Direkter Vergleich der hyperspektralen stimulierten Raman-Streuung und der kohärenten Anti-Stokes-Raman-Streumikroskopie für die chemische Bildgebung

Dieses Papier vergleicht direkt die Auflösung, Empfindlichkeit und Bildkontraste der stimulierten Raman-Streuung (SRS) und der kohärenten Anti-Stokes-Raman-Streuung (CARS), die in dieselbe Mikroskopplattform integriert sind. Die Ergebnisse zeigen, dass CARS eine bessere räumliche Auflösung hat, SRS bessere Kontraste und spektrale Auflösung liefert und beide Methoden eine ähnliche Empfindlichkeit aufweisen.

Die stimulierte Raman-Streuung (SRS) und die kohärente Anti-Stokes-Raman-Streuung (CARS) sind die am weitesten verbreiteten kohärenten Raman-Streubildgebungstechnologien. Hyperspektrale SRS- und CARS-Bildgebung bieten Raman-Spektralinformationen an jedem Pixel, was eine bessere Trennung verschiedener chemischer Zusammensetzungen ermöglicht. Obwohl beide Techniken zwei Anregungslaser erfordern, sind ihre Signaldetektionsschemata und spektralen Eigenschaften sehr unterschiedlich. Das Ziel dieses Protokolls ist es, sowohl hyperspektrale SRS- als auch CARS-Bildgebung auf einer einzigen Plattform durchzuführen und die beiden Mikroskopietechniken zur Abbildung verschiedener biologischer Proben zu vergleichen. Die Spektralfokussierungsmethode wird verwendet, um Spektralinformationen mit Femtosekundenlasern zu erfassen. Durch die Verwendung chemischer Standardproben werden die Empfindlichkeit, die räumliche Auflösung und die spektrale Auflösung von SRS und CARS unter den gleichen Anregungsbedingungen (d. h. Leistung an der Probe, Pixelverweilzeit, Objektivlinse, Pulsenergie) verglichen. Die bildgebenden Kontraste von CARS und SRS für biologische Proben werden gegenübergestellt und verglichen. Der direkte Vergleich von CARS- und SRS-Leistungen würde eine optimale Auswahl der Modalität für die chemische Bildgebung ermöglichen.

Das Raman-Streuungsphänomen wurde erstmals 1928 von C. V. Raman¹ beobachtet. Wenn ein einfallendes Photon mit einer Probe interagiert, kann spontan ein inelastisches Streuereignis auftreten, bei dem die Energieänderung des Photons mit einem Schwingungsübergang der analysierten chemischen Spezies übereinstimmt. Dieser Prozess erfordert nicht die Verwendung eines chemischen Tags und ist somit ein vielseitiges, etikettenfreies Werkzeug für die chemische Analyse bei gleichzeitiger Minimierung der Probenstörung. Trotz ihrer Vorteile leidet die spontane Raman-Streuung unter einem geringen Streuquerschnitt (typischerweise 10¹¹ niedriger als der Infrarot-Absorptionsquerschnitt [IR]), was lange Erfassungszeiten für die Analyse^{erforderlich macht 2}. Daher ist das Bestreben, die Empfindlichkeit des Raman-Streuprozesses zu erhöhen, unerlässlich, um Raman-Technologien für die Echtzeit-Bildgebung voranzutreiben.

Eine effektive Möglichkeit, die Empfindlichkeit der Raman-Streuung erheblich zu erhöhen, sind kohärente Raman-Streuprozesse (CRS), für die typischerweise zwei Laserpulse verwendet werden, um molekulare Schwingungsübergänge^{anzuregen 3,4}. Wenn die Photonen-Energiedifferenz zwischen den beiden Lasern mit den Schwingungsmoden von Probenmolekülen übereinstimmt, werden starke Raman-Signale erzeugt. Die beiden am häufigsten verwendeten CRS-Verfahren für die Bildgebung sind kohärente Anti-Stokes-Raman-Streuung (CARS) und stimulierte Raman-Streuung (SRS)⁵. In den letzten zwei Jahrzehnten haben technologische Entwicklungen CARS- und SRS-Mikroskopietechniken zu leistungsfähigen Werkzeugen für die markierungsfreie Quantifizierung und Aufklärung chemischer Veränderungen in biologischen Proben gemacht.

Die chemische Bildgebung durch CARS-Mikroskopie kann auf das Jahr 1982 datiert werden, als Laserscanning zum ersten Mal angewendet wurde, um CARS-Bilder zu erfassen, demonstriert von Duncan et al⁶. Die Modernisierung der CARS-Mikroskopie wurde nach den breiten Anwendungen der Laser-Scanning-Multiphotonen-Fluoreszenzmikroskopie^{stark beschleunigt 7}. Frühe Arbeiten der Xie-Gruppe, die Laser mit hoher Wiederholungsrate verwenden, haben CARS zu einer schnellen, markierungsfreien, chemischen Bildgebungsplattform für die Charakterisierung von Molekülen in biologischen Proben^entwickelt 8,9,10. Eines der Hauptprobleme für die CARS-Bildgebung ist das Vorhandensein eines nicht resonanten Hintergrunds, der den Bildkontrast reduziert und das Raman-Spektrum verzerrt. Es wurden viele Anstrengungen unternommen, um entweder den nicht resonanten Hintergrund 11,12,13,14,15 zu reduzieren oder resonante Raman-Signale aus den CARS-Spektren ^16,17 zu extrahieren. Ein weiterer Fortschritt, der das Feld stark vorangebracht hat, ist die hyperspektrale CARS-Bildgebung, die eine spektrale Kartierung an jedem Bildpixel mit verbesserter chemischer Selektivität 18,19,20,21 ermöglicht.

Die stimulierte Raman-Streuung (SRS) ist eine jüngere Bildgebungstechnologie als CARS, obwohl sie früher entdeckt wurde²². Im Jahr²⁰⁰⁷ wurde berichtet, dass die SRS-Mikroskopie eine Laserquelle mit niedriger Wiederholungsrate 23 verwendete. Bald demonstrierten mehrere Gruppen eine Hochgeschwindigkeits-SRS-Bildgebung mit Lasern mit hoher Wiederholungsrate^24,25,26. Einer der Hauptvorteile der SRS-Mikroskopie gegenüber CARS ist das Fehlen des nicht-resonanten Hintergrunds²⁷, obwohl andere Hintergründe wie Kreuzphasenmodulation (XPM), transiente Absorption (TA), Zwei-Photonen-Absorption (TPA) und photothermischer (PT) -Effekt bei SRS²⁸ auftreten können. Darüber hinaus haben das SRS-Signal und die Probenkonzentration lineare Beziehungen, im Gegensatz zu CARS, das eine quadratische Signalkonzentrationsabhängigkeit^{aufweist 29}. Dies vereinfacht die chemische Quantifizierung und spektrale Entmischung. Mehrfarbiges und hyperspektrales SRS hat sich in verschiedenen Formen^{entwickelt 30,31,32,33,34,35,36}, wobei die spektrale Fokussierung einer der beliebtesten Ansätze für die chemische Bildgebung ^{ist 37,38}.

Sowohl CARS als auch SRS erfordern die Fokussierung der Pumpe und der Stokes-Laserstrahlen auf die Probe, um den Schwingungsübergang der Moleküle für die Signalanregung anzupassen. Auch CARS und SRS-Mikroskope haben viel gemeinsam. Die Physik, die diesen beiden Prozessen zugrunde liegt, und die Signaldetektionen, die an diesen Mikroskopietechnologien beteiligt sind, weisen jedoch Disparitäten^{auf 3,39}. CARS ist ein parametrischer Prozess, der keine Netto-Photonen-Molekül-Energiekopplung^{hat 3}. SRS ist jedoch ein nichtparametrischer Prozess und trägt zum Energietransfer zwischen Photonen und molekularen Systemen bei²⁷. In CARS wird ein neues Signal bei Anti-Stokes-Frequenz erzeugt, während sich SRS als Energieübertragung zwischen der Pumpe und den Stokes-Laserstrahlen manifestiert.

CARS Signal erfüllt Eq (1)²⁸.

(1)

In der Zwischenzeit kann das SRS-Signal als Eq (2) ²⁸ geschrieben werden.

(2)

Hier sind I _p, I _s, I CARS und ΔI_SRS die Intensitäten des Pumpenstrahls, des Stokes-Strahls, des CARS-Signals bzw. der _SRS-Signale. χ⁽³⁾ ist die nichtlineare optische Suszeptibilität der Probe dritter Ordnung und ist ein komplexer Wert, der sich aus realen und imaginären Teilen zusammensetzt.

Diese Gleichungen drücken die Spektralprofile und die Signalkonzentrationsabhängigkeit von CARS und SRS aus. Unterschiede in der Physik führen zu unterschiedlichen Nachweisschemata für diese beiden Mikroskopietechnologien. Die Signaldetektion in CARS beinhaltet in der Regel die spektrale Trennung neu erzeugter Photonen und die Detektion mit einer Photomultiplierröhre (PMT) oder einem ladungsgekoppelten Gerät (CCD); Für SRS wird der Energieaustausch zwischen der Pumpe und Stokes-Strahlen normalerweise durch Hochgeschwindigkeitsintensitätsmodulation mit einem optischen Modulator und Demodulation mit einer Photodiode (PD) in Verbindung mit einem Lock-in-Verstärker gemessen.

Obwohl in den letzten Jahren viele technologische Entwicklungen und Anwendungen sowohl im CARS- als auch im SRS-Bereich veröffentlicht wurden, wurden keine systematischen Vergleiche der beiden CRS-Techniken auf derselben Plattform durchgeführt, insbesondere für die hyperspektrale CARS- und SRS-Mikroskopie. Direkte Vergleiche in Bezug auf Empfindlichkeit, räumliche Auflösung, spektrale Auflösung und chemische Trennfähigkeiten würden es Biologen ermöglichen, die beste Modalität für die chemische Quantifizierung auszuwählen. In diesem Protokoll werden detaillierte Schritte zum Aufbau einer multimodalen Bildgebungsplattform mit hyperspektralen CARS- und SRS-Modalitäten auf der Grundlage eines Femtosekundenlasersystems und einer spektralen Fokussierung bereitgestellt. Die beiden Techniken wurden in Vorwärtsrichtung für spektrale Auflösung, Detektionsempfindlichkeit, räumliche Auflösung und bildgebende Kontraste von Zellen verglichen.

1. Instrumenteller Aufbau für die hyperspektrale CRS-Bildgebung

HINWEIS: Die Erzeugung von CRS-Signalen erfordert die Verwendung von Hochleistungslasern (d. h. Klasse 3B oder Klasse 4). Sicherheitsprotokolle müssen beachtet werden, und bei Arbeiten mit solch hohen Spitzenleistungen muss jederzeit eine geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA) getragen werden. Konsultieren Sie die ordnungsgemäße Dokumentation, bevor Sie experimentieren. Dieses Protokoll konzentriert sich auf das Entwerfen des Strahlwegs, das Zwitschern der Femtosekundenpulse und die Optimierung der Bildgebungsbedingungen. Ein allgemeines optisches Layout dieses hyperspektralen CRS-Mikroskops ist in Abbildung 1 dargestellt. Die hier gezeigte Konfiguration ist eine von vielen vorhandenen Konfigurationen für die CRS-Mikroskopie. Das in diesem Protokoll verwendete CRS-Mikroskopiesystem basiert auf einer Femtosekunden-Laserquelle mit zwei Ausgängen und einem Laser-Scanning-Mikroskop.

1. Stellen Sie sicher, dass die Laserquelle zwei Femtosekunden-Pulszüge (120 fs Breite) mit einer Wiederholrate von 80 MHz liefert, einschließlich einer festen Wellenlänge bei 1.045 nm, die als Stokes-Strahl verwendet wird, und einer abstimmbaren Wellenlänge von 680 bis 1.300 nm, die als Pumpstrahl verwendet wird. Synchronisieren Sie die Ausgangsimpulse mit einer optischen Verzögerungsdifferenz. Verwenden Sie einen Mikroskoprahmen, um die Bildgebungsplattform zu erstellen.
2. Entwerfen des Balkenpfads
   1. Um die Laserleistung an der Probe zu steuern, verwenden Sie für jeden Laserstrahl eine Halbwellenplatte und eine Kombination aus Polarisationsstrahlteiler (PBS).
   2. Installieren Sie einen akusto-optischen Modulator (AOM) im Stokes-Laserstrahlpfad. Fokussieren Sie den Strahl mit einem 150-mm-Brennweitenobjektiv in das AOM und resolieren^{Sie den} Ausgang 0. Ordnung mit einem 400-mm-Brennweitenobjektiv.
   3. Verwenden Sie das gleiche Objektivpaar (150 mm und 400 mm Brennweiten), um den Pumpenstrahl so zu erweitern, dass die Laserstrahlgröße mit dem Stokes übereinstimmt.
   4. Platzieren Sie die 400-mm-Brennweitenobjektive sowohl im Pump- als auch im Stokes-Strahlpfad auf separaten eindimensionalen Translationsstufen, um die Strahldivergenz zu optimieren und die Strahlgröße vor dem Eintritt in das Mikroskop zu optimieren.
   5. Steuern Sie den Pumpenstrahl mit einem rechtwinklig reflektierenden Spiegel, der auf einem motorisierten Übersetzungstisch montiert ist, um die optische Verzögerungsabstimmung zu ermöglichen. Wenn der Stokes-Strahl eine optische Verzögerung benötigt, platzieren Sie diese Komponenten stattdessen in seinem Strahlweg.
   6. Lassen Sie beide Strahlen an einem dichroitischen Spiegel mit einer Grenzwellenlänge bei ~ 1.000 nm (zwischen der Pumpe und den Stokes-Wellenlängen) kombinieren, so dass der Stokes-Strahl durch den dichroitischen Spiegel übertragen wird, während der Pumpstrahl vom dichroitischen Spiegel reflektiert wird. Senden Sie die linear kombinierten Laserstrahlen zum Mikroskop.
   7. Um die Pumpe und die Stokes-Balken zu zwitschern, platzieren Sie Glasstäbe in ihren Balkenbahnen. Weitere Informationen finden Sie in Schritt 1.5.
   8. Um die richtige Ausrichtung und Strahlgröße zu bestätigen, verwenden Sie Irismembranen nach dem dichroitischen Spiegel und vor dem Mikroskop. Installieren Sie insbesondere eine Position in der Nähe und die andere in einem Abstand vom dichroitischen Spiegel, um eine gute Ausrichtung und Strahlüberlappung zu bestätigen. Verwenden Sie eine IR-Anzeigekarte oder einen IR-Viewer, um den Strahl während der Ausrichtung zu visualisieren.
   9. Verwenden Sie ein schnelles PD und ein Oszilloskop, um die optische Verzögerung zwischen der Pumpe und den Stokes-Impulsen ungefähr zu messen. Lösen Sie das Oszilloskop aus, indem Sie den Laserpulszug abtasten.
   10. Blockieren Sie den Pumpenstrahl und nehmen Sie Proben am Stokes-Strahl. Zoomen Sie auf einen der Impulse und platzieren Sie einen vertikalen Cursor darauf, um seine zeitliche Position auf dem Oszilloskop zu markieren.
   11. Entsperren Sie den Pumpenstrahl und blockieren Sie den Stokes-Strahl. Übersetzen Sie die Verzögerungsstufe, bis die Impulse der Probenpumpe zeitlich an der markierten Position ausgerichtet sind.
3. Das Laserscanning-Mikroskop
   1. Für eine aufrechte Mikroskopkonfiguration senden Sie die kombinierten Laserstrahlen durch ein Periskop, um auf eine geeignete Ebene zu klettern, bevor Sie die 2D-Galvo-Scanning-Spiegel erreichen.
   2. Messen Sie die Laserstrahlgröße vor dem Mikroskop und richten Sie das richtige Linsenpaar nach den Galvospiegeln ein, um den Laserstrahl so zu erweitern, dass er der Größe der Eintrittspupille der Objektivlinse am besten entspricht.
   3. Konstruieren Sie ein 4-f-System mit den beiden Linsen, wobei die hintere Blende der Objektivlinse und die Mitte der beiden Galvospiegel konjugierte Ebenen sind. Alternativ können Sie zwei separate 1D-Galvospiegel mit zwei 4-F-Linsensystemen für das Laserscannen verwenden.
   4. Entwerfen Sie nach dem Kondensator einen 2-Zoll-Klappspiegel, um die Laserstrahlen für die Signalerfassung zu reflektieren. Positionieren Sie eine Linse mit einem Durchmesser von 2 im übertragenen Strahlengang, um Übertragungssignale zu den Detektoren vollständig zu sammeln und zu fokussieren.
   5. Leiten Sie die CARS-Signale mit einem dichroitischen Spiegel mit einem Grenzwert bei 776 nm an den PMT und lassen Sie die übertragenen SRS-Signale vom PD erkennen. Verwenden Sie einen Bandpassfilter (655/30 nm) vor dem PMT, um Restanregungslaserpulse abzulehnen. Verwenden Sie einen Kurzpassfilter (980 nm Kurzpass) vor dem PD, um das Eindringen des Stokes-Strahls in den Detektor zu blockieren.
   6. Für die CARS-Signalerkennung schließen Sie nach dem PMT und vor dem Senden des Signals an das Datenerfassungssystem einen Vorverstärker und einen Strom-Spannungs-Wandler an. Stellen Sie die PMT-Spannung ein, um den Signal- und Bildkontrast zu optimieren.
   7. Verwenden Sie einen Funktionsgenerator, um das AOM bei 1-10 MHz zu modulieren, und verwenden Sie die gleiche Frequenz wie die Referenz für die Lock-in-Demodulation. Verwenden Sie einen Lock-in-Verstärker, um SRS-Signale vor der Datenerfassung zu extrahieren.
4. Datenerfassung und -anzeige
   1. Führen Sie die Datenerfassung mit einer digitalen Datenerfassungskarte (DAQ) in Verbindung mit einer Klemmleiste durch.
   2. Verwenden Sie die analogen Ausgänge des Datenerfassungsgeräts, um die Galvospiegel und die analogen Eingänge für die Signalerfassung zu steuern.
   3. Verwenden Sie im Labor geschriebene Software, die auf LabVIEW basiert und über eine simultane Mehrkanalanzeige verfügt, um Bilder in Echtzeit anzuzeigen und zu speichern (siehe Ergänzende Datei).
5. Chirping der Femtosekundenquelle und Messung der spektralen Auflösung
   HINWEIS: Um eine gute spektrale Auflösung durch spektrale Fokussierung zu erreichen, werden Glasstäbe verwendet, um Dispersionen einzuführen und Laserpulse von Femtosekunde bis Pikosekunde zu chirpen. Um die beste spektrale Auflösung zu erreichen, muss die Chirprate des Pumpstrahls der des Stokes-Strahls entsprechen. Für dieses Lasersystem kann die beste spektrale Auflösung erreicht werden, indem die ~120 fs Ausgangslaserpulse auf 3,4 ps für die Pumpe und 1,8 ps für den Stokes gezwitschert werden. Dieses Zwitschern wird durch die Verwendung einer 4 + 1-Kombination (vier im kombinierten Strahl, einer nur im Stokes-Strahl) von 150 mm Glasstab (SF-57) -Kombination, wie unten beschrieben, erreicht und sollte eine spektrale Auflösung von 15 ^cm-1 erreichen. Die Pulsdauer kann mit einem Autokorrelator gemessen werden.
   1. Stecken Sie einen 150-mm-Glasstab nur in den Stokes-Balkenweg.
   2. Setzen Sie zwei 150-mm-Glasstäbe in den kombinierten Pump-/Stokes-Balkenpfad nach dem dichroitischen Balkensplitter ein. Um das Zwitschern zu erhöhen, lassen Sie die kombinierten Laserstrahlen die beiden Glasstäbe doppelt passieren, indem Sie einen dielektrischen Spiegel an einem Ende der Stäbe platzieren.
   3. Um die spektrale Auflösung zu messen, bereiten Sie eine chemische Standardprobe (z. B. Dimethylsulfoxid [DMSO]) vor, die zwischen zwei Glasabdeckungen gepresst wird, und scannen Sie die Verzögerungsstufe ab, bis das maximale Signal erreicht ist.
   4. Bewegen Sie die optische Verzögerung um 1.000 μm in Rotverschiebungsrichtung. Führen Sie dann 200 Bilder mit 10 μm / Schritt in Richtung Blueshift-Richtung aus, um den hyperspektralen Bildstapel zu sammeln.
   5. Um die Framezahlen in Wellenzahlen umzuwandeln, führen Sie eine lineare Regression mit der symmetrischen (2.913 cm-1) und asymmetrischen (2.994 ^{cm-1) C-H-Dehnung} von DMSO und den entsprechenden Framenummern⁴⁰ durch.
   6. Verwenden Sie das XPM-Signal zur Messung des spektralen Fokussierungsintensitätsprofils. Schließen Sie die Membran am Kondensator halb und verschieben Sie den Fokus auf ein leeres Deckglas. Sammeln Sie die gleiche Anzahl von Schritten wie bei hyperspektralem SRS. Um den nicht resonanten CARS-Hintergrund zu messen, konzentrieren Sie sich auf den Glasbelag und sammeln Sie die gleiche Anzahl von Schritten für die hyperspektralen CARS-Messungen.
6. Optimierung des Signal-Rausch-Verhältnisses (SNR) von Bildern
   1. Bereiten Sie eine chemische Probe für die Systemausrichtung vor. Befolgen Sie das in Schritt 3.1 beschriebene Verfahren für die Probenvorbereitung.
      HINWEIS: DMSO ist eine gute Wahl, da es sich um eine gängige Laborchemikalie mit starken Raman-Signalen und gut getrennten symmetrischen und asymmetrischen C-H-Peaks handelt.
   2. Legen Sie die Probe auf den Mikroskoptisch und fügen Sie bei Bedarf Wasser oder Tauchöl für die Objektivlinse oder den Kondensator hinzu. Bewegen Sie den Rand des DMSO-Tröpfchens ordnungsgemäß im Sichtfeld und stellen Sie das Objektiv für den besten Fokus ein. Zentrieren Sie den Kondensator mit der Köhler Beleuchtungsmethode⁴¹. Öffnen Sie die Membran am Kondensator vollständig.
   3. Stimmen Sie die Wellenlänge des Pumpstrahls auf 800 nm (1.045 nm_Stokes) ab, um die Spitze von 2.913 ^cm-1 CH 3 anzuvisieren. Stellen Sie die Leistung sowohl der Pumpe als auch des Stokes-Strahls auf ~ 30 mW vor dem Mikroskop ein, indem Sie die Halbwellenplatte einstellen (~ 10 mW Leistung in der Probenebene).
   4. Stellen Sie für SRS die Lock-in-Verstärkerverstärkung auf ~10 mit einer Zeitkonstante von 7 μs ein (bei Verwendung einer Verweilzeit von 10 μs Pixel). Stellen Sie sicher, dass die Zeitkonstante kleiner ist als die Pixelverweildauer. Verwenden Sie Demod R für den AUX-Ausgang für SRS-Signale.
   5. Senden Sie bei CARS den PMT-Ausgang an den Vorverstärker und den Strom-Spannungs-Wandler. Verwenden Sie die Datenerfassung, um die Ausgabe vom Wandler zu erfassen.
   6. Stellen Sie die Bildaufnahmeparameter in der Aufnahmesoftware ein. Verwenden Sie eine Pixelzahl von 200 x 200 mit einer Scangröße von ~100 x 100 μm². Stellen Sie sicher, dass das Bild sowohl das DMSO-Droplet als auch einen leeren Bereich enthält.
   7. Scannen Sie das Beispiel und überprüfen Sie das Bild auf dem Computerbildschirm. Scannen Sie die motorisierte Verzögerungsstufe im Stokes/Pumpenstrahl und überwachen Sie die Echtzeitbilder. Scannen Sie über die Verzögerung, bis das Signal maximiert ist.
   8. Bewegen Sie den DMSO-Tropfen, um das gesamte Sichtfeld abzudecken, und prüfen Sie, ob das DC-Signalmaximum im Bild zentriert ist (das Signal ist pumpenstrahlabhängig). Stellen Sie entweder die Position des Pumpenstrahls über einen Spiegel oder den Spannungsversatz in der Bildgebungssoftware ein.
   9. Stellen Sie nach der DC-Optimierung die Stokes-Strahlspiegel so lange ein, bis das AC-Signal maximiert ist, indem Sie den Schwellenwert so einstellen, dass eine Sättigung von ~ 50% angezeigt wird. Überprüfen Sie, ob die Sättigung im Bild zentriert ist. Wenn nicht, stimmen Sie die Spiegel nur im Stokes-Strahl ab. Überwachen Sie das Signal während der Ausrichtung als Echtzeit-Feedback über die Qualität der Ausrichtung.
   10. Um den SNR zu bestimmen, wählen Sie einen kleinen Bereich des DMSO-Bildes aus und messen Sie den Mittelwert. Wählen Sie für das Rauschen einen kleinen Bereich im leeren Bereich des Bildes aus und ermitteln Sie sowohl den Mittelwert als auch die Standardabweichung. Subtrahieren Sie den Rauschmittelwert vom Signalmittelwert und dividieren Sie die Ergebnisse durch die Standardabweichung des leeren Bereichs.
   11. Wenn der berechnete SNR nicht hoch genug ist (typischerweise 800-1.000 für SRS und >10.000 für CARS bei einer PMT-Spannung von 0,4 V mit dieser Leistungskombination), überprüfen und optimieren Sie die Strahlüberlappung, die Strahlgrößen und die Verzögerungsstufenposition, passen Sie das AUM an und ändern Sie die Modulationsfrequenz des Funktionsgenerators, bis die erwartete SNR erreicht ist.

2. Bildanalyse und Datenverarbeitung

1. SNR-Analyse
   1. Öffnen Sie die ImageJ-Software. Um die gespeicherte DMSO-Beispieldatei .txt zu importieren, klicken Sie auf Datei | | importieren Textbild-| Offen.
   2. Sobald das Bild importiert wurde, drücken Sie STRG+UMSCHALT+C , um die Helligkeits- und Kontrastfunktion (B&C) aufzurufen. Um das maximale Sample-Signal zu finden, drücken Sie die Auto-Taste im B&C, bis ein Bereich der DMSO-Probe gesättigt erscheint.
   3. Klicken Sie auf der ImageJ-Benutzeroberfläche auf das ovale Auswahlwerkzeug und markieren Sie einen kleinen Bereich des gesättigten DMSO-Bereichs. Drücken Sie nach der Markierung M , um den Mittelwert und die Standardabweichung des ausgewählten Bereichs zu messen.
   4. Um den Hintergrund zu messen, passen Sie die Balken in der B&C-Funktion an, bis das Signal des leeren Bereichs beobachtet werden kann. Klicken Sie auf die ovale Auswahl und markieren Sie einen Bereich des Hintergrunds, der die gleiche Größe wie in Schritt 2.1.3 hat. Stellen Sie sicher, dass die ausgewählte Region kein DMSO enthält. Drücken Sie M , um die Statistiken des ausgewählten Bereichs zu messen.
   5. Berechnen Sie den SNR gemäß Schritt 1.6.10.
2. Verarbeitung von hyperspektralen CRS-Bildern
   1. Importieren Sie die .txt Datei gemäß Schritt 2.1.1. Klicken Sie nach dem Import auf Bild | Stapel | Tools | Montage zu Stack... , um die Datei in einen Image-Stack zu konvertieren.
   2. Scrollen Sie durch die Montage, bis der erste DMSO-Peak sichtbar ist. Wählen Sie eine Region auf dem DMSO aus und klicken Sie auf Image | | stapeln Zeichnen Sie das Profil der Z-Achse , um das Spektrum der Intensität im Vergleich zum Frame-Zahlenspektrum darzustellen. Um die spektralen Rohdaten zu extrahieren, klicken Sie auf Liste und kopieren Sie die Profildaten.
   3. Um das wiederhergestellte Spektrum in Wellenzahleinheiten umzuwandeln, führen Sie eine lineare Regression durch, wie in Schritt 1.5.5 beschrieben.
3. Passform zur Messung der spektralen Auflösung
   HINWEIS: Lorentzianische Funktionen werden verwendet, um die SRS- und CARS-Spektren²⁸ anzupassen.
   1. Öffnen Sie die Anpassungssoftware, kopieren Sie die linearen Regressionsdaten und fügen Sie sie in das Programm ein. Um die SRS-Daten anzupassen, markieren Sie die Daten und zeichnen Sie sie dann als Streudiagramm.
   2. Ziehen Sie das Streudiagramm nach oben. Klicken Sie auf Analyse | Peaks und Baseline-| Mehrere Peak-Fit-| Öffnen Sie den Dialog, um den Peak-Analysator aufzurufen. Wenn Sie nach oben gezogen werden, überprüfen Sie, ob die Eingabe das aktuelle Diagramm ist, und ändern Sie die Spitzenfunktion in Lorentzian (Lorentz).
   3. Doppelklicken Sie auf jeden der beiden DMSO-Spitzen im Diagramm, um die anzupassenden Regionen hervorzuheben. Klicken Sie anschließend auf NLfit öffnen , um das passende Fenster aufzurufen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Bis zur Konvergenz anpassen (Fit until converged ) und dann auf OK, um eine tabellarische Zusammenfassung der Anpassungskoeffizienten anzuzeigen (siehe Eq (3)).
      HINWEIS: Die folgende Gleichung zeigt das Lorentzsche Funktionsformat in der Software. A 1/2 sind die Amplituden der passenden Peaks, w₁/₂ sind die Breiten der angepassten Peaks und die x₀₁/_02-Werte sind die Center der angepassten Peaks. Die unabhängige Variable ist x und die abhängige Variable ist y.
      (3)
   4. Für die CARS-Spektralanpassung klicken Sie auf Analyse | Anpassung | Nichtlineare Kurvenanpassung | Öffnen Sie den Dialog. Wählen Sie die Kategorie: Neu, um eine neue Funktion für CARS zu definieren. Verwenden Sie eine unten definierte Zwei-Peak-CARS-Fitting-Funktion (siehe Eq (4)) für die CARS-Spektralanpassung.
      (4)
4. Bestimmen der räumlichen Auflösung
   HINWEIS: Vor diesem Schritt ist es wichtig, die Konvertierung zwischen der Pixelgröße bei einer bestimmten Vergrößerung, Pixelanzahl und der Schrittgröße in μm zu kennen. Dies kann durchgeführt werden, indem eine Probe mit einem bekannten Durchmesser, der größer als die erwartete Bildauflösung ist, verwendet wird, ihr Linienprofil gemessen und eine Gaußsche Funktion angepasst wird, um die volle Breite bei halbem Maximalwert (FWHM) zu bestimmen. Es können Auflösungstargets oder einheitliche Proben wie polymere Perlen verwendet werden.
   1. Erfassen Sie ein Bild von Zellen oder Polymerpartikeln mit einem Durchmesser von weniger als 200 nm.
   2. Verwenden Sie ImageJ, um eine Linie über das kleinste Partikel im Bild zu zeichnen.
   3. Drücken Sie K , um das Intensitätsprofil darzustellen.
   4. Klicken Sie im Popup-Fenster auf Liste und kopieren Sie die Informationen in die passende Software.
   5. Zeichnen Sie das Profil in der Beschlagsoftware auf und verwenden Sie Gaußsches Fitting (klicken Sie auf Analyse | Anpassung | Nichtlineare Kurvenanpassung | Dialog öffnen | Kategorie: Grundfunktionen; Funktion: Gauss).
   6. Lesen Sie die Spitzenbreite nach dem Anpassen ab. Verwenden Sie die Pixel-zu-Größe-Konvertierung, um die tatsächliche Auflösung des Mikroskops zu erhalten.

3. Vorbereitung der Proben für die hyperspektrale CRS-Bildgebung

1. Vorbereitung von bildgebenden Objektträgern und chemischen Proben
   1. Legen Sie ein Stück doppelseitiges Klebeband auf ein Deckglas und schneiden Sie eine kleine rechteckige Form des Bandes von der Mitte des platzierten Bandes aus, um einen offenen Bereich für die zu platzierende Probe zu schaffen.
   2. Pipette 1-2 μL reines DMSO und dosieren Sie das Tröpfchen in der Mitte des Leerstands.
   3. Legen Sie das obere Deckglas vorsichtig auf und drücken Sie vorsichtig auf die Kanten der Deckgläser, um die Kammer zu versiegeln, während Sie sicherstellen, dass die DMSO-Probe nicht mit den Rändern des Bandes in Berührung kommt.
   4. Für Sensitivitätsexperimente sind serielle Verdünnungen von DMSO in Deuteriumoxid (_D2O) herzustellen, um einen Konzentrationsbereich von 50%-0% zu erhalten. Nehmen Sie 1-2 μL jeder Lösung und bereiten Sie gepresste Proben wie oben beschrieben vor.
2. Zellpräparation
   1. Säen Sie die Zellen in einer 35 mm großen Glasbodenschale (oder größer) in Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin.
   2. Inkubieren Sie die Zellen in einer Inkubationskammer bei 37 °C mit einer 5% CO_{2-Atmosphäre} über Nacht oder länger, bis ~ 50% -80% Konfluenz erreicht ist.
   3. Stellen Sie die lebenden Zellen direkt dar oder fixieren Sie die Zellen mit einer 10% igen Formalinlösung für die Bildgebung.

Vergleiche der spektralen Auflösung
Abbildung 2 vergleicht die spektrale Auflösung der hyperspektralen SRS- (Abbildung 2A) und CARS- (Abbildung 2B) Mikroskopie unter Verwendung einer DMSO-Probe. Für das SRS-Spektrum wurden zwei Lorentzsche Funktionen (siehe Protokollschritt 2.3) angewendet, um in das Spektrum zu passen, und eine Auflösung von 14,6 ^cm-1 wurde unter Verwendung des 2.913 ^cm-1-Peaks erhalten. Für CARS wurde für die Anpassung eine Zwei-Peak-Fitting-Funktion mit Gauß-Hintergrund (siehe Protokollschritt 2.3) verwendet, die die spektrale Auflösung von 17,1 ^cm-1 ergab. Diese Ergebnisse zeigen, dass SRS unter der gleichen Messbedingung eine bessere spektrale Auflösung als CARS hat. Die reduzierte spektrale Auflösung in CARS wird hauptsächlich durch die Einbeziehung des nicht-resonanten Hintergrunds beigetragen. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die symmetrischen (2.913 ^cm-1) und asymmetrischen (2.995 ^cm-1) Spitzenverhältnisse für SRS und CARS sehr unterschiedlich waren. Dies liegt an den unterschiedlichen Signalkorrelationen mit der nichtlinearen optischen Suszeptibilität dritter Ordnung, wie sie in den Gleichungen (1) und (2) beschrieben sind. Mit der quadratischen Abhängigkeit von CARS wird der Intensitätsunterschied zwischen den beiden Peaks verstärkt. Die symmetrischen Linienformen der SRS-Peaks und die asymmetrischen Linienformen der CARS-Peaks können im Spektrum beobachtet werden. Die Asymmetrie im CARS-Signal ist hauptsächlich auf das Vorhandensein der nicht resonanten Hintergrundstörung zurückzuführen. Die CARS-Spektralpeaks erscheinen leicht rotverschoben (1-2 cm-1) zu den ^SRS-Peaks. Dies ergibt sich auch aus der nicht-resonanten Hintergrundinterferenz mit resonanten Peaks.

Vergleiche der Detektionsempfindlichkeit
Abbildung 3 vergleicht die Detektionsempfindlichkeit von hyperspektraler SRS- und CARS-Mikroskopie. Zuerst werden die SNR der DMSO-SRS-Signale (2.913 cm-1) als Funktion der ^{DMSO-Konzentration in D2O} bei hohen Konzentrationen aufgetragen (1%-50%, Abbildung 3A). Die Ergebnisse zeigen eine lineare Beziehung, die Gleichung (2) erfüllt. Abbildung 3B zeigt die DMSO-Spektren bei Konzentrationen von 0,1 % und 0,01 %, wobei der Peak von 2.913 ^cm-1 in ersterem aufgelöst werden kann, in letzterem jedoch nicht, was darauf hinweist, dass die Nachweisgrenze zwischen 0,1% und 0,01% DMSO liegt. Unter Verwendung der Leerzeichengrenze schätzten wir, dass die SRS-Erkennungsgrenze 0,021% DMSO beträgt. Abbildung 3C stellt das CARS SNR als Funktion der DMSO-Konzentration (1%-50%) dar und zeigt eine quadratische Abhängigkeit in Übereinstimmung mit Gleichung (1). Die phasenabgerufenen CARS-Spektren sind in Abbildung 3D für das DMSO von 0,1 % und 0,01 % dargestellt. Um diese Spektren zu erreichen, wurde eine spektrale Phasenabrufmethode verwendet, die auf Kramers-Kronig-Beziehungen basiert, und es wurde eine zusätzliche Hintergrundentfernung durchgeführt¹⁶. Ähnlich wie bei den SRS-Spektren kann der DMSO 2.913 ^cm-1-Peak für den DMSO von 0,1% eindeutig aufgelöst werden, nicht jedoch für den 0,01%, was auf eine Nachweisgrenze zwischen diesen beiden Konzentrationen hinweist. Unter Verwendung der Grenze der Leerkriterien schätzten wir, dass die SRS-Nachweisgrenze 0,015% DMSO beträgt. Die 0,02% DMSO entsprechen 2,8 mM. Daher liegt die Nachweisgrenze des hier verwendeten hyperspektralen CRS-Mikroskops bei ~2,1-2,8 mM DMSO.

Vergleiche der räumlichen Auflösung
Abbildung 4 vergleicht die Auflösung eines kleinen zellulären Merkmals, das in SRS- (Abbildung 4A) und CARS- (Abbildung 4B) Bildern erkannt wurde. Die Intensitätsprofile aus derselben Zeile werden angezeigt und mit einer Gauß-Funktion angepasst, um FWHM-Werte für den Auflösungsvergleich zu ermitteln. Das SRS-Signal lieferte eine Auflösung von 398,6 nm (Abbildung 4C), während das CARS-Signal eine Auflösung von 330,3 nm ergab (Abbildung 4D). Die Auflösung von CARS war ~1,2x besser als die des SRS. Der Grund für die Auflösungsdifferenz liegt ebenfalls in den Gleichungen (1) und (2). Sowohl Pump- als auch Stokes-Strahlen haben eine Gauß-Punktspreizfunktion am Fokus. Das Signal von CARS ist dann proportional zur Multiplikation von drei Gaußschen Funktionen, wodurch die Breite grob um den Faktor √3 reduziert wird. Ebenso wird bei SRS die Breite um den Faktor √2 reduziert. Daher war die Auflösung von CARS √3/√2 = 1,2-mal besser als die des SRS.

Vergleiche der Bilder von Zellen
Abbildung 5 vergleicht SRS- und CARS-Bilder von MIA PaCa-2-Zellen an verschiedenen optischen Verzögerungspositionen. Abbildung 5A zeigt die SRS-Bilder mit der optischen Verzögerung, die das stärkste Signal lieferte. In diesem Bild können Lipidtröpfchen (LDs), endoplasmatisches Retikulum (ER) und Kern (NU) nachgewiesen werden, wobei LDs die stärksten Signale als helle Punkte zeigen. Abbildung 5B zeigt das CARS-Kanalbild mit der gleichen optischen Verzögerung und weist für LDs stark reduzierte Kontraste auf. Die Hauptgründe für diesen Kontrastunterschied sind das Vorhandensein des nicht resonanten Hintergrunds und die Rotverschiebung desselben Raman-Peaks in CARS-Spektren. Bei dieser optischen Verzögerung hat das erzeugte Signal einen großen Beitrag vom nicht resonanten Hintergrund des Wassers. Um den Lipidkontrast in CARS zu erhöhen, wurde die optische Verzögerung auf einen rotverschobenen Wert abgestimmt. Die Rotverschiebung verbesserte die Lipidkontraste, indem sie sowohl für SRS (Abbildung 5C) als auch für CARS (Abbildung 5D) mehr Energie auf die 2.850 ^cm-1 konzentrierte, obwohl der Gesamtsignalpegel reduziert wurde. Für CARS wurde ein ähnlicher Kontrast von LDs wie SRS durch eine ~ 98 cm-1 Rotverschiebung in der spektralen Fokussierung erreicht (Abbildung 5D), obwohl immer noch ein höherer Hintergrund als der im ^SRS-Bild beobachtet wurde. Bei dieser optischen Verzögerung zeigt das SRS-Bild viel weniger Protein- und Nukleinsäuregehalte, sondern starke Lipidgehalte in LDs, ER und Zellmembranen (Abbildung 5C).

CARS ist ein parametrischer Prozess, während SRS nicht parametrisch ist. Ein solcher Unterschied trägt auch zu Kontrastunterschieden in den beiden Modalitäten bei. Die parametrischen CARS-Signale werden durch die Interferenz von CARS-Signalen aus verschiedenen Schichten in der Nähe des Laserfokus bestimmt, die negative Kontraste aufweisen können, wie durch Pfeile in Abbildung 5B und Abbildung 5D (ebenfalls in Abbildung 4B) angezeigt. Solche signalinterferenzinduzierten negativen Kontraste fehlen in den SRS-Bildern. Der negative Kontrast in CARS könnte Aufschluss über die axiale Position des interessierenden Ziels geben.

Die SRS-Signale haben eine lineare Beziehung zur molekularen Konzentration, während die CARS-Signale eine nahezu quadratische Konzentrationsabhängigkeit erfüllen. Daher zeigen die CH_2-reichen LDs im CARS-Bild ein viel stärkeres Signal als die Notaufnahme und die Zellmembranen als im SRS-Bild (Abbildung 5E,F). Die SRS-Spektren können aus hyperspektralen Bildern extrahiert werden. Abbildung 5G zeigt die typischen SRS-Spektren von LDs, ER, Zytosol (CY) und NU. Sowohl die Intensität als auch die Spektralform sind für verschiedene Zellkompartimente unterschiedlich. LD zeigt mit 2.850 ^cm-1 ein viel stärkeres Signal als andere Organellen. Was CARS betrifft, so können ähnliche Spektren, obwohl unterschiedliche Formen, erhalten werden. Die rohen CARS-Spektren zeigen eine kleine Rotverschiebung im Vergleich zu den entsprechenden SRS-Spektren. Der spektrale Phasenabruf kann weiter verwendet werden, um die Raman-Reaktionen mithilfe der CARS-Spektren zu extrahieren.

Abbildung 1: Ein Schema des hyperspektralen CARS/SRS-Mikroskops. Abkürzungen: CARS = kohärente Anti-Stokes-Raman-Streuung; SRS = stimulierte Raman-Streuung; PBS = Polarisationsstrahlteiler; PD = Fotodiode; PMT = Photomultiplierröhre; AOM = akusto-optischer Modulator. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: DMSO-Spektren. (A) SRS- und (B) CARS-Spektren von DMSO. Punkte sind experimentelle Daten; Kurven sind spektrale Anpassungsergebnisse. Abkürzungen: CARS = kohärente Anti-Stokes-Raman-Streuung; SRS = stimulierte Raman-Streuung; DMSO = Dimethylsulfoxid; w = spektrale Auflösung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Signal-Rausch-Verhältnis und Spektren von DMSO. (A) Signal-Rausch-Verhältnis des symmetrischen DMSO-Peaks bei 2.913 ^cm-1 als Funktion der Konzentration in_D2O, gemessen mit SRS. Die Punkte sind experimentelle Daten; Die Linie ist das lineare Anpassungsergebnis. (B) Die SRS-Spektren von 0,1 % und 0,01 % DMSO in D 2 O. (C) Signal-Rausch-Verhältnis des symmetrischen DMSO-Peaks bei 2.913 ^cm-1 als Funktion der Konzentration in_D2O, gemessen mit CARS. Die Punkte sind experimentelle Daten; Die Kurve ist das Ergebnis der polynomischen Anpassung zweiten Grades. (D) Die CARS-Spektren von 0,1 % und 0,01 % DMSO in D₂O. Abkürzungen: CARS = kohärente Anti-Stokes-Raman-Streuung; SRS = stimulierte Raman-Streuung; DMSO = Dimethylsulfoxid; SNR = Signal-Rausch-Verhältnis; _D2O= Deuteriumoxid. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: SRS- und CARS-Bilder und Intensitätsprofile einer MIA PaCa-2-Zelle. (A) Ein SRS-Bild einer MIA PaCa-2-Zelle. (B) Ein CARS-Bild einer MIA PaCa-2-Zelle im selben Sichtfeld wie Panel A. (C) Intensitätsprofil des SRS entlang der gelben Linie in Feld A. (D) Intensitätsprofil von CARS entlang der gelben Linie in Panel B. Punkte sind experimentelle Daten; Kurven sind Gaußsche Funktionsanpassungsergebnisse. Maßstabsstäbe = 5 μm. Abkürzungen: CARS = kohärente Anti-Stokes-Raman-Streuung; SRS = stimulierte Raman-Streuung; w = Auflösung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5: Bilder und Intensitätsprofil von MIA PaCa-2-Zellen. (A) Ein SRS-Bild von MIA PaCa-2-Zellen mit der für die SRS-Intensität optimierten Zeitverzögerung. (B) Ein CARS-Bild mit der gleichen Verzögerung wie in Panel A. (C) Ein SRS-Bild bei den 98 ^cm-1 rotverschobenen Verzögerungen wie in Panel A. (D) Ein CARS-Bild mit der gleichen optischen Verzögerung wie in Panel C. (E,F) Die SRS- und CARS-Intensitätsprofile sind entlang der gepunkteten Linien in den Feldern A und D dargestellt. (G) Typische SRS-Spektren aus den Lipidtröpfchen, dem endoplasmatischen Retikulum, dem Zytosol und dem Kern. (H) Typische CARS-Spektren der vier zellulären Zusammensetzungen. Die grünen und roten gepunkteten Linien sind Verzögerungspositionen für die Panels A/B bzw. C/D. Maßstabsstäbe = 10 μm. Abkürzungen: CARS = kohärente Anti-Stokes-Raman-Streuung; SRS = stimulierte Raman-Streuung; LD = Lipidtröpfchen; ER = endoplasmatisches Retikulum; CY = Zytosol; NU = Kern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ergänzende Datei: Im Labor geschriebene Software, die auf LabVIEW basiert und über eine simultane Mehrkanalanzeige für die Anzeige und Speicherung von Bildern in Echtzeit verfügt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt den Aufbau eines multimodalen CRS-Mikroskops und den direkten Vergleich zwischen CARS- und SRS-Bildgebung. Für die Mikroskopkonstruktion sind die kritischen Schritte räumliche und zeitliche Strahlüberlappung und Strahlgrößenoptimierung. Es wird empfohlen, vor der biologischen Bildgebung eine Standardprobe wie DMSO zur Optimierung von SNR und Kalibrierung von Raman-Verschiebungen zu verwenden. Der direkte Vergleich zwischen CARS- und SRS-Bildern zeigt, dass CARS eine bessere räumliche Auflösung hat, während SRS eine bessere spektrale Auflösung und weniger komplizierte chemische Kontraste liefert. Sowohl CARS als auch SRS haben ähnliche Nachweisgrenzen.

CARS und SRS-Bildgebung verwenden Hochenergie-Pulslaser zur Anregung. Dies ermöglicht es der Plattform, andere nichtlineare optische Bildgebungsmodalitäten wie Multiphotonenanregungsfluoreszenz, harmonische Erzeugung und transiente Absorption für zusätzliche chemische Kontraste^{zu integrieren 28,39}.

CARS und SRS wurden ausgiebig verwendet, um die Lipidzusammensetzung mit hoher chemischer Selektivität zu untersuchen. Die Technologien beschränken sich jedoch nicht auf die Quantifizierung von Lipiden. SRS wurde angewendet, um die Arzneimittelverteilung⁴², die Proteinsynthese⁴³ und die DNA⁴⁴ abzubilden. CARS und SRS wurden auch angewendet, um pharmazeutische Inhaltsstoffe und Hilfsstoffe in Tabletten^45,46,47,48 abzubilden. Hyperspektrale CARS und SRS haben Anwendungen in der Krebsdiagnose⁴⁹, der Bewertung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen⁵⁰ und der neuronalen Bildgebung⁵¹ gefunden. Sie können auch für COVID-19-Studien^{beantragt werden 52}. Breitband-CARS, das Spektralfenster von bis zu 3.000 ^cm-1 abdecken kann, kann reiche chemische Strukturen in biologischen Proben^{aufklären 53}. Aufgrund der langsamen Ausleserate des CCD liegt die Pixelverweilzeit jedoch auf dem Niveau von Millisekunden, viel langsamer als die Mikrosekunden-Pixelverweilzeit für die SRS-Mikroskopie³⁴. Die hyperspektrale SRS-Mikroskopie hat derzeit eine typische Bandbreite von 200-300 cm-1, begrenzt durch die Laserbandbreite und das Fehlen von Lock-in-integrierten ^{Array-Detektoren 34}. Die Fourier-Transformations-SRS-Mikroskopie ist eine alternative Möglichkeit, die SRS-Spektralabdeckung³⁵ potenziell zu erweitern.

Obwohl CARS und SRS reichhaltige chemische Informationen liefern, ohne dass eine Markierung erforderlich ist, liegt die chemische Selektivität in chemischen Bindungen, was es schwierig macht, bestimmte Proteine zu unterscheiden. Raman-Tags haben das Potenzial gezeigt, die chemische Selektivität von CARS und SRS^54,55 zu verbessern. Die kohärente Raman-Bildgebung hat jedoch im Vergleich zur Fluoreszenzdetektion immer noch eine viel geringere Empfindlichkeit. Die Oberflächenverbesserung wurde für die spontane Raman-Streuspektroskopie verwendet, um die Signalpegel⁵⁶ zu verbessern. Es wurde auch auf CARS und SRS zur Signalverstärkung^57,58,59 angewendet. Obwohl der Verstärkungsfaktor nicht so hoch ist wie die spontane Raman-Streuung, zeigt die oberflächenverstärkte CARS- und SRS-Mikroskopie immer noch das Potenzial, einzelne Moleküle zu detektieren ^59,60. Dennoch entzieht die Verwendung von Metallpartikeln oder Oberflächen den Vorteil des markierungsfreien Ansatzes. Die Verbesserung der Empfindlichkeit der kohärenten Raman-Mikroskopie ohne Verwendung von Metalloberflächen würde die Anwendung der Technologie in den Biowissenschaften erheblich erweitern.

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Diese Forschung wurde vom Startup-Fonds des Purdue University Department of Chemistry unterstützt.