从废水中增强低分子量 DNA 的提取，用于抗菌素耐药性的综合评估

在这里，我们提出了一种简单的技术，通过提高低分子量细胞外 DNA 的比例来评估环境抗菌素耐药性 （AMR）。先前用 20%-30% PEG 和 1.2 M NaCl 处理可以检测基因组和水平转移的 AMR 基因。该方案适用于无试剂盒工艺，并进行了额外的优化。

环境监测被认为是后疫情时代评估公共卫生的重要工具。水，尤其是废水，已成为对环境中病原体负荷进行采样的首选来源。来自明渠和社区水处理厂的废水是病原体和抗菌素耐药性 （AMR） 基因的储存库，经常与人类接触。虽然有许多方法可以从水中追踪 AMR，但从异质样品中以高产量分离出优质 DNA 仍然是一项挑战。为了补偿，样品量通常需要很高，从而产生实际限制。此外，环境 DNA 经常片段化，AMR 的来源（质粒、噬菌体、线性 DNA）由低分子量 DNA 组成。然而，很少有提取过程专注于线性和低分子量 DNA 的高产量提取方法。本文报道了一种利用聚乙二醇 （PEG） 的沉淀特性从小体积废水中提取高产线性 DNA 的简单方法。本研究为通过富集线性 DNA 的比例来提高为宏基因组分析而收集的水样的总 DNA 产量。此外，增强低分子量 DNA 克服了当前由于关注高分子量 DNA 和细胞内 DNA 而导致的采样不足环境 AMR 问题。当细胞外 DNA 存在但浓度较低时，例如处理植物的流出物，预计该方法将特别有用。它还应该加强对通过水平基因转移传播的 AMR 基因片段的环境采样。

SARS-CoV-2 及其后果强调了环境监测在监测和预测传染病爆发方面的重要性 ^1,2。虽然病毒大流行是显而易见的，但抗菌素耐药性 （AMR） 的兴起通常被描述为一种隐匿的大流行病，并且构成了全球主要的公共卫生问题 ^3,4。因此，迫切需要制定协调一致的策略来了解 AMR 的演变和传播。水体和废水都可以成为病原体和 AMR 的储存库 5,6,7,8。因此，共享水源是人类疾病传播的有效来源，尤其是在低收入和中等收入国家 （LMIC），那里的卫生条件差和人口过剩是齐头并进的 ^9,10,11。长期以来，水源检测一直被用于评估社区健康状况 12,13,14。最近，来自城市污水处理厂的废水被证明是临床 COVID 病例的良好提前指标 1,2,15,16,17,18。

与监测特定疾病相比，检测和跟踪环境中的 AMR 是一个更复杂的问题。使用的抗生素数量众多、耐药基因多样、局部选择压力不同以及细菌之间的水平基因转移使得难以评估真实的 AMR 负荷，一旦评估，就难以将其与临床观察相关联 19,20,21,22。因此，虽然世界各地的多个组织正在对临床 AMR 进行协调一致的监测 ^3,23,24，^但环境 AMR 监测仍处于起步阶段，^19,25,26 进行了审查。

近年来，已经报道了跟踪环境 AMR 的不同方法 ^{5,27,28,29 进行了审查}。其中大多数的起点是从异质性环境样本中提取高质量的 DNA，这本身就是一个挑战。此外，由于暴露于恶劣的环境中，环境 DNA 通常是片段化的。长期以来，片段化的细胞外 DNA 一直被认为是 AMR 基因的重要储存库（在 30,31,32 中进行了综述），并且具有通过水平基因转移进入和离开细菌的潜力。因此，重要的是，任何旨在测量环境中 AMR 负荷的方案都应尽可能最好地对线性和低分子量 DNA 进行采样。令人惊讶的是，很少有人关注开发专门用于线性和低分子量 DNA 高产量提取的方法：这项工作的重点是解决这一差距。

沉淀 DNA 的一种常见且简单的方法是将聚乙二醇 （PEG） 和氯化钠 （NaCl） 等盐混合³³。PEG 是一种大分子拥挤剂，用于实现 DNA 片段的大小特异性沉淀^34,35。PEG 浓度越低，可有效沉淀的 DNA 分子量就越高。许多研究在环境提取 DNA 和 RNA ^1,2（总结于表 1^{17、33、36、37、38、39}）期间使用 PEG，要么在最后一步 33,36,37 中使用 PEG，要么像 SARS-CoV-2 一样浓缩大水样以提取病毒颗粒 ^15,40.在目前的工作中，发现以前用于环境 DNA 提取的 PEG 浓度（主要由病毒监测方案确定）不能捕获低分子量线性 DNA。因此，它们失去了对短 DNA 片段的采样，并且不适合准确评估 AMR 含量。本研究利用聚乙二醇和氯化钠的特性，以高产量有效沉淀低分子量线性 DNA 片段，这将在未来带来一种具有成本效益的 DNA 提取方法。该方法可用于富集来自复杂天然样品的片段化和低分子量 DNA 的比例，从而更准确地捕捉环境 AMR 的图像。经过进一步改进，该技术适合当地市政公司和其他政府机构轻松、低成本地应用，以用作监控工具，只需最少的技术培训。

1. 废水采样

1. 将 500 mL 聚丙烯烧杯浸入明流式或污水处理厂 （STP） 储液槽中，收集 ~300 mL 废水样品。
2. 将 ~250 mL 样品转移至 250 mL 高压灭菌聚丙烯瓶中。
3. 拧上瓶盖并用塑料薄膜密封。将瓶子直立放在密闭的袋子中。
4. 在环境温度下将样品直立在密闭容器中运输。
5. 将样品在 70 °C 的热风烘箱中加热灭活 4 小时，然后再处理样品以进行 DNA 提取。

2. 从废水样品中提取 DNA

1. 废水样品冷却后，以最大速度涡旋样品，让碎屑/污泥沉淀。
2. 将 27.5 mL 废水倒入 50 mL 离心管中，加入 13.5 g PEG-8000（终浓度 30%）和 3 g NaCl（终浓度 1.2 M），充分混合直至完全溶解。
3. 将样品在 4 °C 下孵育过夜（~16-18 小时）。
4. 将样品在 4 °C 下以 15,500 x g 离心 30 分钟。
5. 丢弃上清液。
   注意：30% 的 PEG-8000 具有高粘度，丢弃上清液时沉淀会脱落。上清液应缓慢而小心地倾析，以确保沉淀不会丢失。根据试剂盒说明，使用土壤 DNA 提取试剂盒进行步骤 2.6 至 2.23，并进行一些修改。
6. 将沉淀溶解在 800 μL 试剂盒的裂解液中，并将溶液添加到混合的锆珠管中。
   注意：如果处理较大体积，请从所需数量的试管中汇集沉淀。例如，如果处理 160 mL 样品;将有四个 50 mL 的管子，里面装有含有 PEG 和 NaCl 的废水。在 4 °C 下以 15,500 x g 离心所有四个试管 30 分钟后，弃去所有四个试管中的上清液。向每个溶液中加入 200 μL CD1 溶液，重新悬浮沉淀，并将它们汇集在一个珠管中。
7. 将珠管水平固定在涡旋上。以最大速度涡旋管 20-30 分钟。
   注：长时间涡旋可确保样品的完全裂解和均质化，从而提高 DNA 产量。
8. 以 8,000 x g 的速度旋转试管 15 秒，使珠子沉淀在底部，去除泡沫，并将上清液从试管中完全转移到 1.5 mL 微量离心管中。在此步骤中，一些珠子也可能被转移。
9. 将上清液以 15,000 x g 离心 1 分钟。
10. 将上清液转移至干净的 2 mL 微量离心管中。上清液可能仍含有一些悬浮颗粒。
11. 加入 200 μL 沉淀剂溶液并以最大速度涡旋 5 秒。在 4 °C 下孵育 5 分钟。
    注：在 4 °C 下孵育可提高蛋白质和细胞碎片的沉淀效率，而 DNA 仍保留在溶液中。可以在此步骤中暂停方案长达 2 小时，而不会显著降低提取的 DNA 的产量和质量。
12. 在室温 （RT） 下以 15,000 x g 离心 1 分钟。避免沉淀，将透明上清液转移到干净的 2 mL 微量离心管中。
13. 每 700 μL 上清液加入 600 μL 结合缓冲液，并以最大速度涡旋 5 秒。
14. 将 700 μL 裂解物上样到硅胶离心柱上，孵育 2 分钟，然后以 15,000 x g 离心 1 分钟。
    注：在硅胶柱上孵育裂解物可增强 DNA 与柱的结合，从而提高 DNA 产量。
15. 弃去流出液并重复步骤 2.14，直到所有裂解物都通过离心柱。
16. 小心地将离心柱放入干净的 2 mL 收集管中。确保没有流出液溅到离心柱上。
17. 向离心柱中加入 500 μL 洗涤缓冲液，并以 15,000 x g 离心离心柱 1 分钟。
18. 弃去流通液，将离心柱放回相同的 2 mL 收集管中。
19. 向离心柱中加入 500 μL 乙醇洗涤缓冲液。以 15,000 x g 离心 1 分钟。
20. 弃去流通液，将离心柱放入新的 2 mL 收集管中。
21. 以 16,000 x g 离心 2 分钟以去除残留的乙醇。将离心柱放入新的 1.5 mL 试管中。
22. 将 100 μL 洗脱缓冲液（预热至 55 °C）添加到白色滤膜中心并孵育 5 分钟。
    注：加热的洗脱缓冲液以及在膜上孵育可提高 DNA 洗脱的效率，尤其是高分子量 DNA。
23. 以 15,000 x g 离心 1 分钟。丢弃离心柱。
24. 向洗脱的 DNA 中加入 10 μL 3 M NaCl（1/10 体积的 DNA 洗脱液）和 250 μL 冷冻的无水乙醇（2.5 体积的 DNA 洗脱液）。倒置以充分混合，并以 8,000 x g 的速度旋转内容物 15 秒。
25. 将 DNA-乙醇混合物在 -20 °C 下孵育至少 1 小时。
    注：DNA-乙醇混合物的孵育时间可延长至 16 小时，而不会显著降低提取的 DNA 的产量或质量。
26. 在 4 °C 下以 19,000 x g 离心 30 分钟。倾析弃去上清液。
27. 向沉淀中加入 500 μL 冷冻的 70% 乙醇。
28. 在 4 °C 下以 19,000 x g 离心 15 分钟。倾析弃去上清液。
29. 倒置并轻轻敲击薄纸上的试管，以通过毛细管作用去除残留的乙醇。
30. 通过在 37 °C 下将试管在加热块上打开 5-10 分钟，直到所有乙醇蒸发，将 DNA 沉淀完全干燥。
31. 将 DNA 沉淀重悬于 30-50 μL 高压灭菌的双蒸水 （ddH₂O） 中。在 37 °C 下孵育 5-10 分钟。
32. 以 8,000 x g 的速度旋转 DNA 15 秒。
33. 在 Nanodrop 分光光度计的 Nucleic Acids（核酸 ）设置下选择 dsDNA 应用程序。
    1. 用不起毛的纸巾和水清洁基座。使用 ddH₂O 将仪器消空，然后将 2 μL DNA 样品加载到基座上。
    2. 测量浓度和吸光度比（A260/280 和 A260/230）以确定纯度。
34. 将 DNA 样品储存在 -20 °C。

3. 沉淀聚合酶链反应 （PCR） 扩增的线性 DNA，以检查一系列分子量的 DNA 回收率

1. 使用来自 大肠杆菌 MG155 的基因组 DNA，通过 PCR 扩增基因片段，从以下基因中生成线性片段库： fusA、lacZ、gapA、rpsD、16S rRNA、marR （引物序列和 PCR 条件见 表 2 ）。
2. 使用 PCR 纯化试剂盒纯化 PCR 产物，并将 PCR 产物混合在一起。
3. 将混合扩增子分装到等体积的 1.5 mL 微量离心管中 - 将一个试管标记为“输入 DNA”。
4. 根据所需条件（9%、20%、30% PEG-8000;0.3 M、1.2 M NaCl）添加到每个试管中，除了标有“输入 DNA”的试管外，并将最终体积补足至 1 mL。
5. 将试管在 4 °C 下孵育过夜（~16-18 小时）。
   注意：对于直到 3.16 的其余步骤，“输入 DNA”在冰箱中保持不变。
6. 根据所需的速度（15,000 x g 或 20,000 x g）在台式微量离心机中在 4 °C 下旋转试管 1 小时。
7. 使用微量移液器从沉淀对面的一侧小心去除 900 μL 上清液。
8. 第一次乙醇洗涤：向沉淀中加入 900 μL 冷冻的 70% 乙醇，轻轻倒置试管进行混合。
9. 在4°C下以与步骤3.6相同的速度（15,000 x g 或 20,000 x g）旋转管30分钟。
10. 倾析除去上清液。
11. 第二次乙醇洗涤：向沉淀中加入 500 μL 冷冻的 70% 乙醇。
12. 在 4°C 下以与步骤 3.6 相同的速度（15,000 x g 或 20,000 x g）旋转试管 30 分钟。 倾析弃去上清液。
13. 倒置并轻轻敲击薄纸上的试管，以通过毛细管作用去除残留的乙醇。
14. 通过在 37 °C 下保持试管在加热块上打开 5-10 分钟，直到所有乙醇蒸发，将 DNA 沉淀完全干燥。
15. 将沉淀重悬于 20 μL 高压灭菌的双蒸水中。
16. 使用 Nanodrop 分光光度计或荧光计测量由不同条件沉淀的 DNA 和“输入 DNA”的浓度。
17. 将沉淀的 DNA 上样到 1% 琼脂糖凝胶上，用于 DNA 可视化。

建立从废水样品中高产量提取 DNA 的方案
使用先前建立的方案的修改版本从水样品中提取高质量的 DNA 和 RNA¹⁷。这些样本来自印度北部德里 NCR 地区的露天排水沟和污水处理厂。使用 PEG 和 NaCl 进行预处理后（图 1），通过试剂盒处理样品，以便从土壤和水中提取 DNA。在所有情况下，都观察到一个突出的高分子量条带，可能对应于细胞内细菌 DNA 和一个背景弥散条带，这是环境样本的典型特征^37（图 2）。

缺乏从污水处理厂 （STP） 污水中提取 DNA 的高效
尽管从开放式排水管和 STP 进水中获得合理的总 DNA 产量（表 3），但无法从最终处理的流出物中获得 DNA;在以前的工作中也描述了低产量的问题⁴¹ （图 3）。后处理，包括废水的氯化，在某些情况下，紫外线和超滤处理⁴²，预计微生物负荷会很低，任何残留的 DNA（由细胞外和片段化的 DNA 组成）都会被稀释。样品浓度和核酸沉淀中使用的初始低浓度 PEG 可能会排除低分子量 DNA。换句话说，片段化的 DNA 可能会在初始浓缩步骤中丢失。

PEG 和 NaCl 浓度的增加导致沉淀出低分子量的 DNA
为了测试增加 PEG 浓度是否有助于富集低分子量 DNA，生成了不同长度的 PCR 片段的实验室标准品，从而产生了一系列线性 DNA 片段（图 4）。标准品经受四种不同的沉淀条件 - 9% PEG-8000 + 0.3 M NaCl（原始组合）、9% PEG-8000 + 1.2 M NaCl（仅升盐）、30% PEG-8000 + 0.3 M NaCl（仅升盐）和 30% PEG-8000 + 1.2 M NaCl（同时升盐和 PEG）。条件的选择基于用于 SARS-CoV-2 监测的标准方案¹⁷ 和从环境样本中提取 DNA 的模块化方法³³ 研究中报告的条件。根据差速对 DNA 沉淀的影响，使用两种不同的离心速度 - 15,000 x g 和 20,000 x g ⁴³。将 PEG 和 NaCl 浓度分别提高到 30% 和 1.2 M 后，DNA 的总回收率增加了约 70%，并且小至 150 个碱基对 （bp） 的 DNA 片段被有效沉淀（图 5）。速度差异对产量没有太大影响（图 6A），可能是由于使用的离心时间长。由于原始 PEG/NaCl 组合中的总 DNA 回收率较低，因此尽管存在较低分子量条带，但浓度可能低于可视化限值。为了测试这一点，增加了用于沉淀的起始 DNA 量，并将对应于每次处理的过量 DNA （1.5 mg） 加载到琼脂糖凝胶上以进行可视化。只有用 30% PEG 处理显示出最低分子量的良好回收率，即 150 bp 条带（图 6B）。

环状 DNA（细菌基因组和质粒 DNA）的沉淀不遵循相同的趋势
大肠杆菌 MG155 基因组 DNA 和质粒 （pRSV， ~4 kb） 用于不同 PEG 和 NaCl 浓度的沉淀。与线性 DNA 不同，提高 PEG 和 NaCl 水平没有显著影响（图 7），表明环状和高分子量 DNA（通常是细胞内 DNA）的产量不受提高 PEG 的影响。这与早期的蛋白质沉淀⁴⁴ 观察结果形成鲜明对比，其中溶解度随着 PEG 浓度的增加而急剧下降。鉴于 PEG 充当拥挤剂，假设可用于相互作用的大分子表面积在其作为沉淀剂的有效性中起着重要作用。对于线性 DNA，随着大小的增加，可以合理地假设可用于相互作用的面积也会增加。对于环状 DNA，低 PEG 浓度可能已经足以使分子饱和，进一步提高浓度可能不会增加相互作用的有效表面积。

省略 PEG 和 NaCl 预处理沉淀时，废水中 DNA 的产量低
为了测试预处理废水是否对 DNA 提取至关重要，将 20 mL 热灭活（70 °C，4 小时）废水中加入 10 mg 先前制备的线性标准品，并在 4 °C 下孵育过夜 （a） 不含 PEG + NaCl，（b） 含 9% PEG + 0.3 M NaCl（原始组合），以及 （c） 含 20% PEG + 1.2 M NaCl（增加 PEG 和盐）。然后通过土壤试剂盒处理样品以进行 DNA 提取，如实验步骤中所述。研究发现，与不进行预处理步骤相比，使用 9% PEG + 0.3 M NaCl 对废水样品进行预处理时，提取的 DNA 产量增加了 60%（图 8），这表明预处理 PEG 和 NaCl 沉淀对于从废水样品中获得高产量 DNA 至关重要。还值得注意的是，当使用高 PEG 和盐进行沉淀时，包括高分子量基因组 DNA （gDNA） 在内的总 DNA 产量较低，但低分子量 DNA 的比例却富集了（图 8）。提高 PEG 和盐的总产量降低可归因于 PEG 的高粘度，这可能导致 DNA 沉淀损失，同时去除上清液。这加强了所提出的逐步 DNA 提取方法（图 9）的情况，其中可以首先使用低 PEG 和 NaCl 沉淀提取高分子量 DNA，然后用增加的 PEG 和 NaCl 对所得上清液进行另一轮预处理，以有效提取逃脱第一轮沉淀的低分子量 DNA。

图 1：废水样品的预处理。 示意图显示了从样品采集到 DNA 提取的工作流程。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2：从废水样品中提取的 DNA 的典型凝胶谱。 通过在 70 °C 下孵育 4 小时，对来自不同地点采样的 50-100 mL（如图所示）的废水进行热灭活。然后将其与 9% PEG 和 0.3 M NaCl 在 4 °C 下孵育过夜，然后使用土壤或水试剂盒处理以提取 DNA。将提取的约 150 ng 总 DNA 上样到 1% 琼脂糖凝胶上，以 1 千克碱基对 （kb） 分子量标准作为标记物，并进行电泳（90 V，30 分钟）。使用染料 SYBR SAFE 在紫外 （UV） 光下观察 DNA。右表详细说明了样品采集来源、处理的废水量以及每个泳道用于 DNA 提取的试剂盒。（STP：污水处理厂;UVR：紫外线辐射） 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3：STP 流出物样品显示 DNA 总产量较差。 通过在 70 °C 下孵育 4 小时，将从 STP 进水和流出物中取样的 40 mL 废水进行热灭活。然后将其与 9% PEG 和 0.3 M NaCl 在 4 °C 下孵育过夜，然后使用土壤或水试剂盒或细菌基因组 DNA 提取试剂盒处理以提取 DNA。将提取的大约 150 ng 总 DNA 上样到 1% 琼脂糖凝胶上，以 1 kb 分子量标准作为标记物，并进行电泳（90 V，30 分钟）。使用染料 SYBR SAFE 在紫外 （UV） 光下观察 DNA。流出物样品中提取的 DNA 浓度低于 1 ng/mL 废水，因此无法可视化。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 4：生成线性 DNA 大小标准品，以测试低分子量 DNA 沉淀的功效。 使用 大肠杆菌 （MG1655） 基因组 DNA 作为模板，引物和条件通过 PCR 扩增产生 5 个不同大小的 DNA 片段，如 表 2 所示。将用 PCR 纯化试剂盒纯化的 DNA （~1 μg） 加载到 1% 琼脂糖凝胶上，同时将 1 kb 分子量标准作为标记物，并进行电泳（90 V，40 分钟）。使用染料 SYBR SAFE 在紫外 （UV） 光下观察 DNA。泳道由扩增片段的基因名称和预期的扩增子大小标记。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 5：低分子量 DNA 仅在最高 （30%） PEG 浓度下才能有效回收。 如图所示，用 PEG 和 NaCl 的不同组合处理先前生成的大小标准品的输入 DNA （3.34 μg），并按照实验步骤中的详细说明进行提取。使用的离心速度为 15,000 x g。对于起始量（泳道 3）和 1.2 M NaCl + 30% PEG（泳道 7），将 0.8 μg DNA 上样到凝胶上。对于其余部分，由于总产量较低，因此上样 16 μL 中提取的 DNA 总量，并将 1 kb 分子量标准作为大小标记物上样到 1% 琼脂糖凝胶上，并进行电泳（80 V，45 分钟）。使用染料 SYBR SAFE 在紫外 （UV） 光下观察 DNA。白框突出显示了 150 bp 的最低条带。请点击此处查看此图的较大版本。

图 6：低分子量 DNA 的回收率由高 PEG 而不是高盐浓度决定。 （A） 如图所示，用 PEG 和 NaCl 的不同组合处理来自大小标准品的起始 DNA （14 μg），并按照方案中的详细说明使用乙醇沉淀法提取。如图所示，使用的离心速度为 15,000 x g 和 20,000 x g 。将全部起始量的 DNA 和提取的 DNA 以及 1 kb 分子量标准上样到 1% 琼脂糖凝胶上，并进行电泳（90 V，30 分钟）。使用染料 SYBR SAFE 在紫外 （UV） 光下观察 DNA。（B） 如图所示，用 PEG 和 NaCl 的不同组合处理先前生成的大小标准品的输入 DNA （15.67 μg），并按照方案中的详细说明进行提取。使用的离心速度为 15,000 x g。将提取的 DNA （1.5 μg） 上样到每个泳道中，将 1 kb 分子量标准作为大小标记物上样到 1% 琼脂糖凝胶上，并进行电泳（80 V，45 分钟）。使用染料 SYBR SAFE 在紫外 （UV） 光下观察 DNA。白框突出显示了 150 bp 的最低条带。 请点击此处查看此图的较大版本。

图 7：增加 PEG 和 NaCl 浓度对基因组 DNA 和质粒 DNA 的回收率没有显著影响。 如图所示，用 PEG 和 NaCl 的不同组合处理输入 DNA（9 μg;4.5 μg 质粒和 4.5 μg 基因组 DNA），并按照方案中的详细说明进行提取。使用的离心速度为 15,000 x g。 将全部起始量的 DNA 和提取的 DNA 以及 1 kb 分子量标准上样到 1% 琼脂糖凝胶上，并进行电泳（90 V，45 分钟）。使用染料 SYBR SAFE 在紫外 （UV） 光下观察 DNA。白框表示基因组 DNA 和质粒 DNA。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 8：使用 PEG 和 NaCl 进行预处理沉淀对于从废水中高产率提取 DNA 至关重要。 将热灭活（70 °C，4 h）废水 （20 mL） 加入 10 mg 先前制备的线性标准品，并在 4 °C 下孵育过夜，不含 PEG 和 NaCl 或如图所示的不同 PEG 和 NaCl 浓度。然后使用土壤试剂盒对其进行处理以提取 DNA。将用于加标的起始 DNA （4 μg）（泳道 1）和使用 9% PEG + 0.3 M NaCl 预处理步骤（泳道 3）提取的 DNA （4 μg）上样到 1% 琼脂糖凝胶上。对于其余条件，由于产量低，将提取的全部 DNA 量上样到凝胶上。还将 1 kb 分子量标准作为大小标记。对凝胶进行电泳 （70 V， 2 h）。使用染料 SYBR SAFE 在紫外 （UV） 光下观察 DNA。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 9：提出的从废水中提取 DNA 以富集高分子量和低分子量 DNA 的逐步方法。 流程图描述了从废水中提取 DNA 的两步法，其中初始预处理步骤使用低 PEG 和 NaCl 浓度。第一步的上清液经过另一轮前处理沉淀，增加 PEG 和 NaCl，以有效地从废水中提取高分子量和低分子量 DNA。 请单击此处查看此图的较大版本。

表 1.先前在从环境样品中提取 DNA 的研究中使用 PEG 和 NaCl。请点击此处下载此表格。

表 2.用于标准品生成的引物序列和 PCR 条件。请点击此处下载此表格。

表 3.2023 年两个月内从废水样品中获得的 DNA 产量和质量。请点击此处下载此表格。

根据世界卫生组织的排名，抗微生物药物耐药性是当今十大健康威胁之一，抗微生物药物耐药性的环境监测是世界公认的重要工具。如引言中所述，环境 AMR 的全面记录包括低分子量、片段化和细胞外 DNA。此处报道的预处理方案使用高浓度 PEG 与盐（30% PEG 和 1.2 M NaCl）结合，通过富集低分子量 DNA 的比例而不影响高分子量分数（主要是基因组和质粒 DNA）的提取来实现这一结果。这与以前使用较低 PEG 和直接试剂盒方案（无需预处理）的浓缩方法形成鲜明对比，后者由于需要处理大量而很麻烦。使用较低 PEG 浓度进行预处理在回收低分子量 DNA 方面效率低下（此处“低”是指 600 bp 以下的 DNA 条带）。当在预处理过程中不使用 PEG 时，DNA 提取效果不佳，导致仅回收 10% 的输入 DNA，而使用 PEG 和 NaCl 时则回收 70%（图 8）。除了添加 PEG 和 NaCl 外，另一个重要步骤是从试剂盒中去除 DNA 提取后残留的乙醇，以获得用于下游加工的纯 DNA。重要的是要确定洗脱时在 30-50 mL 体积中获得至少 ~300 ng 至 5 mg DNA 总量所需的初始水体积。与通常处理 1 L 或更多水从废水中提取^{DNA 27,41} 相比，发现使用此处建议的预处理步骤，仅 27.5-40 mL 就足以获得用于下游处理的高质量 DNA。废水还含有颗粒物和有机物，其中可能含有吸附的细菌细胞和细胞外 DNA。因此，细胞和 DNA 的解吸伴随着细胞裂解是提高 DNA 产量的重要步骤。如前所述，高浓度的 PEG 会使样品变得粘稠，并可能阻碍 DNA 提取的裂解和解吸步骤。为避免这种情况，已经提出了一种逐步提取 DNA 的方法，如流程图所示（图 9）。该方法将有助于提取细胞内高分子量 DNA（图 7）和细胞外低分子量片段化和环状 DNA。

该方案目前在费用方面的一个限制是通过试剂盒持续处理富集的低分子量 DNA，以提高质量。使用其他 DNA 纯化方法（如苯酚-氯仿提取）可能会绕过这一限制。另一个实际限制是处理高浓度的 PEG，因为沉淀可能会因溶液的高粘度而损失。目前，使用 PEG 和 NaCl 进行预处理，然后对现有试剂盒方案进行修改版本，即该试剂盒仍用于最终 DNA 纯化。一种无需试剂盒的 DNA 纯化方法，DNA 产量高，但纯度低（此处未报道），正在优化，以提高提取的 DNA 的质量。由于 PEG 溶液的粘性，因此需要获得可产生各种 DNA 大小且处理舒适的最佳 PEG 浓度。将浓度降低到 20%（图 6B）获得了介于低 （9%） 和高 （30%） PEG 提取效率之间的结果;这可能值得在以后的工作中跟进。

PEG 通常用于从环境样品中提取 DNA 的不同步骤。然而，在 AMR 监测的背景下，PEG 的使用尚未标准化用于 DNA 提取。废水监测需要检测许多不同领域的抗菌素耐药性，包括 STP（进水和出水）以及明闭排水管 ^8,27。虽然进水中 AMR 的信息提供了有关社区中循环的耐药性的重要信息，但出水中 AMR 基因的存在对于测量和潜在预测耐药性爆发的出现同样重要。流出物样品的微生物载量通常较低，因为大多数细胞在处理过程中被杀死，导致细胞 DNA 产量非常低。然而，流出物含有细胞外自由漂浮的 DNA，包括高分子量基因组 DNA 和低分子量质粒、噬菌粒和片段化 DNA。存在于低分子量 DNA（片段化和质粒/噬菌粒）中的 AMR 基因可以转移到流出物中剩余的活细胞，从而导致耐药性的传播 30,41,45。因此，检测废水中的低分子量细胞外 DNA 非常重要。在评估 AMR 时，用于从废水中提取 DNA 的其他方法通常不能确保低分子量 DNA 的初始富集。这种从废水中提取 DNA 的方法可用于提供有关环境综合抵抗组的信息。

作者声明没有利益冲突。

我们感谢洛克菲勒基金会（洛克菲勒基金会拨款号 2021 HTH 018）作为 APSI 印度团队（病原体监测创新联盟 https://data.ccmb.res.in/apsi/team/）的一部分提供的资金支持。我们还感谢 Axis Bank 为支持这项研究而提供的财政援助，以及阿育王大学 Trivedi 生物科学学院提供的设备和其他支持。