכה לשיפור האיכות. מגבלה זו ניתנת לעקיפה באמצעות שיטות אחרות של ניקוי DNA, כמו מיצוי פנול-כלורופורם. מגבלה מעשית נוספת היא טיפול בריכוזי PEG גבוהים מכיוון שהגלולה עלולה ללכת לאיבוד בשל צמיגות גבוהה של התמיסה. נכון לעכשיו, עיבוד מקדים באמצעות PEG ו- NaCl מתבצע, ואחריו גרסה שונה של פרוטוקול ערכה קיים, כלומר, הערכה עדיין משמשת לטיהור DNA סופי. טיהור ללא ערכה של DNA, אשר נותן תפוקת DNA גבוהה אך של טוהר נמוך (לא דווח כאן), הוא אופטימיזציה כדי לשפר את איכות ה- DNA שחולץ. בשל האופי הצמיגי של תמיסות PEG, יש לכוון לריכוז PEG אופטימלי שיכול להניב מגוון רחב של גדלי DNA ועם זאת להיות מטופל בנוחות. הורדת הריכוז ל-20% (איור 6B) השיגה תוצאה המתווכת ליעילות מיצוי של PEG נמוך (9%) וגבוה (30%); זה עשוי להיות שווה מעקב בעבודה בעתיד.

PEG משמש באופן שגרתי במהלך שלבים שונים של מיצוי DNA מדגימות סביבתיות. עם זאת, השימוש ב-PEG לא עבר סטנדרטיזציה למיצוי DNA בהקשר של מעקב AMR. מעקב אחר שפכים כרוך באיתור עמידות מיקרוביאלית בנישות רבות ושונות, כולל STPs (שפכים וקולחים) וניקוז פתוח וסגור 8,27. בעוד שהמידע על AMR בשפכים מספק מידע חיוני על העמידות המסתובבת בקהילה, נוכחותם של גנים של AMR בשפכים חשובה באותה מידה כדי למדוד ולחזות את הופעתן של התפרצויות עמידות. דגימות קולחים בדרך כלל יש עומס מיקרוביאלי נמוך מאז רוב התאים נהרגים במהלך תהליך הטיפול, וכתוצאה מכך תפוקת DNA התא נמוכה מאוד. עם זאת, הקולחים מכילים דנ"א צף חופשי חוץ-תאי הכולל הן דנ"א גנומי בעל משקל מולקולרי גבוה והן פלסמיד בעל משקל מולקולרי נמוך, פאגמידים ודנ"א מקוטע. גנים AMR הנמצאים בדנ"א במשקל מולקולרי נמוך (הן מקוטעים והן פלסמיד/פאגמידים) יכולים לעבור לתאים החיים הנותרים בקולחים, מה שמוביל להפצת עמידות 30,41,45. לכן, חשוב לזהות DNA חוץ-תאי בעל משקל מולקולרי נמוך בשפכים. שיטות אחרות המשמשות להפקת DNA משפכים בעת הערכת AMR בדרך כלל אינן מבטיחות העשרה ראשונית של DNA במשקל מולקולרי נמוך. גישה זו של מיצוי DNA משפכים יכולה לשמש כדי לספק מידע על התנגדות מקיפה של הסביבה.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

Acknowledgements

אנו מכירים בתמיכת מימון מקרן רוקפלר (מענק קרן רוקפלר מספר 2021 HTH 018) כחלק מצוות APSI הודו (Alliance for Pathogen Surveillance Innovations https://data.ccmb.res.in/apsi/team/). אנו מכירים גם בסיוע הכספי שניתן על ידי בנק Axis לתמיכה במחקר זה ובית הספר Trivedi למדעים ביולוגיים באוניברסיטת אשוקה עבור ציוד ותמיכה אחרת.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
24-seat microcentrifugeEppendorf Centrifuge 5425 REP5406000046
Absolute Ethanol (Emsure ACS, ISO, Reag. Ph Eur Ethanol absolute for analysis)Supelco100983-0511
AgaroseInvitrogen16500500
Bench top refrigerated centrifugeEppendorf Centrifuge 5920 REP5948000131
ChemiDoc Imaging SystemBioRad12003153
DNeasy PowerSoil Pro KitQiagen47014
DNeasy PowerWater Pro KitQiagen14900-100-NF
dNTPs (dNTP Mix 10mM Each,0.2 mL, R0191)Thermo FisherR0191
DreamTaq DNA Polymerase, 5 U/µL + 10x DreamTaq Buffer*ThermofscientificEP0702
E-Gel 1 Kb Plus Express DNA LadderInvitrogen10488091
Maxiamp PCR tubes 0.2 mLTarsons510051
Molecular Biology Grade Water for PCRHiMediaML065-1.5ML
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis SpectrophotometerThermo Scientific13400519
ParafilmBemisS37440
PEG-8000SRL54866
QIAquick PCR & Gel Cleanup KitQiagen28506
Qubit 4 Fluorometer (with WiFi)ThermofisherQ33238
Qubit Assay TubesThermofisherQ32856
Qubitt reagent kit for ds DNA, broad rangeThermo ScientificQ32853 (500 assays)
Sodium ChlorideHiMediaTC046M-500G
SYBR Safe DNA Gel StainInvitrogenS33102
T100 Thermal CyclerBioRad1861096
Thermo Cycler (ProFlex 3 x 32-well PCR System)Applied Biosystems4484073
Wizard Genomic DNA Purification KitPromegaA1125

