Method Article
הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הגישה הסקלרית להשתלת התקן תת-רשתית, טכניקה כירורגית אפשרית ליישום במודלים של מחלות רשתית בבעלי חיים במחקר.
ניוון רשתית, כגון ניוון מקולרי הקשור לגיל (AMD), הוא גורם מוביל לעיוורון ברחבי העולם. מספר עצום של גישות ננקטו לפיתוח טיפולים מבוססי רפואה רגנרטיבית ל-AMD, כולל טיפולים מבוססי תאי גזע. מכרסמים כמודלים של בעלי חיים לניוון רשתית הם בסיס למחקר תרגומי, בשל הספקטרום הרחב של זנים המפתחים מחלות ניוון רשתית בשלבים שונים. עם זאת, חיקוי מתן טיפולי אנושי של שתלים תת-רשתית במכרסמים הוא מאתגר, בשל הבדלים אנטומיים כגון גודל העדשה ונפח הזגוגית. פרוטוקול כירורגי זה נועד לספק שיטה מונחית להשתלת שתלים בחלל התת-רשתית בחולדות. נכלל תיאור מקיף וידידותי למשתמש של השלבים הקריטיים. פרוטוקול זה פותח כהליך כירורגי חסכוני לשחזור במחקרים פרה-קליניים שונים בחולדות. נדרש מזעור נכון של שתל בגודל אנושי לפני ביצוע הניסוי הכירורגי, הכולל התאמות למידות השתל. נעשה שימוש בגישה חיצונית במקום הליך תוך-זגוגי כדי להעביר את השתל לחלל התת-רשתית. באמצעות מחט חדה קטנה מבוצע חתך סקלרלי ברביע העליון הטמפורלי, ואחריו פרצנטזיס להפחתת הלחץ התוך עיני, ובכך למזער את ההתנגדות במהלך ההשתלה הניתוחית. לאחר מכן, מתבצעת הזרקת תמיסת מלח מאוזנת (BSS) דרך החתך כדי להשיג היפרדות רשתית מוקדית (RD). לבסוף, מתבצעת החדרה והדמיה של השתל לחלל התת-רשתית. הערכה לאחר הניתוח של המיקום התת-רשתית של השתל כוללת הדמיה על ידי טומוגרפיה קוהרנטית אופטית בתחום הספקטרלי (SD-OCT). מעקבי הדמיה מוודאים את היציבות התת-רשתית של השתל, לפני שהעיניים נקצרות ומקובעות לניתוח היסטולוגי.
ניוון מקולרי הקשור לגיל (AMD) הוא גורם מוביל לעיוורון ברחבי העולם. מספר האנשים שנפגעו מ-AMD בשנת 2020 נאמד ב-196 מיליון, וזה צפוי לגדול לכ-288 מיליון עד 20401. במהלך העשור האחרון, פותחו מספר טיפולים כדי להפחית את השינויים החזותיים הקשורים לשלבים המאוחרים של AMD, בעיקר כדי לטפל בהתפתחות והתקדמות הניאו-וסקולריזציה הכורואידית שנצפתה ב-AMD רטוב. לעומת זאת, הטיפול ב-AMD יבש, שבו תפקוד לקוי ואובדן של תאי אפיתל פיגמנט ברשתית (RPE) מתקדמים ל-RPE וניוון רשתית, הוערך כאחראי ל-85% עד 90% מ-AMD, עם שכיחות של 0.44% ברחבי העולם 1,2. AMD תוארה כמחלה רב-גורמית עם גורמי גיל, גנטיקה וסביבה התורמים להופעת המחלה והתקדמותה; מספר טיפולים נמצאים בפיתוח כדי לטפל במסלולים הפתופיזיולוגיים השונים הקשורים למחלה זו3.
טיפול מבוסס תאי גזע פותח כאופציה טיפולית חדשה להחלפת ה-RPE הכושל ב-AMD4 יבש. למרות שהשימוש בתאי גזע פלוריפוטנטיים עדיין נמצא בניסויים קליניים מוקדמים, הבטיחות הוכחה במספר ניסויים קליניים 5,6,7. נכון להיום, ישנם שני מסלולים עיקריים לפריסת תאי גזע בחלל התת-רשתית: השעיה או החדרת מדבקה חד-שכבתית שנזרעה על שתל תואם ביולוגית 8,9,10,11,12. אסטרטגיות חדשות המשתמשות בטיפולים מבוססי תאי גזע במחקרים פרה-קליניים דורשות מודלים של בעלי חיים שבהם ניתן להעביר את הטיפולים המבוססים על תאי גזע לאותו אתר ממוקד כפי שתוכנן בבני אדם. ההבדל באנטומיה עשוי לחייב שינויים קלים בהליכים, בציוד הכירורגי ובגישה בהשוואה לאלה ששימשו במוצר האנושי הסופי13,14. שינוי הטכניקות הכירורגיות של העיניים הוא אחד השינויים הנדרשים שתוארו באופן נרחב כגישה מוצלחת לשימוש במודלים שונים של בעלי חיים 15,16,17.
למרות שפרסומים קודמים הזכירו טכניקות כירורגיות לשתלים תת-רשתית בחולדות, אין תיאורים מקיפים של טכניקות כאלה כדי להתגבר על הקשיים הטכניים שחוקרים עלולים להיתקל בהם. לכן, יש צורך לתאר כראוי את הטכניקות הכירורגיות בפירוט, לספק שיטות עבודה מומלצות ולקחים שיש להימנע מהם, ובמידת הצורך לטפל בבעיות במהלך שלבים קריטיים לאורך ההליך. מטרת כתב יד זה היא לספק הנחיה מקיפה להשתלה כירורגית של השתל בחלל התת-רשתית בחולדות.
כל הניסויים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת דרום קליפורניה (IACUC) ובוצעו בהתאם למדריך המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) לטיפול ושימוש בחיות מעבדה והצהרת האגודה לחקר ראייה ורפואת עיניים (ARVO) לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וראייה. בסך הכל נעשה שימוש ב-12 חולדות זכרות של הקולג' המלכותי לכירורגיה (RCS) במחקר הנוכחי. בעלי החיים גודלו במתקן בעלי החיים ונכללו במחקר לאחר שהגיעו לגיל 28 ± יום אחד לאחר הלידה. בוצעה בדיקת עיניים מלאה כדי לוודא את היעדר חריגות בעיניים. השתלים התת-רשתיים, ממברנות אולטרה-דקות העשויות מפארילן C ומצופות בוויטרונקטין, תוכננו על ידי ארגון מסחרי ספציפי (ראה טבלת חומרים). ממברנות אלו משכפלות ממברנות בגודל אנושי מבחינת העובי והחדירות שלהן (מסגרת רשת בעובי 6.0 מיקרומטר עם נקבוביות עגולות של 20 מיקרומטר באזורים האולטרה-דקים). מזעור האורך והרוחב (1.0 מ"מ × 0.4 מ"מ) מממברנות בגודל אנושי הושג כדי להתאים את השתלים התת-רשתית בתוך עיני המכרסמים18.
1. טיפול בבעלי חיים והכנה כירורגית
2. גישה סקלרלית להשתלה תת-רשתית: טכניקה כירורגית
3. הדמיית SD-OCT
4. התאוששות בעלי חיים
השתלת שתל תת-רשתית בחולדות RCS (N = 12) הדגימה את ההיתכנות והשחזור של הטכניקה הכירורגית ללידה תת-רשתית בחולדות. במחקר זה, העין הימנית הייתה העין המטופלת (N = 12) עם השתל. בהערכה הקלינית שבוצעה בתום ההליך באמצעות המיקרוסקופ הכירורגי, תשע מתוך 12 העיניים שטופלו הדגימו לוקליזציה תת-רשתית של השתל (75.00%), שתי עיניים (16.67%) זוהו כמיקום תוך רשתית של השתל, ובעין אחת (8.33%) הדמיה ישירה לא התאפשרה עקב אטימות מדיה הנגרמת מדימום תת-רשתית באזור הניתוח, עם תצוגה מוגבלת של מבני השתל והרשתית (טבלה 1). סריקות SD-OCT שבוצעו מיד לאחר ההליך הכירורגי הדגימו את המיקום התת-רשתית או התוך-רשתית של השתל (10 [83.33%] ואחד [8.33%], בהתאמה) (איור 1A). SD-OCT לא הצליח לזהות לחלוטין את מיקום השתל תת-רשתית באותה חיה (n = 1) עם אטימות מדיה שתוארה לעיל (הדמיה ישירה אינה אפשרית), גם לאחר מעקב של 10 ימים. איור 1B,C מראה שתי חיות שונות עם שתל שממוקם כראוי בחלל התת-רשתית. לא היו סיבוכים כירורגיים אחרים הקשורים לטכניקה הניתוחית. על ידי צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E), נצפה אימות של המיקום התת-רשתית של השתל (איור 1D).
איור 1: סריקות טומוגרפיה קוהרנטיות אופטית בתחום ספקטרלי (SD-OCT) בשבוע לאחר ההשתלה לאחר הניתוח. (A) תמונת אינפרא אדום של השתל התת-רשתית. הקו הירוק תוחם את החתך המוצג ב-(B). סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר. (B,C) שני בעלי חיים שונים עם שתל הממוקם כראוי בחלל התת-רשתית (חיצים שחורים). קצה השתל מצביע לכיוון עצב הראייה (ראש חץ שחור). 1 = שכבת סיבי עצב רשתית/תאי גנגליון, 2 = שכבת פרספקס פנימית, 3 = שכבה חיצונית פנימית, 4 = שכבת פרספקס חיצונית ו-5 = שכבה גרעינית חיצונית. סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר. (D) חתך היסטולוגיה צבוע ב-H&E כדי להדגים את ההשתלה התת-רשתית של קרום הפארילן (חץ לבן). ראש החץ מראה את אחת המיקרו-נקבוביות באזורים האולטרה-דקים. 1 = שכבת סיבי עצב רשתית/תאי גנגליון, 2 = שכבת פרספקס פנימית, 3 = שכבה חיצונית פנימית, 4 = שכבת פרספקס חיצונית ו-5 = שכבה גרעינית חיצונית. סרגל קנה מידה: 20 מיקרומטר. הגדלה: פי 20. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.
הערכה קלינית | SD-OCT | |||||
נושא | SR | IR | ידוע | SR | IR | ידוע |
1 | X | X | ||||
2 | X | X | ||||
3 | X | X | ||||
4 | X | X | ||||
5 | X | X | ||||
6 | X | X | ||||
7 | X | X | ||||
8 | X | X | ||||
9 | X | X | ||||
10 | X | X | ||||
11 | X | X | ||||
12 | X | X | ||||
9 | 2 | 1 | 10 | 1 | 1 | |
75.00% | 16.67% | 8.33% | 83.33% | 8.33% | 8.33% |
טבלה 1: השוואה של ממצאי העיניים בין הערכות קליניות להדמיית SD-OCT בקרב כל בעלי החיים. קיצורים: SR = תת-רשתית, IR = תוך-רשתית, ו-SD-OCT = טומוגרפיה קוהרנטית אופטית של תחום ספקטרלי.
למרות שההליך תואר בעבר בשינויים קלים, היקף כתב היד הזה הוא לספק תיאור מקיף של הליך כירורגי לשתלים תת-רשתית בחולדות שיש לעקוב אחריו תוך כדי לימוד הטכניקה ולהתגבר על האתגרים הכירורגיים והסיבוכים הפוטנציאליים שהחוקרים עלולים להיתקל בהם. הפרוטוקול הכירורגי המתואר כאן כולל שימוש בקרום הפארילן האולטרה-דק שנמצא בשימוש נרחב במעבדה שלנו מזה מספר שנים 9,10,16,18. עם זאת, יכולת השחזור של הטכניקה באמצעות מזרקים וחומרים שונים המושתלים בחלל התת-רשתית נצפתה 18,19.
גישה סקלרלית להשתלת התקנים תת-רשתית אינה מוגבלת לטיפולים מבוססי תאי גזע; הליכי השתלת רשתית במודלים של בעלי חיים קטנים תוארו גםהם 20,21. בתחום הגירוי החשמלי ברשתית, הליך כירורגי זה לשתלים תת-רשתית בחולדות נמצא בשימוש כבר יותר מעשור22. לאחרונה, Ho et al.23 השתילו מערך לגירוי רשתית החולדה, ותומס ואחרים 24 השתמשו באורגנואידים ברשתית כמקור לתאי גזע. כפי שהוזכר קודם לכן, טיפולים מבוססי תאי גזע פורסמו היטב, כולל פרסומים על השתלה כירורגית של שתלים תואמים ביולוגית שנזרעו בתאי גזע4. ישנן וריאציות קלות בגישות הכירורגיות המתוארות על ידי מחברים שונים, אשר יידונו וישוו לטכניקה הכירורגית המתוארת בכתב יד זה.
סגירה סקלרלית ומכשור כירורגי דורשים דיון נוסף. ישנן שתי גישות נפוצות לניהול חתך סקלרלי: (1) סגירה עם תפר ו-(2) סגירה ללא תפר. מספר מחברים משתמשים בניילון 10-0 כדי לסגור את החתך הסקלרלי עם תפר כחלק מההליך הרגיל שלהם 23,25,26,27. עם זאת, קבוצות אחרות (כולל שלנו) מצאו שתפר ניילון 10-0 אינו נדרש28. אלה התומכים בסגירה עם התפר טוענים שהשתל התת-רשתית יחליק החוצה מהחתך בעין אם אין תפר. כפי שמתואר בסעיף התוצאות, המחקר הנוכחי לא מצא שחול של השתל או הרקמה התוך עינית לאורך כל החתך. גישה כירורגית זו ללא התפר שימשה במעבדה שלנו באופן שגרתי ומוצלח 9,10,12,13,16. ההצדקה לגישה ללא תפרים מסתמכת על שני גורמים: ראשית, שילוב של מיקום החתך ותצורתו מספק מספיק מבנה כדי ליצור חתך איטום עצמי. יש לזכור כי תצורה נכונה של מנהרת הסקלר היא צעד שהחוקרים ישיגו בתרגול. שנית, הלחץ התוך עיני עולה ברגע שהמתיחה משתחררת, ושומר על השתל במקומו. הלחץ התוך עיני המוגבר מביא לכך שהרשתית נדחפת כנגד החתך, מקרבת את שני הדשים הסקלריאליים זה לזה וגורמת לחתך אוטם את עצמו. לכן, אין צורך בתפר. יש לציין שאורך החתך הוא עד 1.5 מ"מ בלבד. במקרים בהם החתך הניתוחי דורש פצע גדול יותר או אם לא מושגת תצורת תעלה סקלרלית תקינה, תפר ניילון 10-0 הוא פתרון סביר. הטכניקה הנוכחית אמינה ביותר אם משתמשים בה עם המכשור הכירורגי המומלץ. חלק מהמחברים השתמשו במזרקים מותאמים אישית עבור השתלים שלהם, מה שמשנה את גודל החתך ומביא לצורך להשתמש בתפר סקלרלי לסגירה נכונה 25,29. עם זאת, מניסיוננו, שימוש בחומרים ומזרקים שונים הביא להגדלת אורך החתך (~0.5 מ"מ)18,19. עדיין לא ראינו חוסר יציבות או סיבוכים הקשורים לחתך סקלרלי גדול יותר, ולא היה צורך בתפר. עם זאת, שימוש במכשור מחוץ להנחיות אלה במהלך ההליך יכול להיחשב כמגבלה של טכניקה זו.
שלב קריטי נוסף שכמעט ולא הוזכר בפרסומים קודמים הוא הפרצנטזיס להפחתת הלחץ התוך עיני (IOP) לפני יצירת ה-RD המוקד והזרקת השתל לחלל התת-רשתית 4,10,13,15. הפחתת ה-IOP מספקת שליטה טובה יותר על המבנים התוך עיניים תוך ניתוק הרשתית ומונעת שחול של התוכן התוך עיני, מה שמוביל להליך לא מוצלח. יתרון נוסף הקשור לעין היפוטונית, הוא הפחתת ההתנגדות בעת הזרקת השתל דרך החתך הסקלרלי, מה שמביא לפחות נזק לשתל עצמו. מצד שני, IOP נמוך נוטה לדימום עיני מוגבר בחתך הניתוח. כמויות גדולות של דם בחתך הסקלרי מסתירות את הנוף ומגבירות את הסיכון להעברת דם לחלל התת-רשתית במהלך ההשתלה התת-רשתית. אנו ממליצים לשלוט בדימום באמצעות החלפות כותנה ו-BSS כדי לנקות את האזור ולמנוע סיבוכים כירורגיים.
ראוי להזכיר כי גודל ה-RD חשוב למיקום נכון של השתל בחלל התת-רשתית. בניגוד למודלים אחרים של בעלי חיים ובני אדם 5,14,30, מכיוון שגישה סקלרלית זו אינה מספקת הדמיה ישירה של המרחב התת-רשתית, קשה יותר ליצור RD מוקדי. כדי לספק מספיק מקום לפריסת השתל בעדינות לחלל התת-רשתית מבלי למקם מחוץ לאזור זה, ההמלצה היא להזריק 100 μLof BSS. המלצה זו מבוססת על יצירת RD של לפחות רבע אחד של הרשתית. אם נוצר RD קטן מרבע אחד לפחות של הרשתית, השתל יוזרק באופן שגוי לחלל התוך-זגוגי, התוך-רשתית או הסופרכורואידי. כפי שמתואר לאורך הפרוטוקול, אם נצפה RD קטן, מומלץ לחזור על שלבים 2.2.4 עד 2.2.8 עד להשגת ה-RD הרצוי.
רוב הסיבוכים הכירורגיים והשלבים הקריטיים שנדונו בכתב היד עלולים להתרחש במהלך עקומת הלמידה, מה שעלול לפגוע בהצלחת ההשתלה התת-רשתית. עקומת למידה זו כוללת גם את משך הזמן שבעלי החיים נשארים תחת הרדמה ואת רמת ההתייבשות. זמן הרדמה ארוך יותר, חומרי הרדמה והתייבשות עלולים להוביל לסיבוכים בעין יבשה, כגון שינויים בקרנית, בעדשה ובסקלרל31. בנוסף, חומרי הרדמה, כגון קטמין וקסילזין, נקשרו לאטימות מדיה בקרנית ובעדשה יחד עם שינויים בהרכב ההומור המימי32. שימוש בטיפות עיניים סיכה (BSS) על העין הניתוחית לאורך כל זמן ההרדמה מטפל בסיבוכים אלה. לסיכום, המתודולוגיה המתוארת בכתב יד זה נועדה לשמש כהמלצה כירורגית בפיתוח טיפולים תת-רשתית בעיני חולדות.
M.S.H., D.R.H. ו-J.L. הם מייסדים ויועצים שותפים ל-Regenerative Patch Technologies (RPT). המחברים האחרים מאשרים כי אין להם קשרים או מעורבות בארגון או ישות כלשהם בעלי אינטרס כספי או לא פיננסי כלשהו בנושא או בחומרים הנדונים בכתב יד זה.
מחקר זה נתמך על ידי CIRM DT3 (MSH) ומחקר למניעת עיוורון (מכון העיניים USC Roski). אנו רוצים להודות לפרננדו גלארדו ולד"ר יינג ליו על הסיוע הטכני שלהם.
לנותן החסות לא היה כל תפקיד בתכנון או בביצוע מחקר זה.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1 cc syringe | VWR | BD309659 | |
27 G needle 1/2'' | VWR | BD305109 | |
30 G needle 1/2'' | VWR | BD305106 | |
32 G Blunt needle - Small hub RN | Hamilton | 7803-04 | |
4-0 Perma Hand silk black 1X18" PC-5 | Ethicon | 1984G | |
6'' sterile cotton tips | VWR | 10805-154 | |
Betadine 5% sterile ophthalmic prep solution | Alcon | 8007-1 | |
BSS irrigating solution 15 mL | Accutome | Ax17362 | |
Buprenorphine ER | ZooPharm | N/A | |
Castroviejo Caliper | Storz | E2405 | |
Castroviejo suturing forceps 0.12 mm | Storz | E1796 | |
Clayman-Vannas scissors straight | Storz | E3383S | |
Cover glass, square | WVR | 48366-227 | |
EPS Polystyrene block | Silverlake LLC | CFB8x12x2 | |
Gonak 15 mL | Accutome | Ax10968 | Eye lubricant |
Halstead straight hemostatic mosquito forceps non-magnetic | Storz | E6772 | |
Hamilton syringe 700 series 100 µL | Hamilton | 7638-01 | |
HEYEX Software | Heidelberg | N/A | an image management software |
Kelman-McPherson tying forceps angled | Storz | E1815 AKUS | |
Ketamine (100 mg/mL) | MWI | 501072 | |
Needle holder 9mm curved fine locking | Storz | 3-302 | |
Neomycin/Polymyxin B sulfactes/Bacitracin zinc ointment 3.5 g | Accutome | Ax0720 | |
Ophthalmic surgical microscope | Zeiss | SN: 233922 | |
Phenylephrine 2.5% 15 mL | Accutome | Ax0310 | |
Spectralis SD-OCT | Heidelberg | SPEC-CAM-011210s3600 | |
Sterile Drape | VWR | 100229-300 | |
Sterile surgical gloves | VWR | 89233-804 | |
T-Pump heating system | Gaymar | TP650 | |
Tropicamide 1% 15 mL | Accutome | Ax0330 | |
Ultrathin membranes made from Parylene C and coated with vitronectin | Mini Pumps LLC, CA | specifically designed for this study | used as subretinal implants |
Xylazine (100 mg/mL) | MWI | 510650 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved