Прямое сравнение гиперспектрального стимулированного рамановского рассеяния и когерентной рамановской микроскопии против Стокса для химической визуализации

В этой статье непосредственно сравниваются разрешение, чувствительность и контрасты визуализации стимулированного комбинационного рассеяния (SRS) и когерентного анти-Стоксовского рамановского рассеяния (CARS), интегрированные в одну и ту же платформу микроскопа. Результаты показывают, что CARS имеет лучшее пространственное разрешение, SRS дает лучшие контрасты и спектральное разрешение, и оба метода имеют одинаковую чувствительность.

Стимулированное рамановское рассеяние (SRS) и когерентная микроскопия против стоксовского рамановского рассеяния (CARS) являются наиболее широко используемыми технологиями когерентного рамановского рассеяния. Гиперспектральная визуализация SRS и CARS предлагает рамановскую спектральную информацию на каждом пикселе, что позволяет лучше разделять различные химические составы. Хотя оба метода требуют двух лазеров возбуждения, их схемы обнаружения сигналов и спектральные свойства совершенно различны. Целью этого протокола является выполнение гиперспектральной визуализации SRS и CARS на одной платформе и сравнение двух методов микроскопии для визуализации различных биологических образцов. Метод спектральной фокусировки используется для получения спектральной информации с помощью фемтосекундных лазеров. При использовании стандартных химических образцов сравниваются чувствительность, пространственное разрешение и спектральное разрешение SRS и CARS в одинаковых условиях возбуждения (т.е. мощность на образце, время выдержки пикселя, объективная линза, энергия импульса). Контрасты изображений CARS и SRS для биологических образцов сопоставляются и сравниваются. Прямое сравнение характеристик CARS и SRS позволит оптимально выбрать модальность для химической визуализации.

Явление комбинационного рассеяния впервые наблюдалось в 1928 году К. В.^{Раманом 1}. Когда падающий фотон взаимодействует с образцом, может спонтанно произойти событие неупругого рассеяния, при котором изменение энергии фотона соответствует вибрационному переходу анализируемых химических веществ. Этот процесс не требует использования химической метки, что делает его универсальным инструментом для химического анализа без этикеток, сводя к минимуму возмущение образца. Несмотря на свои преимущества, спонтанное комбинационное рассеяние страдает от низкого поперечного сечения рассеяния (обычно 10¹¹ ниже, чем инфракрасное [ИК] поперечное сечение поглощения), что требует длительного времени получения для анализа². Таким образом, стремление повысить чувствительность процесса рамановского рассеяния имеет важное значение для продвижения рамановских технологий для визуализации в режиме реального времени.

Одним из эффективных способов значительного повышения чувствительности комбинационного рассеяния являются когерентные процессы комбинационного рассеяния (CRS), для которых обычно используются два лазерных импульса для возбуждения молекулярных колебательных переходов ^3,4. Когда разность энергии фотонов между двумя лазерами соответствует колебательным модам молекул образцов, будут генерироваться сильные рамановские сигналы. Двумя наиболее часто используемыми процессами CRS для визуализации являются когерентное анти-Стоксовское рамановское рассеяние (CARS) и стимулированное рамановское рассеяние (SRS)⁵. За последние два десятилетия технологические разработки продвинули методы микроскопии CARS и SRS, чтобы стать мощными инструментами для количественной оценки без маркировки и выяснения химических изменений в биологических образцах.

Химическая визуализация с помощью микроскопии CARS может быть датирована 1982 годом, когда лазерное сканирование было впервые применено для получения изображений CARS, продемонстрированных Duncan et al⁶. Модернизация микроскопии CARS была значительно ускорена после широкого применения лазерной сканирующей многофотонной флуоресцентной микроскопии⁷. Ранняя работа группы Xie с использованием лазеров с высокой частотой повторения превратила CARS в высокоскоростную, без маркировки, химическую платформу визуализации для характеристики молекул в биологических образцах ^8,9,10. Одной из основных проблем для визуализации CARS является наличие нерезонансного фона, который снижает контрастность изображения и искажает рамановский спектр. Было предпринято много усилий, чтобы либо уменьшить нерезонансный фон 11,12,13,14,15, либо извлечь резонансные рамановские сигналы из спектров CARS ^16,17. Еще одним достижением, которое значительно продвинуло эту область, является гиперспектральная визуализация CARS, которая позволяет осуществлять спектральное отображение на каждом пикселе изображения с улучшенной химической селективностью 18,19,20,21.

Стимулированное рамановское рассеяние (SRS) является более молодой технологией визуализации, чем CARS, хотя она была обнаружена ранее^{22 года}. В 2007 году сообщалось о микроскопии SRS с использованием лазерного источника²³ с низкой частотой повторения. Вскоре несколько групп продемонстрировали высокоскоростную визуализацию SRS с использованием лазеров с высокой частотой повторения 24,25,26. Одним из основных преимуществ микроскопии SRS перед CARS является отсутствие нерезонансного фона²⁷, хотя другие фоны, такие как кросс-фазовая модуляция (XPM), переходное поглощение (TA), поглощение двух фотонов (TPA) и фототермический (PT) эффект, могут возникать с SRS²⁸. Кроме того, сигнал SRS и концентрация образца имеют линейные отношения, в отличие от CARS, который имеет квадратичную зависимость сигнал-концентрация²⁹. Это упрощает химическую количественную оценку и спектральное размешивание. Многоцветная и гиперспектральная SRS развивалась в различных формах 30,31,32,33,34,35,36, причем спектральная фокусировка является одним из самых популярных подходов для химической визуализации ^37,38.

Как CARS, так и SRS требуют фокусировки накачки и лазерных лучей Стокса на образец, чтобы соответствовать вибрационному переходу молекул для возбуждения сигнала. Микроскопы CARS и SRS также имеют много общего. Однако физика, лежащая в основе этих двух процессов, и обнаружение сигналов, участвующих в этих технологиях микроскопии, имеют различия ^3,39. CARS представляет собой параметрический процесс, который не имеет чистой энергетической связи фотон-молекула³. SRS, однако, является непараметрическим процессом и способствует передаче энергии между фотонами и молекулярными системами²⁷. В CARS генерируется новый сигнал на анти-Стоксовой частоте, в то время как SRS проявляется как передача энергии между накачкой и лазерными лучами Стокса.

Сигнал CARS удовлетворяет Eq (1)²⁸.

(1)

Между тем, сигнал SRS может быть записан как Eq (2)²⁸.

(2)

Здесь I_p, I s, I_CARS и ΔI_SRS — это интенсивности пучка насоса, луча Стокса, _{сигнала} CARS и сигналов SRS соответственно. χ⁽³⁾ — нелинейная оптическая восприимчивость образца третьего порядка, представляющая собой комплексное значение, состоящее из реальной и воображаемой частей.

Эти уравнения выражают спектральные профили и зависимость концентрации сигнала CARS и SRS. Различия в физике приводят к разрозненным схемам обнаружения для этих двух технологий микроскопии. Обнаружение сигнала в CARS обычно включает спектральное разделение вновь генерируемых фотонов и обнаружение с помощью фотоумножителя (PMT) или устройства с зарядовой связью (CCD); для SRS обмен энергией между насосом и пучками Стокса обычно измеряется высокоскоростной модуляцией интенсивности с использованием оптического модулятора и демодуляцией с использованием фотодиода (PD) в паре с блокирующим усилителем.

Хотя в последние годы было опубликовано много технологических разработок и приложений как в областях CARS, так и SRS, на одной и той же платформе не проводилось систематического сравнения двух методов CRS, особенно для гиперспектральной МИКРОСКОПИИ CARS и SRS. Прямые сравнения чувствительности, пространственного разрешения, спектрального разрешения и возможностей химического разделения позволят биологам выбрать наилучшую модальность для количественной оценки химических веществ. В этом протоколе приведены подробные шаги по созданию мультимодальной платформы визуализации с гиперспектральными модальностями CARS и SRS на основе фемтосекундной лазерной системы и спектральной фокусировки. Эти два метода были сопоставлены в прямом направлении для спектрального разрешения, чувствительности обнаружения, пространственного разрешения и контрастов изображений клеток.

1. Инструментальная настройка для гиперспектральной визуализации CRS

ПРИМЕЧАНИЕ: Генерация сигнала CRS требует использования мощных (т.е. класса 3B или класса 4) лазеров. Протоколы безопасности должны быть соблюдены, и надлежащие средства индивидуальной защиты (СИЗ) должны носиться в любое время при работе на таких высоких пиковых мощностях. Перед экспериментированием ознакомьтесь с надлежащей документацией. Этот протокол фокусируется на проектировании траектории луча, щебетании фемтосекундных импульсов и оптимизации условий визуализации. Общая оптическая компоновка этого гиперспектрального микроскопа CRS показана на рисунке 1. Конфигурация, показанная здесь, является одной из многих существующих конфигураций для микроскопии CRS. Система микроскопии CRS, используемая в этом протоколе, построена на фемтосекундном лазерном источнике с двойным выходом и лазерном сканирующем микроскопе.

1. Убедитесь, что лазерный источник обеспечивает две фемтосекундные импульсные цепи (ширина 120 fs) с частотой повторения 80 МГц, включая фиксированную длину волны на 1045 нм, используемую в качестве пучка Стокса, и перестраиваемую длину волны от 680 до 1 300 нм, используемую в качестве пучка накачки. Синхронизируйте выходные импульсы с оптической разностью задержки. Используйте рамку микроскопа для создания платформы визуализации.
2. Проектирование траектории луча
   1. Чтобы контролировать мощность лазера на образце, используйте комбинацию полуволновой пластины и поляризационного луча (PBS) для каждого лазерного луча.
   2. Установите акустооптический модулятор (AOM) на траектории лазерного луча Стокса. Сфокусируйте луч с помощью объектива с фокусным расстоянием 150 мм на AOM и вспомните выход^0-го порядка с объективом с фокусным расстоянием 400 мм.
   3. Используйте ту же пару объективов (фокусные расстояния 150 мм и 400 мм), чтобы расширить луч накачки в соответствии с размером лазерного луча с Stokes.
   4. Поместите объективы с фокусным расстоянием 400 мм в траектории насоса и луча Стокса на отдельные одномерные ступени трансляции для точной настройки расхождения луча и оптимизации размера луча перед входом в микроскоп.
   5. Направляйте пучок насоса с помощью прямоугольного отражающего зеркала, установленного на моторизованной ступени трансляции для настройки оптической задержки. Если луч Стокса нуждается в оптической задержке, поместите эти компоненты в его траекторию луча.
   6. Позвольте объединить оба луча в дихроичном зеркале с длиной волны отсечки ~ 1000 нм (между длинами волн насоса и Стокса), так что луч Стокса будет проходить через дихроичное зеркало, в то время как луч насоса отражается дихроичным зеркалом. Отправьте коллинеарно комбинированные лазерные лучи в микроскоп.
   7. Чтобы чирикать насос и балки Стокса, разместите стеклянные стержни на их лучевых дорожках. Подробности см. в шаге 1.5.
   8. Чтобы подтвердить правильное выравнивание и размер луча, используйте диафрагмы радужной оболочки после дихроичного зеркала и перед микроскопом. В частности, установите один в положении, близком к, а другой на расстоянии от дихроичного зеркала, чтобы подтвердить хорошее выравнивание и перекрытие луча. Используйте карту ИК-просмотра или ИК-просмотрщик для визуализации луча во время выравнивания.
   9. Используйте быстрый PD и осциллограф, чтобы приблизительно измерить оптическую задержку между импульсами насоса и Стокса. Запустите осциллограф, взяв пробу лазерного импульса.
   10. Заблокируйте пучку насоса и возьмите образец балки Стокса. Увеличьте масштаб одного из импульсов и наведите на него вертикальный курсор, чтобы отметить его временное положение на осциллографе.
   11. Разблокируйте балку насоса и заблокируйте балку Стокса. Переведите стадию задержки до тех пор, пока импульсы насоса образца не выровняются во времени с отмеченным положением.
3. Лазерный сканирующий микроскоп
   1. Для вертикальной конфигурации микроскопа отправьте комбинированные лазерные лучи через перископ, чтобы подняться на соответствующий уровень, прежде чем достичь 2D-зеркал сканирования гальво.
   2. Измерьте размер лазерного луча перед микроскопом и установите правильную пару линз после зеркал гальво, чтобы расширить лазерный луч, чтобы наилучшим образом соответствовать размеру входного зрачка объектива.
   3. Постройте систему 4-f, используя две линзы, с задней диафрагмой объектива и центром двух зеркал гальво, являющихся сопряженными плоскостями. В качестве альтернативы можно использовать два отдельных зеркала 1D galvo с двумя системами объективов 4-f для лазерного сканирования.
   4. После конденсатора спроектируйте 2-дюймовое откидное зеркало для отражения лазерных лучей для сбора сигнала. Расположите линзу диаметром 2 в пути передаваемого луча, чтобы полностью собирать и фокусировать сигналы передачи на детекторы.
   5. Направляйте сигналы CARS на PMT с дихроичным зеркалом, имеющим отсечку на 776 нм, и позволяйте передаваемым сигналам SRS обнаруживаться PD. Используйте полосовой фильтр (655/30 нм) перед PMT для отклонения остаточных лазерных импульсов возбуждения. Используйте фильтр коротких частот (980 нм короткого прохода) перед PD, чтобы заблокировать попадание луча Стокса в детектор.
   6. Для обнаружения сигнала CARS подключите предусилитель и преобразователь тока-напряжения после PMT и перед отправкой сигнала в систему сбора данных. Отрегулируйте напряжение PMT для оптимизации контрастности сигнала и изображения.
   7. Используйте генератор функций для модуляции AOM на частоте 1-10 МГц и используйте ту же частоту, что и эталон для демодуляции блокировки. Используйте блокирующий усилитель для извлечения сигналов SRS перед сбором данных.
4. Сбор и отображение данных
   1. Выполняйте сбор данных с помощью карты цифрового сбора данных (DAQ) в сочетании с клеммным блоком.
   2. Используйте аналоговые выходы DAQ для управления зеркалами galvo и аналоговыми входами для получения сигнала.
   3. Используйте программное обеспечение, написанное Lab, на основе LabVIEW с одновременным многоканальным дисплеем для просмотра и сохранения изображений в режиме реального времени (см. Дополнительный файл).
5. Чирикание фемтосекундного источника и измерение спектрального разрешения
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения хорошего спектрального разрешения с использованием спектральной фокусировки стеклянные стержни используются для введения дисперсий и щебетания лазерных импульсов от фемтосекунды до пикосекунды. Для достижения наилучшего спектрального разрешения скорость чирпирования пучка насоса должна быть равна скорости луча Стокса. Для этой лазерной системы наилучшее спектральное разрешение может быть достигнуто путем щебетания выходных лазерных импульсов ~ 120 fs до 3,4 л.с. для накачки и 1,8 л.с. для Stokes. Это чиркание достигается с помощью комбинации 4 + 1 (четыре в комбинированном луче, один только в луче Стокса) комбинации стеклянных стержней 150 мм (SF-57), как описано ниже, и должно достигать спектрального разрешения 15 ^см-1 . Длительность импульса может быть измерена с помощью автокоррелятора.
   1. Вставьте один стеклянный стержень толщиной 150 мм только в траекторию луча Стокса.
   2. Вставьте два стеклянных стержня диаметром 150 мм в комбинированный тракт насоса/балки Стокса после дихроичного делителя балок. Чтобы увеличить щебетание, позвольте комбинированным лазерным лучам дважды пройти два стеклянных стержня, поместив диэлектрическое зеркало на один конец стержней.
   3. Для измерения спектрального разрешения подготовьте стандартный химический (например, диметилсульфоксид [DMSO]) образец, зажатый между двумя стеклянными крышками, и отсканируйте стадию задержки до тех пор, пока не будет достигнут максимальный сигнал.
   4. Переместите оптическую задержку на 1000 мкм в направлении красного смещения. Затем выполните 200 кадров со скоростью 10 мкм/шаг в направлении синего смещения, чтобы собрать стек гиперспектральных изображений.
   5. Чтобы преобразовать номера кадров в волновые числа, выполните линейную регрессию с использованием симметричного (2 913 ^см-1) и асимметричного (2 994 ^см-1) C-H, простирающегося от DMSO и соответствующих им номеров кадров⁴⁰.
   6. Используйте сигнал XPM для измерения профиля интенсивности спектральной фокусировки. Наполовину закройте диафрагму на конденсаторе и переместите фокус на пустую крышку. Соберите такое же количество шагов, как и для гиперспектральных SRS. Чтобы измерить нерезонансный фон CARS, сосредоточьтесь на стеклянной крышке и соберите такое же количество шагов для гиперспектральных измерений CARS.
6. Оптимизация отношения сигнал/шум (SNR) изображений
   1. Подготовьте химический образец для выравнивания системы. Выполните процедуру, описанную в шаге 3.1 для подготовки образца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: DMSO является хорошим выбором, потому что это обычное лабораторное химическое вещество с сильными рамановскими сигналами и хорошо разделенными симметричными и асимметричными пиками C-H.
   2. Поместите образец на ступень микроскопа и добавьте воду или иммерсионное масло, если это необходимо для объектива или конденсатора. Правильно переместите край капли DMSO в поле зрения и отрегулируйте объектив для лучшей фокусировки. Центрируйте конденсатор с помощью метода⁴¹ подсветки Кёлера. Полностью откройте диафрагму на конденсаторе.
   3. Настройте длину волны пучка насоса до 800 нм (1 045 нм Стокса), чтобы нацелиться на пик 2,913 ^см-1 CH₃ . Установите мощность насоса и пучка Стокса на ~30 мВт перед микроскопом, отрегулировав полуволновую пластину (~ 10 мВт мощности в плоскости образца).
   4. Для SRS установите коэффициент усиления блокирующего усилителя равным ~10 с константой времени 7 мкс (при использовании времени выдержки пикселя 10 мкс). Убедитесь, что константа времени меньше, чем время ожидания пикселя. Используйте Demod R для выхода AUX для сигналов SRS.
   5. Для АВТОМОБИЛЕЙ отправьте выход PMT на предусилитель и преобразователь тока-напряжения. Используйте DAQ для получения выходных данных из конвертера.
   6. Задайте параметры получения изображений в программном обеспечении для сбора. Используйте число пикселей 200 x 200 с размером сканирования ~100 x 100 мкм². Убедитесь, что изображение содержит как каплю DMSO, так и пустую область.
   7. Отсканируйте образец и проверьте изображение на экране компьютера. Сканируйте моторизованную стадию задержки в пучке Стокса/насоса, отслеживая изображения в режиме реального времени. Сканируйте задержку до тех пор, пока сигнал не станет максимальным.
   8. Переместите каплю DMSO, чтобы охватить все поле зрения, и проверьте, центрирован ли максимум сигнала постоянного тока на изображении (сигнал зависит от пучка насоса). Отрегулируйте положение пучка насоса через зеркало или смещение напряжения в программном обеспечении для визуализации.
   9. После оптимизации постоянного тока отрегулируйте зеркала луча Стокса до тех пор, пока сигнал переменного тока не будет максимизирован, отрегулировав пороговое значение для отображения насыщенности ~ 50%. Проверьте, центрирована ли насыщенность изображения. Если нет, тонкая настройка зеркал только в луче Стокса. Отслеживайте сигнал во время выравнивания в виде обратной связи в режиме реального времени о качестве выравнивания.
   10. Чтобы определить SNR, выберите небольшую область изображения DMSO и измерьте среднее значение. Для шума выберите небольшую область в пустой области изображения и определите как среднее среднее значение, так и стандартное отклонение. Вычтите среднее значение шума из среднего значения сигнала и разделите результаты на стандартное отклонение пустой области.
   11. Если расчетный SNR недостаточно высок (обычно 800-1000 для SRS и >10 000 для CARS при напряжении PMT 0,4 В с этой комбинацией мощности), проверьте и повторно оптимизируйте перекрытие луча, размеры пучка и положение ступени задержки, тонкую настройку AOM и изменение частоты модуляции генератора функций до получения ожидаемого SNR.

2. Анализ изображений и обработка данных

1. Анализ SNR
   1. Откройте программное обеспечение ImageJ. Чтобы импортировать сохраненный образец .txt файла DMSO, щелкните Файл | Импорт | текстовое изображение | Открыто.
   2. После импорта изображения нажмите клавиши CTRL+SHIFT+C , чтобы открыть функцию яркости и контрастности (B&C). Чтобы найти максимальный сигнал образца, нажимайте кнопку auto в B &C , пока область образца DMSO не станет насыщенной.
   3. Щелкните инструмент выделения овала на интерфейсе ImageJ и выделите небольшую область насыщенной области DMSO. После выделения нажмите клавишу M , чтобы измерить среднее и стандартное отклонение выбранной области.
   4. Для измерения фона отрегулируйте бары в функции B &C до тех пор, пока не будет наблюдаться сигнал пустой области. Щелкните овальную область и выделите область фона того же размера, что и на шаге 2.1.3. Убедитесь, что выбранный регион не содержит DMSO. Нажмите M , чтобы измерить статистику выбранной области.
   5. Рассчитайте SNR в соответствии с шагом 1.6.10.
2. Обработка гиперспектральных изображений CRS
   1. Импортируйте файл .txt в соответствии с шагом 2.1.1. После импорта нажмите на image | Стеки | Инструменты | Монтаж в стек... , чтобы преобразовать файл в стек изображений.
   2. Прокрутите монтаж до тех пор, пока не будет виден первый пик DMSO. Выберите регион в DMSO и нажмите на Image | Стек | Построение профиля оси Z для отображения интенсивности и спектра чисел кадров. Чтобы извлечь необработанные спектральные данные, нажмите на список и скопируйте данные профиля.
   3. Чтобы преобразовать восстановленный спектр в волновые числовые единицы, выполните линейную регрессию, как описано в шаге 1.5.5.
3. Фитинг для измерения спектрального разрешения
   ПРИМЕЧАНИЕ: Функции Лоренца используются для соответствия спектрам SRS и CARS²⁸.
   1. Откройте программное обеспечение для подгонки, затем скопируйте и вставьте данные линейной регрессии в программу. Чтобы подогнать данные SRS, выделите данные, а затем постройте их в виде точечной диаграммы.
   2. Подтяните вверх точечный график. Нажмите на | анализа Пики и базовые | Несколько пиковых | Откройте диалоговое окно , чтобы вызвать анализатор пиков. При подтягивании проверьте, что входом является текущий график и измените пиковую функцию на Лоренциан (Lorentz).
   3. Дважды щелкните каждый из двух пиков DMSO на графике, чтобы выделить области, которые должны быть установлены. Затем нажмите « Открыть NLfit», чтобы открыть окно установки . Нажмите кнопку «Подогнать до схода», а затем OK, чтобы увидеть сводку коэффициентов подгонки в табличной таблице (см. Eq (3)).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приведенное ниже уравнение показывает формат функции Лоренца в программном обеспечении. _{A 1}/₂ - амплитуды фитинговых пиков,_{w 1}/₂ - ширина установленных пиков, а значения x₀₁/₀₂ - центры установленных пиков. Независимая переменная равна x, а зависимая переменная — y.
      (3)
   4. Для спектральной установки CARS нажмите на Анализ | Монтажные | Нелинейная кривая подгонки | Откройте диалоговое окно. Выберите категорию: новая , чтобы определить новую функцию для CARS. Используйте двухпиковую функцию подгонки CARS, определенную ниже (см. Eq (4)) для спектральной установки CARS.
      (4)
4. Определение пространственного разрешения
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перед этим шагом важно знать преобразование между размером пикселя при определенном увеличении, числом пикселя и размером шага в мкм. Это может быть выполнено путем использования образца известного диаметра, который больше ожидаемого разрешения изображения, измерения его линейного профиля и установки функции Гаусса для определения полной ширины при половинном максимальном значении (FWHM). Могут использоваться мишени разрешения или однородные образцы, такие как полимерные шарики.
   1. Получите изображение клеток или частиц полимера диаметром менее 200 нм.
   2. Используйте ImageJ, чтобы провести линию по самой маленькой частице на изображении.
   3. Нажмите клавишу K , чтобы построить профиль интенсивности.
   4. Щелкните список во всплывающем окне и скопируйте информацию в соответствующее программное обеспечение.
   5. Составьте профиль в программном обеспечении для подгонки и используйте гауссовскую подгонку (нажмите на Анализ | Монтажные | Нелинейная кривая подгонки | Открыть диалоговое | Категория: Основные функции; Функция: Гаусс).
   6. Считывание ширины пика после подгонки. Используйте преобразование пикселя в размер для получения фактического разрешения микроскопа.

3. Подготовка образцов для гиперспектральной визуализации CRS

1. Подготовка слайдов изображений и химических образцов
   1. Поместите кусок двусторонней ленты на крышку и вырежьте небольшую прямоугольную форму ленты из середины помещенной ленты, чтобы создать открытую область для размещения образца.
   2. Пипетку 1-2 мкл чистого ДМСО и дозируют капельку в центре вакансии.
   3. Осторожно поместите верхнюю крышку и осторожно прижмите края обшивки, чтобы герметизировать камеру, убедившись, что образец DMSO не соприкасается с краями ленты.
   4. Для экспериментов по чувствительности готовят серийные разведения ДМСО в оксиде дейтерия (_D2O) с получением диапазона концентраций 50%-0%. Возьмите 1-2 мкл каждого раствора и подготовьте прессованные образцы, как описано выше.
2. Клеточная подготовка
   1. Посейте клетки в 35-миллиметровую посуду со стеклянным дном (или больше) в модифицированной орлиной среде Dulbecco (DMEM) с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 1% пенициллином / стрептомицином.
   2. Инкубируют клетки в инкубационной камере при 37 °C с 5% атмосферой CO₂ в течение ночи или дольше до тех пор, пока не будет достигнута ~50%-80% слияние.
   3. Визуализируйте живые клетки непосредственно или зафиксируйте клетки 10% раствором формалина для визуализации.

Сравнение спектрального разрешения
На рисунке 2 сравнивается спектральное разрешение гиперспектральной микроскопии SRS (рисунок 2A) и CARS (рисунок 2B) с использованием образца DMSO. Для спектра SRS были применены две функции Лоренца (см. этап протокола 2.3), чтобы соответствовать спектру, и разрешение 14,6 ^см-1 было получено с использованием пика 2,913 ^см-1 . Для CARS для подгонки использовалась функция двухпиковой подгонки с гауссовским фоном (см. шаг протокола 2.3), которая давала спектральное разрешение 17,1 ^см-1. Эти результаты показывают, что при том же условии измерения SRS имеет лучшее спектральное разрешение, чем CARS. Снижение спектрального разрешения в CARS в основном обусловлено вовлечением нерезонансного фона. Кроме того, было обнаружено, что симметричные (2 913 ^см-1) и асимметричные (2 995 ^см-1) пиковые соотношения сильно отличались для SRS и CARS. Это связано с различными корреляциями сигналов с нелинейной оптической восприимчивостью третьего порядка, как описано в уравнениях (1) и (2). При квадратичной зависимости CARS разница интенсивностей между двумя пиками усиливается. Симметричные формы линий пиков SRS и асимметричные формы линий пиков CARS можно наблюдать в спектре. Асимметрия в сигнале CARS в основном обусловлена наличием нерезонансных фоновых помех. Спектральные пики CARS кажутся слегка смещенными в красный цвет (1-2 ^см-1) к пикам SRS. Это также возникает из-за нерезонансной фоновой интерференции с резонансными пиками.

Сравнение чувствительности обнаружения
На рисунке 3 сравнивается чувствительность обнаружения гиперспектральной микроскопии SRS и CARS. SNR сигналов DMSO SRS (2,913 ^см-1) как функции концентрации DMSO в_D2Oпри высоких концентрациях строится первым (1%-50%, рисунок 3A). Результаты показывают линейную зависимость, удовлетворяющую уравнению (2). На рисунке 3В показаны спектры ДМСО в концентрациях 0,1% и 0,01%, в которых пик 2,913 ^см-1 может быть разрешен в первом, но не во втором, указывая, что предел обнаружения составляет от 0,1% до 0,01% ДМСО. Используя предел пустых критериев, мы оценили, что предел обнаружения SRS составляет 0,021% DMSO. На рисунке 3C показана SNR CARS как функция концентрации DMSO (1%-50%), показывающая квадратичную зависимость в согласии с уравнением (1). Фазовые спектры CARS показаны на рисунке 3D для 0,1% и 0,01% DMSO. Для достижения этих спектров был использован спектральный метод фазового извлечения, основанный на соотношениях Крамерса-Кронига и выполнено дополнительное удаление фона¹⁶. Подобно спектрам SRS, пик DMSO 2,913 ^см-1 может быть четко разрешен для 0,1% DMSO, но не для 0,01%, что указывает на предел обнаружения между этими двумя концентрациями. Используя предел пустых критериев, мы подсчитали, что предел обнаружения SRS составляет 0,015% DMSO. 0,02% DMSO соответствует 2,8 мМ. Таким образом, предел обнаружения гиперспектрального микроскопа CRS, используемого здесь, составляет ~ 2,1-2,8 мМ DMSO.

Сравнение пространственного разрешения
На рисунке 4 сравнивается разрешение небольшого сотового объекта, обнаруженного на изображениях SRS (рисунок 4A) и CARS (рисунок 4B). Профили интенсивности из одной линии отображаются и подходят с помощью функции Гаусса для определения значений FWHM для сравнения разрешения. Сигнал SRS давал разрешение 398,6 нм (рисунок 4C), в то время как сигнал CARS давал разрешение 330,3 нм (рисунок 4D). Разрешение CARS было ~1,2x лучше, чем у SRS. Причина разницы в разрешении также кроется в уравнениях (1) и (2). И пучки насоса, и пучки Стокса имеют функцию гауссовского точечного разброса в фокусе. Таким образом, сигнал CARS пропорционален умножению трех гауссовских функций, что примерно уменьшает ширину в √3 раза. Аналогичным образом, для SRS ширина уменьшается в √2 раза. Поэтому разрешение CARS было √3/√2 = в 1,2 раза лучше, чем у SRS.

Сравнение изображений клеток
На рисунке 5 сравниваются изображения SRS и CARS с ячеек MIA PaCa-2 в разных положениях оптической задержки. На рисунке 5A показаны изображения SRS с оптической задержкой, которая дала самый сильный сигнал. На этом изображении могут быть обнаружены липидные капли (ЛД), эндоплазматический ретикулум (ER) и ядро (NU), причем ЛД имеют самые сильные сигналы, показанные в виде ярких точек. На рисунке 5B показано изображение канала CARS с той же оптической задержкой, что значительно снижает контрастность для ЛД. Основными причинами этой контрастной разницы являются наличие нерезонансного фона и красное смещение одного и того же рамановского пика в спектрах CARS. При такой оптической задержке генерируемый сигнал имеет большой вклад от нерезонансного фона воды. Чтобы усилить липидный контраст в CARS, оптическая задержка была настроена на значение красного смещения. Красное смещение улучшило липидные контрасты, концентрируя больше энергии до 2 850 ^см-1 как для SRS (рисунок 5C), так и для CARS (рисунок 5D), хотя общий уровень сигнала был снижен. Для CARS аналогичная контрастность ЛД, как и SRS, была достигнута красным смещением в спектральной фокусировке ~98 ^см-1 (рисунок 5D), хотя фон выше, чем на изображении SRS, все еще наблюдался. При этой оптической задержке изображение SRS показывает гораздо меньшее содержание белка и нуклеиновых кислот, но сильное содержание липидов в ЛД, ER и клеточных мембранах (рисунок 5C).

CARS является параметрическим процессом, в то время как SRS является непараметрическим. Такое различие также способствует контрастным различиям в двух модальностях. Параметрические сигналы CARS определяются интерференцией сигналов CARS из различных слоев, близких к лазерному фокусу, которые могут показывать отрицательные контрасты, как указано стрелками на рисунке 5B и рисунке 5D (также на рисунке 4B). Такие отрицательные контрасты, вызванные сигнальными помехами, отсутствуют на изображениях SRS. Отрицательный контраст в CARS может предоставить информацию об осевом положении интересующей цели.

Сигналы SRS имеют линейную зависимость от молекулярной концентрации, в то время как сигналы CARS удовлетворяют почти квадратичной зависимости концентрации. Таким образом, богатые CH₂ ЛД показывают гораздо более сильный сигнал, чем ER и клеточные мембраны на изображении CARS, чем на изображении SRS (рисунок 5E, F). Спектры SRS могут быть извлечены из гиперспектральных изображений. На рисунке 5G показаны типичные спектры SRS от ЛД, ER, цитозола (CY) и NU. Как интенсивность, так и спектральная форма различны для разных клеточных компартментов. LD показывает гораздо более сильный сигнал на 2 850 ^см-1 , чем другие органеллы. Что касается CARS, то можно получить сходные спектры, хотя и разные по форме. Необработанные спектры CARS показывают небольшое красное смещение по сравнению с соответствующими спектрами SRS. Спектральное фазовое извлечение может быть дополнительно использовано для извлечения рамановских ответов с использованием спектров CARS.

Рисунок 1: Схема гиперспектрального микроскопа CARS/SRS. Сокращения: CARS = когерентное анти-Стоксовское рамановское рассеяние; SRS = стимулированное рамановское рассеяние; PBS = поляризационный светоделитель; PD = фотодиод; PMT = фотоумножительная трубка; AOM = акустооптический модулятор. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Спектры DMSO. (A) SRS и (B) CARS спектры DMSO. Точки являются экспериментальными данными; кривые являются результатами спектральной подгонки. Сокращения: CARS = когерентное анти-Стоксовское рамановское рассеяние; SRS = стимулированное рамановское рассеяние; ДМСО = диметилсульфоксид; w = спектральное разрешение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Отношение сигнал/шум и спектры DMSO. (A) Отношение сигнал/шум симметричного пика DMSO при 2,913 ^см-1 в зависимости от концентрации в_D2O, измеренной SRS. Точки являются экспериментальными данными; линия является линейным результатом подгонки. (B) Спектры SRS 0,1% и 0,01% DMSO в_D2O. (C) Отношение сигнал/шум симметричного пика DMSO при 2,913 ^см-1 в зависимости от концентрации в_D2O, измеренной CARS. Точки являются экспериментальными данными; кривая является результатом полиномиальной подгонки второй степени. (D) Спектры CARS 0,1% и 0,01% DMSO в D₂O. Сокращения: CARS = когерентное анти-Стоксовское рамановское рассеяние; SRS = стимулированное рамановское рассеяние; ДМСО = диметилсульфоксид; SNR = отношение сигнал/шум; _D2O = оксид дейтерия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Изображения SRS и CARS и профили интенсивности ячейки MIA PaCa-2. (A) Изображение SRS ячейки MIA PaCa-2. (B) Изображение CARS ячейки MIA PaCa-2 в том же поле зрения, что и панель A. С) Профиль интенсивности СГД вдоль желтой линии на панели А. D) Профиль силы света ТС вдоль желтой линии в табличке В. Точки являются экспериментальными данными; кривые — это результаты подгонки функции Гаусса. Шкала стержней = 5 мкм. Сокращения: CARS = когерентное анти-Стоксовское рамановское рассеяние; SRS = стимулированное рамановское рассеяние; w = разрешение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Изображения и профиль интенсивности ячеек MIA PaCa-2. (A) Изображение SRS ячеек MIA PaCa-2 с оптимизированной временной задержкой для интенсивности SRS. (B) Изображение CARS с той же задержкой, что и на панели A. (C) Изображение СГД при задержках с красным смещением 98 ^см-1, как на панели А. (D) Изображение CARS с той же оптической задержкой, что и на панели C. (Э,Ф) Профили интенсивности SRS и CARS, нанесенные вдоль пунктирных линий на панелях A и D. (G) Типичные спектры SRS из липидных капель, эндоплазматического ретикулума, цитозола и ядра. (H) Типичные спектры CARS четырех клеточных композиций. Зеленые и красные пунктирные линии являются позициями задержки для панелей A/B и C/D соответственно. Шкала стержней = 10 мкм. Сокращения: CARS = когерентное анти-Стоксовское рамановское рассеяние; SRS = стимулированное рамановское рассеяние; LD = липидные капли; ER = эндоплазматический ретикулум; CY = цитозоль; NU = ядро. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный файл: Лабораторно написанное программное обеспечение на основе LabVIEW, имеющее одновременный многоканальный дисплей для просмотра и сохранения изображений в режиме реального времени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Протокол, представленный здесь, описывает конструкцию мультимодального микроскопа CRS и прямое сравнение между визуализацией CARS и SRS. Для конструкции микроскопа критическими шагами являются пространственное и временное перекрытие пучка и оптимизация размера пучка. Рекомендуется использовать стандартный образец, такой как DMSO, перед биологической визуализацией для оптимизации SNR и калибровки рамановских сдвигов. Прямое сравнение между изображениями CARS и SRS показывает, что CARS имеет лучшее пространственное разрешение, в то время как SRS дает лучшее спектральное разрешение и менее запутанные химические контрасты. И CARS, и SRS имеют одинаковые пределы обнаружения.

Визуализация CARS и SRS использует высокоэнергетические импульсные лазеры для возбуждения. Это позволяет платформе интегрировать другие нелинейные оптические методы визуализации, такие как многофотонная флуоресценция возбуждения, генерация гармоник и переходное поглощение для дополнительных химических контрастов^28,39.

CARS и SRS широко используются для изучения липидного состава с высокой химической селективностью. Тем не менее, технологии не ограничиваются количественной оценкой липидов. SRS был применен для карты распределения лекарств⁴², синтеза белка⁴³ и ДНК⁴⁴. CARS и SRS также были применены для изображения фармацевтических ингредиентов и вспомогательных веществ в таблетках 45,46,47,48. Гиперспектральные CARS и SRS нашли применение в диагностике рака⁴⁹, оценке сердечно-сосудистых заболеваний⁵⁰ и нейронной визуализации⁵¹. Они также могут быть применены для исследований COVID-19⁵². Широкополосные CARS, которые могут охватывать спектральные окна шириной до 3000 ^см-1, могут прояснить богатые химические структуры в биологических образцах⁵³. Однако из-за медленной скорости считывания ПЗС время ожидания пикселя находится на уровне миллисекунд, что намного медленнее, чем микросекундное время ожидания пикселя для микроскопии SRS³⁴. Гиперспектральная микроскопия SRS в настоящее время имеет типичную полосу пропускания 200-300 ^см-1, ограниченную полосой пропускания лазера и отсутствием фиксированных детекторов³⁴. Микроскопия с преобразованием Фурье SRS является альтернативным способом потенциального расширения спектрального покрытия SRS³⁵.

Хотя CARS и SRS предоставляют богатую химическую информацию без необходимости маркировки, химическая селективность заключается в химических связях, что затрудняет различение конкретных белков. Рамановские метки показали потенциал для повышения химической селективности CARS и SRS^54,55. Тем не менее, когерентная рамановская визуализация по-прежнему имеет гораздо более низкую чувствительность по сравнению с обнаружением флуоресценции. Улучшение поверхности использовалось для спонтанной спектроскопии рассеяния комбинационного рассеяния для улучшения уровней сигнала⁵⁶. Он также применялся к CARS и SRS для усиления сигнала 57,58,59. Хотя коэффициент усиления не так высок, как спонтанное рамановское рассеяние, микроскопия CARS и SRS по-прежнему показывают потенциал для обнаружения отдельных молекул^59,60. Тем не менее, использование металлических частиц или поверхностей лишает преимущества подхода без маркировки. Повышение чувствительности когерентной рамановской микроскопии без использования металлических поверхностей значительно расширило бы применение технологии в биологической науке.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Это исследование было поддержано стартап-фондом факультета химии Университета Пердью.