References

  1. Kirby, A. E., et al. Using wastewater surveillance data to support the COVID-19 response - United States, 2020-2021. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 70 (36), 1242-1244 (2021).
  2. Amman, F., et al. Viral variant-resolved wastewater surveillance of SARS-COV-2 at national scale. Nat Biotechnol. 40 (12), 1814-1822 (2022).
  3. Antimicrobial Resistance Collaborators. Global burden of bacterial antimicrobial resistance in 2019: A systematic analysis. Lancet. 399 (10325), 629-655 (2022).
  4. The L. Antimicrobial resistance. The L. Antimicrobial resistance: Time to repurpose the global fund. Lancet. 399 (10322), 335(2022).
  5. Munk, P., et al. Genomic analysis of sewage from 101 countries reveals global landscape of antimicrobial resistance. Nat Commun. 13 (1), 7251(2022).
  6. Parnanen, K. M. M., et al. Antibiotic resistance in European wastewater treatment plants mirrors the pattern of clinical antibiotic resistance prevalence. Sci Adv. 5 (3), 9124(2019).
  7. Grenni, P. Antimicrobial resistance in rivers: A review of the genes detected and new challenges. Environ Toxicol Chem. 41 (3), 687-714 (2022).
  8. Siri, Y., Precha, N., Sirikanchana, K., Haramoto, E., Makkaew, P. Antimicrobial resistance in southeast Asian water environments: A systematic review of current evidence and future research directions. Sci Total Environ. 896, 165229(2023).
  9. Hunter, P. R., Macdonald, A., Carter, R. C. Water supply and health. PLoS Med. 7 (11), e1000361(2010).
  10. Bain, R., et al. Fecal contamination of drinking-water in low- and middle-income countries: A systematic review and meta-analysis. PLoS Med. 11 (5), e1001644(2014).
  11. Collignon, P., Beggs, J. J., Walsh, T. R., Gandra, S., Laxminarayan, R. Anthropological and socioeconomic factors contributing to global antimicrobial resistance: A univariate and multivariable analysis. Lancet Planet Health. 2 (9), e398-e405 (2018).
  12. Asghar, H., et al. Environmental surveillance for polioviruses in the global polio eradication initiative. J Infect Dis. 210, Suppl 1 S294-S303 (2014).
  13. Gracia-Lor, E., Rousis, N. I., Hernandez, F., Zuccato, E., Castiglioni, S. Wastewater-based epidemiology as a novel biomonitoring tool to evaluate human exposure to pollutants. Environ Sci Technol. 52 (18), 10224-10226 (2018).
  14. Choi, P. M., et al. economic correlates of food and chemical consumption measured by wastewater-based epidemiology. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (43), 21864-21873 (2019).
  15. Hemalatha, M., et al. Surveillance of SARS-COV-2 spread using wastewater-based epidemiology: Comprehensive study. Sci Total Environ. 768, 144704(2021).
  16. Westhaus, S., et al. Detection of sars-cov-2 in raw and treated wastewater in Germany - suitability for COVID-19 surveillance and potential transmission risks. Sci Total Environ. 751, 141750(2021).
  17. Lamba, S., et al. SARS-COV-2 infection dynamics and genomic surveillance to detect variants in wastewater - a longitudinal study in Bengaluru, India. Lancet Reg Health Southeast Asia. 11, 100151(2023).
  18. Stockdale, S. R., et al. RNA-seq of untreated wastewater to assess COVID-19 and emerging and endemic viruses for public health surveillance. Lancet Reg Health Southeast Asia. 14, 100205(2023).
  19. Bengtsson-Palme, J., et al. Towards monitoring of antimicrobial resistance in the environment: For what reasons, how to implement it, and what are the data needs. Environ Int. 178, 108089(2023).
  20. Bengtsson-Palme, J., Kristiansson, E., Larsson, D. G. J. Environmental factors influencing the development and spread of antibiotic resistance. FEMS Microbiol Rev. 42 (1), 053(2018).
  21. Dunachie, S. J., Day, N. P., Dolecek, C. The challenges of estimating the human global burden of disease of antimicrobial resistant bacteria. Curr Opin Microbiol. 57, 95-101 (2020).
  22. Hughes, D., Andersson, D. I. Evolutionary trajectories to antibiotic resistance. Annu Rev Microbiol. 71, 579-596 (2017).
  23. World Health Organization. Global antimicrobial resistance and use surveillance system (GLASS). World Health Organization. , (2022).
  24. Walia, K., et al. Establishing antimicrobial resistance surveillance & research network in india: Journey so far. Indian J Med Res. 149 (2), 164-179 (2019).
  25. Hart, A., Warren, J., Wilkinson, H., Schmidt, W. Environmental surveillance of antimicrobial resistance (AMR), perspectives from a national environmental regulator in 2023. Euro Surveill. 28 (11), (2023).
  26. Huijbers, P. M. C., Flach, C. F., Larsson, D. G. J. A conceptual framework for the environmental surveillance of antibiotics and antibiotic resistance. Environ Int. 130, 104880(2019).
  27. Liguori, K., et al. Antimicrobial resistance monitoring of water environments: A framework for standardized methods and quality control. Environ Sci Technol. 56 (13), 9149-9160 (2022).
  28. Hayward, C., Ross, K. E., Brown, M. H., Whiley, H. Water as a source of antimicrobial resistance and healthcare-associated infections. Pathogens. 9 (8), 667(2020).
  29. Booton, R. D., et al. One health drivers of antibacterial resistance: Quantifying the relative impacts of human, animal and environmental use and transmission. One Health. 12, 100220(2021).
  30. Sivalingam, P., Pote, J., Prabakar, K. Extracellular DNA (eDNA): Neglected and potential sources of antibiotic resistant genes (ARGs) in the aquatic environments. Pathogens. 9 (11), 874(2020).
  31. Woegerbauer, M., Bellanger, X., Merlin, C. Cell-free DNA: An underestimated source of antibiotic resistance gene dissemination at the interface between human activities and downstream environments in the context of wastewater reuse. Front Microbiol. 11, 671(2020).
  32. Kittredge, H. A., Dougherty, K. M., Evans, S. E. Dead but not forgotten: How extracellular DNA, moisture, and space modulate the horizontal transfer of extracellular antibiotic resistance genes in soil. Appl Environ Microbiol. 88 (7), 0228021(2022).
  33. Lever, M. A., et al. A modular method for the extraction of DNA and RNA, and the separation of DNA pools from diverse environmental sample types. Front Microbiol. 6, 476(2015).
  34. Lis, J. T., Schleif, R. Size fractionation of double-stranded DNA by precipitation with polyethylene glycol. Nucleic Acids Res. 2 (3), 383-389 (1975).
  35. He, Z., Zhu, Y., Gu, H. A new method for the determination of critical polyethylene glycol concentration for selective precipitation of DNA fragments. Appl Microbiol Biotechnol. 97 (20), 9175-9183 (2013).
  36. Bey, B. S., Fichot, E. B., Dayama, G., Decho, A. W., Norman, R. S. Extraction of high molecular weight DNA from microbial mats. Biotechniques. 49 (3), 631-640 (2010).
  37. Arbeli, Z., Fuentes, C. L. Improved purification and PCR amplification of DNA from environmental samples. FEMS Microbiol Lett. 272 (2), 269-275 (2007).
  38. Verma, S. K., Singh, H., Sharma, P. C. An improved method suitable for isolation of high-quality metagenomic DNA from diverse soils. 3 Biotech. 7 (3), 171(2017).
  39. Narayan, A., Jain, K., Shah, A. R., Madamwar, D. An efficient and cost-effective method for DNA extraction from athalassohaline soil using a newly formulated cell extraction buffer. 3 Biotech. 6 (1), 62(2016).
  40. Sapula, S. A., Whittall, J. J., Pandopulos, A. J., Gerber, C., Venter, H. An optimized and robust peg precipitation method for detection of sars-cov-2 in wastewater. Sci Total Environ. 785, 147270(2021).
  41. Calderon-Franco, D., Van Loosdrecht, M. C. M., Abeel, T., Weissbrodt, D. G. Free-floating extracellular DNA: Systematic profiling of mobile genetic elements and antibiotic resistance from wastewater. Water Res. 189, 116592(2021).
  42. Sangamnere, R., Misra, T., Al Bherwani, H. E. t A critical review of conventional and emerging wastewater treatment technologies. Sustain Water Resour Manag. 9, 58(2023).
  43. Weiss, N., Heng, S. W., Lim, H. W. Centrifugation at 30,000 x g. in plasmid DNA precipitation allows better recovery rates and shorter centrifugation times. Application note no: 234, Eppendorf. , Available from: https://www.eppendorf.com/product-media/doc/en/157398_Application/Eppendorf_Centrifugation_Application-Note_234_Centrifuge-5430-familiy_Safe-Lock-Tubes_Centrifugation-at-30_000-x-g-plasmid-DNA-precipitation-allows-better-recovery-rates-shorter-centrifug.pdf (2017).
  44. Atha, D. H., Ingham, K. C. Mechanism of precipitation of proteins by polyethylene glycols. Analysis in terms of excluded volume. J Biol Chem. 256 (23), 12108-12117 (1981).
  45. Sivalingam, P., et al. Extracellular DNA includes an important fraction of high-risk antibiotic resistance genes in treated wastewaters. Environ Pollut. 323, 121325(2023).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE209

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved