Расширенная экстракция низкомолекулярной ДНК из сточных вод для комплексной оценки устойчивости к противомикробным препаратам

В этой статье мы представляем простой метод оценки устойчивости к противомикробным препаратам (УПП) окружающей среды путем увеличения доли внеклеточной ДНК с низкой молекулярной массой. Предварительная обработка 20%-30% ПЭГ и 1,2 М NaCl позволяет обнаруживать как геномные, так и горизонтально перенесенные гены AMR. Протокол позволяет использовать процесс без наборов с дополнительной оптимизацией.

Эпиднадзор за окружающей средой признан важным инструментом оценки здоровья населения в постпандемическую эпоху. Вода, в частности сточные воды, стала предпочтительным источником отбора проб патогенных микроорганизмов в окружающей среде. Сточные воды из открытых стоков и общественных водоочистных сооружений являются резервуаром как патогенов, так и генов устойчивости к противомикробным препаратам (УПП) и часто вступают в контакт с человеком. Несмотря на то, что существует множество методов отслеживания УПП из воды, выделение ДНК хорошего качества с высоким выходом из гетерогенных образцов остается сложной задачей. Чтобы компенсировать это, часто требуется большой объем образцов, что создает практические ограничения. Кроме того, ДНК окружающей среды часто фрагментирована, а источники УПП (плазмиды, фаги, линейная ДНК) состоят из низкомолекулярной ДНК. Тем не менее, лишь немногие процессы экстракции были сосредоточены на методах высокопродуктивной экстракции линейной и низкомолекулярной ДНК. В данной работе представлен простой метод высокопродуктивной линейной экстракции ДНК из небольших объемов сточных вод с использованием осадительных свойств полиэтиленгликоля (ПЭГ). Это исследование доказывает необходимость увеличения общего выхода ДНК из образцов воды, собранных для метагеномного анализа, за счет обогащения доли линейной ДНК. Кроме того, усиление низкомолекулярной ДНК позволяет решить текущую проблему недостаточной выборки УПП окружающей среды из-за акцента на высокомолекулярную и внутриклеточную ДНК. Ожидается, что этот метод будет особенно полезен в тех случаях, когда внеклеточная ДНК существует, но в низких концентрациях, например, в сточных водах очистных сооружений. Это также должно улучшить отбор проб из окружающей среды фрагментов гена AMR, которые распространяются через горизонтальный перенос генов.

SARS-CoV-2 и его последствия подчеркнули важность эпиднадзора за окружающей средой для мониторинга и прогнозирования вспышек инфекционных заболеваний ^1,2. Несмотря на очевидные вирусные пандемии, рост устойчивости к противомикробным препаратам (УПП) часто описывается как коварная пандемия, которая представляет собой одну из главных проблем общественного здравоохранения во всем мире ^3,4. Следовательно, существует острая необходимость в скоординированных стратегиях для понимания эволюции и распространения УПП. Водоемы, как и сточные воды, могут служить резервуарами как для патогенов, так и для УПП 5,6,7,8. Таким образом, общие источники воды являются мощным источником передачи болезней среди людей, особенно в странах с низким и средним уровнем дохода (СНСД), где плохая гигиена и перенаселение идут рука об руку ^9,10,11. Тестирование источников воды уже давно используется для оценки состояния здоровья населения 12,13,14. В последнее время сточные воды городских очистных сооружений оказались хорошим опережающим индикатором случаев COVID в клинике 1,2,15,16,17,18.

По сравнению с мониторингом конкретных заболеваний, обнаружение и отслеживание УПП в окружающей среде представляет собой более сложную проблему. Большое количество используемых антибиотиков, разнообразные гены устойчивости, различное давление местного отбора и горизонтальный перенос генов среди бактерий затрудняют оценку истинного бремени УПП и, после оценки, соотнесение его с клиническими наблюдениями 19,20,21,22. В результате, в то время как согласованный эпиднадзор за клинической УПП проводится несколькими организациями по всему миру ^3,23,24, мониторинг экологической УПП все еще находится в зачаточном состоянии, рассмотрен в 19,25,26.

В последние годы сообщалось о различных методах отслеживания экологических УПП ^5,27, рассмотренных в^28,29. Отправной точкой для большинства из них является извлечение ДНК хорошего качества из разнородных образцов окружающей среды, что само по себе является сложной задачей. Кроме того, ДНК окружающей среды обычно фрагментируется из-за воздействия агрессивной окружающей среды. Фрагментированная внеклеточная ДНК уже давно признана важным резервуаром генов AMR (рассмотрено в 30,31,32) с добавленным потенциалом проникновения и выхода из бактерий посредством горизонтального переноса генов. Следовательно, важно, чтобы любой протокол, направленный на измерение бремени УПП в окружающей среде, как можно лучше отбирал образцы линейной и низкомолекулярной ДНК. Удивительно, но мало внимания уделялось разработке методов, специфичных для высокопродуктивной экстракции линейной и низкомолекулярной ДНК: эта работа сосредоточена на устранении этого разрыва.

Распространенным и простым методом осаждения ДНК является соединение полиэтиленгликоля (ПЭГ) и солей, таких как хлорид натрия (NaCl)³³. ПЭГ является высокомолекулярным агентом сквырастивания, используемым для достижения размерно-специфического осаждения фрагментов ДНК^34,35. Чем ниже концентрация ПЭГ, тем выше молекулярная масса ДНК, которая может быть эффективно осаждена. Во многих исследованиях ПЭГ использовался во время экстракции ДНК и РНК ^1,2 в окружающей среде (обобщено в таблице 1 17,33,36,37,38,39) либо на заключительном этапе 33,36,37, либо для концентрации больших проб воды для экстракции вирусных частиц, как в случае с SARS-CoV-2 ^15,40. В текущей работе было обнаружено, что концентрации ПЭГ, использованные ранее для экстракции ДНК из окружающей среды (в значительной степени определяемые протоколами вирусного надзора), не охватывают низкомолекулярную линейную ДНК. Таким образом, они проигрывают в отборе коротких фрагментов ДНК и не подходят для точной оценки содержания УПП. В этом исследовании были использованы свойства полиэтиленгликоля и хлорида натрия для эффективного осаждения низкомолекулярных линейных фрагментов ДНК с высоким выходом, что в будущем может привести к экономически эффективному методу экстракции ДНК. Этот метод может быть использован для обогащения доли фрагментированной и низкомолекулярной ДНК из сложных природных образцов, что позволяет получить более точную картину УПП в окружающей среде. При небольшом дальнейшем совершенствовании этот метод может быть легко и недорого применен местными муниципальными корпорациями и другими государственными органами в качестве инструмента наблюдения с минимальной технической подготовкой.

1. Отбор проб сточных вод

1. Опустите полипропиленовый стакан объемом 500 мл в резервуар с открытым дренажем или очистными сооружениями (STP) и соберите ~300 мл образца сточных вод.
2. Перенесите ~250 мл образца в автоклавный полипропиленовый флакон объемом 250 мл.
3. Закрутите крышку бутылки и заклейте ее полиэтиленовой пленкой. Храните флакон в вертикальном положении в закрытом пакете.
4. Транспортируйте образец в вертикальном положении в закрытом контейнере при температуре окружающей среды.
5. Нагрейте образец при температуре 70 °C в духовке с горячим воздухом в течение 4 часов перед обработкой для экстракции ДНК.

2. Экстракция ДНК из образцов сточных вод

1. После того как проба сточных вод охладится, нанесите на них вихревую нагрузку на максимальную скорость и дайте мусору/илу осесть.
2. Сцедите 27,5 мл сточных вод в центрифужные пробирки объемом 50 мл и добавьте к ним 13,5 г PEG-8000 (конечная концентрация 30%) и 3 г NaCl (конечная концентрация 1,2 М) и хорошо перемешайте до полного растворения.
3. Инкубируйте образец в течение ночи (~16-18 ч) при температуре 4 °C.
4. Центрифугируйте образец при 15 500 x g при 4 °C в течение 30 минут.
5. Выбросьте надосадочную жидкость.
   ПРИМЕЧАНИЕ: PEG-8000 при 30% обладает высокой вязкостью, и гранула может сместиться при выбросе надосадочной жидкости. Надосадочную жидкость следует сцеживать медленно и осторожно, чтобы не потерять гранулы. Шаги с 2.6 по 2.23 выполняются с использованием набора для экстракции ДНК почвы в соответствии с инструкциями к набору с некоторыми изменениями.
6. Растворите гранулу в 800 μл раствора для лизиса из набора и добавьте раствор в смешанную циркониевую пробирку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При переработке больших объемов объединяйте гранулы из желаемого количества пробирок. Например, если обрабатывается 160 мл пробы; будет четыре трубки объемом 50 мл со сточными водами с ПЭГ и NaCl. После центрифугирования всех четырех пробирок при 15 500 x g при 4 °C в течение 30 мин удалите надосадочную жидкость из всех четырех пробирок. Добавьте 200 μL раствора CD1 в каждую, повторно суспендируйте гранулы и объедините их в одну трубку.
7. Закрепите трубку с шариком горизонтально на вихре. Вихревая трубка на максимальной скорости в течение 20-30 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Длительное вихревое производство обеспечивает полный лизис и гомогенизацию образцов, что повышает выход ДНК.
8. Отжимайте пробирки при давлении 8 000 x g в течение 15 с, чтобы шарики осели на дне, удалите пену и полностью перенесите надосадочную жидкость из пробирки в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Некоторые бусины также могут быть перенесены во время этого шага.
9. Центрифугируйте надосадочную жидкость при давлении 15 000 x g в течение 1 мин.
10. Перенесите надосадочную жидкость в чистую микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл. Надосадочная жидкость может содержать некоторые взвешенные частицы.
11. Добавьте 200 мкл раствора осадителя и завихрите на максимальной скорости в течение 5 с. Выдерживать при температуре 4 °C в течение 5 минут.
    Примечание: Инкубация при 4 °C повышает эффективность осаждения белков и клеточного мусора, в то время как ДНК остается в растворе. На этом этапе можно приостановить протокол на срок до 2 ч без существенного снижения выхода и качества экстрагированной ДНК.
12. Центрифуга при 15 000 x g в течение 1 минуты при комнатной температуре (RT). Избегайте гранул и переложите прозрачную надосадочную жидкость в чистую микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл.
13. Добавьте 600 мкл связывающего буфера на 700 мкл надосадочной жидкости и вихря с максимальной скоростью в течение 5 с.
14. Загрузите 700 мкл лизата в кремнеземную колонку, инкубируйте в течение 2 мин и центрифугируйте при 15 000 x g в течение 1 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубация лизата на колонке с кремнеземом усиливает связывание ДНК с колонкой, что приводит к лучшему выходу ДНК.
15. Откажитесь от проточной трубы и повторяйте шаг 2.14 до тех пор, пока весь лизат не пройдет через спиновую колонку.
16. Осторожно поместите спиновую колонку в чистую пробирку для сбора объемом 2 мл. Следите за тем, чтобы проточный поток не попадал на вращающуюся колонну.
17. Добавьте 500 μL промывочного буфера в спин-колонну и центрифугируйте в спин-колонне при давлении 15 000 x g в течение 1 минуты.
18. Выбросьте проточный поток и верните спиновую колонку в ту же сборную пробирку объемом 2 мл.
19. Добавьте 500 μL буфера для промывки этанолом в спиновую колонну. Центрифуга при 15 000 x g в течение 1 мин.
20. Откажитесь от проточной трубки и поместите вращающуюся колонку в новую сборную пробирку объемом 2 мл.
21. Центрифугируйте при давлении 16 000 x g в течение 2 минут, чтобы удалить остатки этанола. Поместите спиновую колонку в новую пробирку объемом 1,5 мл.
22. Добавьте 100 мкл элюирующего буфера (предварительно нагретого до 55 °C) в центр белой фильтрующей мембраны и инкубируйте в течение 5 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нагретый элюирующий буфер, наряду с инкубацией на мембране, повышает эффективность элюирования ДНК, особенно высокомолекулярной ДНК.
23. Центрифуга при 15 000 x g в течение 1 мин. Откажитесь от спин-колонки.
24. К элюированной ДНК добавить 10 мкл 3 М NaCl (1/10 объема элюата ДНК) и 250 мкл охлажденного абсолютного этанола (2,5 объема элюата ДНК). Переверните для хорошего перемешивания и уменьшите содержимое при 8 000 x g в течение 15 секунд.
25. Инкубируйте смесь ДНК и этанола при температуре -20 °C в течение не менее 1 часа.
    Примечание: Инкубация смеси ДНК и этанола может быть увеличена до 16 ч без существенного снижения выхода или качества экстрагированной ДНК.
26. Центрифуга при 19 000 x g при 4 °C в течение 30 мин. Выбросьте надосадочную жидкость путем сцеживания.
27. Добавьте в гранулу 500 μл охлажденного 70% этанола.
28. Центрифуга при 19 000 x g при 4 °C в течение 15 мин. Выбросьте надосадочную жидкость путем сцеживания.
29. Переверните и аккуратно постучите по трубке по папиросной бумаге, чтобы удалить остатки этанола капиллярным действием.
30. Полностью высушите гранулу ДНК, держа трубки открытыми на нагревательном блоке в течение 5-10 минут при температуре 37 °C, пока весь этанол не испарится.
31. Повторно суспендируйте гранулу ДНК в 30-50 мкл автоклавной воды двойной дистилляции (ddH₂O). Выдерживать при 37 °C в течение 5-10 минут.
32. Вращайте ДНК при 8 000 x g в течение 15 с.
33. Выберите приложение dsDNA в настройках Нуклеиновые кислоты в спектрофотометре Nanodrop.
    1. Очистите пьедестал безворсовой папиросной бумагой и водой. Используйте ddH₂O для заглушения прибора, а затем загрузите 2 мкл образца ДНК на пьедестал.
    2. Измерьте коэффициенты концентрации и поглощения (A260/280 и A260/230), чтобы определить чистоту.
34. Храните образец ДНК при температуре -20 °C.

3. Осаждение линейной ДНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) для проверки восстановления ДНК в диапазоне молекулярных масс

1. Используя геномную ДНК из E. coli MG155, амплифицируйте фрагменты генов с помощью ПЦР для получения пула линейных фрагментов из следующих генов: fusA, lacZ, gapA, rpsD, 16S рРНК, marR (см. Таблицу 2 для последовательностей праймеров и условий ПЦР).
2. Очистите продукты ПЦР с помощью набора для очистки ПЦР и объедините продукты ПЦР вместе.
3. Разделите объединенные ампликоны на микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл с равными объемами и пометьте одну пробирку как «Входная ДНК».
4. Добавьте ПЭГ и NaCl в соответствии с желаемыми условиями (9%, 20%, 30% PEG-8000; 0,3 M, 1,2 M NaCl) в каждую из пробирок, кроме той, которая помечена как «Входная ДНК», и составьте окончательный объем до 1 мл.
5. Инкубируйте пробирки в течение ночи (~16-18 часов) при температуре 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На остальных этапах до 3.16 «Входная ДНК» хранится в холодильнике без изменений.
6. Вращайте пробирки в настольной микроцентрифуге в соответствии с желаемой скоростью (15 000 x g или 20 000 x g) в течение 1 часа при 4 °C.
7. Осторожно удалите 900 мкл надосадочной жидкости со стороны, противоположной грануле, с помощью микропипетки.
8. Первая промывка этанолом: Добавьте 900 μл охлажденного 70% этанола в гранулу и перемешайте, аккуратно перевернув трубки.
9. Вращайте трубки с той же скоростью, что и на шаге 3.6 (15 000 x g или 20 000 x g) в течение 30 минут при температуре 4 °C.
10. Удалите надосадочную жидкость путем сцеживания.
11. Вторая промывка этанолом: добавьте в гранулу 500 μл охлажденного 70% этанола.
12. Вращайте трубки с той же скоростью, что и на шаге 3.6 (15 000 x g или 20 000 x g) в течение 30 минут при температуре 4°C. Выбросьте надосадочную жидкость путем сцеживания.
13. Переверните и аккуратно постучите по трубке по папиросной бумаге, чтобы удалить остатки этанола капиллярным действием.
14. Полностью высушите гранулу ДНК, держа трубки открытыми на нагревательном блоке в течение 5-10 минут при температуре 37 °C, пока весь этанол не испарится.
15. Повторно суспендируйте гранулу в 20 μл автоклавной воды двойной дистилляции.
16. Измерьте концентрацию ДНК, осажденной различными условиями и «входной ДНК», с помощью нанокапельного спектрофотометра или флуориметра.
17. Загрузите осажденную ДНК на 1% агарозный гель для визуализации ДНК.

Разработка протокола высокопродуктивного извлечения ДНК из образцов сточных вод
Модифицированный вариант ранее разработанных протоколов был использован для извлечения высококачественных ДНК и РНК из образцов воды¹⁷. Образцы были получены из открытых дренажных систем, а также из очистных сооружений в регионе Дели-NCR в Северной Индии. После предварительной обработки с использованием ПЭГ и NaCl (рис. 1) образцы были обработаны с помощью наборов для извлечения ДНК из почвы и воды. Во всех ^{случаях наблюдалась} заметная высокомолекулярная полоса, вероятно, соответствующая внутриклеточной бактериальной ДНК, и фоновый мазок, как это типично для образцов окружающей среды³⁷ (рисунок 2).

Отсутствие эффективной экстракции ДНК из сточных вод очистных сооружений (СТП)
Несмотря на то, что разумный выход общей ДНК был получен из открытых стоков и притоков STP (Таблица 3), из окончательно очищенных сточных вод ДНК получить не удалось; проблемы с низкой урожайностью описаны и в предыдущей работе⁴¹ (рис. 3). Ожидается, что при последующей очистке, которая включает в себя хлорирование сточных вод и, в некоторых случаях, обработку как ультрафиолетовой, так и ультрафильтрационной терапией42, микробная нагрузка будет низкой, а любая остаточная ДНК (состоящая из внеклеточной и фрагментированной ДНК) будет разбавлена. Исходная низкая концентрация ПЭГ, используемая в концентрации образца и осаждении нуклеиновых кислот, может исключить низкомолекулярную ДНК. Другими словами, фрагментированная ДНК может быть потеряна на начальном этапе концентрации.

Увеличение концентраций ПЭГ и NaCl приводит к осаждению ДНК с более низкой молекулярной массой
Чтобы проверить, помогает ли увеличение концентрации ПЭГ в обогащении низкомолекулярной ДНК, был сгенерирован лабораторный стандарт фрагментов ПЦР различной длины, создающий ряд линейных фрагментов ДНК (рис. 4). Стандарт подвергался четырем различным условиям осаждения: 9% PEG-8000 + 0,3 M NaCl (исходная комбинация), 9% PEG-8000 + 1,2 M NaCl (только повышающая соль), 30% PEG-8000 + 0,3 M NaCl (только повышающая PEG) и 30% PEG-8000 + 1,2 M NaCl (повышающая как соль, так и PEG). Условия были выбраны на основе стандартного протокола, используемого для эпиднадзора за SARS-CoV-2¹⁷ , и условий, описанных в исследовании модульных методов экстракции ДНК из образцов окружающей среды³³. Использовались две различные скорости центрифугирования - 15 000 x g и 20 000 x g - на основе влияния дифференциальных скоростей на гранулирование ДНК⁴³. При увеличении концентраций PEG и NaCl до 30% и 1,2 М соответственно общее восстановление ДНК увеличивалось примерно на 70%, а фрагменты ДНК размером до 150 пар оснований (.н.) эффективно осаждались (рис. 5). Разница в скорости не оказала большого влияния на выход продукции (рис. 6A) и может быть связана с длительным временем центрифугирования. Поскольку общее восстановление ДНК было ниже в исходной комбинации PEG/NaCl, возможно, что полосы с более низкой молекулярной массой, хотя и присутствовали, были в концентрации ниже предела визуализации. Чтобы проверить это, количество входной ДНК для осаждения увеличивали, а избыток ДНК, соответствующий каждой обработке (1,5 мг), загружали в агарозный гель для визуализации. Только лечение 30% ПЭГ показало хорошее восстановление при самой низкой молекулярной массе, т.е. в полосе 150.о. (Рисунок 6B).

Осаждение кольцевой ДНК (бактериальной геномной и плазмидной ДНК) не следует той же тенденции
Кишечная палочка Геномную ДНК и плазмиду MG155 (pRSV, ~4 kb) использовали для осаждения с различными концентрациями PEG и NaCl. В отличие от линейной ДНК, повышение уровней PEG и NaCl не оказало существенного влияния (рис. 7), что позволяет предположить, что повышение PEG не влияет на выход кольцевой и высокомолекулярной ДНК (как правило, внутриклеточной ДНК). Это контрастирует с более ранними наблюдениями при осаждении белка⁴⁴, где растворимость резко снижалась с концентрацией ПЭГ. Учитывая, что ПЭГ действует как агент скученности, предполагается, что площадь поверхности макромолекулы, доступная для взаимодействия, играет важную роль в ее эффективности в качестве провоцирующего агента. В случае с линейной ДНК по мере увеличения размера разумно предположить, что площадь, доступная для взаимодействия, также увеличивается. При использовании кольцевой ДНК возможно, что низкие концентрации ПЭГ уже достаточны для насыщения молекулы, и дальнейшее повышение концентрации может не увеличить эффективную площадь поверхности для взаимодействия.

Низкий выход ДНК из сточных вод при предварительной обработке осадков с помощью ПЭГ и NaCl не учитывается
Чтобы проверить, имеет ли предварительная обработка сточных вод решающее значение для экстракции ДНК, в 20 мл инактивированных теплом сточных вод (70 °C, 4 ч) добавляли 10 мг ранее приготовленного линейного стандарта и инкубировали в течение ночи при 4 °C (a) без PEG + NaCl, (b) с 9% PEG + 0,3 M NaCl (исходная комбинация) и (c) с 20% PEG + 1,2 M NaCl (повышенное содержание PEG и соли). Затем образцы были обработаны с помощью почвенного набора для извлечения ДНК, как объясняется в протоколе. Было обнаружено, что выход экстрагированной ДНК увеличивается на 60 % при предварительной обработке проб сточных вод с 9% PEG + 0,3 M NaCl по сравнению с отсутствием стадии предварительной обработки (рис. 8), что указывает на то, что предварительная обработка осадков PEG и NaCl жизненно важна для получения высокопродуктивной ДНК из проб сточных вод. Следует также отметить, что в то время как общий выход ДНК, включая высокомолекулярную геномную ДНК (гДНК), ниже, когда для осаждения используется высокое содержание ПЭГ и соли, доля ДНК с более низкой молекулярной массой обогащена (рис. 8). Снижение общего выхода при повышении ПЭГ и соли можно объяснить высокой вязкостью ПЭГ, что может привести к потере гранул ДНК при удалении надосадочной жидкости. Это усиливает аргументы в пользу предложенного метода поэтапной экстракции ДНК (рис. 9), при котором высокомолекулярная ДНК может быть сначала экстрагирована с использованием низкого осаждения PEG и NaCl, а полученная надосадочная жидкость может быть подвергнута еще одному раунду предварительной обработки с повышенным содержанием PEG и NaCl для эффективного извлечения низкомолекулярной ДНК, которая избежала первого раунда осаждения.

Рисунок 1: Предварительная обработка проб сточных вод. Схема, показывающая рабочий процесс от сбора образцов до экстракции ДНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Типичный профиль геля ДНК, извлеченной из образцов сточных вод. Объем 50-100 мл (как указано на рисунке) сточных вод, отобранных с различных участков, был инактивирован нагреванием путем инкубации при 70 °С в течение 4 ч. Затем его инкубировали с 9% ПЭГ и 0,3 М NaCl в течение ночи при 4 °C, а затем обрабатывали для извлечения ДНК с использованием почвы или водного набора. Примерно 150 нг общей экстрагированной ДНК загружали в 1% агарозный гель вместе с лестницей из 1 килопар оснований (kb) в качестве маркера и подвергали электрофорезу (90 В, 30 мин). ДНК визуализировали в ультрафиолетовом (УФ) свете с помощью красителя SYBR SAFE. В таблице справа указаны источники сбора образцов, объем очищенных сточных вод и комплект, используемый для извлечения ДНК для каждой дорожки. (STP: Станция очистки сточных вод; UVR: Ультрафиолетовое излучение) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Образцы сточных вод STP показывают низкий общий выход ДНК. Объем 40 мл сточных вод, отобранных из входных и сточных вод STP, был инактивирован нагреванием путем инкубации при 70 °C в течение 4 часов. Затем его инкубировали с 9% ПЭГ и 0,3 М NaCl в течение ночи при 4 °C, а затем обрабатывали для извлечения ДНК с использованием почвенного или водного набора или набора для экстракции бактериальной геномной ДНК. Примерно 150 нг общей экстрагированной ДНК загружали в 1% агарозный гель вместе с 1 kb лестничкой в качестве маркера и подвергали электрофорезу (90 В, 30 мин). ДНК визуализировали в ультрафиолетовом (УФ) свете с помощью красителя SYBR SAFE. Концентрация экстрагированной ДНК в образцах сточных вод была ниже 1 нг/мл сточных вод и, следовательно, не могла быть визуализирована. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Создание линейного стандарта размера ДНК для проверки эффективности осаждения низкомолекулярной ДНК. Пять фрагментов ДНК разного размера были получены путем амплификации методом ПЦР с использованием геномной ДНК E. coli (MG1655) в качестве матрицы, а также праймеров и условий, как описано в таблице 2. Очищенную ДНК (~1 мкг) с помощью набора для очистки ПЦР загружали на 1% агарозный гель вместе с 1 кб ладдера в качестве маркера и подвергали электрофорезу (90 В, 40 мин). ДНК визуализировали в ультрафиолетовом (УФ) свете с помощью красителя SYBR SAFE. Дорожки помечены именами генов, из которых был амплифицирован фрагмент, и ожидаемым размером ампликона. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5: Низкомолекулярная ДНК эффективно восстанавливается только при самой высокой (30%) концентрации ПЭГ. Входную ДНК (3,34 мкг) из ранее полученного стандартного размера обрабатывали различными комбинациями ПЭГ и NaCl, как указано на рисунке, и экстрагировали, как подробно описано в протоколе. Используемая скорость центрифугирования составляла 15 000 x g. Для ввода (дорожка 3) и 1,2 М NaCl + 30% ПЭГ (дорожка 7) на гель загружали 0,8 мкг ДНК. В остальном, поскольку общий выход был низким, загружали общее количество ДНК, выделенной в 16 μл, и 1 kb ladder загружали в качестве маркера размера на 1% агарозный гель и подвергали электрофорезу (80 В, 45 мин). ДНК визуализировали в ультрафиолетовом (УФ) свете с помощью красителя SYBR SAFE. Белым прямоугольником выделена самая нижняя полоса в 150.н. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Восстановление низкомолекулярной ДНК определяется высокими концентрациями ПЭГ, а не солей. (A) Входная ДНК (14 мкг) из стандартного размера была обработана различными комбинациями ПЭГ и NaCl, как показано на рисунке, и экстрагирована с использованием осаждения этанола, как подробно описано в протоколе. Используемая скорость центрифугирования составляла 15 000 x g и 20 000 x g, как показано на рисунке. Весь объем входной ДНК и извлеченной ДНК вместе с 1 кб лесцем загружали на 1% агарозный гель и подвергали электрофорезу (90 В, 30 мин). ДНК визуализировали в ультрафиолетовом (УФ) свете с помощью красителя SYBR SAFE. (B) Входная ДНК (15,67 мкг) из ранее полученного стандартного размера была обработана различными комбинациями ПЭГ и NaCl, как показано на рисунке, и экстрагирована, как описано в протоколе. Используемая скорость центрифугирования составляла 15 000 x g. Экстрагированную ДНК (1,5 мкг) загружали в каждую дорожку, а лестницу объемом 1 кб загружали в качестве маркера размера на 1% агарозный гель и подвергали электрофорезу (80 В, 45 мин). ДНК визуализировали в ультрафиолетовом (УФ) свете с помощью красителя SYBR SAFE. Белым прямоугольником выделена самая нижняя полоса в 150.н. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 7: Увеличение концентрации PEG и NaCl существенно не влияет на восстановление геномной ДНК и плазмидной ДНК. Входную ДНК (9 мкг; 4,5 мкг плазмиды и 4,5 мкг геномной ДНК) обрабатывали различными комбинациями ПЭГ и NaCl, как показано на рисунке, и экстрагировали, как описано в протоколе. Используемая скорость центрифугирования составляла 15 000 x g. Весь объем входной ДНК и извлеченной ДНК вместе с 1 кб лесенка загружали на 1% агарозный гель и подвергали электрофорезу (90 В, 45 мин). ДНК визуализировали в ультрафиолетовом (УФ) свете с помощью красителя SYBR SAFE. В белых прямоугольниках обозначены геномная ДНК и плазмидная ДНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 8: Предварительная обработка осадков с помощью ПЭГ и NaCl имеет решающее значение для высокопроизводительного извлечения ДНК из сточных вод. В инактивированные при нагревании (70 °C, 4 ч) сточные воды (20 мл) добавляли 10 мг предварительно приготовленного линейного стандарта и инкубировали в течение ночи при 4 °C без ПЭГ и NaCl или различных концентраций ПЭГ и NaCl, как показано на рисунке. Затем его обработали для извлечения ДНК с помощью почвенного набора. Входную ДНК (4 мкг), используемую для спайкинга (дорожка 1), и экстрагированную ДНК (4 мкг) со стадией предварительной обработки 9% ПЭГ + 0,3 М NaCl (дорожку 3) загружали в 1% агарозный гель. Для остальных условий все количество извлеченной ДНК загружалось в гель, так как выход был низким. Лестница на 1 КБ также была загружена в качестве маркера размера. Гель подвергали электрофорезу (70 В, 2 ч). ДНК визуализировали в ультрафиолетовом (УФ) свете с помощью красителя SYBR SAFE. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 9: Предложен поэтапный метод экстракции ДНК из сточных вод для обогащения как высокомолекулярной, так и низкомолекулярной ДНК. Блок-схема, изображающая двухступенчатый метод извлечения ДНК из сточных вод с начальной стадией предварительной обработки с использованием низкой концентрации PEG и NaCl. Надосадочная жидкость с первого этапа подвергается еще одному раунду предварительной обработки осаждением с повышенным содержанием PEG и NaCl для эффективного извлечения как высокомолекулярной, так и низкомолекулярной ДНК из сточных вод. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Таблица 1. Предыдущее использование ПЭГ и NaCl в исследованиях по экстракции ДНК из образцов окружающей среды. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 2. Последовательности праймеров и условия ПЦР для получения стандарта. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 3. Выход и качество ДНК получены из образцов сточных вод в течение двух месяцев в 2023 году. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

По данным ВОЗ, УПП является одной из 10 основных угроз здоровью на сегодняшний день, а эпиднадзор за окружающей средой на предмет УПП признан важным инструментом во всем мире. Как упоминалось во введении, всесторонняя запись УПП окружающей среды включает низкомолекулярную, фрагментированную и внеклеточную ДНК. Описанный здесь протокол предварительной обработки с использованием высокой концентрации ПЭГ в сочетании с солью (30% ПЭГ и 1,2 М NaCl) позволяет достичь этого результата за счет обогащения доли низкомолекулярной ДНК без влияния на экстракцию более высокомолекулярных фракций (в основном геномной и плазмидной ДНК). Это отличается от предыдущих методов концентрирования с использованием более низких протоколов PEG и прямых протоколов набора (без предварительной обработки), которые являются громоздкими из-за необходимости обработки больших объемов. Предварительная обработка с более низкими концентрациями ПЭГ была неэффективной для восстановления низкомолекулярной ДНК («низкая» здесь относится к полосам ДНК ниже 600.н.). Когда во время предварительной обработки не используется ПЭГ, экстракция ДНК происходит плохо, в результате чего восстанавливается только 10% входной ДНК по сравнению с 70% при использовании ПЭГ и NaCl (Рисунок 8). В дополнение к добавлению PEG и NaCl, еще одним важным шагом является удаление остаточного этанола после экстракции ДНК из набора, чтобы получить чистую ДНК для последующей обработки. Важно определить начальный объем воды, необходимый для получения общего количества от ~300 нг до 5 мг ДНК в объеме 30-50 мл при элюировании. В отличие от 1 л или более воды, которая обычно обрабатывается для извлечения ДНК из сточных вод ^27,41, было обнаружено, что при предложенном здесь этапе предварительной обработки достаточно всего 27,5-40 мл для получения высококачественной ДНК для последующей обработки. Сточные воды также содержат твердые частицы и органические вещества, которые могут содержать адсорбированные бактериальные клетки и внеклеточную ДНК. Следовательно, десорбция клеток и ДНК, сопровождающаяся лизисом клеток, является важным этапом для увеличения выхода ДНК. Высокие концентрации ПЭГ делают образец вязким и могут препятствовать этапам лизиса и десорбции для экстракции ДНК, как упоминалось ранее. Чтобы избежать этого, был предложен поэтапный метод экстракции ДНК, как показано на блок-схеме (рис. 9). Этот метод будет полезен для извлечения как внутриклеточной высокомолекулярной ДНК (рис. 7), так и внеклеточной низкомолекулярной фрагментированной и кольцевой ДНК.

Одним из текущих ограничений этого протокола с точки зрения стоимости является непрерывная обработка обогащенной низкомолекулярной ДНК с помощью набора для повышения качества. Это ограничение потенциально можно обойти с помощью других методов очистки ДНК, таких как фенол-хлороформная экстракция. Еще одним практическим ограничением является работа с высокими концентрациями ПЭГ, поскольку гранулы могут теряться из-за высокой вязкости раствора. В настоящее время проводится предварительная обработка с использованием PEG и NaCl с последующей доработкой версии существующего протокола набора, т.е. набор по-прежнему используется для окончательной очистки ДНК. Очистка ДНК без использования наборов, которая дает высокий выход ДНК, но низкую чистоту (не сообщается здесь), оптимизируется для улучшения качества извлеченной ДНК. Из-за вязкой природы растворов ПЭГ следует стремиться к оптимальной концентрации ПЭГ, которая может давать полный диапазон размеров ДНК и при этом удобна в обращении. Снижение концентрации до 20% (рис. 6В) позволило получить результат, промежуточный по отношению к эффективности экстракции низкой (9%) и высокой (30%) ПЭГ; Возможно, это стоит рассмотреть в будущей работе.

ПЭГ обычно используется на различных этапах экстракции ДНК из образцов окружающей среды. Тем не менее, использование ПЭГ не было стандартизировано для экстракции ДНК в контексте эпиднадзора за УПП. Надзор за сточными водами включает в себя выявление устойчивости к противомикробным препаратам во многих различных нишах, включая STP (входные и сточные воды), а также открытые и закрытые стоки ^8,27. В то время как информация об УПП в притоке дает важнейшую информацию о резистентности, циркулирующей в сообществе, присутствие генов УПП в сточных водах не менее важно для измерения и потенциального прогнозирования возникновения вспышек резистентности. Образцы сточных вод обычно имеют низкую микробную нагрузку, поскольку большинство клеток погибает в процессе обработки, что приводит к очень низкому выходу клеточной ДНК. Тем не менее, стоки содержат внеклеточную свободно плавающую ДНК, содержащую как высокомолекулярную геномную ДНК, так и низкомолекулярную плазмиду, фагемиды и фрагментированную ДНК. Гены AMR, присутствующие в низкомолекулярной ДНК (как фрагментированной, так и плазмидной/фагемидной), могут переноситься на оставшиеся живые клетки в стоке, что приводит к распространению резистентности 30,41,45. Следовательно, важно обнаруживать низкомолекулярную внеклеточную ДНК в сточных водах. Другие методы, используемые для извлечения ДНК из сточных вод при оценке УПП, обычно не обеспечивают начального обогащения низкомолекулярной ДНК. Такой подход к извлечению ДНК из сточных вод может быть использован для получения информации о комплексном резистоме окружающей среды.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Мы выражаем признательность за финансовую поддержку со стороны Фонда Рокфеллера (Номер гранта Фонда Рокфеллера 2021 HTH 018) в составе команды APSI India (Альянс за инновации в области надзора за патогенами https://data.ccmb.res.in/apsi/team/). Мы также выражаем признательность за финансовую помощь, предоставленную банком Axis Bank для поддержки этого исследования и Школой биологических наук Триведи при Университете Ашоки за оборудование и другую поддержку.