Method Article
Mevcut protokol, araştırmalarda retina hastalıklarının hayvan modellerinde uygulama için uygun bir cerrahi teknik olan subretinal cihaz implantasyonu için skleral yaklaşımı tanımlamaktadır.
Yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) gibi retina dejenerasyonu, dünya çapında körlüğün önde gelen nedenlerinden biridir. Kök hücre bazlı tedaviler de dahil olmak üzere AMD için rejeneratif tıp temelli tedaviler geliştirmek için sayısız yaklaşım benimsenmiştir. Retina dejenerasyonu için hayvan modelleri olarak kemirgenler, farklı aşamalarda retinal dejenerasyon hastalıkları geliştiren geniş suş spektrumu nedeniyle translasyonel araştırmalar için bir temel oluşturur. Bununla birlikte, kemirgenlerde subretinal implantların insan terapötik uygulamasını taklit etmek, lens boyutu ve vitreus hacmi gibi anatomik farklılıklar nedeniyle zordur. Bu cerrahi protokol, sıçanlarda implantların subretinal boşluğa nakli için rehberli bir yöntem sağlamayı amaçlamaktadır. Kritik adımların kullanıcı dostu kapsamlı bir açıklaması dahil edilmiştir. Bu protokol, sıçanlarda farklı preklinik çalışmalarda tekrarlanabilirlik için uygun maliyetli bir cerrahi prosedür olarak geliştirilmiştir. İmplantın boyutlarında ayarlamalar içeren cerrahi deneyi gerçekleştirmeden önce insan boyutunda bir implantın uygun şekilde minyatürleştirilmesi gerekir. İmplantı subretinal boşluğa iletmek için intravitreal bir prosedür yerine harici bir yaklaşım kullanılır. Küçük keskin bir iğne kullanılarak, temporal üst kadranda skleral bir insizyon yapılır, ardından göz içi basıncını azaltmak için parasentez yapılır, böylece cerrahi implantasyon sırasında direnci en aza indirir. Daha sonra, fokal retina dekolmanı (RD) elde etmek için insizyondan dengeli bir tuz çözeltisi (BSS) enjeksiyonu gerçekleştirilir. Son olarak, implantın subretinal boşluğa yerleştirilmesi ve görüntülenmesi gerçekleştirilir. İmplantın subretinal yerleşiminin ameliyat sonrası değerlendirilmesi, spektral domain optik koherens tomografi (SD-OCT) ile görüntülemeyi içerir. Görüntüleme takipleri, gözler alınmadan ve histolojik analiz için sabitlenmeden önce implantın subretinal stabilitesini tespit eder.
Yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD), dünya çapında körlüğün önde gelen bir nedenidir. 2020'de AMD'den etkilenen insan sayısının 196 milyon olduğu tahmin ediliyordu ve bunun 2040 yılına kadar yaklaşık 288 milyona çıkması bekleniyor1. Son on yılda, AMD'nin geç evreleri ile ilişkili görsel değişiklikleri hafifletmek için, esas olarak ıslak AMD'de gözlenen koroidal neovaskülarizasyonun gelişimini ve ilerlemesini tedavi etmek için çeşitli terapötikler geliştirilmiştir. Tersine, retina pigment epitel (RPE) hücresinin işlev bozukluğu ve kaybının RPE ve retinal atrofisine ilerlediği kuru YBMD tedavisinin, dünya çapında %0,44'lük bir prevalans ile AMD'nin %85 ila %90'ını oluşturduğu tahmin edilmektedir 1,2. AMD, hastalığın başlangıcına ve ilerlemesine katkıda bulunan yaş, genetik ve çevresel faktörlerle birlikte çok faktörlü bir hastalık olarak tanımlanmıştır; Bu hastalıkla ilişkili farklı patofizyolojik yolları ele almak için çeşitli tedaviler geliştirilmektedir3.
Kök hücre bazlı tedavi, kuru AMD4'te başarısız RPE'nin yerini almak için yeni bir terapötik seçenek olarak geliştirilmiştir. Pluripotent kök hücrelerin kullanımı hala erken klinik çalışmalarda olmasına rağmen, çeşitli klinik çalışmalarda güvenlik gösterilmiştir 5,6,7. Bugüne kadar, kök hücreleri subretinal boşluğa yerleştirmenin iki ana yolu vardır: biyouyumlu bir implant 8,9,10,11,12 üzerine ekilen tek katmanlı bir yamanın askıya alınması veya yerleştirilmesi. Klinik öncesi çalışmalarda kök hücre bazlı tedavileri kullanan yeni stratejiler, kök hücre bazlı terapötiklerin insanlarda amaçlandığı gibi aynı hedeflenen bölgeye verilebileceği hayvan modellerini gerektirir. Anatomideki farklılık, nihai insan ürünü ile kullanılanlara kıyasla prosedürlerde, cerrahi ekipmanda ve yaklaşımda küçük değişiklikler gerektirebilir13,14. Oküler cerrahi tekniklerin modifiye edilmesi, farklı hayvan modellerinde kullanım için başarılı bir yaklaşım olarak yaygın olarak tanımlanan gerekli değişikliklerden biridir 15,16,17.
Önceki yayınlar sıçanlarda subretinal implantlar için cerrahi tekniklerden bahsetmiş olsa da, araştırmacıların karşılaşabileceği teknik zorlukların üstesinden gelmek için bu tür tekniklerin kapsamlı bir açıklaması yoktur. Bu nedenle, cerrahi teknikleri ayrıntılı olarak tanımlamaya, kaçınılması gereken en iyi uygulamaları ve öğrenilen dersleri sağlamaya ve gerekirse prosedür boyunca kritik adımlar sırasında sorunları ele almaya ihtiyaç vardır. Bu makalenin amacı, sıçanlarda implantın subretinal boşluğa cerrahi implantasyonu için kapsamlı bir kılavuz sağlamaktır.
Tüm deneyler Güney Kaliforniya Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu ve Görme ve Oftalmoloji Araştırmaları Derneği (ARVO) Oftalmik ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımı Beyanı'na göre gerçekleştirildi. Bu çalışmada toplam 12 adet Royal College of Surgeon (RCS) erkek sıçan kullanıldı. Hayvanlar hayvan tesisinde yetiştirildi ve doğumdan 1 gün sonra 28 ± 1 yaşına geldiklerinde çalışmaya dahil edildi. Göz anormalliklerinin olmadığını doğrulamak için tam bir göz muayenesi yapıldı. Parilen C'den yapılmış ve vitronektin ile kaplanmış ultra ince membranlar olan subretinal implantlar, belirli bir ticari organizasyon tarafından tasarlanmıştır (bkz. Bu membranlar, kalınlıkları ve geçirgenlikleri açısından insan boyutundaki membranları çoğaltır (ultra ince alanlarda 20 μm dairesel gözenekli 6.0 μm kalınlığında ağ çerçeve). İnsan boyutundaki zarlardan uzunluk ve genişliğin (1.0 mm × 0.4 mm) minyatürleştirilmesi, subretinal implantları kemirgen gözlerinin içine yerleştirmek için elde edildi18.
1. Hayvan bakımı ve cerrahi hazırlık
2. Subretinal implantasyon için skleral yaklaşım: cerrahi teknik
3. SD-OCT görüntüleme
4. Hayvanların geri kazanılması
RCS sıçanlarında (N = 12) bir subretinal implantın implantasyonu, sıçanlarda subretinal doğum için cerrahi tekniğin fizibilitesini ve tekrarlanabilirliğini göstermiştir. Bu çalışmada, implant ile tedavi edilen göz (N = 12) sağ gözdü. İşlem sonunda cerrahi mikroskop kullanılarak yapılan klinik değerlendirmede, tedavi edilen 12 gözün dokuzunda (%75.00) implantın subretinal lokalizasyonu görüldüğü, iki gözde (%16.67) implantın intraretinal yerleşimi olarak tespit edildiği, bir gözde (%8.33) ise cerrahi alanda subretinal kanamanın neden olduğu medya opaklığı nedeniyle doğrudan görmenin mümkün olmadığı, hem implant hem de retina yapılarının sınırlı bir görünümü ile (Tablo 1). Cerrahi işlemden hemen sonra yapılan SD-OKT taramaları implantın subretinal veya intraretinal pozisyonunu gösterdi (sırasıyla 10 [%83.33] ve bir [%8.33]) (Şekil 1A). SD-OCT, 10 günlük bir takipten sonra bile, yukarıda açıklanan medya opaklığı ile (doğrudan görselleştirme mümkün değildir) aynı hayvanda (n = 1) implantın subretinal yerleşimini tam olarak tanımlayamadı. Şekil 1B,C, subretinal boşluğa düzgün bir şekilde yerleştirilmiş bir implantı olan iki farklı hayvanı göstermektedir. Cerrahi teknikle ilişkili başka bir cerrahi komplikasyon gelişmedi. Hematoksilen ve Eozin (H&E) boyaması ile implantın subretinal yerleşiminin doğrulanması gözlendi (Şekil 1D).
Şekil 1: Cerrahi implantasyondan 1 hafta sonra spektral domain optik koherens tomografi (SD-OCT) taramaları. (A) Subretinal implantın kızılötesi görüntüsü. Yeşil çizgi, (B)'de gösterilen kesiti sınırlar. Ölçek çubuğu: 200 μm. (B,C) Subretinal boşluğa düzgün bir şekilde yerleştirilmiş bir implanta sahip iki farklı hayvan (siyah oklar). İmplantın ucu optik sinire doğru işaret eder (siyah ok ucu). 1 = retina sinir lifi/ganglion hücre tabakası, 2 = iç pleksiform tabaka, 3 = iç dış tabaka, 4 = dış pleksiform tabaka ve 5 = dış nükleer tabaka. Ölçek çubuğu: 200 μm. (D) Parilen membranının subretinal implantasyonunu göstermek için H&E ile boyanmış histoloji kesiti (beyaz ok). Ok ucu, ultra ince alanlardaki mikro gözeneklerden birini gösterir. 1 = retina sinir lifi/ganglion hücre tabakası, 2 = iç pleksiform tabaka, 3 = iç dış tabaka, 4 = dış pleksiform tabaka ve 5 = dış nükleer tabaka. Ölçek çubuğu: 20 μm. Büyütme: 20x. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Klinik Değerlendirme | SD-OCT (Türkçe) | |||||
Konu | SR | IR | Bilinmeyen | SR | IR | Bilinmeyen |
1 | X | X | ||||
2 | X | X | ||||
3 | X | X | ||||
4 | X | X | ||||
5 | X | X | ||||
6 | X | X | ||||
7 | X | X | ||||
8 | X | X | ||||
9 | X | X | ||||
10 | X | X | ||||
11 | X | X | ||||
12 | X | X | ||||
9 | 2 | 1 | 10 | 1 | 1 | |
75.00% | 16.67% | 8.33% | 83.33% | 8.33% | 8.33% |
Tablo 1: Tüm hayvanlar arasında klinik değerlendirmeler ile SD-OCT görüntüleme arasındaki oküler bulguların karşılaştırılması. Kısaltmalar: SR = subretinal, IR = intraretinal ve SD-OCT = spektral domain optik koherens tomografi.
Prosedür daha önce küçük değişikliklerle tanımlanmış olsa da, bu makalenin kapsamı, tekniği öğrenirken izlenecek sıçanlarda subretinal implantlar için cerrahi prosedürün kapsamlı bir tanımını sağlamak ve araştırmacıların karşılaşabileceği cerrahi zorlukların ve potansiyel komplikasyonların üstesinden gelmektir. Burada özetlenen cerrahi protokol, laboratuvarımızda birkaç yıldır yaygın olarak kullanılan ultra ince parilen membranın kullanımını içerir 9,10,16,18. Bununla birlikte, farklı enjektörler ve subretinal boşluğa implante edilen materyaller kullanılarak tekniğin tekrarlanabilirliği gözlenmiştir18,19.
Subretinal cihaz implantasyonu için skleral bir yaklaşım, kök hücre bazlı tedavilerle sınırlı değildir; Küçük hayvan modellerinde retina nakli prosedürleri de tanımlanmıştır20,21. Retinal elektriksel stimülasyon alanında, sıçanlarda subretinal implantlar için bu cerrahi prosedür on yıldan fazla bir süredir kullanılmaktadır22. Daha yakın zamanlarda, Ho ve ark.23, sıçan retinasını uyarmak için bir dizi implante etti ve Thomas ve ark.24, kök hücre kaynağı olarak retina organoidlerini kullandı. Daha önce de belirtildiği gibi, kök hücre bazlı tedaviler, kök hücrelerle tohumlanmış biyouyumlu implantların cerrahi implantasyonu ile ilgili yayınlar da dahil olmak üzere iyi bir şekilde yayınlanmıştır4. Farklı yazarlar tarafından tanımlanan cerrahi yaklaşımlarda, bu yazıda açıklanan cerrahi teknikle tartışılacak ve karşılaştırılacak olan küçük farklılıklar vardır.
Skleral kapatma ve cerrahi enstrümantasyon ek tartışma gerektirir. Skleral insizyonu yönetmek için iki yaygın yaklaşım vardır: (1) dikişli kapatma ve (2) dikişsiz kapatma. Bazı yazarlar, normal prosedürlerinin bir parçası olarak skleral insizyonu bir sütürle kapatmak için 10-0 naylon kullanır 23,25,26,27. Bununla birlikte, diğer gruplar (bizimki dahil) 10-0 naylon sütürün gerekli olmadığını bulmuşlardır28. Dikişle kapatmayı destekleyenler, eğer dikiş yoksa subretinal protezin gözdeki kesiden kayarak dışarı çıkacağını savunurlar. Sonuçlar bölümünde açıklandığı gibi, mevcut çalışmada insizyon boyunca implantın veya göz içi dokusunun ekstrüzyonu bulunamamıştır. Dikişsiz bu cerrahi yaklaşım laboratuvarımızda rutin ve başarılı bir şekilde kullanılmaktadır 9,10,12,13,16. Dikişsiz bir yaklaşımın gerekçesi iki faktöre dayanır: Birincisi, insizyon yeri ve konfigürasyonunun bir kombinasyonu, kendi kendine kapanan bir insizyon oluşturmak için yeterli yapıyı sağlar. Skleral tünelin uygun şekilde yapılandırılmasının, araştırmacıların pratikle başaracakları bir adım olduğu unutulmamalıdır. İkincisi, traksiyon serbest bırakıldığında göz içi basıncı artar ve implantı yerinde tutar. Artan göz içi basıncı, retinanın insizyona doğru itilmesine, her iki skleral flebin birbirine yaklaşmasına ve kendi kendine kapanan bir kesi yapılmasına neden olur. Bu nedenle dikişe gerek yoktur. Unutulmamalıdır ki, kesi uzunluğu sadece 1,5 mm'ye kadardır. Cerrahi insizyonun daha büyük bir yara gerektirdiği veya uygun bir skleral tünel konfigürasyonunun elde edilemediği durumlarda, 10-0 naylon sütür makul bir çözümdür. Mevcut teknik, önerilen cerrahi enstrümantasyonla birlikte kullanıldığında oldukça güvenilirdir. Bazı yazarlar implantları için özelleştirilmiş enjektörler kullanmışlardır, bu da insizyon boyutunu değiştirir ve uygun kapatma için skleral sütür kullanma ihtiyacına neden olur25,29. Bununla birlikte, deneyimlerimize göre, farklı malzemeler ve enjektörler kullanmak, insizyon uzunluğunun artmasına (~0,5 mm) neden olmuştur18,19. Hala daha büyük bir skleral insizyonla ilişkili instabilite veya komplikasyon gözlemlemedik ve sütür gerekmedi. Bununla birlikte, prosedür sırasında bu kılavuzların dışında enstrümantasyon kullanılması bu tekniğin bir sınırlaması olarak kabul edilebilir.
Önceki yayınlarda nadiren atıfta bulunulan bir diğer kritik adım, fokal RD'yi oluşturmadan ve implantı subretinal boşluğa enjekte etmeden önce göz içi basıncını (GİB) azaltmak için parasentezdir 4,10,13,15. GİB'nin azaltılması, retinayı ayırırken göz içi yapıların daha iyi kontrol edilmesini sağlar ve göz içi içeriğinin ekstrüzyonunu önler, bu da başarısız bir işlemle sonuçlanır. Hipotonik bir gözle ilişkili bir diğer avantaj, implantın skleral insizyon yoluyla enjekte edilmesi sırasında direncin azalmasıdır, bu da implantın kendisine daha az zarar verir. Öte yandan, düşük GİB, cerrahi insizyonda oküler kanamanın artmasına eğilimlidir. Skleral insizyondaki büyük miktarda kan, görüşü gizler ve subretinal implantasyon sırasında kanın subretinal boşluğa taşınma riskini artırır. Bölgeyi temizlemek ve cerrahi komplikasyonlardan kaçınmak için kanamayı pamuk takasları ve BSS kullanarak kontrol etmenizi öneririz.
İmplantın subretinal boşluğa düzgün bir şekilde yerleştirilmesi için RD'nin boyutunun önemli olduğunu belirtmekte fayda var. Diğer hayvan modellerinden ve insanlardanfarklı olarak 5,14,30, bu skleral yaklaşım subretinal boşluğun doğrudan görüntülenmesini sağlamadığından, fokal bir RD oluşturmak daha zordur. İmplantın bu alanın dışına yerleştirilmeden subretinal boşluğa nazikçe yerleştirilmesi için yeterli alan sağlamak için 100 μLof BSS enjekte edilmesi önerilir. Bu öneri, retinanın en az bir kadranında bir RD oluşturulmasına dayanmaktadır. Retinanın en az bir kadranından daha küçük bir RD oluşturulursa, implant intravitreal, intraretinal veya suprakoroidal boşluğa yanlış bir şekilde enjekte edilecektir. Protokol boyunca açıklandığı gibi, küçük bir RD gözlenirse, istenen RD elde edilene kadar 2.2.4 ila 2.2.8 arasındaki adımların tekrarlanması önerilir.
Makalede tartışılan cerrahi komplikasyonların ve kritik adımların çoğu, öğrenme eğrisi sırasında ortaya çıkabilir ve bu da subretinal implantasyonun başarısını tehlikeye atabilir. Bu öğrenme eğrisi aynı zamanda hayvanların anestezi altında kaldığı süreyi ve dehidrasyon seviyesini de içerir. Daha uzun anestezi süresi, anestezikler ve dehidrasyon, kornea, lens ve skleral değişiklikler gibi kuru göz komplikasyonlarına yol açabilir31. Ek olarak, ketamin ve ksilazin gibi anestezikler, sulu mizah bileşimindeki değişikliklerle birlikte kornea ve lensteki ortam opaklığı ile ilişkilendirilmiştir32. Anestezi süresi boyunca cerrahi göze kayganlaştırıcı göz damlası (BSS) kullanmak bu komplikasyonları giderir. Özetle, bu yazıda açıklanan metodolojinin, sıçan gözlerinde subretinal terapötiklerin geliştirilmesinde cerrahi bir öneri olarak kullanılması amaçlanmıştır.
M.S.H., D.R.H. ve JL, Rejeneratif Yama Teknolojileri'nin (RPT) kurucu ortakları ve danışmanlarıdır. Diğer yazarlar, bu yazıda tartışılan konu veya materyallerle ilgili herhangi bir mali veya mali olmayan çıkarı olan herhangi bir kuruluş veya kuruluşla hiçbir bağlantıları veya katılımları olmadığını onaylarlar.
Bu çalışma CIRM DT3 (MSH) ve Körlüğü Önleme Araştırmaları (USC Roski Göz Enstitüsü) tarafından desteklenmiştir. Teknik yardımları için Fernando Gallardo ve Dr. Ying Liu'ya teşekkür etmek istiyoruz.
Sponsorun bu araştırmanın tasarımında veya yürütülmesinde hiçbir rolü yoktu.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1 cc syringe | VWR | BD309659 | |
27 G needle 1/2'' | VWR | BD305109 | |
30 G needle 1/2'' | VWR | BD305106 | |
32 G Blunt needle - Small hub RN | Hamilton | 7803-04 | |
4-0 Perma Hand silk black 1X18" PC-5 | Ethicon | 1984G | |
6'' sterile cotton tips | VWR | 10805-154 | |
Betadine 5% sterile ophthalmic prep solution | Alcon | 8007-1 | |
BSS irrigating solution 15 mL | Accutome | Ax17362 | |
Buprenorphine ER | ZooPharm | N/A | |
Castroviejo Caliper | Storz | E2405 | |
Castroviejo suturing forceps 0.12 mm | Storz | E1796 | |
Clayman-Vannas scissors straight | Storz | E3383S | |
Cover glass, square | WVR | 48366-227 | |
EPS Polystyrene block | Silverlake LLC | CFB8x12x2 | |
Gonak 15 mL | Accutome | Ax10968 | Eye lubricant |
Halstead straight hemostatic mosquito forceps non-magnetic | Storz | E6772 | |
Hamilton syringe 700 series 100 µL | Hamilton | 7638-01 | |
HEYEX Software | Heidelberg | N/A | an image management software |
Kelman-McPherson tying forceps angled | Storz | E1815 AKUS | |
Ketamine (100 mg/mL) | MWI | 501072 | |
Needle holder 9mm curved fine locking | Storz | 3-302 | |
Neomycin/Polymyxin B sulfactes/Bacitracin zinc ointment 3.5 g | Accutome | Ax0720 | |
Ophthalmic surgical microscope | Zeiss | SN: 233922 | |
Phenylephrine 2.5% 15 mL | Accutome | Ax0310 | |
Spectralis SD-OCT | Heidelberg | SPEC-CAM-011210s3600 | |
Sterile Drape | VWR | 100229-300 | |
Sterile surgical gloves | VWR | 89233-804 | |
T-Pump heating system | Gaymar | TP650 | |
Tropicamide 1% 15 mL | Accutome | Ax0330 | |
Ultrathin membranes made from Parylene C and coated with vitronectin | Mini Pumps LLC, CA | specifically designed for this study | used as subretinal implants |
Xylazine (100 mg/mL) | MWI | 510650 |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır