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Dieses Papier vergleicht direkt die Auflösung, Empfindlichkeit und Bildkontraste der stimulierten Raman-Streuung (SRS) und der kohärenten Anti-Stokes-Raman-Streuung (CARS), die in dieselbe Mikroskopplattform integriert sind. Die Ergebnisse zeigen, dass CARS eine bessere räumliche Auflösung hat, SRS bessere Kontraste und spektrale Auflösung liefert und beide Methoden eine ähnliche Empfindlichkeit aufweisen.
Die stimulierte Raman-Streuung (SRS) und die kohärente Anti-Stokes-Raman-Streuung (CARS) sind die am weitesten verbreiteten kohärenten Raman-Streubildgebungstechnologien. Hyperspektrale SRS- und CARS-Bildgebung bieten Raman-Spektralinformationen an jedem Pixel, was eine bessere Trennung verschiedener chemischer Zusammensetzungen ermöglicht. Obwohl beide Techniken zwei Anregungslaser erfordern, sind ihre Signaldetektionsschemata und spektralen Eigenschaften sehr unterschiedlich. Das Ziel dieses Protokolls ist es, sowohl hyperspektrale SRS- als auch CARS-Bildgebung auf einer einzigen Plattform durchzuführen und die beiden Mikroskopietechniken zur Abbildung verschiedener biologischer Proben zu vergleichen. Die Spektralfokussierungsmethode wird verwendet, um Spektralinformationen mit Femtosekundenlasern zu erfassen. Durch die Verwendung chemischer Standardproben werden die Empfindlichkeit, die räumliche Auflösung und die spektrale Auflösung von SRS und CARS unter den gleichen Anregungsbedingungen (d. h. Leistung an der Probe, Pixelverweilzeit, Objektivlinse, Pulsenergie) verglichen. Die bildgebenden Kontraste von CARS und SRS für biologische Proben werden gegenübergestellt und verglichen. Der direkte Vergleich von CARS- und SRS-Leistungen würde eine optimale Auswahl der Modalität für die chemische Bildgebung ermöglichen.
Das Raman-Streuungsphänomen wurde erstmals 1928 von C. V. Raman1 beobachtet. Wenn ein einfallendes Photon mit einer Probe interagiert, kann spontan ein inelastisches Streuereignis auftreten, bei dem die Energieänderung des Photons mit einem Schwingungsübergang der analysierten chemischen Spezies übereinstimmt. Dieser Prozess erfordert nicht die Verwendung eines chemischen Tags und ist somit ein vielseitiges, etikettenfreies Werkzeug für die chemische Analyse bei gleichzeitiger Minimierung der Probenstörung. Trotz ihrer Vorteile leidet die spontane Raman-Streuung unter einem geringen Streuquerschnitt (typischerweise 1011 niedriger als der Infrarot-Absorptionsquerschnitt [IR]), was lange Erfassungszeiten für die Analyseerforderlich macht 2. Daher ist das Bestreben, die Empfindlichkeit des Raman-Streuprozesses zu erhöhen, unerlässlich, um Raman-Technologien für die Echtzeit-Bildgebung voranzutreiben.
Eine effektive Möglichkeit, die Empfindlichkeit der Raman-Streuung erheblich zu erhöhen, sind kohärente Raman-Streuprozesse (CRS), für die typischerweise zwei Laserpulse verwendet werden, um molekulare Schwingungsübergängeanzuregen 3,4. Wenn die Photonen-Energiedifferenz zwischen den beiden Lasern mit den Schwingungsmoden von Probenmolekülen übereinstimmt, werden starke Raman-Signale erzeugt. Die beiden am häufigsten verwendeten CRS-Verfahren für die Bildgebung sind kohärente Anti-Stokes-Raman-Streuung (CARS) und stimulierte Raman-Streuung (SRS)5. In den letzten zwei Jahrzehnten haben technologische Entwicklungen CARS- und SRS-Mikroskopietechniken zu leistungsfähigen Werkzeugen für die markierungsfreie Quantifizierung und Aufklärung chemischer Veränderungen in biologischen Proben gemacht.
Die chemische Bildgebung durch CARS-Mikroskopie kann auf das Jahr 1982 datiert werden, als Laserscanning zum ersten Mal angewendet wurde, um CARS-Bilder zu erfassen, demonstriert von Duncan et al6. Die Modernisierung der CARS-Mikroskopie wurde nach den breiten Anwendungen der Laser-Scanning-Multiphotonen-Fluoreszenzmikroskopiestark beschleunigt 7. Frühe Arbeiten der Xie-Gruppe, die Laser mit hoher Wiederholungsrate verwenden, haben CARS zu einer schnellen, markierungsfreien, chemischen Bildgebungsplattform für die Charakterisierung von Molekülen in biologischen Probenentwickelt 8,9,10. Eines der Hauptprobleme für die CARS-Bildgebung ist das Vorhandensein eines nicht resonanten Hintergrunds, der den Bildkontrast reduziert und das Raman-Spektrum verzerrt. Es wurden viele Anstrengungen unternommen, um entweder den nicht resonanten Hintergrund 11,12,13,14,15 zu reduzieren oder resonante Raman-Signale aus den CARS-Spektren 16,17 zu extrahieren. Ein weiterer Fortschritt, der das Feld stark vorangebracht hat, ist die hyperspektrale CARS-Bildgebung, die eine spektrale Kartierung an jedem Bildpixel mit verbesserter chemischer Selektivität 18,19,20,21 ermöglicht.
Die stimulierte Raman-Streuung (SRS) ist eine jüngere Bildgebungstechnologie als CARS, obwohl sie früher entdeckt wurde22. Im Jahr2007 wurde berichtet, dass die SRS-Mikroskopie eine Laserquelle mit niedriger Wiederholungsrate 23 verwendete. Bald demonstrierten mehrere Gruppen eine Hochgeschwindigkeits-SRS-Bildgebung mit Lasern mit hoher Wiederholungsrate24,25,26. Einer der Hauptvorteile der SRS-Mikroskopie gegenüber CARS ist das Fehlen des nicht-resonanten Hintergrunds27, obwohl andere Hintergründe wie Kreuzphasenmodulation (XPM), transiente Absorption (TA), Zwei-Photonen-Absorption (TPA) und photothermischer (PT) -Effekt bei SRS28 auftreten können. Darüber hinaus haben das SRS-Signal und die Probenkonzentration lineare Beziehungen, im Gegensatz zu CARS, das eine quadratische Signalkonzentrationsabhängigkeitaufweist 29. Dies vereinfacht die chemische Quantifizierung und spektrale Entmischung. Mehrfarbiges und hyperspektrales SRS hat sich in verschiedenen Formenentwickelt 30,31,32,33,34,35,36, wobei die spektrale Fokussierung einer der beliebtesten Ansätze für die chemische Bildgebung ist 37,38.
Sowohl CARS als auch SRS erfordern die Fokussierung der Pumpe und der Stokes-Laserstrahlen auf die Probe, um den Schwingungsübergang der Moleküle für die Signalanregung anzupassen. Auch CARS und SRS-Mikroskope haben viel gemeinsam. Die Physik, die diesen beiden Prozessen zugrunde liegt, und die Signaldetektionen, die an diesen Mikroskopietechnologien beteiligt sind, weisen jedoch Disparitätenauf 3,39. CARS ist ein parametrischer Prozess, der keine Netto-Photonen-Molekül-Energiekopplunghat 3. SRS ist jedoch ein nichtparametrischer Prozess und trägt zum Energietransfer zwischen Photonen und molekularen Systemen bei27. In CARS wird ein neues Signal bei Anti-Stokes-Frequenz erzeugt, während sich SRS als Energieübertragung zwischen der Pumpe und den Stokes-Laserstrahlen manifestiert.
CARS Signal erfüllt Eq (1)28.
(1)
In der Zwischenzeit kann das SRS-Signal als Eq (2) 28 geschrieben werden.
(2)
Hier sind I p, I s, I CARS und ΔISRS die Intensitäten des Pumpenstrahls, des Stokes-Strahls, des CARS-Signals bzw. der SRS-Signale. χ(3) ist die nichtlineare optische Suszeptibilität der Probe dritter Ordnung und ist ein komplexer Wert, der sich aus realen und imaginären Teilen zusammensetzt.
Diese Gleichungen drücken die Spektralprofile und die Signalkonzentrationsabhängigkeit von CARS und SRS aus. Unterschiede in der Physik führen zu unterschiedlichen Nachweisschemata für diese beiden Mikroskopietechnologien. Die Signaldetektion in CARS beinhaltet in der Regel die spektrale Trennung neu erzeugter Photonen und die Detektion mit einer Photomultiplierröhre (PMT) oder einem ladungsgekoppelten Gerät (CCD); Für SRS wird der Energieaustausch zwischen der Pumpe und Stokes-Strahlen normalerweise durch Hochgeschwindigkeitsintensitätsmodulation mit einem optischen Modulator und Demodulation mit einer Photodiode (PD) in Verbindung mit einem Lock-in-Verstärker gemessen.
Obwohl in den letzten Jahren viele technologische Entwicklungen und Anwendungen sowohl im CARS- als auch im SRS-Bereich veröffentlicht wurden, wurden keine systematischen Vergleiche der beiden CRS-Techniken auf derselben Plattform durchgeführt, insbesondere für die hyperspektrale CARS- und SRS-Mikroskopie. Direkte Vergleiche in Bezug auf Empfindlichkeit, räumliche Auflösung, spektrale Auflösung und chemische Trennfähigkeiten würden es Biologen ermöglichen, die beste Modalität für die chemische Quantifizierung auszuwählen. In diesem Protokoll werden detaillierte Schritte zum Aufbau einer multimodalen Bildgebungsplattform mit hyperspektralen CARS- und SRS-Modalitäten auf der Grundlage eines Femtosekundenlasersystems und einer spektralen Fokussierung bereitgestellt. Die beiden Techniken wurden in Vorwärtsrichtung für spektrale Auflösung, Detektionsempfindlichkeit, räumliche Auflösung und bildgebende Kontraste von Zellen verglichen.
1. Instrumenteller Aufbau für die hyperspektrale CRS-Bildgebung
HINWEIS: Die Erzeugung von CRS-Signalen erfordert die Verwendung von Hochleistungslasern (d. h. Klasse 3B oder Klasse 4). Sicherheitsprotokolle müssen beachtet werden, und bei Arbeiten mit solch hohen Spitzenleistungen muss jederzeit eine geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA) getragen werden. Konsultieren Sie die ordnungsgemäße Dokumentation, bevor Sie experimentieren. Dieses Protokoll konzentriert sich auf das Entwerfen des Strahlwegs, das Zwitschern der Femtosekundenpulse und die Optimierung der Bildgebungsbedingungen. Ein allgemeines optisches Layout dieses hyperspektralen CRS-Mikroskops ist in Abbildung 1 dargestellt. Die hier gezeigte Konfiguration ist eine von vielen vorhandenen Konfigurationen für die CRS-Mikroskopie. Das in diesem Protokoll verwendete CRS-Mikroskopiesystem basiert auf einer Femtosekunden-Laserquelle mit zwei Ausgängen und einem Laser-Scanning-Mikroskop.
2. Bildanalyse und Datenverarbeitung
3. Vorbereitung der Proben für die hyperspektrale CRS-Bildgebung
Vergleiche der spektralen Auflösung
Abbildung 2 vergleicht die spektrale Auflösung der hyperspektralen SRS- (Abbildung 2A) und CARS- (Abbildung 2B) Mikroskopie unter Verwendung einer DMSO-Probe. Für das SRS-Spektrum wurden zwei Lorentzsche Funktionen (siehe Protokollschritt 2.3) angewendet, um in das Spektrum zu passen, und eine Auflösung von 14,6 cm-1 wurde unter Verwendung des 2.913 cm-1-Peaks erhalten. Für CARS wurde für die Anpassung eine Zwei-Peak-Fitting-Funktion mit Gauß-Hintergrund (siehe Protokollschritt 2.3) verwendet, die die spektrale Auflösung von 17,1 cm-1 ergab. Diese Ergebnisse zeigen, dass SRS unter der gleichen Messbedingung eine bessere spektrale Auflösung als CARS hat. Die reduzierte spektrale Auflösung in CARS wird hauptsächlich durch die Einbeziehung des nicht-resonanten Hintergrunds beigetragen. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die symmetrischen (2.913 cm-1) und asymmetrischen (2.995 cm-1) Spitzenverhältnisse für SRS und CARS sehr unterschiedlich waren. Dies liegt an den unterschiedlichen Signalkorrelationen mit der nichtlinearen optischen Suszeptibilität dritter Ordnung, wie sie in den Gleichungen (1) und (2) beschrieben sind. Mit der quadratischen Abhängigkeit von CARS wird der Intensitätsunterschied zwischen den beiden Peaks verstärkt. Die symmetrischen Linienformen der SRS-Peaks und die asymmetrischen Linienformen der CARS-Peaks können im Spektrum beobachtet werden. Die Asymmetrie im CARS-Signal ist hauptsächlich auf das Vorhandensein der nicht resonanten Hintergrundstörung zurückzuführen. Die CARS-Spektralpeaks erscheinen leicht rotverschoben (1-2 cm-1) zu den SRS-Peaks. Dies ergibt sich auch aus der nicht-resonanten Hintergrundinterferenz mit resonanten Peaks.
Vergleiche der Detektionsempfindlichkeit
Abbildung 3 vergleicht die Detektionsempfindlichkeit von hyperspektraler SRS- und CARS-Mikroskopie. Zuerst werden die SNR der DMSO-SRS-Signale (2.913 cm-1) als Funktion der DMSO-Konzentration in D2O bei hohen Konzentrationen aufgetragen (1%-50%, Abbildung 3A). Die Ergebnisse zeigen eine lineare Beziehung, die Gleichung (2) erfüllt. Abbildung 3B zeigt die DMSO-Spektren bei Konzentrationen von 0,1 % und 0,01 %, wobei der Peak von 2.913 cm-1 in ersterem aufgelöst werden kann, in letzterem jedoch nicht, was darauf hinweist, dass die Nachweisgrenze zwischen 0,1% und 0,01% DMSO liegt. Unter Verwendung der Leerzeichengrenze schätzten wir, dass die SRS-Erkennungsgrenze 0,021% DMSO beträgt. Abbildung 3C stellt das CARS SNR als Funktion der DMSO-Konzentration (1%-50%) dar und zeigt eine quadratische Abhängigkeit in Übereinstimmung mit Gleichung (1). Die phasenabgerufenen CARS-Spektren sind in Abbildung 3D für das DMSO von 0,1 % und 0,01 % dargestellt. Um diese Spektren zu erreichen, wurde eine spektrale Phasenabrufmethode verwendet, die auf Kramers-Kronig-Beziehungen basiert, und es wurde eine zusätzliche Hintergrundentfernung durchgeführt16. Ähnlich wie bei den SRS-Spektren kann der DMSO 2.913 cm-1-Peak für den DMSO von 0,1% eindeutig aufgelöst werden, nicht jedoch für den 0,01%, was auf eine Nachweisgrenze zwischen diesen beiden Konzentrationen hinweist. Unter Verwendung der Grenze der Leerkriterien schätzten wir, dass die SRS-Nachweisgrenze 0,015% DMSO beträgt. Die 0,02% DMSO entsprechen 2,8 mM. Daher liegt die Nachweisgrenze des hier verwendeten hyperspektralen CRS-Mikroskops bei ~2,1-2,8 mM DMSO.
Vergleiche der räumlichen Auflösung
Abbildung 4 vergleicht die Auflösung eines kleinen zellulären Merkmals, das in SRS- (Abbildung 4A) und CARS- (Abbildung 4B) Bildern erkannt wurde. Die Intensitätsprofile aus derselben Zeile werden angezeigt und mit einer Gauß-Funktion angepasst, um FWHM-Werte für den Auflösungsvergleich zu ermitteln. Das SRS-Signal lieferte eine Auflösung von 398,6 nm (Abbildung 4C), während das CARS-Signal eine Auflösung von 330,3 nm ergab (Abbildung 4D). Die Auflösung von CARS war ~1,2x besser als die des SRS. Der Grund für die Auflösungsdifferenz liegt ebenfalls in den Gleichungen (1) und (2). Sowohl Pump- als auch Stokes-Strahlen haben eine Gauß-Punktspreizfunktion am Fokus. Das Signal von CARS ist dann proportional zur Multiplikation von drei Gaußschen Funktionen, wodurch die Breite grob um den Faktor √3 reduziert wird. Ebenso wird bei SRS die Breite um den Faktor √2 reduziert. Daher war die Auflösung von CARS √3/√2 = 1,2-mal besser als die des SRS.
Vergleiche der Bilder von Zellen
Abbildung 5 vergleicht SRS- und CARS-Bilder von MIA PaCa-2-Zellen an verschiedenen optischen Verzögerungspositionen. Abbildung 5A zeigt die SRS-Bilder mit der optischen Verzögerung, die das stärkste Signal lieferte. In diesem Bild können Lipidtröpfchen (LDs), endoplasmatisches Retikulum (ER) und Kern (NU) nachgewiesen werden, wobei LDs die stärksten Signale als helle Punkte zeigen. Abbildung 5B zeigt das CARS-Kanalbild mit der gleichen optischen Verzögerung und weist für LDs stark reduzierte Kontraste auf. Die Hauptgründe für diesen Kontrastunterschied sind das Vorhandensein des nicht resonanten Hintergrunds und die Rotverschiebung desselben Raman-Peaks in CARS-Spektren. Bei dieser optischen Verzögerung hat das erzeugte Signal einen großen Beitrag vom nicht resonanten Hintergrund des Wassers. Um den Lipidkontrast in CARS zu erhöhen, wurde die optische Verzögerung auf einen rotverschobenen Wert abgestimmt. Die Rotverschiebung verbesserte die Lipidkontraste, indem sie sowohl für SRS (Abbildung 5C) als auch für CARS (Abbildung 5D) mehr Energie auf die 2.850 cm-1 konzentrierte, obwohl der Gesamtsignalpegel reduziert wurde. Für CARS wurde ein ähnlicher Kontrast von LDs wie SRS durch eine ~ 98 cm-1 Rotverschiebung in der spektralen Fokussierung erreicht (Abbildung 5D), obwohl immer noch ein höherer Hintergrund als der im SRS-Bild beobachtet wurde. Bei dieser optischen Verzögerung zeigt das SRS-Bild viel weniger Protein- und Nukleinsäuregehalte, sondern starke Lipidgehalte in LDs, ER und Zellmembranen (Abbildung 5C).
CARS ist ein parametrischer Prozess, während SRS nicht parametrisch ist. Ein solcher Unterschied trägt auch zu Kontrastunterschieden in den beiden Modalitäten bei. Die parametrischen CARS-Signale werden durch die Interferenz von CARS-Signalen aus verschiedenen Schichten in der Nähe des Laserfokus bestimmt, die negative Kontraste aufweisen können, wie durch Pfeile in Abbildung 5B und Abbildung 5D (ebenfalls in Abbildung 4B) angezeigt. Solche signalinterferenzinduzierten negativen Kontraste fehlen in den SRS-Bildern. Der negative Kontrast in CARS könnte Aufschluss über die axiale Position des interessierenden Ziels geben.
Die SRS-Signale haben eine lineare Beziehung zur molekularen Konzentration, während die CARS-Signale eine nahezu quadratische Konzentrationsabhängigkeit erfüllen. Daher zeigen die CH2-reichen LDs im CARS-Bild ein viel stärkeres Signal als die Notaufnahme und die Zellmembranen als im SRS-Bild (Abbildung 5E,F). Die SRS-Spektren können aus hyperspektralen Bildern extrahiert werden. Abbildung 5G zeigt die typischen SRS-Spektren von LDs, ER, Zytosol (CY) und NU. Sowohl die Intensität als auch die Spektralform sind für verschiedene Zellkompartimente unterschiedlich. LD zeigt mit 2.850 cm-1 ein viel stärkeres Signal als andere Organellen. Was CARS betrifft, so können ähnliche Spektren, obwohl unterschiedliche Formen, erhalten werden. Die rohen CARS-Spektren zeigen eine kleine Rotverschiebung im Vergleich zu den entsprechenden SRS-Spektren. Der spektrale Phasenabruf kann weiter verwendet werden, um die Raman-Reaktionen mithilfe der CARS-Spektren zu extrahieren.
Abbildung 1: Ein Schema des hyperspektralen CARS/SRS-Mikroskops. Abkürzungen: CARS = kohärente Anti-Stokes-Raman-Streuung; SRS = stimulierte Raman-Streuung; PBS = Polarisationsstrahlteiler; PD = Fotodiode; PMT = Photomultiplierröhre; AOM = akusto-optischer Modulator. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: DMSO-Spektren. (A) SRS- und (B) CARS-Spektren von DMSO. Punkte sind experimentelle Daten; Kurven sind spektrale Anpassungsergebnisse. Abkürzungen: CARS = kohärente Anti-Stokes-Raman-Streuung; SRS = stimulierte Raman-Streuung; DMSO = Dimethylsulfoxid; w = spektrale Auflösung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Signal-Rausch-Verhältnis und Spektren von DMSO. (A) Signal-Rausch-Verhältnis des symmetrischen DMSO-Peaks bei 2.913 cm-1 als Funktion der Konzentration inD2O, gemessen mit SRS. Die Punkte sind experimentelle Daten; Die Linie ist das lineare Anpassungsergebnis. (B) Die SRS-Spektren von 0,1 % und 0,01 % DMSO in D 2 O. (C) Signal-Rausch-Verhältnis des symmetrischen DMSO-Peaks bei 2.913 cm-1 als Funktion der Konzentration inD2O, gemessen mit CARS. Die Punkte sind experimentelle Daten; Die Kurve ist das Ergebnis der polynomischen Anpassung zweiten Grades. (D) Die CARS-Spektren von 0,1 % und 0,01 % DMSO in D2O. Abkürzungen: CARS = kohärente Anti-Stokes-Raman-Streuung; SRS = stimulierte Raman-Streuung; DMSO = Dimethylsulfoxid; SNR = Signal-Rausch-Verhältnis; D2O= Deuteriumoxid. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: SRS- und CARS-Bilder und Intensitätsprofile einer MIA PaCa-2-Zelle. (A) Ein SRS-Bild einer MIA PaCa-2-Zelle. (B) Ein CARS-Bild einer MIA PaCa-2-Zelle im selben Sichtfeld wie Panel A. (C) Intensitätsprofil des SRS entlang der gelben Linie in Feld A. (D) Intensitätsprofil von CARS entlang der gelben Linie in Panel B. Punkte sind experimentelle Daten; Kurven sind Gaußsche Funktionsanpassungsergebnisse. Maßstabsstäbe = 5 μm. Abkürzungen: CARS = kohärente Anti-Stokes-Raman-Streuung; SRS = stimulierte Raman-Streuung; w = Auflösung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Bilder und Intensitätsprofil von MIA PaCa-2-Zellen. (A) Ein SRS-Bild von MIA PaCa-2-Zellen mit der für die SRS-Intensität optimierten Zeitverzögerung. (B) Ein CARS-Bild mit der gleichen Verzögerung wie in Panel A. (C) Ein SRS-Bild bei den 98 cm-1 rotverschobenen Verzögerungen wie in Panel A. (D) Ein CARS-Bild mit der gleichen optischen Verzögerung wie in Panel C. (E,F) Die SRS- und CARS-Intensitätsprofile sind entlang der gepunkteten Linien in den Feldern A und D dargestellt. (G) Typische SRS-Spektren aus den Lipidtröpfchen, dem endoplasmatischen Retikulum, dem Zytosol und dem Kern. (H) Typische CARS-Spektren der vier zellulären Zusammensetzungen. Die grünen und roten gepunkteten Linien sind Verzögerungspositionen für die Panels A/B bzw. C/D. Maßstabsstäbe = 10 μm. Abkürzungen: CARS = kohärente Anti-Stokes-Raman-Streuung; SRS = stimulierte Raman-Streuung; LD = Lipidtröpfchen; ER = endoplasmatisches Retikulum; CY = Zytosol; NU = Kern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzende Datei: Im Labor geschriebene Software, die auf LabVIEW basiert und über eine simultane Mehrkanalanzeige für die Anzeige und Speicherung von Bildern in Echtzeit verfügt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt den Aufbau eines multimodalen CRS-Mikroskops und den direkten Vergleich zwischen CARS- und SRS-Bildgebung. Für die Mikroskopkonstruktion sind die kritischen Schritte räumliche und zeitliche Strahlüberlappung und Strahlgrößenoptimierung. Es wird empfohlen, vor der biologischen Bildgebung eine Standardprobe wie DMSO zur Optimierung von SNR und Kalibrierung von Raman-Verschiebungen zu verwenden. Der direkte Vergleich zwischen CARS- und SRS-Bildern zeigt, dass CARS eine bessere räumliche Auflösung hat, während SRS eine bessere spektrale Auflösung und weniger komplizierte chemische Kontraste liefert. Sowohl CARS als auch SRS haben ähnliche Nachweisgrenzen.
CARS und SRS-Bildgebung verwenden Hochenergie-Pulslaser zur Anregung. Dies ermöglicht es der Plattform, andere nichtlineare optische Bildgebungsmodalitäten wie Multiphotonenanregungsfluoreszenz, harmonische Erzeugung und transiente Absorption für zusätzliche chemische Kontrastezu integrieren 28,39.
CARS und SRS wurden ausgiebig verwendet, um die Lipidzusammensetzung mit hoher chemischer Selektivität zu untersuchen. Die Technologien beschränken sich jedoch nicht auf die Quantifizierung von Lipiden. SRS wurde angewendet, um die Arzneimittelverteilung42, die Proteinsynthese43 und die DNA44 abzubilden. CARS und SRS wurden auch angewendet, um pharmazeutische Inhaltsstoffe und Hilfsstoffe in Tabletten45,46,47,48 abzubilden. Hyperspektrale CARS und SRS haben Anwendungen in der Krebsdiagnose49, der Bewertung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen50 und der neuronalen Bildgebung51 gefunden. Sie können auch für COVID-19-Studienbeantragt werden 52. Breitband-CARS, das Spektralfenster von bis zu 3.000 cm-1 abdecken kann, kann reiche chemische Strukturen in biologischen Probenaufklären 53. Aufgrund der langsamen Ausleserate des CCD liegt die Pixelverweilzeit jedoch auf dem Niveau von Millisekunden, viel langsamer als die Mikrosekunden-Pixelverweilzeit für die SRS-Mikroskopie34. Die hyperspektrale SRS-Mikroskopie hat derzeit eine typische Bandbreite von 200-300 cm-1, begrenzt durch die Laserbandbreite und das Fehlen von Lock-in-integrierten Array-Detektoren 34. Die Fourier-Transformations-SRS-Mikroskopie ist eine alternative Möglichkeit, die SRS-Spektralabdeckung35 potenziell zu erweitern.
Obwohl CARS und SRS reichhaltige chemische Informationen liefern, ohne dass eine Markierung erforderlich ist, liegt die chemische Selektivität in chemischen Bindungen, was es schwierig macht, bestimmte Proteine zu unterscheiden. Raman-Tags haben das Potenzial gezeigt, die chemische Selektivität von CARS und SRS54,55 zu verbessern. Die kohärente Raman-Bildgebung hat jedoch im Vergleich zur Fluoreszenzdetektion immer noch eine viel geringere Empfindlichkeit. Die Oberflächenverbesserung wurde für die spontane Raman-Streuspektroskopie verwendet, um die Signalpegel56 zu verbessern. Es wurde auch auf CARS und SRS zur Signalverstärkung57,58,59 angewendet. Obwohl der Verstärkungsfaktor nicht so hoch ist wie die spontane Raman-Streuung, zeigt die oberflächenverstärkte CARS- und SRS-Mikroskopie immer noch das Potenzial, einzelne Moleküle zu detektieren 59,60. Dennoch entzieht die Verwendung von Metallpartikeln oder Oberflächen den Vorteil des markierungsfreien Ansatzes. Die Verbesserung der Empfindlichkeit der kohärenten Raman-Mikroskopie ohne Verwendung von Metalloberflächen würde die Anwendung der Technologie in den Biowissenschaften erheblich erweitern.
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Diese Forschung wurde vom Startup-Fonds des Purdue University Department of Chemistry unterstützt.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2D galvo scanner set | Thorlabs | GVS002 | |
Acousto-optic modulator | Isomet | M1205-P80L-0.5 | |
AOM driver | Isomet | 532B-2 | |
Data acquisition card | National Instruments | PCle 6363 | Custom ordered filter (980 sp) |
Delay stage | Zaber | X-LSM050A | |
Deuterium oxide | Millipore Sigma | 151882-100G | |
Dichroic mirror for beam combination | Thorlabs | DMLP1000 | |
Dichroic mirror for signal separation | Semrock | FF776-Di01-25x36 | |
DMSO | MiliporeSigma | 200-664-3 | |
MIA PaCa 2 Cells | ATCC | CRL-1420 | |
Femtosecond laser system | Spectral Physics | InSightX3+ | |
Filter for CARS | Chroma | AT655/30m | |
Filter for SRS | Chroma | ET980sp | |
Function generator | Rigol | DG1022Z | |
Glass rods | Lattice Electro Optics | SF-57 | |
Half-wave plate | Newport | 10RP02-51; 10RP02-46 | |
LabVIEW 2020 | National Instruments | This is the image acquisition software | |
Lock-in amplifier | Zurich Instrument | HF2LI | |
Microscope housing | Olympus | BX51W1 | |
Objective lens | Olympus | UPLSAPO60XW | |
Origin Pro 2019b | OriginLab Corporation | This is the spectral fitting software | |
Oscilloscope | Tektronix | TBS2204B | |
Photodiode | Hamamatsu | S3994-01 | |
PMT detector | Hamamatsu | H7422P-40 | |
PMT voltage amplifier | Advanced Research Instrument Corp. | PMT4V3 | |
Polarizing beamsplitter cube | Thorlabs | PBS255 | |
Terminal block | National Instruments | BNC-2110 |
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