Method Article
يصف البروتوكول الحالي نهج الصلبة لزرع الجهاز تحت الشبكية ، وهي تقنية جراحية مجدية للتنفيذ في النماذج الحيوانية لأمراض الشبكية في البحث.
يعد تنكس الشبكية ، مثل التنكس البقعي المرتبط بالعمر (AMD) ، سببا رئيسيا للعمى في جميع أنحاء العالم. تم اتباع عدد لا يحصى من الأساليب لتطوير علاجات قائمة على الطب التجديدي ل AMD ، بما في ذلك العلاجات القائمة على الخلايا الجذعية. تعتبر القوارض كنماذج حيوانية لتنكس الشبكية أساسا للأبحاث الانتقالية ، نظرا لمجموعة واسعة من السلالات التي تطور أمراض تنكس الشبكية في مراحل مختلفة. ومع ذلك ، فإن تقليد التوصيل العلاجي البشري للغرسات تحت الشبكية في القوارض يمثل تحديا ، بسبب الاختلافات التشريحية مثل حجم العدسة وحجم الجسم الزجاجي. يهدف هذا البروتوكول الجراحي إلى توفير طريقة موجهة لزرع الغرسات في الفضاء تحت الشبكية في الفئران. تم تضمين وصف شامل سهل الاستخدام للخطوات الحاسمة. تم تطوير هذا البروتوكول كإجراء جراحي فعال من حيث التكلفة للتكاثر عبر الدراسات قبل السريرية المختلفة في الفئران. مطلوب التصغير المناسب للغرسة بحجم الإنسان قبل إجراء التجربة الجراحية ، والتي تتضمن تعديلات على أبعاد الزرع. يتم استخدام نهج خارجي بدلا من الإجراء داخل الجسم الزجاجي لتوصيل الغرسة إلى الفضاء تحت الشبكية. باستخدام إبرة حادة صغيرة ، يتم إجراء شق صلبي في الربع العلوي الصدغي ، يليه بزل للنظر لتقليل ضغط العين ، وبالتالي تقليل المقاومة أثناء الزرع الجراحي. بعد ذلك ، يتم إجراء حقن محلول ملح متوازن (BSS) من خلال الشق لتحقيق انفصال الشبكية البؤري (RD). أخيرا ، يتم إدخال وتصور الغرسة في الفضاء تحت الشبكية. يشمل التقييم بعد الجراحة لموضع الغرسة تحت الشبكية التصوير عن طريق التصوير المقطعي البصري للمجال الطيفي (SD-OCT). تتأكد المتابعة التصويرية من استقرار تحت الشبكية للغرسة ، قبل حصاد العينين وتثبيتها للتحليل النسيجي.
يعد التنكس البقعي المرتبط بالعمر (AMD) سببا رئيسيا للعمى في جميع أنحاء العالم. قدر عدد الأشخاص المصابين ب AMD في عام 2020 ب 196 مليون ، ومن المتوقع أن يرتفع هذا إلى حوالي 288 مليونا بحلول عام 20401. على مدى العقد الماضي ، تم تطوير العديد من العلاجات للتخفيف من التغيرات البصرية المرتبطة بالمراحل المتأخرة من AMD ، بشكل أساسي لعلاج تطور وتطور الأوعية الدموية المشيمية الجديدة التي لوحظت في AMD الرطب. على العكس من ذلك ، فإن علاج AMD الجاف ، حيث يتطور الخلل الوظيفي وفقدان خلايا ظهارة صبغة الشبكية (RPE) إلى RPE وضمور الشبكية ، يمثل 85٪ إلى 90٪ من AMD ، مع انتشار 0.44٪ في جميع أنحاء العالم1،2. تم وصف AMD بأنه مرض متعدد العوامل مع العمر والعوامل الوراثية والبيئية التي تساهم في ظهور المرض وتطوره. هناك العديد من العلاجات قيد التطوير لمعالجة المسارات الفيزيولوجية المرضية المختلفة المرتبطة بهذاالمرض 3.
تم تطوير العلاج القائم على الخلايا الجذعية كخيار علاجي جديد لاستبدال RPE الفاشل في AMD4 الجاف. على الرغم من أن استخدام الخلايا الجذعية متعددة القدرات لا يزال في التجارب السريرية المبكرة ، فقد تم إثبات السلامة في العديد من التجارب السريرية5،6،7. حتى الآن ، هناك طريقان رئيسيان لنشر الخلايا الجذعية في الفضاء تحت الشبكية: تعليق أو إدخال رقعة أحادية الطبقة مصنفة على غرسة متوافقةحيويا 8،9،10،11،12. تتطلب الاستراتيجيات الجديدة التي تستخدم العلاجات القائمة على الخلايا الجذعية في الدراسات قبل السريرية نماذج حيوانية حيث يمكن توصيل العلاجات القائمة على الخلايا الجذعية إلى نفس الموقع المستهدف كما هو مقصود في البشر. قد يتطلب الاختلاف في علم التشريح تغييرات طفيفة في الإجراءات والمعدات الجراحية والنهج مقارنة بتلك المستخدمة مع المنتج البشري النهائي13،14. يعد تعديل تقنيات جراحة العين أحد التغييرات المطلوبة التي تم وصفها على نطاق واسع بأنها نهج ناجح للاستخدام عبر نماذج حيوانية مختلفة15،16،17.
على الرغم من أن المنشورات السابقة قد ذكرت التقنيات الجراحية لزراعة تحت الشبكية في الفئران ، إلا أنه لا توجد أوصاف شاملة لمثل هذه التقنيات للتغلب على الصعوبات التقنية التي قد يواجهها الباحثون. لذلك ، هناك حاجة لوصف التقنيات الجراحية بشكل صحيح بالتفصيل ، وتقديم أفضل الممارسات والدروس المستفادة لتجنب المشكلات ، وإذا لزم الأمر ، معالجة المشكلات أثناء الخطوات الحرجة طوال الإجراء. الغرض من هذه المخطوطة هو توفير إرشادات شاملة للزرع الجراحي للغرسة في الفضاء تحت الشبكية في الفئران.
تمت الموافقة على جميع التجارب من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام بجامعة جنوب كاليفورنيا (IACUC) وتم إجراؤها وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) لرعاية واستخدام المختبر وبيان جمعية البحوث في الرؤية وطب العيون (ARVO) لاستخدام في أبحاث طب العيون والرؤية. تم استخدام ما مجموعه 12 من ذكور الجرذان من الكلية الملكية للجراحين (RCS) في هذه الدراسة. تم تربية في منشأة وتم تضمينها في الدراسة بمجرد بلوغها سن 28 ± 1 يوم بعد الولادة. تم إجراء فحص كامل للعين للتحقق من عدم وجود تشوهات في العين. تم تصميم الغرسات تحت الشبكية ، وهي أغشية رقيقة للغاية مصنوعة من الباريلين C ومغلفة بفيتامين برونكتين ، من قبل منظمة تجارية محددة (انظر جدول المواد). تكرر هذه الأغشية أغشية بحجم الإنسان من حيث سمكها ونفاذيتها (إطار شبكي بسمك 6.0 ميكرومتر مع مسام دائرية 20 ميكرومتر في المناطق فائقة النحافة). تم تصغير الطول والعرض (1.0 مم × 0.4 مم) من أغشية بحجم الإنسان لاستيعاب الغرسات تحت الشبكية داخل عيون القوارض18.
1. رعاية والتحضير الجراحي
2. نهج الصلبة لزرع تحت الشبكية: تقنية جراحية
3. تصوير SD-OCT
4. استعادة
أظهر زرع غرسة تحت الشبكية في فئران RCS (N = 12) جدوى وقابلية استنساخ التقنية الجراحية للولادة تحت الشبكية في الفئران. في هذه الدراسة ، كانت العين اليمنى هي العين المعالجة (N = 12) مع الزرع. في التقييم السريري الذي تم إجراؤه في نهاية الإجراء باستخدام المجهر الجراحي ، أظهرت تسعة من العيون ال 12 المعالجة توطين تحت الشبكية للزرع (75.00٪) ، وتم تحديد عينين (16.67٪) على أنهما وضعان داخل الشبكية للزرع ، وفي عين واحدة (8.33٪) لم يكن التصور المباشر ممكنا بسبب عتامة الوسائط الناجمة عن نزيف تحت الشبكية في المنطقة الجراحية ، مع رؤية محدودة لكل من الزرع وهياكل الشبكية (الجدول 1). أظهرت فحوصات SD-OCT التي تم إجراؤها مباشرة بعد الإجراء الجراحي وضع تحت الشبكية أو داخل الشبكية للغرسة (10 [83.33٪] وواحد [8.33٪] ، على التوالي) (الشكل 1 أ). لم يتمكن SD-OCT من تحديد موضع الغرسة بشكل كامل تحت الشبكية في نفس (ن = 1) مع عتامة الوسائط الموضحة أعلاه (التصور المباشر غير ممكن) ، حتى بعد متابعة لمدة 10 أيام. يوضح الشكل 1 ب ، ج حيوانين مختلفين مع غرسة موضوعة بشكل صحيح في الفضاء تحت الشبكية. لم تكن هناك مضاعفات جراحية أخرى مرتبطة بالتقنية الجراحية. من خلال تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين (H & E) ، لوحظ التحقق من وضع الشبكية تحت القناة للغرسة (الشكل 1 د).
الشكل 1: التصوير المقطعي البصري للمجال الطيفي (SD-OCT) في أسبوع واحد بعد الزرع الجراحة. (أ) صورة الأشعة تحت الحمراء للغرسة تحت الشبكية. يحدد الخط الأخضر المقطع العرضي الموضح في (ب). شريط المقياس: 200 ميكرومتر (B ، C) حيوانان مختلفان مع غرسة موضوعة بشكل صحيح في الفضاء تحت الشبكية (أسهم سوداء). يشير طرف الغرسة نحو العصب البصري (رأس السهم الأسود). 1 = الألياف العصبية الشبكية / طبقة الخلايا العقدية ، 2 = طبقة الضفيرة الداخلية ، 3 = الطبقة الخارجية الداخلية ، 4 = طبقة الضفيرة الخارجية ، و 5 = الطبقة النووية الخارجية. شريط المقياس: 200 ميكرومتر (د) قسم الأنسجة ملطخ ب H & E لإثبات الزرع تحت الشبكية لغشاء الباريلين (السهم الأبيض). يظهر رأس السهم أحد المسام الدقيقة في المناطق فائقة النحافة. 1 = الألياف العصبية الشبكية / طبقة الخلايا العقدية ، 2 = طبقة الضفيرة الداخلية ، 3 = الطبقة الخارجية الداخلية ، 4 = طبقة الضفيرة الخارجية ، و 5 = الطبقة النووية الخارجية. شريط المقياس: 20 ميكرومتر. التكبير: 20x. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
التقييم السريري | SD-أكتوبر | |||||
موضوع | ريال | الاشعه تحت الحمراء | مجهول | ريال | الاشعه تحت الحمراء | مجهول |
1 | X | X | ||||
2 | X | X | ||||
3 | X | X | ||||
4 | X | X | ||||
5 | X | X | ||||
6 | X | X | ||||
7 | X | X | ||||
8 | X | X | ||||
9 | X | X | ||||
10 | X | X | ||||
11 | X | X | ||||
12 | X | X | ||||
9 | 2 | 1 | 10 | 1 | 1 | |
75.00% | 16.67% | 8.33% | 83.33% | 8.33% | 8.33% |
الجدول 1: مقارنة النتائج العينية بين التقييمات السريرية وتصوير SD-OCT بين جميع. الاختصارات: SR = تحت الشبكية ، IR = داخل الشبكية ، و SD-OCT = التصوير المقطعي البصري للتماسك البصري في المجال الطيفي.
على الرغم من أن الإجراء قد تم وصفه سابقا باختلافات طفيفة ، إلا أن نطاق هذه المخطوطة هو تقديم وصف شامل للإجراء الجراحي لزراعة تحت الشبكية في الفئران التي يجب اتباعها أثناء تعلم التقنية والتغلب على التحديات الجراحية والمضاعفات المحتملة التي قد يواجهها الباحثون. يتضمن البروتوكول الجراحي الموضح هنا استخدام غشاء الباريلين الرقيق للغاية الذي تم استخدامه على نطاق واسع في مختبرنا لعدة سنوات9،10،16،18. ومع ذلك ، فقد لوحظت قابلية تكرار التقنية باستخدام حاقنات ومواد مختلفة مزروعة في الفضاء تحت الشبكية18،19.
لا يقتصر نهج الصلبة لزرع الجهاز تحت الشبكية على العلاجات القائمة على الخلايا الجذعية. كما تم وصف إجراءات زرع الشبكية في نماذج الصغيرة20،21. في مجال التحفيز الكهربائي للشبكية ، تم استخدام هذا الإجراء الجراحي لزراعة تحت الشبكية في الفئران لأكثر من عقدمن الزمان 22. في الآونة الأخيرة ، قام Ho et al.23 بزرع مجموعة لتحفيز شبكية العين ، واستخدم Thomas et al.24 عضيات شبكية العين كمصدر للخلايا الجذعية. كما ذكرنا سابقا ، تم نشر العلاجات القائمة على الخلايا الجذعية بشكل جيد ، بما في ذلك المنشورات حول الزرع الجراحي للغرسات المتوافقة حيويا المصنفة بالخلايا الجذعية4. هناك اختلافات طفيفة في الأساليب الجراحية التي وصفها مؤلفون مختلفون ، والتي سيتم مناقشتها ومقارنتها بالتقنية الجراحية الموضحة في هذه المخطوطة.
يتطلب إغلاق الصلبة والأجهزة الجراحية مناقشات إضافية. هناك طريقتان شائعتان لإدارة شق الصلبة: (1) الإغلاق بخياطة و (2) الإغلاق بدون خياطة. يستخدم العديد من المؤلفين 10-0 نايلون لإغلاق شق الصلبة بخياطة كجزء من إجراءاتهم المعتادة23،25،26،27. ومع ذلك ، وجدت مجموعات أخرى (بما في ذلك مجموعتنا) أن خياطة النايلون 10-0 ليستمطلوبة 28. يجادل أولئك الذين يدعمون الإغلاق بالخياطة بأن الغرسة تحت الشبكية ستنزلق من شق العين إذا لم يكن هناك خياطة. كما هو موضح في قسم النتائج ، لم تجد الدراسة الحالية بثق الغرسة أو الأنسجة داخل العين في جميع أنحاء الشق. تم استخدام هذا النهج الجراحي بدون خياطة في مختبرنا بشكل روتيني وناجح9،10،12،13،16. يعتمد تبرير نهج عدم الخياطة على عاملين: أولا ، يوفر الجمع بين موقع الشق وتكوينه بنية كافية لإنشاء شق ذاتي الإغلاق. يجب أن يؤخذ في الاعتبار أن التكوين الصحيح للنفق الصلبي هو خطوة سيحققها المحققون من خلال الممارسة. ثانيا ، يزداد ضغط العين بمجرد تحرير الجر ، مما يحافظ على الغرسة في مكانها. يؤدي الضغط المتزايد داخل العين إلى دفع شبكية العين ضد الشق ، مما يجعل كلا اللوحات الصلبية قريبة من بعضها البعض وعمل شق ذاتي الإغلاق. لذلك ، ليست هناك حاجة إلى خياطة. وتجدر الإشارة إلى أن طول الشق يصل إلى 1.5 مم فقط. في الحالات التي يتطلب فيها الشق الجراحي جرحا أكبر أو إذا لم يتم تحقيق تكوين نفق صلبي مناسب ، فإن خياطة النايلون 10-0 هي حل معقول. التقنية الحالية موثوقة للغاية إذا تم استخدامها مع الأجهزة الجراحية الموصى بها. استخدم بعض المؤلفين عن طريق الحقن المخصصة لغرساتهم ، مما يعدل حجم الشق ويؤدي إلى الحاجة إلى استخدام خياطة صلبية للإغلاق المناسب25،29. ومع ذلك ، من خلال تجربتنا ، أدى استخدام مواد وحاقن مختلفة إلى زيادة طول الشق (~ 0.5 مم) 18،19. ما زلنا لم نلاحظ عدم الاستقرار أو المضاعفات المرتبطة بشق صلبي أكبر ، ولم تكن هناك حاجة إلى خياطة. ومع ذلك، يمكن اعتبار استخدام الأجهزة خارج هذه الإرشادات أثناء الإجراء قيدا لهذه التقنية.
خطوة أخرى حاسمة نادرا ما تمت الإشارة إليها في المنشورات السابقة هي بزل الرحمن لتقليل ضغط العين (IOP) قبل إنشاء RD البؤري وحقن الغرسة في الفضاء تحت الشبكية4،10،13،15. يوفر تقليل IOP تحكما أفضل في الهياكل داخل العين أثناء فصل الشبكية ويتجنب بثق المحتوى داخل العين ، مما يؤدي إلى إجراء غير ناجح. ميزة أخرى مرتبطة بالعين منخفضة التوتر هي تقليل المقاومة أثناء حقن الغرسة من خلال شق الصلبة ، مما يؤدي إلى تقليل الضرر للغرسة نفسها. من ناحية أخرى ، فإن انخفاض IOP عرضة لزيادة نزيف العين عند الشق الجراحي. تحجب كميات كبيرة من الدم عند شق الصلبة الرؤية وتزيد من خطر نقل الدم إلى الحيز تحت الشبكية أثناء الانغراس تحت الشبكية. نوصي بالسيطرة على النزيف باستخدام مقايضات القطن و BSS لتنظيف المنطقة وتجنب المضاعفات الجراحية.
من الجدير بالذكر أن حجم RD مهم لوضع الغرسة بشكل صحيح في الفضاء تحت الشبكية. على عكس النماذج الحيوانية الأخرى والبشر5،14،30 ، نظرا لأن هذا النهج الصلبي لا يوفر تصورا مباشرا للمساحة تحت الشبكية ، فمن الصعب إنشاء RD بؤري. لتوفير مساحة كافية لنشر الغرسة برفق في الفضاء تحت الشبكية دون وضعها خارج هذه المنطقة ، فإن التوصية هي حقن 100 ميكرولتر من BSS. تستند هذه التوصية إلى توليد RD من ربع واحد على الأقل من شبكية العين. إذا تم إنشاء RD أصغر من ربع واحد على الأقل من شبكية العين ، حقن الغرسة بشكل غير صحيح في الفضاء داخل الجسم الزجاجي أو داخل الشبكية أو فوق الشبكية. كما هو موضح في جميع أنحاء البروتوكول ، إذا لوحظ RD صغير ، يوصى بتكرار الخطوات 2.2.4 إلى 2.2.8 حتى يتم تحقيق RD المطلوب.
قد تحدث معظم المضاعفات الجراحية والخطوات الحرجة التي تمت مناقشتها في المخطوطة أثناء منحنى التعلم ، مما قد يضر بنجاح عملية زرع تحت الشبكية. يتضمن منحنى التعلم هذا أيضا مقدار الوقت الذي تبقى فيه تحت التخدير ومستوى الجفاف. يمكن أن يؤدي وقت التخدير الأطول والتخدير والجفاف إلى مضاعفات جفاف العين ، مثل تغيرات القرنية والعدسة والصلبة31. بالإضافة إلى ذلك ، ارتبطت التخدير ، مثل الكيتامين والزيلازين ، بعتامة الوسائط في القرنية والعدسة جنبا إلى جنب مع التغييرات في تكوين الفكاهة المائية32. يعالج استخدام قطرات العين المزلقة (BSS) على العين الجراحية طوال فترة التخدير هذه المضاعفات. باختصار ، من المفترض أن تستخدم المنهجية الموضحة في هذه المخطوطة كتوصية جراحية في تطوير العلاجات تحت الشبكية في عيون الفئران.
M.S.H. و D.R.H. و JL هم مؤسسون مشاركون ومستشارون لشركة Regenerative Patch Technologies (RPT). يشهد المؤلفون الآخرون بأنه ليس لديهم أي انتماءات أو مشاركة في أي منظمة أو كيان له أي مصلحة مالية أو غير مالية في الموضوع أو المواد التي تمت مناقشتها في هذه المخطوطة.
تم دعم هذه الدراسة من قبل CIRM DT3 (MSH) والبحث لمنع العمى (معهد USC Roski Eye Institute). نود أن نشكر فرناندو غالاردو والدكتور يينغ ليو على مساعدتهما الفنية.
لم يكن للراعي أي دور في تصميم أو إجراء هذا البحث.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1 cc syringe | VWR | BD309659 | |
27 G needle 1/2'' | VWR | BD305109 | |
30 G needle 1/2'' | VWR | BD305106 | |
32 G Blunt needle - Small hub RN | Hamilton | 7803-04 | |
4-0 Perma Hand silk black 1X18" PC-5 | Ethicon | 1984G | |
6'' sterile cotton tips | VWR | 10805-154 | |
Betadine 5% sterile ophthalmic prep solution | Alcon | 8007-1 | |
BSS irrigating solution 15 mL | Accutome | Ax17362 | |
Buprenorphine ER | ZooPharm | N/A | |
Castroviejo Caliper | Storz | E2405 | |
Castroviejo suturing forceps 0.12 mm | Storz | E1796 | |
Clayman-Vannas scissors straight | Storz | E3383S | |
Cover glass, square | WVR | 48366-227 | |
EPS Polystyrene block | Silverlake LLC | CFB8x12x2 | |
Gonak 15 mL | Accutome | Ax10968 | Eye lubricant |
Halstead straight hemostatic mosquito forceps non-magnetic | Storz | E6772 | |
Hamilton syringe 700 series 100 µL | Hamilton | 7638-01 | |
HEYEX Software | Heidelberg | N/A | an image management software |
Kelman-McPherson tying forceps angled | Storz | E1815 AKUS | |
Ketamine (100 mg/mL) | MWI | 501072 | |
Needle holder 9mm curved fine locking | Storz | 3-302 | |
Neomycin/Polymyxin B sulfactes/Bacitracin zinc ointment 3.5 g | Accutome | Ax0720 | |
Ophthalmic surgical microscope | Zeiss | SN: 233922 | |
Phenylephrine 2.5% 15 mL | Accutome | Ax0310 | |
Spectralis SD-OCT | Heidelberg | SPEC-CAM-011210s3600 | |
Sterile Drape | VWR | 100229-300 | |
Sterile surgical gloves | VWR | 89233-804 | |
T-Pump heating system | Gaymar | TP650 | |
Tropicamide 1% 15 mL | Accutome | Ax0330 | |
Ultrathin membranes made from Parylene C and coated with vitronectin | Mini Pumps LLC, CA | specifically designed for this study | used as subretinal implants |
Xylazine (100 mg/mL) | MWI | 510650 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved