Kimyasal Görüntüleme için Hiperspektral Uyarılmış Raman Saçılması ve Tutarlı Anti-Stokes Raman Saçılma Mikroskobunun Doğrudan Karşılaştırılması

Bu makale, aynı mikroskop platformuna entegre edilmiş uyarılmış Raman saçılmasının (SRS) ve tutarlı anti-Stokes Raman saçılmasının (CARS) çözünürlüğünü, hassasiyetini ve görüntüleme kontrastlarını doğrudan karşılaştırmaktadır. Sonuçlar, CARS'ın daha iyi bir uzamsal çözünürlüğe sahip olduğunu, SRS'nin daha iyi kontrastlar ve spektral çözünürlük sağladığını ve her iki yöntemin de benzer hassasiyete sahip olduğunu göstermektedir.

Uyarılmış Raman saçılması (SRS) ve tutarlı anti-Stokes Raman saçılması (CARS) mikroskobu en yaygın kullanılan tutarlı Raman saçılma görüntüleme teknolojileridir. Hiperspektral SRS ve CARS görüntüleme, her pikselde Raman spektral bilgisi sunar ve bu da farklı kimyasal bileşimlerin daha iyi ayrılmasını sağlar. Her iki teknik de iki uyarma lazeri gerektirse de, sinyal algılama şemaları ve spektral özellikleri oldukça farklıdır. Bu protokolün amacı, hem hiperspektral SRS hem de CARS görüntülemeyi tek bir platformda gerçekleştirmek ve farklı biyolojik örnekleri görüntülemek için iki mikroskopi tekniğini karşılaştırmaktır. Spektral odaklama yöntemi, femtosaniye lazerler kullanılarak spektral bilgi elde etmek için kullanılır. Standart kimyasal numuneler kullanılarak, SRS ve CARS'ın aynı uyarma koşullarında (yani, numunedeki güç, piksel bekleme süresi, objektif lens, darbe enerjisi) hassasiyeti, uzamsal çözünürlüğü ve spektral çözünürlüğü karşılaştırılır. Biyolojik örnekler için CARS ve SRS'nin görüntüleme kontrastları yan yana getirilir ve karşılaştırılır. CARS ve SRS performanslarının doğrudan karşılaştırılması, kimyasal görüntüleme için modalitenin optimal seçimine izin verecektir.

Raman saçılma fenomeni ilk olarak 1928'de C. V. Raman¹ tarafından gözlemlenmiştir. Bir olay fotonu bir örnekle etkileşime girdiğinde, fotonun enerji değişiminin analiz edilen kimyasal türlerin titreşimsel geçişiyle eşleştiği elastik olmayan bir saçılma olayı kendiliğinden meydana gelebilir. Bu işlem kimyasal etiket kullanımını gerektirmez, bu da onu numune bozulmasını en aza indirirken kimyasal analiz için çok yönlü, etiketsiz bir araç haline getirir. Avantajlarına rağmen, spontan Raman saçılması, analiz² için uzun edinme süreleri gerektiren düşük bir saçılma kesitinden (tipik olarak kızılötesi [IR] absorpsiyon kesitinden 10¹¹ daha düşük) muzdariptir. Bu nedenle, Raman saçılma işleminin hassasiyetini artırma arayışı, Raman teknolojilerini gerçek zamanlı görüntüleme için zorlamak için çok önemlidir.

Raman saçılmasının hassasiyetini büyük ölçüde arttırmanın etkili bir yolu, moleküler titreşimsel geçişleri uyarmak için tipik olarak iki lazer darbesinin kullanıldığı tutarlı Raman saçılma (CRS) işlemleridir ^3,4. İki lazer arasındaki foton enerji farkı, örnek moleküllerin titreşim modlarıyla eşleştiğinde, güçlü Raman sinyalleri üretilecektir. Görüntüleme için en sık kullanılan iki CRS işlemi, tutarlı anti-Stokes Raman saçılması (CARS) ve uyarılmış Raman saçılmasıdır (SRS)⁵. Son yirmi yılda, teknolojik gelişmeler, biyolojik numunelerdeki kimyasal değişikliklerin etiketsiz nicelleştirilmesi ve aydınlatılması için güçlü araçlar haline gelmek üzere CARS ve SRS mikroskopi tekniklerini geliştirmiştir.

CARS mikroskobu ile kimyasal görüntüleme, Duncan ve ark.⁶ tarafından gösterilen CARS görüntülerini elde etmek için lazer taramanın ilk kez uygulandığı 1982 yılına tarihlenebilir. CARS mikroskobunun modernizasyonu, lazer taramalı multifoton floresan mikroskopi^7'nin geniş uygulamalarından sonra büyük ölçüde hızlandırılmıştır. Xie grubunun yüksek tekrarlama oranlı lazerler kullanan erken çalışmaları, CARS'ı biyolojik örneklerdeki moleküllerin karakterizasyonu için yüksek hızlı, etiketsiz, kimyasal bir görüntüleme platformu haline getirdi ^8,9,10. CARS görüntüleme için en önemli sorunlardan biri, görüntü kontrastını azaltan ve Raman spektrumunu bozan rezonans olmayan bir arka planın varlığıdır. Rezonans olmayan arka plan 11,12,13,14,15'i azaltmak veya CARS spektrumu ^16,17'den rezonans Raman sinyallerini çıkarmak için birçok çaba sarf edilmiştir. Alanı büyük ölçüde geliştiren bir diğer gelişme, her görüntü pikselinde gelişmiş kimyasal seçicilik^18,19,20,21 ile spektral haritalamaya izin veren hiperspektral CARS görüntülemedir^.

Uyarılmış Raman saçılması (SRS),²² yıl önce keşfedilmesine rağmen, CARS'tan daha genç bir görüntüleme teknolojisidir. 2007 yılında, SRS mikroskobu düşük tekrarlama oranlı lazer kaynağı²³ kullanılarak rapor edilmiştir. Kısa süre sonra, birkaç grup yüksek tekrarlama oranlı lazerler kullanarak yüksek hızlı SRS görüntüleme gösterdi^24,25,26. SRS mikroskopisinin CARS üzerindeki en büyük avantajlarından biri, rezonans olmayan arka plan^27'nin olmamasıdır, ancak çapraz faz modülasyonu (XPM), geçici absorpsiyon (TA), iki foton absorpsiyonu (TPA) ve fototermal (PT) etkisi gibi diğer arka planlar SRS²⁸ ile ortaya çıkabilir. Ek olarak, SRS sinyali ve numune konsantrasyonu, ikinci dereceden bir sinyal-konsantrasyon bağımlılığına sahip olan CARS'ın aksine doğrusal ilişkilere sahiptir²⁹. Bu, kimyasal niceliği ve spektral karıştırmayı basitleştirir. Çok renkli ve hiperspektral SRS, 30,31,32,33,34,35,36 farklı formlarda evrimleşmiştir ve spektral odaklama kimyasal görüntüleme için en popüler yaklaşımlardan biridir ^37,38.

Hem CARS hem de SRS, sinyal uyarımı için moleküllerin titreşimsel geçişine uymak için pompanın ve Stokes lazer ışınlarının numuneye odaklanmasını gerektirir. CARS ve SRS mikroskopları da birçok ortak noktayı paylaşır. Bununla birlikte, bu iki sürecin altında yatan fizik ve bu mikroskopi teknolojilerinde yer alan sinyal tespitleri^3,39 eşitsizliklere sahiptir. CARS, net foton-molekül enerji kuplajına sahip olmayan parametrik bir işlemdir³. Bununla birlikte, SRS, parametrik olmayan bir süreçtir ve fotonlar ile moleküler sistemler arasındaki enerji transferine katkıda bulunur²⁷. CARS'da, anti-Stokes frekansında yeni bir sinyal üretilirken, SRS, pompa ve Stokes lazer ışınları arasındaki enerji transferi olarak kendini gösterir.

CARS sinyali Eq (1)^28'i tatmin eder.

(1)

Bu arada SRS sinyali Eq (2)28 olarak yazılabilir.

(2)

Burada, I _p, I _s, I CARS ve ΔI_SRS, sırasıyla pompa ışınının, Stokes ışınının, _CARS sinyalinin ve SRS sinyallerinin yoğunluklarıdır. χ^(3), numunenin üçüncü dereceden doğrusal olmayan optik duyarlılığıdır ve gerçek ve hayali parçalardan oluşan karmaşık bir değerdir.

Bu denklemler, CARS ve SRS'nin spektral profillerini ve sinyal-konsantrasyon bağımlılığını ifade eder. Fizikteki farklılıklar, bu iki mikroskopi teknolojisi için farklı algılama şemalarına neden olur. CARS'ta sinyal algılama genellikle yeni üretilen fotonların spektral olarak ayrılmasını ve bir fotoçarpan tüpü (PMT) veya şarj bağlantılı cihaz (CCD) kullanılarak algılanmasını içerir; SRS için, pompa ve Stokes ışınları arasındaki enerji alışverişi genellikle bir optik modülatör kullanılarak yüksek hızlı yoğunluk modülasyonu ve kilitli bir amplifikatör ile eşleştirilmiş bir fotodiyot (PD) kullanılarak demodülasyon ile ölçülür.

Son yıllarda hem CARS hem de SRS alanlarında birçok teknolojik gelişme ve uygulama yayınlanmış olmasına rağmen, özellikle hiperspektral CARS ve SRS mikroskopisi için iki CRS tekniğinin sistematik bir karşılaştırması aynı platformda yapılmamıştır. Hassasiyet, uzamsal çözünürlük, spektral çözünürlük ve kimyasal ayırma yeteneklerindeki doğrudan karşılaştırmalar, biyologların kimyasal niceleme için en iyi yöntemi seçmelerine izin verecektir. Bu protokolde, femtosaniye lazer sistemine ve spektral odaklamaya dayalı hem hiperspektral CARS hem de SRS modaliteleri ile multimodal bir görüntüleme platformu oluşturmak için ayrıntılı adımlar sağlanmaktadır. İki teknik, spektral çözünürlük, algılama duyarlılığı, uzamsal çözünürlük ve hücrelerin görüntüleme kontrastları için ileri yönde karşılaştırılmıştır.

1. Hiperspektral CRS görüntüleme için enstrümantal kurulum

NOT: CRS sinyalinin oluşturulması, yüksek güçlü (yani sınıf 3B veya sınıf 4) lazerlerin kullanılmasını gerektirir. Güvenlik protokolleri ele alınmalı ve bu kadar yüksek tepe güçlerinde çalışırken her zaman uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) giyilmelidir. Denemeden önce uygun belgelere başvurun. Bu protokol, ışın yolunu tasarlamaya, femtosaniye darbelerini cıvıl cı Bu hiperspektral CRS mikroskobunun genel optik düzeni Şekil 1'de gösterilmiştir. Burada gösterilen yapılandırma, CRS mikroskobu için mevcut birçok yapılandırmadan biridir. Bu protokolde kullanılan CRS mikroskopi sistemi, çift çıkışlı bir femtosaniye lazer kaynağı ve bir lazer tarama mikroskobu üzerine kurulmuştur.

1. Lazer kaynağının, Stokes ışını olarak kullanılan 1.045 nm'de sabit bir dalga boyu ve pompa ışını olarak kullanılan 680 ila 1.300 nm arasında ayarlanabilir bir dalga boyu dahil olmak üzere 80 MHz'lik bir tekrarlama hızına sahip iki femtosaniye darbe treni (120 fs genişliği) sağladığından emin olun. Çıkış darbelerini optik gecikme farkıyla senkronize edin. Görüntüleme platformunu oluşturmak için mikroskop çerçevesi kullanın.
2. Işın yolunun tasarlanması
   1. Numunedeki lazer gücünü kontrol etmek için, her lazer ışını için yarım dalga plakası ve polarizasyon ışını ayırıcı (PBS) kombinasyonu kullanın.
   2. Stokes lazer ışını yoluna bir akusto-optik modülatör (AOM) takın. 150 mm netleme uzaklığına sahip lensle ışını^AOM'ye odaklayın ve 0. dereceden çıkışı 400 mm netleme uzaklığına sahip bir lensle yeniden harmanlayın.
   3. Pompa ışınını lazer ışını boyutunu Stokes ile eşleştirecek şekilde genişletmek için aynı lens çiftini (150 mm ve 400 mm odak uzaklıkları) kullanın.
   4. 400 mm odak uzaklığına sahip lensleri, mikroskopa girmeden önce ışın sapmasını hassas bir şekilde ayarlamak ve ışın boyutunu optimize etmek için hem pompa hem de Stokes ışın yollarına ayrı tek boyutlu çeviri aşamalarına yerleştirin.
   5. Pompa kirişini, optik gecikme ayarı için motorlu bir çeviri aşamasına monte edilmiş dik açılı yansıtıcı bir ayna ile yönlendirin. Stokes ışınının optik gecikmeye ihtiyacı varsa, bu bileşenleri bunun yerine ışın yoluna yerleştirin.
   6. Her iki ışının da ~ 1.000 nm'de (pompa ve Stokes dalga boyları arasında) bir kesme dalga boyuna sahip dikroik bir aynada birleştirilmesine izin verin, böylece pompa ışını dikroik ayna tarafından yansıtılırken Stokes ışını dikroik aynadan iletilir. Kolinerken kombine lazer ışınlarını mikroskopa gönderin.
   7. Pompayı ve Stokes kirişlerini cıvıl cıvıl etmek için, kiriş yollarına cam çubuklar yerleştirin. Ayrıntılar için adım 1.5'e bakın.
   8. Doğru hizalamayı ve ışın boyutunu doğrulamak için, dikroik aynadan sonra ve mikroskoptan önce iris diyaframları kullanın. Özellikle, iyi hizalama ve ışın örtüşmesini doğrulamak için birini dikroik aynaya yakın, diğerini ise dikroik aynadan uzak bir konuma takın. Hizalama sırasında ışını görselleştirmek için bir IR görüntüleme kartı veya IR görüntüleyici kullanın.
   9. Pompa ve Stokes darbeleri arasındaki optik gecikmeyi yaklaşık olarak ölçmek için hızlı bir PD ve bir osiloskop kullanın. Lazer darbe trenini örnekleyerek osiloskobu tetikleyin.
   10. Pompa kirişini bloke edin ve Stokes kirişini örnekleyin. Darbelerden birini yakınlaştırın ve osiloskop üzerindeki zamansal konumunu işaretlemek için üzerine dikey bir imleç yerleştirin.
   11. Pompa kirişinin blokajını kaldırın ve Stokes kirişini engelleyin. Numune pompası darbeleri geçici olarak işaretli konumla hizalanana kadar gecikme aşamasını çevirin.
3. Lazer tarama mikroskobu
   1. Dik bir mikroskop konfigürasyonu için, 2D galvo tarama aynalarına ulaşmadan önce uygun bir seviyeye tırmanmak için kombine lazer ışınlarını bir periskoptan gönderin.
   2. Mikroskoptan önce lazer ışını boyutunu ölçün ve lazer ışınını objektif lensin giriş gözbebeğinin boyutuna en iyi şekilde uyacak şekilde genişletmek için galvo aynalarından sonra uygun lens çiftini ayarlayın.
   3. İki lensi kullanarak, objektif lensin arka diyaframı ve iki galvo aynanın merkezi eşlenik düzlemler olacak şekilde bir 4-f sistemi oluşturun. Alternatif olarak, lazer tarama için iki adet 4-f lens sistemine sahip iki ayrı 1D galvo ayna kullanın.
   4. Kondenserden sonra, sinyal toplama için lazer ışınlarını yansıtacak şekilde 2 inç ayna tasarlayın. İletim sinyallerini tamamen toplamak ve dedektörlere odaklamak için iletilen ışın yolunda 2 çapında bir lens konumlandırın.
   5. CARS sinyallerini 776 nm'de bir kesime sahip dikroik bir ayna ile PMT'ye yönlendirin ve iletilen SRS sinyallerinin PD tarafından algılanmasına izin verin. Stokes ışınının dedektöre girmesini engellemek için PD'den önce kısa geçirgen bir filtre (980 nm kısa geçiş) kullanın.
   6. CARS sinyal algılaması için, PMT'den sonra ve sinyali veri toplama sistemine göndermeden önce bir ön amplifikatör ve bir akım-voltaj dönüştürücüsü bağlayın. Sinyali ve görüntü kontrastını optimize etmek için PMT voltajını ayarlayın.
   7. AOM'yi 1-10 MHz'de modüle etmek için bir işlev üreteci kullanın ve kilitleme demodülasyonu için referansla aynı frekansı kullanın. Veri toplamadan önce SRS sinyallerini ayıklamak için bir kilitleme amplifikatörü kullanın.
4. Veri toplama ve görüntüleme
   1. Terminal bloğuyla birlikte dijital veri toplama (DAQ) kartı kullanarak veri toplama gerçekleştirin.
   2. Galvo aynalarını kontrol etmek için DAQ'dan analog çıkışları ve sinyal alımı için analog girişleri kullanın.
   3. Görüntüleri gerçek zamanlı görüntüleme ve kaydetme için eşzamanlı çok kanallı ekrana sahip LabVIEW'a dayalı Laboratuvar tarafından yazılmış yazılımı kullanın (bkz.
5. Femtosaniye kaynağının cıvıltılı olması ve spektral çözünürlüğün ölçülmesi
   NOT: Spektral odaklamayı kullanarak iyi bir spektral çözünürlük elde etmek için, femtosaniyeden pikosaniyeye dağılımlar ve cıvıl cıvıl lazer darbeleri tanıtmak için cam çubuklar kullanılır. En iyi spektral çözünürlüğü elde etmek için, pompa kirişinin cıvıl cıvıl hızının Stokes ışınınınkine eşit olması gerekir. Bu lazer sistemi için en iyi spektral çözünürlük, ~ 120 fs çıkış lazer darbelerinin pompa için 3,4 ps'ye ve Stokes için 1,8 ps'ye cıvıl cıvıl cıvıl Bu cıvıltı, aşağıda açıklandığı gibi 150 mm cam çubuk (SF-57) kombinasyonunun 4 + 1 kombinasyonu (kombine kirişte dört, sadece Stokes ışınında bir tane) kullanılarak elde edilir ve 15 ^cm-1 spektral çözünürlüğe ulaşmalıdır. Nabız süresi bir otokorelatör kullanılarak ölçülebilir.
   1. Sadece Stokes ışın yoluna 150 mm'lik bir cam çubuk takın.
   2. Dikroik kiriş ayırıcıdan sonra kombine pompa/Stokes ışın yoluna iki adet 150 mm'lik cam çubuk yerleştirin. Cıvıltıyı arttırmak için, kombine lazer ışınlarının, çubukların bir ucuna dielektrik bir ayna yerleştirerek iki cam çubuğu çift geçmesine izin verin.
   3. Spektral çözünürlüğü ölçmek için, iki cam kapak arasına sıkıştırılmış standart bir kimyasal (örneğin, dimetil sülfoksit [DMSO]) numunesi hazırlayın ve maksimum sinyal elde edilene kadar gecikme aşamasını tarayın.
   4. Optik gecikmeyi 1.000 μm kırmızıya kaydırma yönünde hareket ettirin. Ardından, hiperspektral görüntü yığınını toplamak için blueshift yönüne doğru 10 μm/adımda 200 kare çalıştırın.
   5. Kare numaralarını dalga sayılarına dönüştürmek için, DMSO'dan uzanan simetrik (2.913 cm-1) ve asimetrik (2.994 ^cm-1) ^C-H ve bunlara karşılık gelen kare numaraları^40'ı kullanarak doğrusal bir regresyon gerçekleştirin.
   6. Spektral odaklama yoğunluğu profilini ölçmek için XPM sinyalini kullanın. Kondenser üzerindeki diyaframı yarıya kadar kapatın ve odağı boş bir kapak kapağına taşıyın. Hiperspektral SRS ile aynı sayıda adım toplayın. CARS rezonans olmayan arka planını ölçmek için, cam kapak kapağına odaklanın ve hiperspektral CARS ölçümleri için aynı sayıda adımı toplayın.
6. Görüntülerin sinyal-gürültü oranını (SNR) optimize etme
   1. Sistem hizalaması için kimyasal bir numune hazırlayın. Numune hazırlama için adım 3.1'de açıklanan yordamı izleyin.
      NOT: DMSO iyi bir seçimdir çünkü güçlü Raman sinyalleri ve iyi ayrılmış C-H simetrik ve asimetrik pikleri olan yaygın bir laboratuvar kimyasalıdır.
   2. Numuneyi mikroskop aşamasına yerleştirin ve objektif lens veya kondenser için gerekirse su veya daldırma yağı ekleyin. DMSO damlacığının kenarını görüş alanında düzgün bir şekilde hareket ettirin ve objektif lensi en iyi odaklama için ayarlayın. Köhler aydınlatma yöntemi 41'i kullanarak kondenseri^ortalayın. Kondenser üzerindeki diyaframı tamamen açın.
   3. 2.913 ^cm-1 CH₃ tepe noktasını hedeflemek için pompa ışını dalga boyunu 800 nm'ye (1.045 nm Stokes) ayarlayın. Yarım dalga plakasını ayarlayarak mikroskoptan önce hem pompanın hem de Stokes ışınının gücünü ~30 mW'a ayarlayın (numune düzleminde ~10 mW güç).
   4. SRS için, kilitlenme amplifikatörü kazancını 7 μs zaman sabitiyle ~10 olarak ayarlayın (10 μs piksel bekleme süresi kullanırken). Zaman sabitinin pikselin bekleme süresinden daha küçük olduğundan emin olun. SRS sinyalleri için AUX çıkışı için Demod R'yi kullanın.
   5. CARS için, PMT çıkışını ön amplifikatöre ve akım-voltaj dönüştürücüsüne gönderin. Dönüştürücüden çıktıyı almak için DAQ'yı kullanın.
   6. Yakalama yazılımında görüntü alma parametrelerini ayarlayın. Tarama boyutu ~100 x 100 μm2 olan^{200 x 200} piksel sayısını kullanın. Görüntünün hem DMSO damlacığını hem de boş bir alanı içerdiğinden emin olun.
   7. Örneği tarayın ve bilgisayar ekranındaki görüntüyü kontrol edin. Gerçek zamanlı görüntüleri izlerken Stokes/pompa ışınındaki motorlu gecikme aşamasını tarayın. Sinyal ekranı kaplayana kadar gecikmeyi tarayın.
   8. DMSO damlacığını tüm görüş alanını kaplayacak şekilde hareket ettirin ve DC sinyal maksimumunun görüntüde ortalanmış olup olmadığını kontrol edin (sinyal pompa ışınına bağımlıdır). Pompa ışınının konumunu bir ayna aracılığıyla veya görüntüleme yazılımındaki voltaj ofsetini ayarlayın.
   9. DC optimizasyonundan sonra, eşik değerini ~% 50 doygunluk gösterecek şekilde ayarlayarak AC sinyali en üst düzeye çıkana kadar Stokes ışın aynalarını ayarlayın. Doygunluğun görüntüde ortalanmış olup olmadığını kontrol edin. Değilse, aynalara yalnızca Stokes ışınında ince ayar yapın. Hizalama sırasındaki sinyali, hizalamanın kalitesi hakkında gerçek zamanlı geri bildirim olarak izleyin.
   10. SNR'yi belirlemek için, DMSO görüntüsünün küçük bir bölgesini seçin ve ortalama değeri ölçün. Parazit için, görüntünün boş bölgesinde küçük bir alan seçin ve hem ortalama ortalama değeri hem de standart sapmayı belirleyin. Gürültü ortalama değerini sinyal ortalama değerinden çıkarın ve sonuçları boş bölgenin standart sapmasına bölün.
   11. Hesaplanan SNR yeterince yüksek değilse (bu güç kombinasyonuyla SRS için tipik olarak 800-1.000 ve 0,4 V'luk bir PMT voltajında CARS için >10.000), ışın üst üste binmesini, ışın boyutlarını ve gecikme aşaması konumunu kontrol edin ve yeniden optimize edin, AOM'ye ince ayar yapın ve beklenen SNR elde edilene kadar fonksiyon üreteci modülasyon frekansını değiştirin.

2. Görüntü analizi ve veri işleme

1. SNR analizi
   1. ImageJ yazılımını açın. Kaydedilen DMSO örnek .txt dosyasını içe aktarmak için, Dosya |'nı tıklatın | içe aktar Metin Resim | Açık.
   2. Görüntü içe aktarıldıktan sonra, parlaklık ve karşıtlık işlevini (B&C) açmak için CTRL+shift+C tuşlarına basın. Maksimum örnek sinyalini bulmak için, DMSO örneğinin bir bölgesi doymuş görünene kadar B&C'deki otomatik düğmesine basın.
   3. ImageJ arayüzündeki oval seçim aracına tıklayın ve doymuş DMSO bölgesinin küçük bir alanını vurgulayın. Vurgulandıktan sonra, seçilen alanın ortalama ve standart sapmasını ölçmek için M düğmesine basın.
   4. Arka planı ölçmek için, boş bölgenin sinyali gözlemlenene kadar B & C işlevindeki çubukları ayarlayın. Oval seçimi tıklatın ve arka planın adım 2.1.3 ile aynı boyutta bir bölgesini vurgulayın. Seçilen bölgenin DMSO içermediğinden emin olun. Seçilen alanın istatistiklerini ölçmek için M tuşuna basın.
   5. SNR'yi adım 1.6.10'a göre hesaplayın.
2. Hiperspektral CRS görüntülerinin işlenmesi
   1. .txt dosyasını adım 2.1.1'e göre alın. İçe aktarıldıktan sonra, Resim | Yığınlar | Araçlar | Yığına Montaj... tıklayarak dosyayı bir görüntü yığınına dönüştürün.
   2. İlk DMSO zirvesi görünene kadar montaj boyunca ilerleyin. DMSO'da bir bölge seçin ve Görüntü | Yığın | Yoğunluğu kare sayısı spektrumuna karşı çizmek için Z ekseni Profilini çizin. Ham spektral verileri çıkarmak için, listeye tıklayın ve profil verilerini kopyalayın.
   3. Kurtarılan spektrumu dalga sayısı birimlerine dönüştürmek için, adım 1.5.5'te özetlendiği gibi doğrusal bir regresyon gerçekleştirin.
3. Spektral çözünürlüğü ölçmek için montaj
   NOT: Lorentzian fonksiyonları SRS ve CARS spektrumları^28'e uyacak şekilde kullanılır.
   1. Sığdırma yazılımını açın, ardından doğrusal regresyon verilerini kopyalayıp programa yapıştırın. SRS verilerini sığdırmak için, verileri vurgulayın ve ardından verileri dağılım grafiği olarak çizin.
   2. Dağılım grafiğini yukarı çekin. Analiz | tıklayın Zirveler ve Temel | Çoklu Tepe Uyumu | En iyi analizörü açmak için İletişim Kutusu'nu açın. Yukarı çekildiğinde, girişin geçerli grafik olup olmadığını kontrol edin ve tepe fonksiyonunu Lorentzian (Lorentz) olarak değiştirin.
   3. Takılacak bölgeleri vurgulamak için grafikteki iki DMSO tepe noktasının her birine çift tıklayın. Ardından, sığdırma penceresini açmak için NLfit'i Aç'a tıklayın. Yakınsanana kadar sığdır düğmesine ve ardından Tamam'a tıklayarak uydurma katsayılarının tablolu bir özetini görün (bkz. Eq (3)).
      NOT: Aşağıdaki denklem yazılımdaki Lorentzian fonksiyon formatını göstermektedir. A 1/2, montaj zirvelerinin genlikleri, w₁/_2, takılan piklerin genişlikleridir ve x ₀₁/₀₂ değerleri, takılan piklerin merkezleridir. Bağımsız değişken x, bağımlı değişken ise y'dir.
      (3)
   4. CARS spektral montajı için, Analiz | Montaj | Doğrusal olmayan eğri uyum | İletişim Kutusu'nu açın. Kategori seç: ARABALAR için yeni bir işlev tanımlamak üzere yeni. CARS spektral montajı için aşağıda tanımlanan iki tepe noktalı bir CARS montaj fonksiyonu kullanın (bkz. Eq (4)).
      (4)
4. Uzamsal çözünürlüğün belirlenmesi
   NOT: Bu adımdan önce, belirli bir büyütmedeki piksel boyutu, piksel numarası ve μm cinsinden adım boyutu arasındaki dönüşümü bilmek önemlidir. Bu, beklenen görüntüleme çözünürlüğünden daha büyük olan bilinen çapta bir örnek kullanılarak, çizgi profilini ölçerek ve tam genişliği yarı maksimum (FWHM) değerinde belirlemek için bir Gauss fonksiyonu takılarak gerçekleştirilebilir. Çözünürlük hedefleri veya polimerik boncuklar gibi tek tip numuneler kullanılabilir.
   1. Çapı 200 nm'den küçük hücrelerin veya polimer parçacıklarının görüntüsünü elde edin.
   2. Görüntüdeki en küçük parçacık boyunca bir çizgi çizmek için ImageJ kullanın.
   3. Yoğunluk profilini çizmek için K düğmesine basın.
   4. Açılır pencereden listeye tıklayın ve bilgileri uygun yazılıma kopyalayın.
   5. Profili montaj yazılımında çizin ve Gauss fitingini kullanın ( Analiz | Montaj | Doğrusal olmayan eğri uyum | İletişim Kutusu | Kategori: Temel İşlevler; İşlev: Gauss).
   6. Taktıktan sonra tepe genişliğini okuyun. Mikroskobun gerçek çözünürlüğünü elde etmek için pikselden boyuta dönüştürmeyi kullanın.

3. Hiperspektral CRS görüntüleme için örneklerin hazırlanması

1. Görüntüleme slaytlarının ve kimyasal numunelerin hazırlanması
   1. Bir kapak kapağı üzerine bir parça çift taraflı bant yerleştirin ve yerleştirilecek numune için açık bir alan oluşturmak üzere yerleştirilen bandın ortasından bandın küçük bir dikdörtgen şeklini kesin.
   2. Pipet 1-2 μL saf DMSO ve damlacığı boşluğun merkezine dağıtın.
   3. Üst kapak kapağını dikkatlice yerleştirin ve DMSO numunesinin bandın kenarlarına temas etmediğinden emin olurken odayı kapatmak için kapak kapaklarının kenarlarına hafifçe bastırın.
   4. Duyarlılık deneyleri için,% 50-0'lık bir konsantrasyon aralığı vermek için döteryum oksitte (_D2O) DMSO'nun seri seyreltimlerini hazırlayın. Her çözeltiden 1-2 μL alın ve yukarıda açıklandığı gibi preslenmiş numuneler hazırlayın.
2. Hücre hazırlığı
   1. Hücreleri Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı'nda (DMEM) 35 mm'lik cam tabanlı bir kaba (veya daha büyük) % 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin ile tohumlayın.
   2. Hücreleri 37 ° C'de bir inkübasyon odasında, ~% 50 -% 80 akıcılık elde edilene kadar% 5 CO₂ atmosferi ile gece boyunca veya daha uzun süre inkübe edin.
   3. Canlı hücreleri doğrudan görüntüleyin veya görüntüleme için hücreleri% 10'luk bir formalin çözeltisi ile sabitleyin.

Spektral çözünürlüğün karşılaştırılması
Şekil 2, bir DMSO örneği kullanarak hiperspektral SRS (Şekil 2A) ve CARS (Şekil 2B) mikroskobunun spektral çözünürlüğünü karşılaştırır. SRS spektrumu için, spektruma uyacak şekilde iki Lorentzian fonksiyonu (protokol adım 2.3'e bakınız) uygulandı ve 2.913 ^cm-1 tepe noktası kullanılarak 14.6 ^cm-1'lik bir çözünürlük elde edildi. CARS için, 17.1 cm-1'lik spektral çözünürlüğü veren bir Gauss arka planına sahip iki tepe noktası takma işlevi (protokol adım 2.3'e bakınız) kullanıldı. Bu sonuçlar, aynı ölçüm koşulunda, SRS'nin CARS'den daha iyi bir spektral çözünürlüğe sahip olduğunu göstermektedir. CARS'daki azaltılmış spektral çözünürlük, esas olarak rezonans olmayan arka planın katılımından kaynaklanmaktadır. Ayrıca SRS ve CARS için simetrik (2.913 cm-1) ve asimetrik (2.995 ^cm-1) tepe oranlarının çok farklı olduğu bulunmuştur. Bunun nedeni, (1) ve (2) numaralı denklemlerde açıklandığı gibi, üçüncü dereceden doğrusal olmayan optik duyarlılık ile farklı sinyal korelasyonlarından kaynaklanmaktadır. CARS'ın ikinci dereceden bağımlılığı ile, iki tepe noktası arasındaki yoğunluk farkı artar. SRS zirvelerinin simetrik çizgi şekilleri ve CARS zirvelerinin asimetrik çizgi şekilleri spektrumda gözlemlenebilir. CARS sinyalindeki asimetri esas olarak rezonans olmayan arka plan parazitinin varlığından kaynaklanmaktadır. CARS spektral zirveleri, SRS zirvelerine hafifçe kırmızıya kaymış (^{1-2 cm-1}) görünür. Bu aynı zamanda rezonans zirveleri ile rezonans olmayan arka plan müdahalesinden de kaynaklanmaktadır.

Algılama hassasiyetinin karşılaştırılması
Şekil 3, hiperspektral SRS ve CARS mikroskopisinin algılama duyarlılığını karşılaştırmaktadır. DMSO SRS sinyallerinin SNR'si (2.913 cm-1) yüksek konsantrasyonlarda_D2O'daki DMSO konsantrasyonunun fonksiyonu olarak ilk önce çizilir (% ^{1 -}% 50, Şekil 3A). Sonuçlar, denklemi (2) tatmin eden doğrusal bir ilişki göstermektedir. Şekil 3B, DMSO spektrumlarını% 0.1 ve% 0.01 konsantrasyonlarında çizer; burada 2.913 ^cm-1 zirvesi birincisinde çözülebilir, ancak ikincisinde çözülemez, bu da algılama sınırının% 0.1 ile% 0.01 DMSO arasında olduğunu gösterir. Boş ölçüt sınırını kullanarak, SRS algılama sınırının %0,021 DMSO olduğunu tahmin ettik. Şekil 3C, CARS SNR'yi DMSO konsantrasyonunun fonksiyonu olarak (% 1 -% 50) çizer ve denklem (1) ile uyumlu olarak ikinci dereceden bir bağımlılık gösterir. Faz alınan CARS spektrumları, %0,1 ve %0,01 DMSO için Şekil 3B'de gösterilmiştir. Bu spektrumlara ulaşmak için, Kramers-Kronig ilişkilerine dayanan bir spektral faz-geri getirme yöntemi kullanılmış ve ek arka plan kaldırma işlemi gerçekleştirilmiştir¹⁶. SRS spektrumlarına benzer şekilde, DMSO 2.913 ^cm-1 zirvesi% 0.1 DMSO için açıkça çözülebilir, ancak% 0.01 için değil, bu iki konsantrasyon arasında bir tespit sınırı olduğunu gösterir. Boş ölçüt sınırını kullanarak, SRS algılama sınırının %0,015 DMSO olduğunu tahmin ettik. %0,02 DMSO 2,8 mM'ye karşılık gelir. Bu nedenle, burada kullanılan hiperspektral CRS mikroskobunun tespit sınırı ~ 2.1-2.8 mM DMSO'dur.

Uzamsal çözünürlüğün karşılaştırılması
Şekil 4, SRS (Şekil 4A) ve CARS (Şekil 4B) görüntülerinde algılanan küçük bir hücresel özelliğin çözünürlüğünü karşılaştırır. Aynı çizgideki yoğunluk profilleri, çözünürlük karşılaştırması için FWHM değerlerini belirlemek üzere bir Gauss fonksiyonu kullanılarak görüntülenir ve sığdırılır. SRS sinyali 398.6 nm (Şekil 4C) çözünürlük verirken, CARS sinyali 330.3 nm çözünürlük verdi (Şekil 4D). CARS'ın çözünürlüğü SRS'ninkinden ~ 1.2x daha iyiydi. Çözünürlük farkının nedeni de (1) ve (2) denklemlerinde yatmaktadır. Hem pompa hem de Stokes ışınları, odakta Gauss noktası yayılma fonksiyonuna sahiptir. CARS'ın sinyali daha sonra genişliği kabaca √3 kat azaltan üç Gauss fonksiyonunun çarpımı ile orantılıdır. Benzer şekilde, SRS için genişlik √2 kat azalır. Bu nedenle, CARS'ın çözünürlüğü SRS'ninkinden √3/√2 = 1.2 kat daha iyiydi.

Hücre görüntülerinin karşılaştırılması
Şekil 5, farklı optik gecikme konumlarındaki MIA PaCa-2 hücrelerinden SRS ve CARS görüntülerini karşılaştırmaktadır. Şekil 5A, SRS görüntülerini en güçlü sinyali veren optik gecikmede göstermektedir. Bu görüntüde, lipit damlacıkları (LD'ler), endoplazmik retikulum (ER) ve çekirdek (NU) tespit edilebilir, LD'ler parlak noktalar olarak gösterilen en güçlü sinyallere sahiptir. Şekil 5B, LD'ler için çok daha düşük kontrastlara sahip olan CARS kanal görüntüsünü aynı optik gecikmede göstermektedir. Bu kontrast farkının başlıca nedenleri, rezonans olmayan arka planın varlığı ve CARS spektrumlarında aynı Raman zirvesinin kırmızıya kaymasıdır. Bu optik gecikmede, üretilen sinyalin suyun rezonans olmayan arka planından büyük bir katkısı vardır. CARS'daki lipit kontrastını arttırmak için, optik gecikme kırmızıya kaymış bir değere ayarlandı. Kırmızıya kayma, genel sinyal seviyesi azalmış olsa da, hem SRS (Şekil 5C) hem de CARS (Şekil 5D) için 2.850 ^cm-1'e daha fazla enerji yoğunlaştırarak lipit kontrastlarını iyileştirdi. CARS için, LD'lerin SRS ile benzer bir kontrastı, spektral odaklamada ~ 98 ^cm-1 kırmızıya kayma ile elde edildi (Şekil 5D), ancak SRS görüntüsündekinden daha yüksek bir arka plan hala gözlendi. Bu optik gecikmede, SRS görüntüsü LD'lerde, ER'de ve hücre zarlarında çok daha az protein ve nükleik asit içeriği ancak güçlü lipit içeriği göstermektedir (Şekil 5C).

CARS parametrik bir işlemdir, SRS ise parametrik değildir. Böyle bir fark, iki modalitedeki kontrast farklılıklarına da katkıda bulunur. Parametrik CARS sinyalleri, lazer odağına yakın farklı katmanlardan gelen CARS sinyallerinin paraziti ile belirlenir ve bu da Şekil 5B ve Şekil 5B'deki oklarla gösterildiği gibi negatif kontrastlar gösterebilir (ayrıca Şekil 4B'de). Bu tür sinyal paraziti kaynaklı negatif kontrastlar SRS görüntülerinde yoktur. CARS'daki negatif kontrast, ilgilenilen hedefin eksenel konumu hakkında bilgi sağlayabilir.

SRS sinyalleri moleküler konsantrasyonla doğrusal bir ilişkiye sahipken, CARS sinyalleri neredeyse ikinci dereceden bir konsantrasyon bağımlılığını karşılar. Bu nedenle, CH₂ bakımından zengin LD'ler, CAR görüntüsündeki ER'den ve hücre zarlarından SRS görüntüsünden çok daha güçlü bir sinyal gösterir (Şekil 5E, F). SRS spektrumları hiperspektral görüntülerden çıkarılabilir. Şekil 5G , LD'ler, ER, sitosol (CY) ve NU'dan tipik SRS spektrumlarını göstermektedir. Hem yoğunluk hem de spektral şekil farklı hücresel bölmeler için farklıdır. LD, 2.850 ^cm-1'de diğer organellere göre çok daha güçlü bir sinyal gösterir. CARS'a gelince, benzer spektrumlar, şekiller bakımından farklı olsa da, elde edilebilir. Ham CARS spektrumları, karşılık gelen SRS spektrumlarına kıyasla küçük bir kırmızıya kayma gösterir. Spektral faz geri alımı, CARS spektrumlarını kullanarak Raman yanıtlarını çıkarmak için daha fazla kullanılabilir.

Resim 1: Hiperspektral CARS/SRS mikroskobunun şeması. Kısaltmalar: CARS = tutarlı anti-Stokes Raman saçılması; SRS = uyarılmış Raman saçılması; PBS = polarizasyon ışın ayırıcı; PD = fotodiyot; PMT = fotoçarpan tüpü; AOM = akusto-optik modülatör. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Resim 2: DMSO spektrumları. DMSO'nun (A) SRS ve (B) CARS spektrumları. Noktalar deneysel verilerdir; eğriler spektral uyum sonuçlarıdır. Kısaltmalar: CARS = tutarlı anti-Stokes Raman saçılması; SRS = uyarılmış Raman saçılması; DMSO = dimetil sülfoksit; w = spektral çözünürlük. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: DMSO'nun sinyal-gürültü oranları ve spektrumları. (A) SRS ile ölçülen_{D 2}O'daki konsantrasyonun bir fonksiyonu olarak DMSO simetrik zirvesinin 2.913 ^{cm-1'deki sinyal-gürültü} oranı. Noktalar deneysel verilerdir; çizgi doğrusal montaj sonucudur. (B) D 2 O'da %0,1 ve %0,01 DMSO'luk SRS spektrumları (C) CARS tarafından ölçülen_D2O'daki konsantrasyonun bir fonksiyonu olarak 2.913 cm-1'de DMSO simetrik zirvesinin ^{sinyal-gürültü} oranı. Noktalar deneysel verilerdir; eğri ikinci derece polinom uydurma sonucudur. (D) D₂O'da %0,1 ve %0,01 DMSO'luk CARS spektrumları: CARS = tutarlı anti-Stokes Raman saçılması; SRS = uyarılmış Raman saçılması; DMSO = dimetil sülfoksit; SNR = sinyal-gürültü oranı; _D2O = döteryum oksit. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Bir MIA PaCa-2 hücresinin SRS ve CARS görüntüleri ve yoğunluk profilleri. (A) Bir MIA PaCa-2 hücresinin SRS görüntüsü. (B) Panel A ile aynı görüş alanındaki bir MIA PaCa-2 hücresinin CARS görüntüsü. (C) SRS'nin A panelindeki sarı çizgi boyunca yoğunluk profili. (D) B panelindeki sarı çizgi boyunca CARS'ın yoğunluk profili. Noktalar deneysel verilerdir; eğriler Gauss fonksiyonuna uyan sonuçlardır. Ölçek çubukları = 5 μm. Kısaltmalar: CARS = tutarlı anti-Stokes Raman saçılması; SRS = uyarılmış Raman saçılması; w = çözünürlük. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: MIA PaCa-2 hücrelerinin görüntüleri ve yoğunluk profili. (A) SRS yoğunluğu için optimize edilmiş zaman gecikmesinde MIA PaCa-2 hücrelerinin SRS görüntüsü. (B) Panel A'dakiyle aynı gecikmede bir CARS görüntüsü. (C) Panel A'da olduğu gibi 98 ^cm-1 kırmızıya kaymalı gecikmelerde bir SRS görüntüsü. (D) C panelindeki ile aynı optik gecikmede bir CARS görüntüsü. (E,F) SRS ve CARS yoğunluk profilleri, A ve D panellerindeki noktalı çizgiler boyunca çizilmiştir. (G) Lipid damlacıklarından, endoplazmik retikulumdan, sitozol ve çekirdekten tipik SRS spektrumları. (H) Dört hücresel bileşimin tipik CARS spektrumları. Yeşil ve kırmızı noktalı çizgiler sırasıyla A/B ve C/D panelleri için gecikme konumlarıdır. Ölçek çubukları = 10 μm. Kısaltmalar: CARS = tutarlı anti-Stokes Raman saçılması; SRS = uyarılmış Raman saçılması; LD = lipit damlacıkları; ER = endoplazmik retikulum; CY = sitozol; NU = çekirdek. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya: Görüntüleri gerçek zamanlı görüntüleme ve kaydetme için eşzamanlı çok kanallı ekrana sahip LabVIEW'a dayalı laboratuvar tarafından yazılmış yazılım. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Burada sunulan protokol, multimodal CRS mikroskobunun yapımını ve CARS ile SRS görüntüleme arasındaki doğrudan karşılaştırmayı açıklamaktadır. Mikroskop yapımı için kritik adımlar mekansal ve zamansal ışın örtüşmesi ve ışın boyutu optimizasyonudur. SNR'yi optimize etmek ve Raman kaymalarını kalibre etmek için biyolojik görüntülemeden önce DMSO gibi standart bir numune kullanılması önerilir. CARS ve SRS görüntüleri arasındaki doğrudan karşılaştırma, CARS'ın daha iyi bir uzamsal çözünürlüğe sahip olduğunu ortaya koyarken, SRS daha iyi spektral çözünürlük ve daha az kıvrımlı kimyasal kontrastlar sağlar. Hem CARS hem de SRS benzer algılama sınırlarına sahiptir.

CARS ve SRS görüntüleme, uyarma için yüksek enerjili darbeli lazerler kullanır. Bu, platformun ek kimyasal kontrastlar için çoklu foton uyarma floresansı, harmonik üretim ve geçici absorpsiyon gibi diğer doğrusal olmayan optik görüntüleme modalitelerini entegre etmesini sağlar^28,39.

CARS ve SRS, yüksek kimyasal seçiciliğe sahip lipit bileşimini incelemek için yaygın olarak kullanılmıştır. Bununla birlikte, teknolojiler lipitleri ölçmekle sınırlı değildir. SRS, ilaç dağılımını⁴², protein sentezini 43^{ve DNA 44'ü} haritalamak için uygulanmıştır. CARS ve SRS,^45,46,47,48 tabletlerindeki farmasötik bileşenlerin ve yardımcı maddelerin görüntülenmesine de uygulanmıştır. Hiperspektral CARS ve SRS, kanser tanısında⁴⁹, kardiyovasküler hastalık değerlendirmesinde⁵⁰ ve nöral görüntülemede⁵¹ uygulama alanı bulmuştur. COVID-19 çalışmaları için de başvurabilirler⁵². 3.000 ^cm-1'e kadar geniş spektral pencereleri kapsayabilen Geniş Bant CARS, biyolojik örneklerde zengin kimyasal yapıları aydınlatabilir⁵³. Bununla birlikte, CCD'nin yavaş okuma hızı nedeniyle, piksel bekleme süresi milisaniye seviyesindedir, SRS mikroskobu³⁴ için mikrosaniye piksel bekleme süresinden çok daha yavaştır. Hiperspektral SRS mikroskobu şu anda lazer bant genişliği ve entegre dizi dedektörlerinin eksikliği ile sınırlı olan tipik 200-300 ^cm-1 bant^{genişliğine sahiptir 34}. Fourier dönüşümü SRS mikroskopisi, SRS spektral kapsamını potansiyel olarak genişletmenin alternatif bir yoludur³⁵.

CARS ve SRS, etiketlemeye gerek kalmadan zengin kimyasal bilgiler sağlasa da, kimyasal seçicilik kimyasal bağlarda yatmaktadır ve bu da spesifik proteinleri ayırt etmeyi zorlaştırmaktadır. Raman etiketleri, CARS ve SRS^54,55'in kimyasal seçiciliğini artırma potansiyelini göstermiştir. Bununla birlikte, tutarlı Raman görüntüleme, floresan tespitine kıyasla hala çok daha düşük hassasiyete sahiptir. Yüzey geliştirme, sinyal seviyelerini⁵⁶ iyileştirmek için spontan Raman saçılma spektroskopisi için kullanıldı. Ayrıca sinyal amplifikasyonu^57,58,59 için CARS ve ^SRS'ye uygulandı. İyileştirme faktörü spontan Raman saçılması kadar yüksek olmasa da, yüzey ile güçlendirilmiş CARS ve SRS mikroskobu hala tek molekülleri tespit etme potansiyelini göstermektedir^59,60. Bununla birlikte, metal parçacıkların veya yüzeylerin kullanılması, etiketsiz yaklaşımın avantajını ortadan kaldırır. Metal yüzeyler kullanmadan tutarlı Raman mikroskobunun duyarlılığının arttırılması, teknolojinin biyoloji bilimindeki uygulamasını büyük ölçüde genişletecektir.

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Bu araştırma Purdue Üniversitesi Kimya Bölümü başlangıç fonu tarafından desteklenmiştir.