Method Article
В этой статье непосредственно сравниваются разрешение, чувствительность и контрасты визуализации стимулированного комбинационного рассеяния (SRS) и когерентного анти-Стоксовского рамановского рассеяния (CARS), интегрированные в одну и ту же платформу микроскопа. Результаты показывают, что CARS имеет лучшее пространственное разрешение, SRS дает лучшие контрасты и спектральное разрешение, и оба метода имеют одинаковую чувствительность.
Стимулированное рамановское рассеяние (SRS) и когерентная микроскопия против стоксовского рамановского рассеяния (CARS) являются наиболее широко используемыми технологиями когерентного рамановского рассеяния. Гиперспектральная визуализация SRS и CARS предлагает рамановскую спектральную информацию на каждом пикселе, что позволяет лучше разделять различные химические составы. Хотя оба метода требуют двух лазеров возбуждения, их схемы обнаружения сигналов и спектральные свойства совершенно различны. Целью этого протокола является выполнение гиперспектральной визуализации SRS и CARS на одной платформе и сравнение двух методов микроскопии для визуализации различных биологических образцов. Метод спектральной фокусировки используется для получения спектральной информации с помощью фемтосекундных лазеров. При использовании стандартных химических образцов сравниваются чувствительность, пространственное разрешение и спектральное разрешение SRS и CARS в одинаковых условиях возбуждения (т.е. мощность на образце, время выдержки пикселя, объективная линза, энергия импульса). Контрасты изображений CARS и SRS для биологических образцов сопоставляются и сравниваются. Прямое сравнение характеристик CARS и SRS позволит оптимально выбрать модальность для химической визуализации.
Явление комбинационного рассеяния впервые наблюдалось в 1928 году К. В.Раманом 1. Когда падающий фотон взаимодействует с образцом, может спонтанно произойти событие неупругого рассеяния, при котором изменение энергии фотона соответствует вибрационному переходу анализируемых химических веществ. Этот процесс не требует использования химической метки, что делает его универсальным инструментом для химического анализа без этикеток, сводя к минимуму возмущение образца. Несмотря на свои преимущества, спонтанное комбинационное рассеяние страдает от низкого поперечного сечения рассеяния (обычно 1011 ниже, чем инфракрасное [ИК] поперечное сечение поглощения), что требует длительного времени получения для анализа2. Таким образом, стремление повысить чувствительность процесса рамановского рассеяния имеет важное значение для продвижения рамановских технологий для визуализации в режиме реального времени.
Одним из эффективных способов значительного повышения чувствительности комбинационного рассеяния являются когерентные процессы комбинационного рассеяния (CRS), для которых обычно используются два лазерных импульса для возбуждения молекулярных колебательных переходов 3,4. Когда разность энергии фотонов между двумя лазерами соответствует колебательным модам молекул образцов, будут генерироваться сильные рамановские сигналы. Двумя наиболее часто используемыми процессами CRS для визуализации являются когерентное анти-Стоксовское рамановское рассеяние (CARS) и стимулированное рамановское рассеяние (SRS)5. За последние два десятилетия технологические разработки продвинули методы микроскопии CARS и SRS, чтобы стать мощными инструментами для количественной оценки без маркировки и выяснения химических изменений в биологических образцах.
Химическая визуализация с помощью микроскопии CARS может быть датирована 1982 годом, когда лазерное сканирование было впервые применено для получения изображений CARS, продемонстрированных Duncan et al6. Модернизация микроскопии CARS была значительно ускорена после широкого применения лазерной сканирующей многофотонной флуоресцентной микроскопии7. Ранняя работа группы Xie с использованием лазеров с высокой частотой повторения превратила CARS в высокоскоростную, без маркировки, химическую платформу визуализации для характеристики молекул в биологических образцах 8,9,10. Одной из основных проблем для визуализации CARS является наличие нерезонансного фона, который снижает контрастность изображения и искажает рамановский спектр. Было предпринято много усилий, чтобы либо уменьшить нерезонансный фон 11,12,13,14,15, либо извлечь резонансные рамановские сигналы из спектров CARS 16,17. Еще одним достижением, которое значительно продвинуло эту область, является гиперспектральная визуализация CARS, которая позволяет осуществлять спектральное отображение на каждом пикселе изображения с улучшенной химической селективностью 18,19,20,21.
Стимулированное рамановское рассеяние (SRS) является более молодой технологией визуализации, чем CARS, хотя она была обнаружена ранее22 года. В 2007 году сообщалось о микроскопии SRS с использованием лазерного источника23 с низкой частотой повторения. Вскоре несколько групп продемонстрировали высокоскоростную визуализацию SRS с использованием лазеров с высокой частотой повторения 24,25,26. Одним из основных преимуществ микроскопии SRS перед CARS является отсутствие нерезонансного фона27, хотя другие фоны, такие как кросс-фазовая модуляция (XPM), переходное поглощение (TA), поглощение двух фотонов (TPA) и фототермический (PT) эффект, могут возникать с SRS28. Кроме того, сигнал SRS и концентрация образца имеют линейные отношения, в отличие от CARS, который имеет квадратичную зависимость сигнал-концентрация29. Это упрощает химическую количественную оценку и спектральное размешивание. Многоцветная и гиперспектральная SRS развивалась в различных формах 30,31,32,33,34,35,36, причем спектральная фокусировка является одним из самых популярных подходов для химической визуализации 37,38.
Как CARS, так и SRS требуют фокусировки накачки и лазерных лучей Стокса на образец, чтобы соответствовать вибрационному переходу молекул для возбуждения сигнала. Микроскопы CARS и SRS также имеют много общего. Однако физика, лежащая в основе этих двух процессов, и обнаружение сигналов, участвующих в этих технологиях микроскопии, имеют различия 3,39. CARS представляет собой параметрический процесс, который не имеет чистой энергетической связи фотон-молекула3. SRS, однако, является непараметрическим процессом и способствует передаче энергии между фотонами и молекулярными системами27. В CARS генерируется новый сигнал на анти-Стоксовой частоте, в то время как SRS проявляется как передача энергии между накачкой и лазерными лучами Стокса.
Сигнал CARS удовлетворяет Eq (1)28.
(1)
Между тем, сигнал SRS может быть записан как Eq (2)28.
(2)
Здесь Ip, I s, ICARS и ΔISRS — это интенсивности пучка насоса, луча Стокса, сигнала CARS и сигналов SRS соответственно. χ(3) — нелинейная оптическая восприимчивость образца третьего порядка, представляющая собой комплексное значение, состоящее из реальной и воображаемой частей.
Эти уравнения выражают спектральные профили и зависимость концентрации сигнала CARS и SRS. Различия в физике приводят к разрозненным схемам обнаружения для этих двух технологий микроскопии. Обнаружение сигнала в CARS обычно включает спектральное разделение вновь генерируемых фотонов и обнаружение с помощью фотоумножителя (PMT) или устройства с зарядовой связью (CCD); для SRS обмен энергией между насосом и пучками Стокса обычно измеряется высокоскоростной модуляцией интенсивности с использованием оптического модулятора и демодуляцией с использованием фотодиода (PD) в паре с блокирующим усилителем.
Хотя в последние годы было опубликовано много технологических разработок и приложений как в областях CARS, так и SRS, на одной и той же платформе не проводилось систематического сравнения двух методов CRS, особенно для гиперспектральной МИКРОСКОПИИ CARS и SRS. Прямые сравнения чувствительности, пространственного разрешения, спектрального разрешения и возможностей химического разделения позволят биологам выбрать наилучшую модальность для количественной оценки химических веществ. В этом протоколе приведены подробные шаги по созданию мультимодальной платформы визуализации с гиперспектральными модальностями CARS и SRS на основе фемтосекундной лазерной системы и спектральной фокусировки. Эти два метода были сопоставлены в прямом направлении для спектрального разрешения, чувствительности обнаружения, пространственного разрешения и контрастов изображений клеток.
1. Инструментальная настройка для гиперспектральной визуализации CRS
ПРИМЕЧАНИЕ: Генерация сигнала CRS требует использования мощных (т.е. класса 3B или класса 4) лазеров. Протоколы безопасности должны быть соблюдены, и надлежащие средства индивидуальной защиты (СИЗ) должны носиться в любое время при работе на таких высоких пиковых мощностях. Перед экспериментированием ознакомьтесь с надлежащей документацией. Этот протокол фокусируется на проектировании траектории луча, щебетании фемтосекундных импульсов и оптимизации условий визуализации. Общая оптическая компоновка этого гиперспектрального микроскопа CRS показана на рисунке 1. Конфигурация, показанная здесь, является одной из многих существующих конфигураций для микроскопии CRS. Система микроскопии CRS, используемая в этом протоколе, построена на фемтосекундном лазерном источнике с двойным выходом и лазерном сканирующем микроскопе.
2. Анализ изображений и обработка данных
3. Подготовка образцов для гиперспектральной визуализации CRS
Сравнение спектрального разрешения
На рисунке 2 сравнивается спектральное разрешение гиперспектральной микроскопии SRS (рисунок 2A) и CARS (рисунок 2B) с использованием образца DMSO. Для спектра SRS были применены две функции Лоренца (см. этап протокола 2.3), чтобы соответствовать спектру, и разрешение 14,6 см-1 было получено с использованием пика 2,913 см-1 . Для CARS для подгонки использовалась функция двухпиковой подгонки с гауссовским фоном (см. шаг протокола 2.3), которая давала спектральное разрешение 17,1 см-1. Эти результаты показывают, что при том же условии измерения SRS имеет лучшее спектральное разрешение, чем CARS. Снижение спектрального разрешения в CARS в основном обусловлено вовлечением нерезонансного фона. Кроме того, было обнаружено, что симметричные (2 913 см-1) и асимметричные (2 995 см-1) пиковые соотношения сильно отличались для SRS и CARS. Это связано с различными корреляциями сигналов с нелинейной оптической восприимчивостью третьего порядка, как описано в уравнениях (1) и (2). При квадратичной зависимости CARS разница интенсивностей между двумя пиками усиливается. Симметричные формы линий пиков SRS и асимметричные формы линий пиков CARS можно наблюдать в спектре. Асимметрия в сигнале CARS в основном обусловлена наличием нерезонансных фоновых помех. Спектральные пики CARS кажутся слегка смещенными в красный цвет (1-2 см-1) к пикам SRS. Это также возникает из-за нерезонансной фоновой интерференции с резонансными пиками.
Сравнение чувствительности обнаружения
На рисунке 3 сравнивается чувствительность обнаружения гиперспектральной микроскопии SRS и CARS. SNR сигналов DMSO SRS (2,913 см-1) как функции концентрации DMSO вD2Oпри высоких концентрациях строится первым (1%-50%, рисунок 3A). Результаты показывают линейную зависимость, удовлетворяющую уравнению (2). На рисунке 3В показаны спектры ДМСО в концентрациях 0,1% и 0,01%, в которых пик 2,913 см-1 может быть разрешен в первом, но не во втором, указывая, что предел обнаружения составляет от 0,1% до 0,01% ДМСО. Используя предел пустых критериев, мы оценили, что предел обнаружения SRS составляет 0,021% DMSO. На рисунке 3C показана SNR CARS как функция концентрации DMSO (1%-50%), показывающая квадратичную зависимость в согласии с уравнением (1). Фазовые спектры CARS показаны на рисунке 3D для 0,1% и 0,01% DMSO. Для достижения этих спектров был использован спектральный метод фазового извлечения, основанный на соотношениях Крамерса-Кронига и выполнено дополнительное удаление фона16. Подобно спектрам SRS, пик DMSO 2,913 см-1 может быть четко разрешен для 0,1% DMSO, но не для 0,01%, что указывает на предел обнаружения между этими двумя концентрациями. Используя предел пустых критериев, мы подсчитали, что предел обнаружения SRS составляет 0,015% DMSO. 0,02% DMSO соответствует 2,8 мМ. Таким образом, предел обнаружения гиперспектрального микроскопа CRS, используемого здесь, составляет ~ 2,1-2,8 мМ DMSO.
Сравнение пространственного разрешения
На рисунке 4 сравнивается разрешение небольшого сотового объекта, обнаруженного на изображениях SRS (рисунок 4A) и CARS (рисунок 4B). Профили интенсивности из одной линии отображаются и подходят с помощью функции Гаусса для определения значений FWHM для сравнения разрешения. Сигнал SRS давал разрешение 398,6 нм (рисунок 4C), в то время как сигнал CARS давал разрешение 330,3 нм (рисунок 4D). Разрешение CARS было ~1,2x лучше, чем у SRS. Причина разницы в разрешении также кроется в уравнениях (1) и (2). И пучки насоса, и пучки Стокса имеют функцию гауссовского точечного разброса в фокусе. Таким образом, сигнал CARS пропорционален умножению трех гауссовских функций, что примерно уменьшает ширину в √3 раза. Аналогичным образом, для SRS ширина уменьшается в √2 раза. Поэтому разрешение CARS было √3/√2 = в 1,2 раза лучше, чем у SRS.
Сравнение изображений клеток
На рисунке 5 сравниваются изображения SRS и CARS с ячеек MIA PaCa-2 в разных положениях оптической задержки. На рисунке 5A показаны изображения SRS с оптической задержкой, которая дала самый сильный сигнал. На этом изображении могут быть обнаружены липидные капли (ЛД), эндоплазматический ретикулум (ER) и ядро (NU), причем ЛД имеют самые сильные сигналы, показанные в виде ярких точек. На рисунке 5B показано изображение канала CARS с той же оптической задержкой, что значительно снижает контрастность для ЛД. Основными причинами этой контрастной разницы являются наличие нерезонансного фона и красное смещение одного и того же рамановского пика в спектрах CARS. При такой оптической задержке генерируемый сигнал имеет большой вклад от нерезонансного фона воды. Чтобы усилить липидный контраст в CARS, оптическая задержка была настроена на значение красного смещения. Красное смещение улучшило липидные контрасты, концентрируя больше энергии до 2 850 см-1 как для SRS (рисунок 5C), так и для CARS (рисунок 5D), хотя общий уровень сигнала был снижен. Для CARS аналогичная контрастность ЛД, как и SRS, была достигнута красным смещением в спектральной фокусировке ~98 см-1 (рисунок 5D), хотя фон выше, чем на изображении SRS, все еще наблюдался. При этой оптической задержке изображение SRS показывает гораздо меньшее содержание белка и нуклеиновых кислот, но сильное содержание липидов в ЛД, ER и клеточных мембранах (рисунок 5C).
CARS является параметрическим процессом, в то время как SRS является непараметрическим. Такое различие также способствует контрастным различиям в двух модальностях. Параметрические сигналы CARS определяются интерференцией сигналов CARS из различных слоев, близких к лазерному фокусу, которые могут показывать отрицательные контрасты, как указано стрелками на рисунке 5B и рисунке 5D (также на рисунке 4B). Такие отрицательные контрасты, вызванные сигнальными помехами, отсутствуют на изображениях SRS. Отрицательный контраст в CARS может предоставить информацию об осевом положении интересующей цели.
Сигналы SRS имеют линейную зависимость от молекулярной концентрации, в то время как сигналы CARS удовлетворяют почти квадратичной зависимости концентрации. Таким образом, богатые CH2 ЛД показывают гораздо более сильный сигнал, чем ER и клеточные мембраны на изображении CARS, чем на изображении SRS (рисунок 5E, F). Спектры SRS могут быть извлечены из гиперспектральных изображений. На рисунке 5G показаны типичные спектры SRS от ЛД, ER, цитозола (CY) и NU. Как интенсивность, так и спектральная форма различны для разных клеточных компартментов. LD показывает гораздо более сильный сигнал на 2 850 см-1 , чем другие органеллы. Что касается CARS, то можно получить сходные спектры, хотя и разные по форме. Необработанные спектры CARS показывают небольшое красное смещение по сравнению с соответствующими спектрами SRS. Спектральное фазовое извлечение может быть дополнительно использовано для извлечения рамановских ответов с использованием спектров CARS.
Рисунок 1: Схема гиперспектрального микроскопа CARS/SRS. Сокращения: CARS = когерентное анти-Стоксовское рамановское рассеяние; SRS = стимулированное рамановское рассеяние; PBS = поляризационный светоделитель; PD = фотодиод; PMT = фотоумножительная трубка; AOM = акустооптический модулятор. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Спектры DMSO. (A) SRS и (B) CARS спектры DMSO. Точки являются экспериментальными данными; кривые являются результатами спектральной подгонки. Сокращения: CARS = когерентное анти-Стоксовское рамановское рассеяние; SRS = стимулированное рамановское рассеяние; ДМСО = диметилсульфоксид; w = спектральное разрешение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Отношение сигнал/шум и спектры DMSO. (A) Отношение сигнал/шум симметричного пика DMSO при 2,913 см-1 в зависимости от концентрации вD2O, измеренной SRS. Точки являются экспериментальными данными; линия является линейным результатом подгонки. (B) Спектры SRS 0,1% и 0,01% DMSO вD2O. (C) Отношение сигнал/шум симметричного пика DMSO при 2,913 см-1 в зависимости от концентрации вD2O, измеренной CARS. Точки являются экспериментальными данными; кривая является результатом полиномиальной подгонки второй степени. (D) Спектры CARS 0,1% и 0,01% DMSO в D2O. Сокращения: CARS = когерентное анти-Стоксовское рамановское рассеяние; SRS = стимулированное рамановское рассеяние; ДМСО = диметилсульфоксид; SNR = отношение сигнал/шум; D2O = оксид дейтерия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Изображения SRS и CARS и профили интенсивности ячейки MIA PaCa-2. (A) Изображение SRS ячейки MIA PaCa-2. (B) Изображение CARS ячейки MIA PaCa-2 в том же поле зрения, что и панель A. С) Профиль интенсивности СГД вдоль желтой линии на панели А. D) Профиль силы света ТС вдоль желтой линии в табличке В. Точки являются экспериментальными данными; кривые — это результаты подгонки функции Гаусса. Шкала стержней = 5 мкм. Сокращения: CARS = когерентное анти-Стоксовское рамановское рассеяние; SRS = стимулированное рамановское рассеяние; w = разрешение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Изображения и профиль интенсивности ячеек MIA PaCa-2. (A) Изображение SRS ячеек MIA PaCa-2 с оптимизированной временной задержкой для интенсивности SRS. (B) Изображение CARS с той же задержкой, что и на панели A. (C) Изображение СГД при задержках с красным смещением 98 см-1, как на панели А. (D) Изображение CARS с той же оптической задержкой, что и на панели C. (Э,Ф) Профили интенсивности SRS и CARS, нанесенные вдоль пунктирных линий на панелях A и D. (G) Типичные спектры SRS из липидных капель, эндоплазматического ретикулума, цитозола и ядра. (H) Типичные спектры CARS четырех клеточных композиций. Зеленые и красные пунктирные линии являются позициями задержки для панелей A/B и C/D соответственно. Шкала стержней = 10 мкм. Сокращения: CARS = когерентное анти-Стоксовское рамановское рассеяние; SRS = стимулированное рамановское рассеяние; LD = липидные капли; ER = эндоплазматический ретикулум; CY = цитозоль; NU = ядро. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный файл: Лабораторно написанное программное обеспечение на основе LabVIEW, имеющее одновременный многоканальный дисплей для просмотра и сохранения изображений в режиме реального времени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Протокол, представленный здесь, описывает конструкцию мультимодального микроскопа CRS и прямое сравнение между визуализацией CARS и SRS. Для конструкции микроскопа критическими шагами являются пространственное и временное перекрытие пучка и оптимизация размера пучка. Рекомендуется использовать стандартный образец, такой как DMSO, перед биологической визуализацией для оптимизации SNR и калибровки рамановских сдвигов. Прямое сравнение между изображениями CARS и SRS показывает, что CARS имеет лучшее пространственное разрешение, в то время как SRS дает лучшее спектральное разрешение и менее запутанные химические контрасты. И CARS, и SRS имеют одинаковые пределы обнаружения.
Визуализация CARS и SRS использует высокоэнергетические импульсные лазеры для возбуждения. Это позволяет платформе интегрировать другие нелинейные оптические методы визуализации, такие как многофотонная флуоресценция возбуждения, генерация гармоник и переходное поглощение для дополнительных химических контрастов28,39.
CARS и SRS широко используются для изучения липидного состава с высокой химической селективностью. Тем не менее, технологии не ограничиваются количественной оценкой липидов. SRS был применен для карты распределения лекарств42, синтеза белка43 и ДНК44. CARS и SRS также были применены для изображения фармацевтических ингредиентов и вспомогательных веществ в таблетках 45,46,47,48. Гиперспектральные CARS и SRS нашли применение в диагностике рака49, оценке сердечно-сосудистых заболеваний50 и нейронной визуализации51. Они также могут быть применены для исследований COVID-1952. Широкополосные CARS, которые могут охватывать спектральные окна шириной до 3000 см-1, могут прояснить богатые химические структуры в биологических образцах53. Однако из-за медленной скорости считывания ПЗС время ожидания пикселя находится на уровне миллисекунд, что намного медленнее, чем микросекундное время ожидания пикселя для микроскопии SRS34. Гиперспектральная микроскопия SRS в настоящее время имеет типичную полосу пропускания 200-300 см-1, ограниченную полосой пропускания лазера и отсутствием фиксированных детекторов34. Микроскопия с преобразованием Фурье SRS является альтернативным способом потенциального расширения спектрального покрытия SRS35.
Хотя CARS и SRS предоставляют богатую химическую информацию без необходимости маркировки, химическая селективность заключается в химических связях, что затрудняет различение конкретных белков. Рамановские метки показали потенциал для повышения химической селективности CARS и SRS54,55. Тем не менее, когерентная рамановская визуализация по-прежнему имеет гораздо более низкую чувствительность по сравнению с обнаружением флуоресценции. Улучшение поверхности использовалось для спонтанной спектроскопии рассеяния комбинационного рассеяния для улучшения уровней сигнала56. Он также применялся к CARS и SRS для усиления сигнала 57,58,59. Хотя коэффициент усиления не так высок, как спонтанное рамановское рассеяние, микроскопия CARS и SRS по-прежнему показывают потенциал для обнаружения отдельных молекул59,60. Тем не менее, использование металлических частиц или поверхностей лишает преимущества подхода без маркировки. Повышение чувствительности когерентной рамановской микроскопии без использования металлических поверхностей значительно расширило бы применение технологии в биологической науке.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Это исследование было поддержано стартап-фондом факультета химии Университета Пердью.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2D galvo scanner set | Thorlabs | GVS002 | |
Acousto-optic modulator | Isomet | M1205-P80L-0.5 | |
AOM driver | Isomet | 532B-2 | |
Data acquisition card | National Instruments | PCle 6363 | Custom ordered filter (980 sp) |
Delay stage | Zaber | X-LSM050A | |
Deuterium oxide | Millipore Sigma | 151882-100G | |
Dichroic mirror for beam combination | Thorlabs | DMLP1000 | |
Dichroic mirror for signal separation | Semrock | FF776-Di01-25x36 | |
DMSO | MiliporeSigma | 200-664-3 | |
MIA PaCa 2 Cells | ATCC | CRL-1420 | |
Femtosecond laser system | Spectral Physics | InSightX3+ | |
Filter for CARS | Chroma | AT655/30m | |
Filter for SRS | Chroma | ET980sp | |
Function generator | Rigol | DG1022Z | |
Glass rods | Lattice Electro Optics | SF-57 | |
Half-wave plate | Newport | 10RP02-51; 10RP02-46 | |
LabVIEW 2020 | National Instruments | This is the image acquisition software | |
Lock-in amplifier | Zurich Instrument | HF2LI | |
Microscope housing | Olympus | BX51W1 | |
Objective lens | Olympus | UPLSAPO60XW | |
Origin Pro 2019b | OriginLab Corporation | This is the spectral fitting software | |
Oscilloscope | Tektronix | TBS2204B | |
Photodiode | Hamamatsu | S3994-01 | |
PMT detector | Hamamatsu | H7422P-40 | |
PMT voltage amplifier | Advanced Research Instrument Corp. | PMT4V3 | |
Polarizing beamsplitter cube | Thorlabs | PBS255 | |
Terminal block | National Instruments | BNC-2110 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены