高光谱受激拉曼散射与相干反斯托克斯拉曼散射显微镜在化学成像中的应用的直接比较

本文直接比较了集成到同一显微镜平台中的受激拉曼散射（SRS）和相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）的分辨率、灵敏度和成像对比度。结果表明，CARS具有更好的空间分辨率，SRS具有更好的对比度和光谱分辨率，并且两种方法具有相似的灵敏度。

受激拉曼散射（SRS）和相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）显微镜是使用最广泛的相干拉曼散射成像技术。高光谱SRS和CARS成像在每个像素处提供拉曼光谱信息，从而可以更好地分离不同的化学成分。虽然这两种技术都需要两个激发激光器，但它们的信号检测方案和光谱特性却大不相同。该协议的目标是在单个平台上执行高光谱SRS和CARS成像，并比较用于成像不同生物样品的两种显微镜技术。采用光谱聚焦方法，利用飞秒激光器获取光谱信息。通过使用标准化学样品，比较了SRS和CARS在相同激发条件下的灵敏度，空间分辨率和光谱分辨率（即样品处的功率，像素停留时间，物镜，脉冲能量）。将CARS和SRS的成像对比度并列并进行比较。直接比较CARS和SRS性能将允许最佳选择化学成像模式。

拉曼散射现象于1928年由C.V.拉曼¹首次观测到。当入射光子与样品相互作用时，可以自发发生非弹性散射事件，其中光子的能量变化与所分析化学物质的振动跃迁相匹配。该过程不需要使用化学标签，使其成为多功能，无标签的化学分析工具，同时最大限度地减少样品扰动。尽管有其优点，但自发拉曼散射的散射截面较低（通常比红外[IR]吸收横截面低^{10 11} ），这需要较长的采集时间进行分析²。因此，寻求提高拉曼散射过程的灵敏度对于推动拉曼技术进行实时成像至关重要。

大大提高拉曼散射灵敏度的一种有效方法是通过相干拉曼散射（CRS）过程，其中两个激光脉冲通常用于激发分子振动转变^3，4。当两种激光器之间的光子能量差与样品分子的振动模式相匹配时，将产生强烈的拉曼信号。用于成像的两种最常用的稀而实过程是相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）和受激拉曼散射（SRS）⁵。在过去的二十年中，技术发展已经使CARS和SRS显微镜技术成为无标记定量和阐明生物样品中化学变化的强大工具。

CARS显微镜的化学成像可以追溯到1982年，当时激光扫描首次应用于获取CARS图像，由Duncan等人⁶演示。在激光扫描多光子荧光显微镜⁷的广泛应用之后，CARS显微镜的现代化大大加快了。Xie小组使用高重复率激光器的早期工作已经将CARS转变为一个高速，无标记的化学成像平台，用于表征生物样品中的分子^8，9，10。CARS成像的主要问题之一是存在非共振背景，这会降低图像对比度并扭曲拉曼光谱。已经做出了许多努力来减少非共振背景^{11，12，13，14，15} 或从CARS光谱^16，17中提取共振拉曼信号。另一个大大推进该领域的进步是高光谱CARS成像，它允许在每个图像像素上进行光谱映射，化学选择性提高^{18，19，20，21}。

受激拉曼散射（SRS）是一种比CARS更年轻的成像技术，尽管它是在^22年早些时候发现的。2007年，SRS显微镜报告使用低重复率激光源²³。很快，几个小组展示了使用高重复率激光^{器24，25，26}的高速SRS成像。与CARS相比，SRS显微镜的主要优点之一是没有非共振背景²⁷，尽管其他背景如交叉相位调制（XPM），瞬态吸收（TA），双光子吸收（TPA）和光热（PT）效应，也可能发生在SRS²⁸上。此外，SRS信号和样品浓度具有线性关系，不像CARS具有二次信号浓度依赖性²⁹。这简化了化学定量和光谱分离。多色和高光谱SRS已经以不同的形式发展^{30，31，32，33，34，35，36}，光谱聚焦是化学成像最流行的方法之一^37，38。

CARS和SRS都需要将泵浦和斯托克斯激光束聚焦到样品上，以匹配分子的振动跃迁以进行信号激发。汽车和SRS显微镜也有很多共同点。然而，这两个过程背后的物理学，以及这些显微镜技术中涉及的信号检测存在差异^3，39。CARS是一个参数化过程，没有净光子分子能量耦合³。然而，SRS是一个非参数过程，并且有助于光子和分子系统之间的能量转移²⁷。在CARS中，产生反斯托克斯频率的新信号，而SRS表现为泵浦和斯托克斯激光束之间的能量转移。

汽车信号满足方程 （1）²⁸。

（1）

同时，SRS信号可以写为等式（2）²⁸。

（二）

在这里， 我_p、 I_s、 I_汽车和 ΔI_SRS 分别是泵波束、斯托克斯波束、汽车信号和 SRS 信号的强度。χ^（3） 是样品的三阶非线性光学敏感性，是由实部和虚部组成的复数值。

这些方程表示CARS和SRS的光谱图和信号浓度依赖性。物理场的差异导致这两种显微镜技术具有不同的检测方案。CARS中的信号检测通常涉及新生成的光子的光谱分离和使用光电倍增管（PMT）或电荷耦合器件（CCD）进行检测;对于SRS，泵和斯托克斯光束之间的能量交换通常通过使用光调制器的高速强度调制和使用与锁定放大器配对的光电二极管（PD）进行解调来测量。

尽管近年来在CARS和SRS领域都发表了许多技术发展和应用，但在同一平台上没有对这两种CRS技术进行系统比较，特别是对于高光谱CARS和SRS显微镜。在灵敏度、空间分辨率、光谱分辨率和化学分离能力方面的直接比较将使生物学家能够选择化学定量的最佳模式。在该协议中，提供了基于飞秒激光系统和光谱聚焦构建具有高光谱CARS和SRS模态的多模态成像平台的详细步骤。这两种技术在光谱分辨率，检测灵敏度，空间分辨率和细胞成像对比度方面进行了正向比较。

1. 用于高光谱稀而实成像的仪器设置

注意:CRS信号的产生需要使用高功率（即3B级或4级）激光器。在如此高的峰值功率下工作时，必须解决安全协议问题，并且必须始终穿戴适当的个人防护装备（PPE）。在试验前查阅适当的文档。该协议侧重于设计光束路径、啁啾飞秒脉冲和优化成像条件。该高光谱稀而实显微镜的一般光学布局如图 1所示。此处显示的配置是稀而实显微镜的众多现有配置之一。该协议中使用的CRS显微镜系统基于双输出飞秒激光源和激光扫描显微镜。

1. 确保激光源提供两个飞秒脉冲序列（120 fs宽度），重复率为80 MHz，包括1，045 nm处的固定波长用作斯托克斯光束，以及680至1，300 nm的可调波长用作泵浦光束。将输出脉冲与光学延迟差同步。使用显微镜框架构建成像平台。
2. 设计光束路径
   1. 要控制样品的激光功率，请对每个激光束使用半波片和偏振分束器（PBS）组合。
   2. 在斯托克斯激光束路径中安装声光调制器（AOM）。将焦距为 150 mm 的镜头的光束聚焦到 AOM 中，并使用⁴⁰⁰ mm 焦距镜头重新组合 0 阶输出。
   3. 使用相同的透镜对（150 mm 和 400 mm 焦距）扩展泵浦光束，使激光束尺寸与 Stokes 相匹配。
   4. 将泵和斯托克斯光束路径中的400 mm焦距透镜放在单独的一维平移载物台上，以便在进入显微镜之前微调光束发散并优化光束尺寸。
   5. 使用安装在电动平移台上的直角反射镜引导泵浦光束，以进行光学延迟调谐。如果斯托克斯光束需要光学延迟，请将这些组件放入其光束路径中。
   6. 允许两个光束在截止波长约为1，000 nm（泵浦和斯托克斯波长之间）的二向色镜处组合，以便斯托克斯光束将通过二向色镜透射，而泵浦光束被二向色镜反射。将共线组合的激光束发送到显微镜。
   7. 要使泵和斯托克斯光束发出啁啾声，请将玻璃棒放置在其光束路径中。有关详细信息，请参阅步骤 1.5。
   8. 为了确认正确的对准和光束尺寸，请在二向色镜之后和显微镜前使用虹膜隔膜。具体来说，将一个安装在靠近二向色镜的位置，另一个安装在离二向色镜较远的位置，以确认良好的对准和光束重叠。使用红外查看卡或红外查看器在对准过程中可视化光束。
   9. 使用快速PD和示波器近似测量泵和斯托克斯脉冲之间的光学延迟。通过对激光脉冲序列进行采样来触发示波器。
   10. 阻挡泵梁并对斯托克斯梁进行采样。放大其中一个脉冲，并在其上放置垂直光标以标记其在示波器上的时间位置。
   11. 疏通泵梁并阻挡斯托克斯梁。平移延迟阶段，直到样品泵脉冲暂时与标记位置对齐。
3. 激光扫描显微镜
   1. 对于直立显微镜配置，在到达2D振镜扫描镜之前，将组合的激光束通过潜望镜发送以爬升到适当的水平。
   2. 在显微镜前测量激光束尺寸，并在振镜后设置适当的透镜对以扩展激光束，以最好地匹配物镜的入射光瞳的大小。
   3. 使用两个镜头构建一个4-f系统，物镜的后光圈和两个振镜的中心是共轭平面。或者，使用两个单独的一维振镜和两个4-f镜头系统进行激光扫描。
   4. 在聚光镜之后，设计一个2英寸的翻转镜来反射激光束以进行信号收集。将直径为2英寸的透镜放置在透射光束路径中，以完全收集传输信号并将其聚焦到探测器。
   5. 使用截止值为776 nm的二向色镜将CARS信号定向到PMT，并允许PD检测传输的SRS信号。在PD之前使用短通滤波器（980 nm短通）以阻止斯托克斯光束进入探测器。
   6. 对于CARS信号检测，在PMT之后和将信号发送到数据采集系统之前，连接前置放大器和电流 - 电压转换器。调整PMT电压以优化信号和图像对比度。
   7. 使用函数发生器在1-10 MHz下调制AOM，并使用与锁定解调的基准相同的频率。在数据采集之前，使用锁相放大器提取SRS信号。
4. 数据采集和显示
   1. 使用数字数据采集 （DAQ） 卡和端子块执行数据采集。
   2. 使用 DAQ 的 模拟 输出 来 控制 振 镜 和 用于 信号 采集 的 模拟 输入。
   3. 使用 基于 LabVIEW 的 Lab 编写 软件， 该软件 具有 同步 的 多 通道 显示， 可 实 时 查看 和 保存 图像 （参见 补充 文件）。
5. 啁啾飞秒源并测量光谱分辨率
   注意:为了使用光谱聚焦获得良好的光谱分辨率，玻璃棒用于引入色散并将激光脉冲从飞秒调到皮秒。为了获得最佳的光谱分辨率，泵浦光束的啁啾速率需要等于斯托克斯光束的啁啾速率。对于这种激光系统，通过将~120 fs输出的激光脉冲啁啾到泵浦的3.4 ps和斯托克斯的1.8 ps，可以实现最佳的光谱分辨率。这种啁啾声是通过使用150毫米玻璃棒（SF-57）组合的4 + 1组合（组合光束中的四个，一个仅在斯托克斯光束中）来实现的，如下所述，并且应达到15 ^cm-1 的光谱分辨率。脉冲持续时间可以使用自相关器进行测量。
   1. 将一根 150 mm 玻璃棒仅插入斯托克斯光束路径。
   2. 在二向色分束器之后将两根 150 mm 玻璃棒插入组合泵/斯托克斯光束路径中。为了增加啁啾声，让组合的激光束通过在棒的一端放置一个介电镜来双通道两个玻璃棒。
   3. 为了测量光谱分辨率，制备一个标准的化学（例如，二甲基亚砜[DMSO]）样品，压在两个玻璃盖玻片之间，并扫描延迟阶段，直到达到最大信号。
   4. 将光学延迟沿红移方向移动 1，000 μm。然后，以10μm/步长向蓝移方向运行200帧以收集高光谱图像堆栈。
   5. 要将帧编号转换为波数，请使用来自 DMSO 及其相应帧编号⁴⁰ 的对称 （2，⁹¹³ cm-1） 和非对称 （2，994 ^cm-1） C-H 拉伸来执行线性回归。
   6. 使用 XPM 信号测量光谱聚焦强度曲线。半关闭冷凝器上的隔膜，并将焦点移动到空白盖玻片上。收集的步骤数与高光谱 SRS 的步骤数相同。要测量CARS非共振背景，请关注玻璃盖玻片，并为高光谱CARS测量收集相同数量的步骤。
6. 优化图像的信噪比 （SNR）
   1. 准备用于系统对准的化学样品。按照步骤3.1中描述的步骤进行样品制备。
      注意:DMSO是一个不错的选择，因为它是一种常见的实验室化学品，具有很强的拉曼信号和分离良好的C-H对称和非对称峰。
   2. 将样品放在显微镜载物台上，如果需要，为物镜或聚光镜加水或浸油。在视野中正确移动DMSO液滴的边缘，并调整物镜以获得最佳对焦。使用科勒照明方法⁴¹将聚光镜居中。完全打开冷凝器上的隔膜。
   3. 将泵浦光束波长调谐至 800 nm（1，045 nm 斯托克斯），以瞄准 2，913 ^cm-1 CH₃ 峰。通过调整半波板（样品平面处的功率约为10 mW），在显微镜前将泵和斯托克斯光束的功率设置为~30 mW。
   4. 对于SRS，将锁定放大器增益设置为~10，时间常数为7 μs（使用10 μs像素停留时间时）。确保时间常数小于像素停留时间。将解调 R 用于 SRS 信号的 AUX 输出。
   5. 对于CARS，将PMT输出发送到前置放大器和电流-电压转换器。使用 DAQ 从 转化 器 获取 输出。
   6. 在采集软件中设置图像采集参数。使用像素数为 200 x 200，扫描尺寸为 ~100 x 100 μm²。确保映像同时包含 DMSO 液滴和空白区域。
   7. 扫描样品并检查计算机屏幕上的图像。扫描斯托克斯/泵光束中的电动延迟级，同时监控实时图像。扫描延迟，直到信号最大化。
   8. 移动DMSO液滴以覆盖整个视野，并检查直流信号最大值是否在图像中居中（信号取决于泵浦波束）。 通过 镜子调整泵浦光束的位置，或在成像软件中调整电压偏移。
   9. 直流优化后，调整斯托克斯光束反射镜，直到通过调整阈值以显示~50%饱和度来最大化交流信号。检查饱和度是否在图像中居中。如果没有，请仅在斯托克斯光束中微调镜子。在对准过程中监控信号，作为对准质量的实时反馈。
   10. 要确定 SNR，请选择 DMSO 图像的一个小区域并测量平均值。对于噪声，在图像的空白区域中选择一个小区域，并确定平均值和标准偏差。从信号平均值中减去噪声平均值，然后将结果除以空区域的标准偏差。
   11. 如果计算的SNR不够高（使用此功率组合，在0.4 V的PMT电压下，对于S >RS通常为800-1，000，对于CARS通常为10，000），请检查并重新优化波束重叠，波束大小和延迟级位置，微调AOM，并更改函数发生器调制频率，直到获得预期的SNR。

2. 图像分析和数据处理

1. 信噪比分析
   1. 打开图像J软件。若要将保存的 DMSO 示例导入.txt文件，请单击" 文件|导入|文本图像|打开。
   2. 导入图像后，按 CTRL+Shift+C 以显示亮度和对比度功能 （B&C）。要查找最大样本信号，请按 B&C 中的自动按钮，直到 DMSO 样本的某个区域显示为饱和。
   3. 单击 ImageJ 界面上的 椭圆形 选择工具，并突出显示饱和 DMSO 区域中的一小块区域。高亮显示后，按 M 测量所选区域的平均值和标准差。
   4. 为了测量背景，调整B&C函数中的条形，直到可以观察到空区域的信号。单击 椭圆形 选区并突出显示与步骤 2.1.3 大小相同的背景区域。确保所选区域不包含 DMSO。按 M 测量所选区域的统计数据。
   5. 根据步骤 1.6.10 计算信噪比。
2. 处理高光谱稀而实图像
   1. 根据步骤 2.1.1 导入.txt文件。导入后，单击 "图像|堆栈|工具|蒙太奇到堆栈... 将文件转换为图像堆栈。
   2. 滚动浏览蒙太奇，直到看到第一个DMSO峰值。在 DMSO 上选择一个区域，然后单击 "映像|堆栈|绘制 Z 轴轮廓 以绘制强度与帧数谱的关系。要提取原始光谱数据，请单击列表并复制配置文件数据。
   3. 要将恢复的频谱转换为波数单位，请按照步骤 1.5.5 中概述执行线性回归。
3. 适合测量光谱分辨率
   注意:洛伦兹函数用于拟合 SRS 和 CARS 光谱²⁸。
   1. 打开拟合软件，然后将线性回归数据复制并粘贴到程序中。要拟合 SRS 数据，请突出显示数据，然后将数据绘制为散点图。
   2. 拉起散点图。点击 分析|峰值和基线|多个峰值拟合|打开对话框 以显示峰值分析器。上拉时，检查输入是否为电流图，并将峰值函数更改为洛伦兹（洛伦兹）。
   3. 双击图表上的两个 DMSO 峰值中的每一个，以突出显示要拟合的区域。接下来，单击" 打开 NLfit "以显示 适合 窗口。单击" 拟合到收敛 "按钮，然后单击 "确定"，以查看拟合系数的表格摘要（请参见等式 （3））。
      注意:下面的等式显示了软件中的洛伦兹函数格式。A₁/₂ 是拟合峰的振幅，w₁/₂ 是拟合峰的宽度，x₀₁/₀₂ 值是拟合峰的中心。自变量为 x，因变量为 y。
      （三）
   4. 对于 CARS 光谱拟合，请单击 分析|配件|非线性曲线拟合|打开对话框。选择 类别:新 ，为 CARS 定义新功能。使用下面定义的双峰 CARS 拟合函数（参见等式 （4））进行 CARS 光谱拟合。
      （四）
4. 确定空间分辨率
   注意:在此步骤之前，了解特定放大倍率下的像素大小、像素数和步长（以μm为单位）之间的转换非常重要。这可以通过使用大于预期成像分辨率的已知直径的样品，测量其线轮廓并拟合高斯函数来确定半最大值（FWHM）值处的全宽来执行。可以使用分辨率目标或均匀样品，例如聚合物微球。
   1. 获取直径小于200nm的细胞或聚合物颗粒的图像。
   2. 使用 ImageJ 在图像中最小的粒子上绘制一条线。
   3. 按 K 绘制强度分布图。
   4. 从弹出窗口中单击 列表 ，然后将信息复制到配件软件。
   5. 在拟合软件中绘制轮廓并使用高斯拟合（单击 "分析|配件|非线性曲线拟合|打开对话框|类别: 基本功能;功能:高斯）。
   6. 安装后读取峰值宽度。使用像素到尺寸的转换来获得显微镜的实际分辨率。

3. 高光谱稀而实成像样品的制备

1. 成像载玻片和化学样品的制备
   1. 将一块双面胶带放在盖玻片上，然后从放置的胶带中间切出胶带的小矩形形状，为要放置的样品创建一个开放区域。
   2. 移液1-2μL纯DMSO，并在空位中心分配液滴。
   3. 小心地放置顶部盖玻片，轻轻按压盖玻片的边缘以密封腔室，同时确保DMSO样品不接触胶带的边缘。
   4. 对于灵敏度实验，在氧化氘（D₂O）中制备DMSO的连续稀释液，得到50%-0%的浓度范围。取1-2μL每种溶液，并如上所述制备压制样品。
2. 细胞制备
   1. 将细胞接种在杜贝克科的改良鹰培养基（DMEM）中的35毫米玻璃底培养皿（或更大）中，其中含有10%的胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素。
   2. 将细胞在37°C的孵育室中用5%CO₂ 气氛孵育过夜或更长时间，直到达到〜50%-80%的汇合度。
   3. 直接对活细胞进行成像，或用10%福尔马林溶液固定细胞进行成像。

光谱分辨率的比较
图2 比较了使用DMSO样品的高光谱SRS（图2A）和CARS（图2B）显微镜的光谱分辨率。对于SRS频谱，应用两个洛伦兹函数（参见协议步骤2.3）来拟合光谱，并使用2，^{913 cm-1} 峰获得14.6 ^cm-1 的分辨率。对于CARS，使用具有高斯背景的双峰拟合函数（参见协议步骤2.3）进行拟合，其光谱分辨率为17.1 ^cm-1。这些结果表明，在相同的测量条件下，SRS具有比CARS更好的光谱分辨率。CARS中光谱分辨率的降低主要是由于非共振背景的参与。此外，还发现SRS和CARS的对称（2，^{913 cm-1}）和不对称（2，995 ^cm-1）峰比差异很大。这是由于信号与三阶非线性光学敏感性的相关性不同，如方程式（1）和（2）所述。随着CARS的二次依赖性，两个峰值之间的强度差被放大。在光谱中可以观察到SRS峰的对称线形和CARS峰的非对称线形。CARS信号中的不对称主要是由于存在非共振背景干扰。CARS光谱峰与SRS峰相比略有红移（^{1-2 cm-1}）。这也源于谐振峰的非共振背景干涉。

检测灵敏度的比较
图3 比较了高光谱SRS和CARS显微镜的检测灵敏度。首先绘制DMSO SRS信号（2，913 ^cm-1）的SNR作为DMSO浓度在高浓度下D₂O中的函数（1%-50%， 图3A）。结果表明线性关系，满足等式（2）。 图3B 绘制了0.1%和0.01%浓度下的DMSO光谱，其中2，913 ^cm-1 峰可以在前者中分辨，但在后者中不能分辨，表明检测限在0.1%和0.01%DMSO之间。使用空白标准的限制，我们估计SRS检测限为0.021%DMSO。 图3C 将CARS SNR绘制为DMSO浓度（1%-50%）的函数，显示了与方程（1）一致的二次依赖性。0.1% 和 0.01% DMSO 的相位检索到的 CARS 光谱如图 3D 所示。为了实现这些光谱，使用了基于Kramers-Kronig关系的光谱相位检索方法，并执行了额外的背景去除¹⁶。与SRS光谱类似，DMSO 2，913 ^cm-1 峰可以清楚地分辨为0.1%DMSO，但不能分辨0.01%，表明这两种浓度之间的检测限。使用空白标准的限制，我们估计SRS检测限为0.015%DMSO。0.02% 的 DMSO 对应于 2.8 mM。因此，这里使用的高光谱稀而实显微镜的检测限约为2.1-2.8 mM DMSO。

空间分辨率的比较
图4 比较了在SRS（图4A）和CARS（图4B）图像中检测到的小蜂窝特征的分辨率。显示来自同一条线的强度分布，并使用高斯函数进行拟合，以确定用于分辨率比较的FWHM值。SRS信号的分辨率为398.6 nm（图4C），而CARS信号的分辨率为330.3 nm（图4D）。汽车的分辨率比SRS高出约1.2倍。分辨率差异的原因还在于等式（1）和（2）。泵和斯托克斯光束在焦点处都具有高斯点扩散函数。然后，CARS的信号与三个高斯函数的乘法成正比，这大约将宽度减小了√3倍。同样，对于 SRS，宽度减小了 √2 倍。因此，CARS的分辨率√3/√2 = SRS的1.2倍。

细胞图像的比较
图5比较了不同光学延迟位置下MIA PaCa-2电池的SRS和CARS图像。图5A显示了在光学延迟下给出最强信号的SRS图像。在该图像中，可以检测到脂质液滴（LD），内质网（ER）和细胞核（NU），其中LD具有最强的信号，显示为亮点。图5B显示了在相同光学延迟下的CARS通道图像，其LD的对比度大大降低。这种对比度差异的主要原因是非共振背景的存在以及CARS光谱中相同拉曼峰的红移。在这种光学延迟下，产生的信号具有来自水的非共振背景的巨大贡献。为了增强CARS中的脂质对比度，光学延迟被调整为红移值。红移通过将更多的能量集中在SRS（图5C）和CARS（图5D）的2，850 ^cm-1上来改善脂质对比，尽管整体信号水平降低了。对于CARS，LD与SRS的对比度相似是通过光谱聚焦中约98 ^cm-1的红移实现的（图5D），尽管仍然观察到比SRS图像中更高的背景。在这种光学延迟下，SRS图像显示LD，ER和细胞膜中的蛋白质和核酸含量要少得多，但脂质含量却很强（图5C）。

CARS 是一个参数化过程，而 SRS 是非参数化的。这种差异也有助于两种模式的对比差异。参数化CARS信号由来自靠近激光焦点的不同层的CARS信号的干扰决定，这可能显示负对比度，如图5B和图5D（也在图4B中的箭头所示）。这种信号干扰引起的负对比度在SRS图像中不存在。CARS中的负对比度可能会提供有关目标的轴向位置的信息。

SRS信号与分子浓度呈线性关系，而CARS信号满足近二次浓度依赖性。因此，富含CH₂的LD在CARS图像中显示的信号比ER和细胞膜比SRS图像中的信号强得多（图5E，F）。SRS光谱可以从高光谱图像中提取。 图5G 显示了来自LD，ER，细胞质基质（CY）和NU的典型SRS光谱。对于不同的细胞区室，强度和光谱形状都不同。LD在2，850 ^cm-1 处显示比其他细胞器强得多的信号。至于CARS，可以获得类似的光谱，尽管形状不同，但可以获得。与相应的SRS光谱相比，原始CARS光谱显示出很小的红移。光谱相位检索可以进一步用于使用CARS光谱提取拉曼响应。

图 1:高光谱 CARS/SRS 显微镜的示意图。 缩写:CARS =相干反斯托克斯拉曼散射;SRS = 受激拉曼散射;PBS = 偏振分束器;PD = 光电二极管;PMT = 光电倍增管;AOM = 声光调制器。 请点击此处查看此图的大图。

图 2:（A） 反洗钱系统综合症和 （B） 德国移动网络监测组织的汽车产权光谱。点是实验数据;曲线是光谱拟合结果。缩写:CARS =相干反斯托克斯拉曼散射;SRS = 受激拉曼散射;DMSO = 二甲基亚砜;w = 光谱分辨率。请点击此处查看此图的大图。

图 3:DMSO 的信噪比和光谱 （A） DMSO 对称峰值在 2，913 ^cm-1 处的信噪比与 SRS 测量的 D₂O 浓度的函数关系。这些点是实验数据;直线是线性拟合结果。（B） D 2 O. （C） DMSO在₂，913 ^cm-1处的DMSO对称峰的信噪比与D₂O中浓度的函数关系。这些点是实验数据;曲线是二阶多项式拟合结果。（D） D₂O 中 0.1% 和 0.01% DMSO 的 CARS 光谱缩写:CARS = 相干反斯托克斯拉曼散射;SRS = 受激拉曼散射;DMSO = 二甲基亚砜;信噪比 = 信噪比;D₂O = 氧化氘。请点击此处查看此图的大图。

图 4:MIA PaCa-2 细胞的 SRS 和 CARS 图像和强度分布图。（B） 与面板 A 具有相同视场的 MIA PaCa-2 细胞的 CARS 图像。（C） 面板A中黄线沿线SRS的强度分布图。（D） B面板中黄线沿线汽车的强度分布。点是实验数据;曲线是高斯函数拟合结果。比例尺 = 5 μm。缩写:CARS =相干反斯托克斯拉曼散射;SRS = 受激拉曼散射;w = 分辨率。请点击此处查看此图的大图。

图5:MIA PaCa-2细胞的图像和强度分布（A）在SRS强度的优化时间延迟下MIA PaCa-2细胞的SRS图像。（B） 与图A中具有相同延迟的汽车图像。（C） 图A中98 ^cm-1红移延迟处的SRS图像。（D） 光学延迟与图C中相同的CARS图像。（英，女）SRS 和 CARS 强度剖面图沿面板 A 和 D 中的虚线绘制。（G）来自脂质液滴，内质网，细胞质基质和细胞核的典型SRS光谱。（H）四种细胞组合物的典型CARS光谱。绿色和红色虚线分别是面板 A/B 和 C/D 的延迟位置。比例尺 = 10 μm。缩写:CARS =相干反斯托克斯拉曼散射;SRS = 受激拉曼散射;LD = 脂质液滴;ER = 内质网;CY = 细胞质基质;核 = 核。请点击此处查看此图的大图。

补充 文件: 基于 LabVIEW 的 Lab 编写 软件， 具有 同步 多 通道 显示， 可 实 时 查看 和 保存 图像。请按此下载此档案。

这里介绍的协议描述了多模态稀而实显微镜的构造以及CARS和SRS成像之间的直接比较。对于显微镜结构，关键步骤是空间和时间光束重叠以及光束尺寸优化。建议在生物成像之前使用DMSO等标准样品，以优化SNR和校准拉曼位移。CARS和SRS图像之间的直接比较表明，CARS具有更好的空间分辨率，而SRS具有更好的光谱分辨率和更少的复杂化学对比度。汽车和SRS都有相似的检测限。

CARS和SRS成像使用高能脉冲激光器进行激发。这使得该平台能够集成其他非线性光学成像模式，例如多光子激发荧光，谐波产生和瞬态吸收，以获得额外的化学对比度^28，39。

CARS和SRS已被广泛用于研究具有高化学选择性的脂质组成。然而，这些技术并不局限于量化脂质。SRS已被应用于绘制药物分布^图42，蛋白质合成⁴³和DNA⁴⁴。CARS和SRS也已应用于片剂^{45，46，47，48}中的图像药物成分和赋形剂。高光谱CARS和SRS在癌症诊断⁴⁹，心血管疾病评估⁵⁰和神经成像⁵¹中都有应用。它们也可以应用于COVID-19研究⁵²。宽带CARS可以覆盖宽达3，000 ^cm-1的光谱窗口，可以阐明生物样品中丰富的化学结构⁵³。然而，由于CCD的读出速率较慢，像素停留时间在毫秒级，远慢于SRS显微镜³⁴的微秒像素停留时间。高光谱SRS显微镜目前的典型带宽为200-300 ^cm-1，受限于激光带宽和缺乏锁定集成阵列探测器³⁴。傅里叶变换SRS显微镜是潜在地扩大SRS光谱覆盖范围³⁵的另一种方法。

虽然CARS和SRS无需标记即可提供丰富的化学信息，但化学选择性在于化学键，因此难以区分特定的蛋白质。拉曼标签已经显示出提高CARS和SRS^54，55的化学选择性^的潜力。然而，与荧光检测相比，相干拉曼成像的灵敏度仍然要低得多。表面增强用于自发拉曼散射光谱，以改善信号电平⁵⁶。它还应用于CARS和SRS的信号放大^57，58，59。虽然增强因子不如自发拉曼散射高，但表面增强的CARS和SRS显微镜仍然显示出检测单分子^59，60的潜力。然而，使用金属颗粒或表面剥夺了无标签方法的优势。在不使用金属表面的情况下提高相干拉曼显微镜的灵敏度将大大扩展该技术在生物科学中的应用。

作者声明没有利益冲突。

这项研究得到了普渡大学化学系启动基金的支持。