화학 이미징을 위한 하이퍼스펙트럼 자극 라만 산란 및 일관된 안티스토크스 라만 산란 현미경의 직접 비교

이 논문은 동일한 현미경 플랫폼에 통합 된 자극 된 라만 산란 (SRS)과 일관된 스토크스 라만 산란 (CARS)의 해상도, 감도 및 이미징 대비를 직접 비교합니다. 결과는 CARS가 더 나은 공간 분해능을 가지며, SRS는 더 나은 콘트라스트와 스펙트럼 분해능을 제공하며, 두 방법 모두 비슷한 감도를 가지고 있음을 보여줍니다.

자극된 라만 산란(SRS) 및 일관된 스토크스 라만 산란(CARS) 현미경은 가장 널리 사용되는 일관된 라만 산란 영상 기술입니다. 하이퍼스펙트럼 SRS 및 CARS 이미징은 모든 픽셀에서 라만 스펙트럼 정보를 제공하므로 다양한 화학 성분을 더 잘 분리할 수 있습니다. 두 기술 모두 두 개의 여기 레이저가 필요하지만 신호 감지 체계와 스펙트럼 특성은 상당히 다릅니다. 이 프로토콜의 목표는 단일 플랫폼에서 하이퍼스펙트럼 SRS 및 CARS 이미징을 모두 수행하고 서로 다른 생물학적 샘플을 이미징하기 위한 두 현미경 기술을 비교하는 것입니다. 스펙트럼 초점 방법은 펨토초 레이저를 사용하여 스펙트럼 정보를 획득하기 위해 사용된다. 표준 화학 샘플을 사용함으로써, 동일한 여기 조건(즉, 샘플에서의 전력, 픽셀 체류 시간, 대물 렌즈, 펄스 에너지)에서 SRS 및 CARS의 감도, 공간 분해능 및 스펙트럼 분해능을 비교한다. 생물학적 샘플에 대한 CARS 및 SRS의 이미징 콘트라스트는 병치되고 비교됩니다. CARS와 SRS 성능을 직접 비교하면 화학 이미징을위한 양식을 최적으로 선택할 수 있습니다.

라만 산란 현상은 1928년 C. V. 라만¹에 의해 처음 관찰되었다. 입사 광자가 샘플과 상호 작용할 때, 비탄성 산란 사건이 자발적으로 발생할 수 있으며, 여기서 광자의 에너지 변화는 분석 된 화학 종의 진동 전이와 일치합니다. 이 공정은 화학 태그를 사용할 필요가 없으므로 시료 교란을 최소화하면서 화학 분석을위한 다용도의 라벨이없는 도구입니다. 장점에도 불구하고, 자발적인 라만 산란은 낮은 산란 단면 (일반적으로 적외선 [IR] 흡수 단면보다^10,11 낮음)을 앓고 있으며, 이는 분석²를 위해 긴 획득 시간을 필요로합니다. 따라서, 라만 산란 공정의 감도를 증가시키기 위한 탐구는 실시간 이미징을 위한 라만 기술을 추진하는데 필수적이다.

라만 산란의 감도를 크게 향상시키는 한 가지 효과적인 방법은 일관된 라만 산란 (CRS) 프로세스를 사용하는 것이며, 일반적으로 두 개의 레이저 펄스가 분자 진동 전이 ^3,4를 자극하는 데 사용됩니다. 두 레이저 사이의 광자 에너지 차이가 샘플 분자의 진동 모드와 일치하면 강한 라만 신호가 생성됩니다. 이미징을 위해 가장 일반적으로 사용되는 두 가지 CRS 프로세스는 일관된 안티 스토크스 라만 산란 (CARS)과 자극 라만 산란 (SRS)⁵입니다. 지난 이십 년 동안 기술 개발은 CARS 및 SRS 현미경 검사 기술을 발전시켜 생물학적 샘플의 화학적 변화에 대한 라벨 없는 정량화 및 해명을위한 강력한 도구가되었습니다.

CARS 현미경에 의한 화학 이미징은 Duncan et al⁶에 의해 입증 된 CARS 이미지를 얻기 위해 레이저 스캐닝이 처음 적용되었을 때 1982 년으로 거슬러 올라갈 수 있습니다. CARS 현미경의 현대화는 레이저 스캐닝 다중 광자 형광 현미경⁷의 광범위한 적용 후에 크게 가속화되었습니다. 높은 반복률 레이저를 사용하는 Xie 그룹의 초기 연구는 CARS를 생물학적 샘플 8,9,10에서 분자의 특성화를위한 고속, 라벨이없는 화학 이미징 플랫폼으로 전환했습니다. CARS 이미징의 주요 문제 중 하나는 비공진 배경의 존재로 이미지 대비가 감소하고 라만 스펙트럼이 왜곡된다는 것입니다. 비공진 배경 11,12,13,14,15를 감소시키거나 CARS 스펙트럼^(16,17)으로부터 공진 라만 신호를 추출하기 위해 많은 노력이 이루어졌다. 이 분야를 크게 발전시킨 또 다른 발전은 하이퍼 스펙트럼 CARS 이미징으로, 화학적 선택성^18,19,20,21이 향상된 각 이미지 픽셀에서 스펙트럼 매핑을 ^{허용합니다.}

자극 라만 산란 (SRS)은 CARS보다 젊은 이미징 기술이지만²² 년 초에 발견되었습니다. 2007년에, SRS 현미경은 낮은 반복률 레이저 소스(²³)를 사용하여 보고되었다. 곧, 몇몇 그룹은 높은 반복률 레이저^24,25,26을 사용하여 고속 SRS 이미징을 시연^했습니다. CARS에 대한 SRS 현미경 검사의 주요 장점 중 하나는 비공진 배경(²⁷)의 부재이지만, 교차 위상 변조(XPM), 과도 흡수(TA), 이광자 흡수(TPA) 및 광열(PT) 효과와 같은 다른 배경은 SRS(²⁸)에서 발생할 수 있다. 또한, SRS 신호 및 샘플 농도는 CARS와 달리 선형 관계를 가지며, 이는 직교 신호-농도 의존성⁽²⁹)을 갖는다. 이것은 화학적 정량화와 스펙트럼 언믹싱을 단순화합니다. 다색 및 하이퍼스펙트럼 SRS는 30,31,32,33,34,35,36 형태로 진화해 왔으며, 스펙트럼 초점은 화학 이미징 ^37,38에 대한 가장 보편적인 접근법 중 하나이다.

CARS와 SRS 모두 신호 여기를 위한 분자의 진동 전이와 일치하도록 펌프와 스토크스 레이저 빔을 샘플에 집중해야 합니다. CARS 및 SRS 현미경도 공통점이 많습니다. 그러나 이러한 두 프로세스의 근간이 되는 물리학과 이러한 현미경 기술에 관련된 신호 검출은^3,39의 불균형을 가지고 있습니다. CARS는 순 광자-분자 에너지 커플링³을 갖지 않는 파라메트릭 공정이다. 그러나, SRS는 비모수 프로세스이며, 광자와 분자 시스템⁽²⁷) 사이의 에너지 전달에 기여한다. CARS에서는 스토크스 방지 주파수에서 새로운 신호가 생성되고, SRS는 펌프와 스토크스 레이저 빔 사이의 에너지 전달로 나타납니다.

CARS 신호는 Eq (1)²⁸을 만족한다.

(1)

한편, SRS 신호는 Eq(2)28로서 기입될 수 있다.

(2)

여기서, I _p, Is, I CARS 및 ΔI SRS는 각각 펌프 빔, 스토크스 빔, _{CARS 신호 및 SRS} 신호의 강도이다. χ⁽³⁾은 샘플의 3차 비선형 광학 감수성이며, 실제 및 허수 부분으로 구성된 복합 값입니다.

이들 방정식은 CARS 및 SRS의 스펙트럼 프로파일과 신호-농도 의존성을 표현한다. 물리학의 차이는이 두 현미경 기술에 대한 이질적인 검출 체계를 초래합니다. CARS에서의 신호 검출은 일반적으로 새로 생성된 광자의 스펙트럼 분리 및 광승수 튜브(PMT) 또는 전하 결합 장치(CCD)를 사용한 검출을 포함한다. SRS의 경우, 펌프와 스토크스 빔 사이의 에너지 교환은 일반적으로 광 변조기를 사용하는 고속 강도 변조 및 록인 증폭기와 페어링된 광 다이오드(PD)를 사용한 복조로 측정됩니다.

최근 몇 년 동안 CARS 및 SRS 분야에서 많은 기술 개발 및 응용 프로그램이 발표되었지만 두 CRS 기술에 대한 체계적인 비교는 동일한 플랫폼, 특히 하이퍼 스펙트럼 CARS 및 SRS 현미경에 대해 수행되지 않았습니다. 감도, 공간 분해능, 스펙트럼 분해능 및 화학적 분리 능력을 직접 비교하면 생물학자가 화학 정량화에 가장 적합한 형식을 선택할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 펨토초 레이저 시스템 및 스펙트럼 포커싱을 기반으로 하이퍼스펙트럼 CARS 및 SRS 형식을 모두 갖춘 멀티모달 이미징 플랫폼을 구축하기 위한 상세한 단계가 제공됩니다. 두 기술은 스펙트럼 해상도, 검출 감도, 공간 해상도 및 세포의 이미징 대비를 위해 전진 방향으로 비교되었습니다.

1. 하이퍼스펙트럼 CRS 이미징을 위한 도구 설정

참고: CRS 신호를 생성하려면 고전력(즉, 클래스 3B 또는 클래스 4) 레이저를 사용해야 합니다. 안전 프로토콜을 해결해야 하며 이러한 높은 피크 전력에서 작업할 때 항상 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용해야 합니다. 실험하기 전에 적절한 문서를 참조하십시오. 이 프로토콜은 빔 경로 설계, 펨토초 펄스 치핑, 이미징 조건 최적화에 중점을 둡니다. 이 하이퍼스펙트럼 CRS 현미경의 일반적인 광학 레이아웃은 그림 1에 나와 있습니다. 여기에 표시된 구성은 CRS 현미경을 위한 많은 기존 구성 중 하나입니다. 이 프로토콜에 사용되는 CRS 현미경 시스템은 이중 출력 펨토초 레이저 소스와 레이저 스캐닝 현미경을 기반으로 구축되었습니다.

1. 레이저 소스가 스토크스 빔으로 사용되는 1,045nm의 고정 파장과 펌프 빔으로 사용되는 680 ~ 1,300nm의 조정 가능한 파장을 포함하여 80MHz의 반복률을 갖는 두 개의 펨토초 펄스 트레인(120 fs 폭)을 제공하는지 확인하십시오. 출력 펄스를 광 지연 차이와 동기화합니다. 현미경 프레임을 사용하여 이미징 플랫폼을 구축하십시오.
2. 빔 경로 설계
   1. 샘플에서 레이저 파워를 제어하려면 각 레이저 빔에 대해 반파 플레이트와 편광 빔 스플리터(PBS) 조합을 사용하십시오.
   2. Stokes 레이저 빔 경로에 AOM(acousto-optic modulator)을 설치합니다. 150mm 초점 거리 렌즈로 빔을 AOM에 초점을 맞추고 400mm 초점 거리 렌즈로 0^차 출력을 다시 시준합니다.
   3. 동일한 렌즈 쌍(150mm 및 400mm 초점 거리)을 사용하여 펌프 빔을 확장하여 레이저 빔 크기를 스톡스와 일치시킵니다.
   4. 400mm 초점 거리 렌즈를 펌프와 스토크스 빔 경로 모두에 놓고 별도의 일차원 변환 단계에 배치하여 현미경에 들어가기 전에 빔 발산을 미세 조정하고 빔 크기를 최적화합니다.
   5. 광학 지연 튜닝을 위해 전동 변환 스테이지에 장착된 직각 반사 미러로 펌프 빔을 향하게 합니다. Stokes 빔에 광학 지연이 필요한 경우 이러한 구성 요소를 대신 빔 경로에 배치하십시오.
   6. 두 빔이 ~1,000nm(펌프와 스토크스 파장 사이)의 컷오프 파장을 갖는 이색성 미러에서 결합되도록 허용하여 펌프 빔이 이색성 미러에 의해 반사되는 동안 스토크스 빔이 이색성 미러를 통해 전송되도록 합니다. 공모로 결합된 레이저 빔을 현미경으로 보냅니다.
   7. 펌프와 스토크스 빔을 짹짹 울리려면 빔 경로에 유리 막대를 놓습니다. 자세한 내용은 1.5단계를 참조하십시오.
   8. 적절한 정렬과 빔 크기를 확인하려면 이색성 거울 뒤와 현미경 전에 홍채 다이어프램을 사용하십시오. 특히, 이색성 거울에서 멀리 떨어진 위치에 하나를 설치하고 다른 하나는 좋은 정렬과 빔 겹침을 확인합니다. IR 보기 카드 또는 IR 뷰어를 사용하여 정렬 중에 빔을 시각화합니다.
   9. 고속 PD와 오실로스코프를 사용하여 펌프와 스토크스 펄스 사이의 광학 지연을 대략적으로 측정하십시오. 레이저 펄스 트레인을 샘플링하여 오실로스코프를 트리거합니다.
   10. 펌프 빔을 차단하고 스톡스 빔을 샘플링하십시오. 펄스 중 하나를 확대하고 수직 커서를 올려 오실로스코프의 시간 위치를 표시합니다.
   11. 펌프 빔의 차단을 해제하고 스토크스 빔을 차단합니다. 샘플 펌프 펄스가 일시적으로 표시된 위치와 정렬될 때까지 지연 단계를 변환합니다.
3. 레이저 스캐닝 현미경
   1. 직립 현미경 구성의 경우, 결합된 레이저 빔을 잠망경을 통해 보내 2D 갈보 스캐닝 미러에 도달하기 전에 적절한 레벨로 올라갑니다.
   2. 현미경 전에 레이저 빔 크기를 측정하고 갈보 거울 다음에 적절한 렌즈 쌍을 설정하여 대물 렌즈의 입구 동공의 크기와 가장 잘 일치하도록 레이저 빔을 확장하십시오.
   3. 대물 렌즈의 후면 조리개와 두 갈보 거울의 중심이 콘쥬게이트 평면인 두 개의 렌즈를 사용하여 4-f 시스템을 구축합니다. 또는 레이저 스캐닝을 위해 두 개의 4-f 렌즈 시스템과 함께 두 개의 개별 1D galvo 미러를 사용하십시오.
   4. 콘덴서 후, 플립 미러에 2를 설계하여 신호 수집을 위해 레이저 빔을 반사하십시오. 투과된 빔 경로에 직경 2의 렌즈를 배치하여 검출기로 전송 신호를 완전히 수집하고 초점을 맞춥니다.
   5. 776nm에서 컷오프를 갖는 이색성 미러를 사용하여 CARS 신호를 PMT로 보내고, 전송된 SRS 신호가 PD에 의해 검출될 수 있도록 한다. PMT 전에 대역통과 필터(655/30nm)를 사용하여 잔류 여기 레이저 펄스를 거부한다. PD 전에 단거리 통과 필터(980nm 쇼트 패스)를 사용하여 스토크스 빔이 검출기로 들어가는 것을 차단합니다.
   6. CARS 신호 감지를 위해 신호를 데이터 수집 시스템으로 보내기 전에 PMT 이후에 프리앰프와 전류 전압 변환기를 연결하십시오. PMT 전압을 조정하여 신호 및 이미지 대비를 최적화합니다.
   7. 함수 생성기를 사용하여 AOM을 1-10MHz에서 변조하고 잠금 복조에 대한 기준과 동일한 주파수를 사용합니다. 록인 증폭기를 사용하여 데이터 수집 전에 SRS 신호를 추출하십시오.
4. 데이터 수집 및 디스플레이
   1. 터미널 블록과 함께 디지털 데이터 수집(DAQ) 카드를 사용하여 데이터 수집을 수행합니다.
   2. DAQ의 아날로그 출력을 사용하여 신호 수집을 위해 galvo 미러 및 아날로그 입력을 제어합니다.
   3. 이미지를 실시간으로 보고 저장할 수 있도록 동시 다중 채널 디스플레이가 있는 LabVIEW를 기반으로 하는 LabVIEW 기반 LabWRITTEN 소프트웨어를 사용하십시오( 보충 파일 참조).
5. 펨토초 소스를 짹짹 울리고 스펙트럼 분해능 측정
   참고: 스펙트럼 포커싱을 사용하여 우수한 스펙트럼 분해능을 달성하기 위해 유리 막대를 사용하여 펨토초에서 피코초로 분산과 처프 레이저 펄스를 도입합니다. 최상의 스펙트럼 분해능을 얻으려면 펌프 빔의 처프 속도가 스토크스 빔의 처프 속도와 같아야합니다. 이 레이저 시스템의 경우, ~120fs 출력 레이저 펄스를 펌프의 경우 3.4ps로, 스토크스의 경우 1.8ps로 칭칭하여 최상의 스펙트럼 분해능을 얻을 수 있습니다. 이러한 처핑은 아래에 설명된 바와 같이 150mm 유리 로드(SF-57) 조합의 4+1 조합(결합된 빔에서 4개, 스토크스 빔에서만 하나)을 사용하여 달성되며, ^15cm-1 스펙트럼 분해능을 달성해야 합니다. 펄스 지속 시간은 오토 코렐레이터를 사용하여 측정 할 수 있습니다.
   1. 150mm 유리 막대 하나를 스토크스 빔 경로에만 삽입합니다.
   2. 이색성 빔 스플리터 뒤의 결합된 펌프/스토크스 빔 경로에 두 개의 150mm 유리 로드를 삽입합니다. 짹짹 소리를 높이려면 결합 된 레이저 빔이로드의 한쪽 끝에 유전체 거울을 배치하여 두 개의 유리 막대를 두 번 통과하게하십시오.
   3. 스펙트럼 분해능을 측정하기 위해, 두 개의 유리 커버슬립 사이에 압착된 표준 화학물질(예를 들어, 디메틸설폭사이드[DMSO]) 샘플을 준비하고, 최대 신호가 달성될 때까지 지연 스테이지를 스캔한다.
   4. 광학 지연 1,000 μm를 적색 편이 방향으로 이동시킨다. 그런 다음 블루시프트 방향을 향해 10μm/step에서 200프레임을 실행하여 하이퍼스펙트럼 이미지 스택을 수집합니다.
   5. 프레임 번호를 웨이브넘버로 변환하려면, DMSO로부터 뻗어있는 대칭(2,913 cm-1) 및 비대칭(2,994 ^{cm-1) C-H} 및 이들의 대응하는 프레임 번호(⁴⁰)를 사용하여 선형 회귀를 수행한다.
   6. 스펙트럼 초점 강도 프로파일을 측정하기 위해 XPM 신호를 사용하십시오. 콘덴서의 다이어프램을 반쯤 닫고 초점을 빈 커버슬립으로 옮깁니다. 하이퍼스펙트럼 SRS와 동일한 수의 단계를 수집합니다. CARS 비공진 배경을 측정하려면 유리 커버슬립에 초점을 맞추고 하이퍼스펙트럼 CARS 측정에 대해 동일한 수의 단계를 수집합니다.
6. 이미지의 신호 대 잡음비(SNR) 최적화
   1. 시스템 정렬을 위해 화학 샘플을 준비합니다. 샘플 준비를 위해 단계 3.1에 설명된 절차를 따르십시오.
      참고 : DMSO는 강한 라만 신호와 잘 분리 된 C-H 대칭 및 비대칭 피크를 가진 일반적인 실험실 화학 물질이기 때문에 좋은 선택입니다.
   2. 샘플을 현미경 스테이지에 놓고 대물 렌즈 또는 콘덴서에 필요한 경우 물 또는 침지 오일을 첨가하십시오. 시야각에서 DMSO 액적의 가장자리를 올바르게 이동하고 대물 렌즈를 조정하여 최상의 초점을 맞춥니다. Köhler 조명 방법(⁴¹)을 사용하여 응축기를 중앙에 배치한다. 콘덴서의 다이어프램을 완전히 엽니다.
   3. 펌프 빔 파장을 800 nm (1,045 nm 스톡스)로 조정하여 2,913 ^cm-1 _CH3 피크를 목표로 삼으십시오. 반파 플레이트를 조정하여 펌프와 스토크스 빔의 전력을 현미경 전에 ~ 30mW로 설정하십시오 (샘플 평면에서 ~ 10mW 전력).
   4. SRS의 경우 잠금 증폭기 게인을 7μs의 시간 상수로 ~10으로 설정합니다(10μs 픽셀 유지 시간을 사용하는 경우). 시간 상수가 픽셀 유지 시간보다 작은지 확인하십시오. SRS 신호의 AUX 출력에 데모드 R을 사용합니다.
   5. CARS의 경우 PMT 출력을 증폭기 및 전류 전압 컨버터로 보냅니다. DAQ를 사용하여 변환기에서 출력을 가져옵니다.
   6. 획득 소프트웨어에서 이미지 획득 파라미터를 설정한다. 스캔 크기가 ~100 x 100 μm2인 픽셀 번호 200 x²⁰⁰을 사용합니다. 이미지에 DMSO 액적과 빈 영역이 모두 포함되어 있는지 확인합니다.
   7. 샘플을 스캔하고 컴퓨터 화면에서 이미지를 확인하십시오. Stokes/펌프 빔의 전동 지연 스테이지를 스캔하면서 실시간 이미지를 모니터링합니다. 신호가 최대화될 때까지 지연 시간을 통해 스캔합니다.
   8. DMSO 액적을 움직여 전체 시야각을 덮고 최대 DC 신호가 이미지의 중앙에 있는지 확인합니다(신호는 펌프 빔에 따라 다름). 미러를 통해 펌프 빔의 위치를 조정하거나 이미징 소프트웨어에서 전압 오프셋을 조정합니다.
   9. DC 최적화 후 임계값을 조정하여 ~ 50% 채도를 표시하도록 임계값을 조정하여 AC 신호가 최대화될 때까지 Stokes 빔 미러를 조정합니다. 채도가 이미지의 중앙에 있는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 Stokes 빔에서만 미러를 미세 조정하십시오. 정렬 중에 신호를 정렬 품질에 대한 실시간 피드백으로 모니터링합니다.
   10. SNR을 결정하려면 DMSO 이미지의 작은 영역을 선택하고 평균값을 측정합니다. 노이즈의 경우 이미지의 빈 영역에서 작은 영역을 선택하고 평균 평균값과 표준 편차를 모두 결정합니다. 신호 평균값에서 잡음 평균값을 빼고 결과를 빈 영역의 표준 편차로 나눕니다.
   11. 계산된 SNR이 충분히 높지 않은 경우(일반적으로 SRS의 경우 800-1,000, 이 전력 조합으로 0.4V의 PMT 전압에서 CARS의 경우 >10,000), 빔 중첩, 빔 크기 및 지연 스테이지 위치를 확인 및 다시 최적화하고, AOM을 미세 조정하고, 예상 SNR이 획득될 때까지 함수 생성기 변조 주파수를 변경합니다.

2. 이미지 분석 및 데이터 처리

1. SNR 분석
   1. ImageJ 소프트웨어를 엽니다. 저장된 DMSO 샘플 .txt 파일을 가져오려면 파일 |를 클릭합니다 . 가져오기 | 텍스트 이미지 | 열기.
   2. 이미지를 가져온 후 Ctrl+shift+C를 눌러 밝기 및 대비 기능(B&C)을 불러옵니다. 최대 샘플 신호를 찾으려면 DMSO 샘플의 영역이 포화로 나타날 때까지 B&C의 자동 버튼을 누릅니다.
   3. ImageJ 인터페이스에서 타원형 선택 도구를 클릭하고 포화 DMSO 영역의 작은 영역을 강조 표시합니다. 강조 표시되면 M 키를 눌러 선택한 영역의 평균 및 표준 편차를 측정합니다.
   4. 배경을 측정하려면 빈 영역의 신호가 관찰될 때까지 B&C 함수의 막대를 조정하십시오. 타원형 선택을 클릭하고 배경 영역을 2.1.3단계와 동일한 크기로 강조 표시합니다. 선택한 지역에 DMSO가 포함되어 있지 않은지 확인합니다. M을 눌러 선택한 영역의 통계를 측정합니다.
   5. 1.6.10단계에 따라 SNR을 계산합니다.
2. 하이퍼스펙트럼 CRS 이미지 처리
   1. 2.1.1단계에 따라 .txt 파일을 가져옵니다. 가져온 후 이미지 |를 클릭하십시오 . 스택 | 도구 | 몽타주를 쌓을 수 있습니다 ... 을 클릭하여 파일을 이미지 스택으로 변환합니다.
   2. 첫 번째 DMSO 피크가 표시될 때까지 몽타주를 스크롤합니다. DMSO에서 지역을 선택하고 이미지를 클릭| 스택 | Z축 프로파일을 플롯 하여 강도 대 프레임 번호 스펙트럼을 플로팅합니다. 원시 스펙트럼 데이터를 추출하려면 목록을 클릭하고 프로파일 데이터를 복사하십시오.
   3. 복구된 스펙트럼을 파형 단위로 변환하려면 1.5.5단계에서 설명한 대로 선형 회귀를 수행하십시오.
3. 스펙트럼 분해능 측정을 위한 피팅
   참고: 로렌치안 함수는 SRS 및 CARS 스펙트럼(²⁸)에 적합하도록 사용된다.
   1. 피팅 소프트웨어를 연 다음 선형 회귀 데이터를 복사하여 프로그램에 붙여넣습니다. SRS 데이터를 맞추려면 데이터를 강조 표시한 다음 데이터를 산점도로 플로팅합니다.
   2. 산점도를 당깁니다. 분석 |를 클릭하십시오. 피크와 베이스라인 | 다중 피크 피팅 | 대화 상자를 열어 피크 분석기를 불러옵니다. 풀업할 때 입력이 현재 플롯인지 확인하고 피크 함수를 Lorentzian(Lorentz)으로 변경합니다.
   3. 그래프에서 두 DMSO 피크 각각을 두 번 클릭하여 장착할 영역을 강조 표시합니다. 그런 다음 NLfit 열기 를 클릭하여 피팅 창을 불러옵니다. 수렴될 때까지 맞춤(Fit ) 버튼을 클릭한 다음 OK를 클릭하여 피팅 계수의 표 요약을 확인합니다(Eq (3) 참조).
      참고: 아래 방정식은 소프트웨어의 Lorentzian 함수 형식을 보여줍니다. ₁/₂ 는 피팅 피크의 진폭이고, w₁/₂ 는 적합 피크의 폭이며, x₀₁/₀₂ 값은 적합 피크의 중심입니다. 독립 변수는 x이고 종속 변수는 y입니다.
      (3)
   4. CARS 스펙트럼 피팅의 경우 분석 |를 클릭하십시오 . 피팅 | 비선형 곡선 맞춤 | 대화 상자를 엽니다. 범주 선택: CARS 에 대한 새 기능을 정의하려면 새로 만들기. CARS 스펙트럼 피팅을 위해 아래에 정의된 2피크 CARS 피팅 기능(Eq(4) 참조)을 사용하십시오.
      (4)
4. 공간 해상도 결정
   참고: 이 단계 전에 특정 배율의 픽셀 크기, 픽셀 번호 및 단계 크기(μm) 간의 변환을 알아야 합니다. 이는 예상된 이미징 해상도보다 큰 알려진 직경의 샘플을 사용하고, 그 라인 프로파일을 측정하고, 가우시안 함수를 피팅하여 절반 최대(FWHM) 값에서 전체 폭을 결정함으로써 수행될 수 있다. 분해능 표적 또는 균일한 샘플, 예컨대 중합체 비드가 사용될 수 있다.
   1. 직경이 200 nm 미만인 세포 또는 중합체 입자의 이미지를 획득한다.
   2. ImageJ를 사용하여 이미지에서 가장 작은 파티클에 선을 그립니다.
   3. K를 눌러 강도 프로파일을 플로팅합니다.
   4. 팝업 창에서 목록을 클릭하고 정보를 피팅 소프트웨어에 복사합니다.
   5. 피팅 소프트웨어에 프로파일을 플로팅하고 가우시안 피팅을 사용하십시오 ( 분석 | 클릭 피팅 | 비선형 곡선 맞춤 | 대화 상자 | 열기 카테고리 : 기본 기능; 기능: 가우스).
   6. 피팅 후 피크 너비를 읽습니다. 픽셀 크기를 변환하여 현미경의 실제 해상도를 얻으십시오.

3. 하이퍼스펙트럼 CRS 이미징을 위한 샘플 준비

1. 이미징 슬라이드 및 화학 샘플의 제조
   1. 양면 테이프 조각을 커버 슬립에 놓고 배치 된 테이프의 중간에서 테이프의 작은 직사각형 모양을 잘라내어 샘플이 배치 될 열린 영역을 만듭니다.
   2. 1-2 μL의 순수한 DMSO를 피펫팅하고, 액적을 공실의 중앙에 분배한다.
   3. 조심스럽게 상단 커버슬립을 놓고 커버슬립의 가장자리를 부드럽게 눌러 챔버를 밀봉하면서 DMSO 샘플이 테이프의 가장자리에 닿지 않도록 합니다.
   4. 민감도 실험을 위해, 중수소 산화물(_D2O)에서 DMSO의 연속 희석물을 준비하여 50%-0%의 농도 범위를 수득하였다. 각 용액의 1-2 μL를 취하고, 상기와 같이 압착된 샘플을 준비한다.
2. 세포 준비
   1. 세포를 둘베코의 변형 이글 배지(DMEM)에 있는 35mm 유리 바닥 접시(또는 그 이상)에 10% 소 태아 혈청(FBS)과 1% 페니실린/스트렙토마이신으로 시드합니다.
   2. 세포를 ∼50%-80% 컨플루언시가 달성될 때까지 밤새 또는 더 긴 5%_CO2 분위기와 함께 37°C의 인큐베이션 챔버에서 인큐베이션한다.
   3. 살아있는 세포를 직접 이미지화하거나 이미징을 위해 10 % 포르말린 용액으로 세포를 고정하십시오.

스펙트럼 해상도의 비교
도 2는 DMSO 샘플을 이용한 하이퍼스펙트럼 SRS(도 2A) 및 CARS(도 2B) 현미경의 스펙트럼 분해능을 비교한다. SRS 스펙트럼의 경우, 스펙트럼에 맞게 두 개의 로렌치안 함수(프로토콜 단계 2.3 참조)를 적용하고, 2,913cm-1 피크를 사용하여 14.6cm-1의 분해능을 얻었다. CARS의 경우, 가우시안 배경을 가진 2개의 피크 피팅 기능(프로토콜 단계 2.3 참조)이 피팅에 활용되었으며, 이는 17.1cm-1의 스펙트럼 분해능을 제공하였다. 이러한 결과는 동일한 측정 조건에서 SRS가 CARS보다 더 나은 스펙트럼 분해능을 갖는다는 것을 보여줍니다. CARS에서 감소된 스펙트럼 분해능은 주로 비공명 배경의 관여에 의해 기여된다. 또한, 대칭 (2,913 cm-1) 및 비대칭 (2,995 ^cm-1) 피크 비율이 SRS 및 CARS에 대해 매우 다르다는 것이 발견되었다. 이는 수학식 1 및 (2)에 설명된 바와 같이 3차 비선형 광 감수성과 상이한 신호 상관관계 때문이다. CARS의 사분면 의존성으로 인해 두 피크 간의 강도 차이가 증폭됩니다. SRS 피크의 대칭 라인 형상 및 CARS 피크의 비대칭 선 형상이 스펙트럼에서 관찰될 수 있다. CARS 신호의 비대칭성은 주로 비공진 배경 간섭의 존재 때문이다. CARS 스펙트럼 피크는 SRS 피크에 약간 적색 시프트(^1-2cm-1)된 것으로 보인다. 이것은 또한 공진 피크와의 비공명 배경 간섭에서 발생합니다.

검출 감도의 비교
도 3은 하이퍼스펙트럼 SRS와 CARS 현미경의 검출 감도를 비교한다. 고농도에서 D2O에서의 DMSO 농도의 함수로서 DMSO SRS 신호(2,913 cm-1)의 SNR이 먼저 플롯팅된다(^1%-50%, 도 3A). 결과는 방정식 (2)를 만족시키는 선형 관계를 보여줍니다. 도 3B는 0.1% 및 0.01% 농도에서 DMSO 스펙트럼을 플롯하고, 여기서 2,913 ^cm-1 피크는 전자에서는 분해될 수 있지만 후자에서는 분해되지 않으며, 검출 한계가 0.1% 및 0.01% DMSO 사이임을 나타낸다. 빈 기준의 한계를 사용하여, SRS 검출 한계가 0.021% DMSO임을 추정하였다. 도 3C는 CARS SNR을 DMSO 농도(1%-50%)의 함수로서 플롯하고, 수학식 1과 일치하는 직교 의존성을 나타낸다. 위상 검색된 CARS 스펙트럼은 0.1% 및 0.01% DMSO에 대해 도 3D에 도시되어 있다. 이러한 스펙트럼을 달성하기 위해, Kramers-Kronig 관계에 기초한 스펙트럼 위상-검색 방법이 사용되었고, 추가적인 배경 제거가 수행되었다¹⁶. SRS 스펙트럼과 유사하게, DMSO 2,913 ^cm-1 피크는 0.1% DMSO에 대해 명확하게 분해될 수 있지만 0.01%는 아니지만, 이들 두 농도 사이의 검출 한계를 나타낸다. 빈 기준의 한계를 사용하여, SRS 검출 한계가 0.015% DMSO임을 추정하였다. 0.02% DMSO는 2.8 mM에 해당한다. 따라서, 여기에 사용된 하이퍼스펙트럼 CRS 현미경의 검출 한계는 ∼2.1-2.8 mM DMSO이다.

공간 해상도의 비교
도 4는 SRS(도 4A) 및 CARS(도 4B) 이미지에서 검출된 작은 세포 특징의 분해능을 비교한다. 동일한 라인의 강도 프로파일이 표시되고 가우시안 함수를 사용하여 분해능 비교를 위한 FWHM 값을 결정합니다. SRS 신호는 398.6nm의 분해능을 제공하였고(그림 4C), CARS 신호는 330.3nm의 분해능을 나타냈다(그림 4D). CARS의 해상도는 SRS보다 ~ 1.2 배 더 좋았습니다. 분해능 차이의 이유는 방정식 (1)과 (2)에도 있습니다. 펌프와 스토크스 빔 모두 초점에서 가우시안 포인트 확산 기능을 가지고 있습니다. CARS의 신호는 세 가우시안 함수의 곱셈에 비례하며, 이는 대략 폭을 √3 배로 줄입니다. 유사하게, SRS의 경우, 폭은 √2의 계수만큼 감소된다. 따라서 CARS의 분해능은 √3/√2 = SRS보다 1.2 배 우수했습니다.

세포 이미지의 비교
도 5는 상이한 광학 지연 위치에서 MIA PaCa-2 셀로부터의 SRS 및 CARS 이미지를 비교한다. 도 5A는 가장 강한 신호를 준 광 지연에서의 SRS 이미지를 도시한다. 이 이미지에서 지질 방울 (LD), 소포체 (ER) 및 핵 (NU)을 감지 할 수 있으며 LD는 밝은 점으로 표시된 가장 강한 신호를 갖습니다. 도 5B는 LD에 대해 훨씬 감소된 콘트라스트를 갖는 동일한 광학 지연에서의 CARS 채널 이미지를 도시한다. 이러한 콘트라스트 차이의 주된 이유는 비공명 배경의 존재와 CARS 스펙트럼에서 동일한 라만 피크의 적색 이동입니다. 이러한 광 지연에서, 생성된 신호는 물의 비공진 배경으로부터 큰 기여를 갖는다. CARS에서 지질 대비를 향상시키기 위해, 광학 지연을 적색-시프트된 값으로 조정하였다. 적색 편이는 전체 신호 레벨이 감소했음에도 불구하고 SRS(그림 5C) 및 CARS(그림 5D) 모두에 대해 2,850cm-1에 더 많은 에너지를 집중시킴으로써 지질 대비를 개선하였다. CARS의 경우, 스펙트럼 포커싱에서 ~^98cm-1 적색 이동에 의해 SRS와 LD의 유사한 대조가 달성되었지만(그림 5D), SRS 이미지에서보다 높은 배경은 여전히 관찰되었다. 이러한 광학적 지연에서, SRS 이미지는 LDs, ER 및 세포막에서 단백질 및 핵산 함량은 훨씬 적지만 강한 지질 함량을 보여준다(도 5C).

CARS는 파라메트릭 프로세스이고 SRS는 비모수성입니다. 이러한 차이는 또한 두 가지 양식의 대조 차이에 기여합니다. 파라메트릭 CARS 신호는 레이저 초점에 가까운 서로 다른 층으로부터의 CARS 신호의 간섭에 의해 결정되며, 이는 도 5B 및 도 5D의 화살표로 표시된 바와 같이 음의 대비를 나타낼 수 있다(도 4B에서도). 이러한 신호-간섭-유도된 네거티브 콘트라스트들은 SRS 이미지들에서 부재한다. CARS의 부정적인 대비는 관심 대상의 축 위치에 대한 정보를 제공 할 수 있습니다.

SRS 신호는 분자 농도와 선형 관계를 갖는 반면, CARS 신호는 거의 직교 농도 의존성을 만족시킨다. 따라서,_CH2-rich LDs는 SRS 이미지에서보다 CARS 이미지에서 ER 및 세포막보다 훨씬 더 강한 신호를 보여준다(도 5E, F). SRS 스펙트럼은 하이퍼스펙트럼 이미지로부터 추출될 수 있다. 도 5G는 LD, ER, 시토졸 (CY) 및 NU로부터의 전형적인 SRS 스펙트럼을 도시한다. 강도와 스펙트럼 모양 모두 다른 세포 구획에 대해 다릅니다. LD는 다른 소기관보다 2,850cm-1에서 훨씬 더 강한 신호를 보여줍니다. CARS에 관해서는, 유사한 스펙트럼이 형태가 다르지만 얻을 수 있습니다. 원시 CARS 스펙트럼은 대응하는 SRS 스펙트럼에 비해 작은 적색 시프트를 나타낸다. 스펙트럼 위상-검색은 CARS 스펙트럼을 사용하여 라만 반응을 추출하는데 추가로 사용될 수 있다.

그림 1: 하이퍼스펙트럼 CARS/SRS 현미경의 회로도. 약어: CARS = 일관된 안티-스토크스 라만 산란; SRS = 자극된 라만 산란; PBS = 편광 빔 스플리터; PD = 광 다이오드; PMT = 광승수 튜브; AOM = acousto-optic modulator. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: DMSO 스펙트럼. (A) SRS 및 (B) DMSO의 CARS 스펙트럼. 점들은 실험 데이터이다; 곡선은 스펙트럼 피팅 결과입니다. 약어: CARS = 일관된 안티-스토크스 라만 산란; SRS = 자극된 라만 산란; DMSO = 디메틸설폭사이드; w = 스펙트럼 해상도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: DMSO의 신호 대 잡음비 및 스펙트럼. (A) SRS에 의해 측정된 D2O 농도의 함수로서 2,913 ^cm-1에서의 DMSO 대칭 피크의 신호 대 잡음_비. 점들은 실험 데이터이다; 선은 선형 피팅 결과입니다. (b) D2O에서 0.1% 및 0.01% DMSO의 SRS 스펙트럼을 (C) CARS에 의해 측정된_D2O농도의 함수로서 2,913 cm-1에서의 DMSO 대칭 피크의 신호-대^-잡음비. 점들은 실험 데이터이다; 곡선은 두 번째 학위 다항식 피팅 결과입니다. (d)_D2O. 약어에서 0.1% 및 0.01% DMSO의 CARS 스펙트럼: CARS = 일관된 항-스토크스 라만 산란; SRS = 자극된 라만 산란; DMSO = 디메틸설폭사이드; SNR = 신호 대 잡음비; _D2O= 중수소 산화물. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 4: MIA PaCa-2 셀의 SRS 및 CARS 이미지 및 강도 프로파일. (A) MIA PaCa-2 셀의 SRS 이미지. (B) 패널 A와 동일한 시야각에서 MIA PaCa-2 셀의 CARS 이미지. (c) 패널 A에서 노란색 선을 따른 SRS의 강도 프로파일. (D) 패널 B에서 노란색 선을 따른 CARS의 강도 프로파일. 점들은 실험 데이터이다; 곡선은 가우시안 함수 피팅 결과입니다. 스케일 바 = 5 μm. 약어: CARS = 일관된 안티-스토크스 라만 산란; SRS = 자극된 라만 산란; w = 해상도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 5: MIA PaCa-2 셀의 이미지 및 강도 프로파일. (A) SRS 강도에 대해 최적화된 시간 지연에서의 MIA PaCa-2 셀의 SRS 이미지. (B) 패널 A에서와 동일한 지연에 있는 CARS 이미지. (C) 패널 A에서와 같이 98cm-1 적색 시프트 지연에서의 SRS 이미지. (D) 패널 C에서와 동일한 광학 지연에서의 CARS 이미지. (E, F) SRS 및 CARS 강도 프로파일은 패널 A 및 D의 점선을 따라 플롯되었습니다. (g) 지질 액적, 소포체, 시토졸 및 핵으로부터의 전형적인 SRS 스펙트럼. (h) 네 개의 세포 조성물의 전형적인 CARS 스펙트럼. 녹색과 빨간색 점선은 각각 패널 A/B 및 C/D의 지연 위치입니다. 스케일 바 = 10 μm. 약어: CARS = 일관된 안티-스토크스 라만 산란; SRS = 자극된 라만 산란; LD = 지질 액적; ER = 소포체; CY = 시토졸; NU = 핵. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보조 파일: LabVIEW를 기반으로 하는 LabVIEW가 제작한 소프트웨어로, 이미지를 실시간으로 보고 저장할 수 있는 동시 멀티채널 디스플레이가 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

여기에 제시된 프로토콜은 다중 모드 CRS 현미경의 구축과 CARS와 SRS 이미징 간의 직접적인 비교를 설명합니다. 현미경 제작의 중요한 단계는 공간 및 시간적 빔 중첩 및 빔 크기 최적화입니다. SNR을 최적화하고 라만 이동을 교정하기 위해 생물학적 이미징 전에 DMSO와 같은 표준 샘플을 사용하는 것이 좋습니다. CARS와 SRS 이미지를 직접 비교하면 CARS가 더 나은 공간 해상도를 갖는 반면, SRS는 더 나은 스펙트럼 해상도와 덜 복잡한 화학적 대비를 제공한다는 것을 알 수 있습니다. CARS와 SRS 모두 비슷한 검출 한계를 가지고 있습니다.

CARS 및 SRS 이미징은 여기를 위해 고에너지 펄스 레이저를 사용합니다. 이를 통해 플랫폼은 추가적인 화학적 대비^28,39를 위해 다중 광자 여기 형광^, 고조파 생성 및 과도 흡수와 같은 다른 비선형 광학 이미징 양식을 통합 할 수 있습니다.

CARS 및 SRS는 높은 화학적 선택성을 갖는 지질 조성을 연구하기 위해 광범위하게 사용되어 왔다. 그러나, 상기 기술은 지질을 정량화하는 것에 한정되지 않는다. SRS는 약물 분포 지도(⁴²), 단백질 합성(⁴³), 및 DNA⁽⁴⁴)에 적용되었다. CARS 및 SRS는 또한 정제^45,46,47,48에서 화상 제약 성분 및 부형제에 적용되었다. 하이퍼스펙트럼 CARS 및 SRS는 암 진단⁴⁹, 심혈관 질환 평가(⁵⁰) 및 신경 영상(⁵¹)에 응용되는 것을 발견하였다. 그들은 또한 COVID-19 연구⁵²에 적용 할 수 있습니다. 3,000cm-1만큼 넓은 스펙트럼 윈도우를 커버할 수 있는 광대역 CARS는 생물학적 샘플⁽⁵³)에서 풍부한 화학 구조를 해명할 수 있다. 그러나, CCD의 느린 판독 레이트로 인해, 픽셀 체류 시간은 밀리초 레벨에 있고, SRS 현미경(³⁴)에 대한 마이크로초 픽셀 드웰 시간보다 훨씬 느리다. 하이퍼스펙트럼 SRS 현미경은 현재 200-300 ^cm-1의 전형적인 대역폭을 가지며, 레이저 대역폭 및 락-인-인-인-통합 어레이 검출기(³⁴)의 부족에 의해 제한된다. 푸리에 변환 SRS 현미경은 SRS 스펙트럼 커버리지⁽³⁵)를 잠재적으로 넓히기 위한 대안적인 방법이다.

CARS와 SRS는 라벨링의 필요 없이 풍부한 화학 정보를 제공하지만, 화학적 선택성은 화학 결합에 있어 특정 단백질을 구별하기가 어렵습니다. 라만 태그는 CARS 및 SRS^54,55의 화학적 선택성을 향상시킬 수 있는 잠재력을 보여주^었다. 그러나, 코히어런트 라만 이미징은 여전히 형광 검출에 비해 훨씬 낮은 감도를 갖는다. 표면 향상은 신호 레벨⁽⁵⁶)을 향상시키기 위해 자발적인 라만 산란 분광법을 이용하였다. 또한 신호 증폭^57,58,59를 위해 CARS 및 SRS에도 적용하였다. 비록 증진 인자가 자발적인 라만 산란만큼 높지는 않지만, 표면 강화된 CARS 및 SRS 현미경은 여전히 단일 분자^59,60을 검출할 수 있는 잠재력을 보여준다. 그럼에도 불구하고, 금속 입자 또는 표면의 사용은 라벨 프리 접근법의 이점을 박탈한다. 금속 표면을 사용하지 않고 일관된 라만 현미경의 감도를 개선하면 생물 과학에서이 기술의 적용이 크게 확대 될 것입니다.

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

이 연구는 퍼듀 대학 화학과 스타트업 펀드의 지원을 받았다.