Comparação direta da dispersão de Raman estimulada hiperespectral e microscopia de dispersão de Raman coerente para imagem química

Este artigo compara diretamente os contrastes de resolução, sensibilidade e imagem da dispersão estimulada de Raman (SRS) e da dispersão coerente anti-Stokes Raman (CARS) integrada à mesma plataforma de microscópio. Os resultados mostram que o CARS tem uma melhor resolução espacial, o SRS dá melhores contrastes e resolução espectral, e ambos os métodos têm sensibilidade semelhante.

A dispersão estimulada de Raman (SRS) e a microscopia de dispersão anti-Stokes Raman (CARS) são as tecnologias de imagem de dispersão raman mais amplamente utilizadas. As imagens hiperespectrais SRS e CARS oferecem informações espectrais de Raman a cada pixel, o que permite uma melhor separação de diferentes composições químicas. Embora ambas as técnicas exijam dois lasers de excitação, seus esquemas de detecção de sinal e propriedades espectrais são bem diferentes. O objetivo deste protocolo é realizar imagens de SRS hiperespectrais e CARS em uma única plataforma e comparar as duas técnicas de microscopia para imagens de diferentes amostras biológicas. O método de foco espectral é empregado para adquirir informações espectrais usando lasers femtosegundos. Utilizando amostras químicas padrão, a sensibilidade, resolução espacial e resolução espectral de SRS e CARS nas mesmas condições de excitação (ou seja, energia na amostra, tempo de moradia dos pixels, lente objetiva, energia de pulso) são comparadas. Os contrastes de imagem de CARROS e SRS para amostras biológicas são justtaposed e comparados. A comparação direta dos desempenhos de CARROS e SRS permitiria a seleção ideal da modalidade para imagem química.

O fenômeno de dispersão de Raman foi observado pela primeira vez em 1928 por C. V. Raman¹. Quando um fóton incidente está interagindo com uma amostra, um evento de dispersão inelástica pode ocorrer espontaneamente, no qual a mudança de energia do fóton corresponde a uma transição vibracional das espécies químicas analisadas. Este processo não requer o uso de uma etiqueta química, tornando-a uma ferramenta versátil e livre de rótulos para análise química, minimizando a perturbação da amostra. Apesar de suas vantagens, a dispersão espontânea de Raman sofre de uma seção transversal de baixa dispersão (tipicamente 10¹¹ menor que a seção transversal de absorção infravermelha [IR]), o que requer longos tempos de aquisição para análise². Assim, a busca pelo aumento da sensibilidade do processo de dispersão de Raman é essencial para impulsionar as tecnologias Raman para imagens em tempo real.

Uma maneira eficaz de aumentar muito a sensibilidade da dispersão de Raman é através de processos coerentes de dispersão de Raman (CRS), para os quais dois pulsos de laser são tipicamente usados para excitar transições vibracionais moleculares ^3,4. Quando a diferença de energia de fótons entre os dois lasers corresponde aos modos vibracionais das moléculas de amostra, fortes sinais raman serão gerados. Os dois processos de CRS mais usados para imagem são a dispersão coerente anti-Stokes Raman (CARS) e a dispersão de Raman estimulada (SRS)⁵. Nas últimas duas décadas, os desenvolvimentos tecnológicos avançaram nas técnicas de microscopia de CARROS e SRS para se tornarem ferramentas poderosas para quantificação sem rótulos e elucidação de alterações químicas em amostras biológicas.

A imagem química por microscopia CARS pode ser datada de 1982 quando a varredura a laser foi aplicada pela primeira vez para adquirir imagens CARS, demonstradas por Duncan et al⁶. A modernização da microscopia CARS foi bastante acelerada após as amplas aplicações da microscopia de fluorescência multifoton^{a laser 7}. Os primeiros trabalhos do grupo Xie usando lasers de alta taxa de repetição tornaram-se uma plataforma de imagem química de alta velocidade, sem rótulos, para a caracterização de moléculas em amostras biológicas ^8,9,10. Um dos principais problemas para a imagem cars é a presença de um fundo não ressonante, que reduz o contraste da imagem e distorce o espectro Raman. Muitos esforços foram feitos para reduzir o fundo não ressonante 11,12,13,14,15 ou para extrair sinais raman ressonantes do espectro ^{CARS 16,17}. Outro avanço que tem avançado muito o campo é a imagem de CARS hiperespectral, que permite o mapeamento espectral em cada pixel de imagem com melhor seletividade química 18,19,20,21.

A dispersão de Raman Estimulada (SRS) é uma tecnologia de imagem mais jovem do que cars, embora tenha sido descoberta anteriormente^{aos 22 anos}. Em 2007, a microscopia SRS foi relatada usando uma baixa taxa de repetição da fonte laser²³. Logo, vários grupos demonstraram imagens de SRS de alta velocidade usando lasers de alta taxa de repetição 24,25,26. Uma das principais vantagens da microscopia SRS sobre carros é a ausência do fundo não ressonante²⁷, embora outros fundos como modulação transversal (XPM), absorção transitória (TA), absorção de dois fótons (TPA) e efeito fototermal (PT), possam ocorrer com o SRS²⁸. Além disso, o sinal SRS e a concentração amostral têm relações lineares, ao contrário dos CARS, que tem uma dependência quadrática de concentração de sinal²⁹. Isso simplifica a quantificação química e o descompramento espectral. A SRS multicolorida e hiperespectral evoluiu de diferentes formas 30,31,32,33,34,35,36, com foco espectral sendo uma das abordagens mais populares para a imagem química ^37,38.

Tanto os CARROS quanto o SRS requerem o foco da bomba e os raios laser de Stokes na amostra para combinar com a transição vibracional das moléculas para excitação de sinal. Os microscópios CARS e SRS também compartilham muito em comum. No entanto, a física subjacente a esses dois processos, e as detecções de sinais envolvidas nessas tecnologias de microscopia têm disparidades ^3,39. CARS é um processo paramétrico que não tem acoplamento de energia net fóton-molécula³. O SRS, no entanto, é um processo não paramétrico, e contribui para a transferência de energia entre fótons e sistemas moleculares²⁷. Em CARS, um novo sinal na frequência anti-Stokes é gerado, enquanto o SRS se manifesta como a transferência de energia entre a bomba e os raios laser stokes.

O sinal CARS satisfaz eq (1)²⁸.

(1)

Enquanto isso, o sinal SRS pode ser escrito como Eq (2)²⁸.

(2)

Aqui, eu_p, i_s, I_CARS, e ΔI_SRS são as intensidades do feixe de bomba, feixe de Stokes, sinal CARS e sinais SRS, respectivamente. Χ⁽³⁾ é a suscetibilidade óptica não linear de terceira ordem da amostra, e é um valor complexo composto de partes reais e imaginárias.

Essas equações expressam os perfis espectrais e a dependência de concentração de sinais de CARROS e SRS. Diferenças na física resultam em esquemas de detecção diferentes para essas duas tecnologias de microscopia. A detecção de sinal em CARROS geralmente envolve a separação espectral de fótons recém-gerados e a detecção usando um tubo fotomultiplier (PMT) ou dispositivo acoplado por carga (CCD); para SRS, a troca de energia entre a bomba e os feixes de Stokes é geralmente medida pela modulação de alta velocidade de intensidade usando um modulador óptico e desmodulação usando um fotodiodo (PD) emparelhado com um amplificador de travamento.

Embora muitos desenvolvimentos tecnológicos e aplicações tenham sido publicados nos últimos anos nos campos de CARROS e SRS, não foram realizadas comparações sistemáticas das duas técnicas de CRS na mesma plataforma, especialmente para carros hiperespectrais e microscopia SRS. Comparações diretas em sensibilidade, resolução espacial, resolução espectral e capacidades de separação química permitiriam aos biólogos selecionar a melhor modalidade de quantificação química. Neste protocolo, são fornecidas etapas detalhadas para a construção de uma plataforma de imagem multimodal com as modalidades CARROS hiperespectrais e SRS baseadas em um sistema laser femtosegundo e foco espectral. As duas técnicas foram comparadas na direção para resolução espectral, sensibilidade à detecção, resolução espacial e contrastes de imagem das células.

1. Configuração instrumental para imagens de CRS hiperespectrais

NOTA: A geração de sinal CRS requer o uso de lasers de alta potência (ou seja, classe 3B ou classe 4). Os protocolos de segurança devem ser abordados e os equipamentos de proteção individual (EPI) adequados devem ser usados em todos os momentos quando se trabalha em potências de pico tão altas. Consulte a documentação adequada antes da experimentação. Este protocolo se concentra em projetar o caminho do feixe, chiar os pulsos femtosegundos e otimizar as condições de imagem. Um layout óptico geral deste microscópio CRS hiperespectral é mostrado na Figura 1. A configuração mostrada aqui é uma das muitas configurações existentes para microscopia CRS. O sistema de microscopia CRS usado neste protocolo é construído sobre uma fonte de laser femtosegundo de dupla saída e um microscópio de varredura a laser.

1. Certifique-se de que a fonte laser fornece dois trens de pulso femtosegundos (120 fs de largura) com uma taxa de repetição de 80 MHz, incluindo um comprimento de onda fixo a 1.045 nm usado como feixe de Stokes, e um comprimento de onda incapaz de 680 a 1.300 nm usado como bomba. Sincronize os pulsos de saída com uma diferença de atraso óptico. Use um quadro de microscópio para construir a plataforma de imagem.
2. Projetando o caminho do feixe
   1. Para controlar a potência do laser na amostra, use uma combinação de placa de meia onda e divisor de feixe de polarização (PBS) para cada feixe de laser.
   2. Instale um modulador acousto-óptico (AOM) no caminho do raio laser stokes. Concentre o feixe com uma lente de distância focal de 150 mm no AOM e recolima a saída de^0ª ordem com uma lente de distância focal de 400 mm.
   3. Use o mesmo par de lentes (comprimentos focais de 150 mm e 400 mm) para expandir o feixe da bomba para combinar o tamanho do raio laser com os Stokes.
   4. Coloque as lentes de distância focal de 400 mm nos caminhos da bomba e do feixe stokes em estágios de tradução unidimensionais separados para ajustar a divergência do feixe e otimizar o tamanho do feixe antes de entrar no microscópio.
   5. Direcione o feixe da bomba com um espelho reto refletindo montado em um estágio de tradução motorizado para ajuste óptico de atraso. Se o feixe stokes precisar de atraso óptico, coloque esses componentes em seu caminho de feixe.
   6. Permita que ambos os feixes sejam combinados em um espelhodicróico com um comprimento de onda de corte a ~1.000 nm (entre os comprimentos de onda da bomba e stokes), de modo que o feixe de Stokes transmita através do espelhodicróico enquanto o feixe da bomba é refletido pelo espelhodicróico. Envie os feixes laser quase combinados para o microscópio.
   7. Para chirp a bomba e as vigas stokes, coloque barras de vidro em seus caminhos de vigas. Veja o passo 1.5 para mais detalhes.
   8. Para confirmar o alinhamento adequado e o tamanho do feixe, use diafragmas de íris após o espelhodicrómico e antes do microscópio. Especificamente, instale um em uma posição próxima e a outra a uma distância do espelhodicróico para confirmar um bom alinhamento e sobreposição do feixe. Use um cartão de visualização IR ou visualizador IR para visualizar o feixe durante o alinhamento.
   9. Use um PD rápido e um osciloscópio para medir aproximadamente o atraso óptico entre os pulsos da bomba e stokes. Acione o osciloscópio amostrando o trem de pulso laser.
   10. Bloqueie o feixe da bomba e prove o feixe de Stokes. Aproxime-se de um dos pulsos e coloque um cursor vertical nele para marcar sua localização temporal no osciloscópio.
   11. Desbloqueie o feixe da bomba e bloqueie o feixe de Stokes. Traduza o estágio de atraso até que a bomba da amostra pulsar temporalmente alinhada com a posição marcada.
3. O microscópio de varredura a laser
   1. Para uma configuração de microscópio vertical, envie os feixes de laser combinados através de um periscópio para subir a um nível apropriado antes de alcançar os espelhos de varredura de galvo 2D.
   2. Meça o tamanho do raio laser antes do microscópio, e configure o par de lentes adequada após os espelhos de galvo para expandir o raio laser para melhor corresponder ao tamanho da pupila de entrada da lente objetiva.
   3. Construa um sistema 4 f usando as duas lentes, com a abertura traseira da lente objetiva e o centro dos dois espelhos galvo sendo planos conjugados. Alternativamente, use dois espelhos galvo 1D separados com dois sistemas de lentes 4 f para escaneamento a laser.
   4. Depois do condensador, projete um espelho 2 em flip para refletir os raios laser para coleta de sinal. Posicione uma lente com 2 de diâmetro no feixe transmitido para coletar e concentrar totalmente os sinais de transmissão nos detectores.
   5. Direcione os sinais cars para o PMT com um espelho dicroico com um corte de 776 nm, e permita que os sinais SRS transmitidos sejam detectados pelo PD. Use um filtro de bandpass (655/30 nm) antes do PMT para rejeitar pulsos de laser de excitação residual. Use um filtro de passagem curta (passe curto de 980 nm) antes que o PD bloqueie a entrada do feixe de Stokes no detector.
   6. Para detecção de sinal CARS, conecte um pré-amplificador e um conversor de tensão de corrente após o PMT e antes de enviar o sinal para o sistema de aquisição de dados. Ajuste a tensão pmt para otimizar o contraste de sinal e imagem.
   7. Use um gerador de função para modular o AOM a 1-10 MHz e use a mesma frequência que a referência para a demodulação de lock-in. Use um amplificador de travamento para extrair sinais SRS antes da aquisição de dados.
4. Aquisição e exibição de dados
   1. Realize a aquisição de dados usando um cartão de aquisição de dados digitais (DAQ) em conjunto com um bloco terminal.
   2. Use as saídas analógicas do DAQ para controlar os espelhos galvo e as entradas analógicas para aquisição de sinal.
   3. Use software escrito em lab com base no LabVIEW que tenha uma tela multicanal simultânea para visualização em tempo real e economia de imagens (consulte Arquivo Suplementar).
5. Chirping a fonte femtosegundo e medindo a resolução espectral
   NOTA: Para obter uma boa resolução espectral usando foco espectral, as hastes de vidro são usadas para introduzir dispersões e pulsos de laser de chirp do femtosegundo ao picosegundo. Para obter a melhor resolução espectral, a taxa de chirp do feixe de bomba precisa ser igual à do feixe de Stokes. Para este sistema de laser, a melhor resolução espectral pode ser alcançada com o chiar os pulsos laser de saída de ~120 fs para 3,4 ps para a bomba e 1,8 ps para os Stokes. Esta chirping é alcançada usando uma combinação 4+1 (quatro no feixe combinado, um apenas no feixe stokes) de 150 mm de haste de vidro (SF-57), como descrito abaixo, e deve alcançar uma resolução espectral ^{de 15 cm-1} . A duração do pulso pode ser medida usando um autocorrelador.
   1. Insira uma haste de vidro de 150 mm apenas no caminho do feixe stokes.
   2. Insira duas hastes de vidro de 150 mm no caminho combinado do feixe da bomba/Stokes após o divisor de feixedicrómico. Para aumentar o brilho, deixe que os raios laser combinados passem duas vezes as duas hastes de vidro colocando um espelho dielétrico em uma extremidade das hastes.
   3. Para medir a resolução espectral, prepare uma amostra química padrão (por exemplo, sulfóxido de dimetil [DMSO]) pressionada entre duas tampas de vidro e escaneie o estágio de atraso até que o sinal máximo seja alcançado.
   4. Mova o atraso óptico de 1.000 μm na direção de mudança vermelha. Em seguida, execute 200 quadros a 10 μm/passo em direção à direção blueshift para coletar a pilha de imagens hiperespectrais.
   5. Para converter os números de quadros em números de ondas, realize uma regressão linear utilizando o simétrico (2.913 ^cm-1) e assimétrico (2.994 ^cm-1) C-H esticando-se do DMSO e seus números de quadro^{correspondentes 40}.
   6. Use o sinal XPM para medir o perfil de intensidade de foco espectral. Feche metade o diafragma no condensador e mova o foco para um deslizamento em branco. Colete o mesmo número de passos que para SRS hiperespectral. Para medir o fundo CARS não ressonante, concentre-se no deslizamento de tampa de vidro e colete o mesmo número de passos para as medidas cars hiperespectrais.
6. Otimizando a relação sinal-ruído (SNR) das imagens
   1. Prepare uma amostra química para alinhamento do sistema. Siga o procedimento descrito na etapa 3.1 para preparação da amostra.
      NOTA: O DMSO é uma boa escolha porque é um produto químico de laboratório comum com sinais raman fortes e picos simétricos e assimétricos bem separados.
   2. Coloque a amostra no estágio do microscópio e adicione água ou óleo de imersão, se necessário, para a lente objetiva ou condensador. Mova corretamente a borda da gotícula DMSO no campo de visão e ajuste a lente objetiva para o melhor foco. Centralizar o condensador usando o método de iluminação Köhler⁴¹. Abra totalmente o diafragma no condensador.
   3. Sintonize o comprimento de onda do feixe de bomba até 800 nm (1.045 nm Stokes) para atingir o pico de 2.913 ^cm-1 CH₃ . Ajuste a potência da bomba e do feixe de Stokes para ~30 mW antes do microscópio, ajustando a placa de meia onda (~10 mW de potência no plano de amostra).
   4. Para SRS, defina o ganho do amplificador de travamento para ~10 com uma constante de tempo de 7 μs (ao usar um tempo de mora de 10 μs pixel). Certifique-se de que a constante de tempo é menor do que o tempo de moradia dos pixels. Use Demod R para a saída AUX para sinais SRS.
   5. Para CARROS, envie a saída pmt para o pré-amplificador e conversor de tensão de corrente. Use o DAQ para adquirir a saída do conversor.
   6. Defina os parâmetros de aquisição de imagens no software de aquisição. Use um número de pixel de 200 x 200 com um tamanho de varredura de ~100 x 100 μm². Certifique-se de que a imagem contém tanto a gota DMSO quanto uma área vazia.
   7. Escaneie a amostra e verifique a imagem na tela do computador. Escaneie o estágio de atraso motorizado no feixe de Stokes/bomba enquanto monitora as imagens em tempo real. Escaneie o atraso até que o sinal seja maximizado.
   8. Mova a gota DMSO para cobrir todo o campo de visão e verifique se a máxima do sinal DC está centrada na imagem (o sinal é dependente do feixe de bomba). Ajuste a posição do feixe da bomba através de um espelho ou o deslocamento de tensão no software de imagem.
   9. Após a otimização do DC, ajuste os espelhos do feixe de Stokes até que o sinal CA seja maximizado ajustando o valor do limiar para exibir ~50% de saturação. Verifique se a saturação está centrada na imagem. Se não, ajuste os espelhos apenas na viga stokes. Monitore o sinal durante o alinhamento como feedback em tempo real sobre a qualidade do alinhamento.
   10. Para determinar o SNR, selecione uma pequena região da imagem DMSO e meça o valor médio. Para o ruído, selecione uma pequena área na região vazia da imagem e determine tanto o valor médio médio quanto o desvio padrão. Subtrair o valor médio de ruído do valor médio do sinal e dividir os resultados pelo desvio padrão da região vazia.
   11. Se o SNR calculado não for alto o suficiente (tipicamente 800-1.000 para SRS e >10.000 para carros a uma tensão PMT de 0,4 V com esta combinação de energia), verifique e reoptimize a sobreposição do feixe, tamanhos de feixe e posição de estágio de atraso, ajuste fino do AOM e altere a frequência de modulação do gerador de funções até que o SNR esperado seja obtido.

2. Análise de imagens e processamento de dados

1. Análise SNR
   1. Abra o software ImageJ. Para importar o arquivo .txt de amostra DMSO salvo, clique em | de Arquivo | de importação | de imagem de texto Abra.
   2. Uma vez que a imagem é importada, pressione CTRL+shift+C para trazer à tona a função de brilho e contraste (B&C). Para encontrar o sinal máximo da amostra, pressione o botão automático no B&C até que uma região da amostra DMSO pareça saturada.
   3. Clique na ferramenta de seleção oval na interface ImageJ e destaque uma pequena área da região Saturada DMSO. Uma vez destacado, pressione M para medir a média e o desvio padrão da área selecionada.
   4. Para medir o fundo, ajuste as barras na função B&C até que o sinal da região vazia possa ser observado. Clique na seleção oval e destaque uma região de fundo do mesmo tamanho da etapa 2.1.3. Certifique-se de que a região selecionada não contém DMSO. Pressione M para medir as estatísticas da área selecionada.
   5. Calcule o SNR de acordo com a etapa 1.6.10.
2. Processamento de imagens crs hiperespectrais
   1. Importar o arquivo .txt de acordo com a etapa 2.1.1. Uma vez importado, clique em Imagem | Pilhas | Ferramentas | Montagem para Stack... para converter o arquivo em uma pilha de imagens.
   2. Role a montagem até que o primeiro pico DMSO esteja visível. Selecione uma região no DMSO e clique em Imagem | Empilhar | Plote O perfil do eixo Z para traçar o espectro intensidade versus número de quadros. Para extrair os dados espectrais brutos, clique na lista e copie os dados do perfil.
   3. Para converter o espectro recuperado em unidades de número de ondas, realize uma regressão linear conforme descrito na etapa 1.5.5.
3. Adequado para medir a resolução espectral
   NOTA: As funções lorentzianas são usadas para se adequar ao espectro SRS e CARS²⁸.
   1. Abra o software de montagem e, em seguida, copie e cole os dados de regressão linear no programa. Para ajustar os dados srs, destaque os dados e, em seguida, plote os dados como um gráfico de dispersão.
   2. Puxe o plano de dispersão. Clique em Análise | Picos e | de linha de base Vários | de pico de pico Abra o Diálogo para trazer o analisador de pico. Quando for puxado para cima, verifique se a entrada é o enredo atual e mude a função de pico para Lorentzian (Lorentz).
   3. Clique duas vezes em cada um dos dois picos de DMSO no gráfico para destacar as regiões a serem instaladas. Em seguida, clique em Open NLfit para trazer a janela de montagem . Clique no botão Fit até convergência e, em seguida, OK, para ver um resumo tabulado dos coeficientes de montagem (ver Eq (3)).
      NOTA: A equação abaixo mostra o formato de função Lorentzian no software. Um₁/₂ são as amplitudes dos picos de montagem, w₁/₂ são as larguras dos picos montados, e os valores x₀₁/₀₂ são os centros dos picos instalados. A variável independente é x e a variável dependente é y.
      (3)
   4. Para encaixe espectral de CARROS, clique em Análise | Montagem | Ajuste de curva não linear | Diálogo Aberto. Selecione categoria: nova para definir uma nova função para CARROS. Use uma função de encaixe CARS de dois picos definida abaixo (ver Eq (4)) para encaixe espectral cars.
      (4)
4. Determinando a resolução espacial
   NOTA: Antes desta etapa, é importante saber a conversão entre o tamanho do pixel em uma ampliação específica, número de pixel e o tamanho da etapa em μm. Isso pode ser realizado usando uma amostra de um diâmetro conhecido que é maior do que a resolução de imagem esperada, medindo seu perfil de linha e encaixando uma função gaussiana para determinar a largura total pela metade do valor máximo (FWHM). Podem ser utilizadas metas de resolução ou amostras uniformes, como contas poliméricas.
   1. Adquira uma imagem de células ou partículas de polímero com menos de 200 nm de diâmetro.
   2. Use ImageJ para desenhar uma linha através da menor partícula da imagem.
   3. Pressione K para traçar o perfil de intensidade.
   4. Clique na lista da janela pop-up e copie as informações para o software de montagem.
   5. Plote o perfil em software de montagem e use o encaixe gaussiano (clique em Análise | Montagem | Ajuste de curva não linear | | de diálogo aberto Categoria: Funções Básicas; Função: Gauss).
   6. Leia a largura do pico após o encaixe. Use o pixel para a conversão de tamanho para obter a resolução real do microscópio.

3. Preparação de amostras para imagens de CRS hiperespectral

1. Preparação de slides de imagem e amostras químicas
   1. Coloque um pedaço de fita dupla face em um deslizamento de tampa e corte uma pequena forma retangular da fita do meio da fita colocada para criar uma área aberta para a amostra ser colocada.
   2. Pipeta 1-2 μL de DMSO puro e dispensar a gota no centro da vaga.
   3. Coloque cuidadosamente a tampa superior e pressione suavemente as bordas das tampas para selar a câmara, certificando-se de que a amostra DMSO não entre em contato com as bordas da fita.
   4. Para experimentos de sensibilidade, prepare diluições seriais de DMSO em óxido de deutério (D₂O) para dar uma faixa de concentração de 50%-0%. Pegue 1-2 μL de cada solução e prepare amostras prensadas conforme descrito acima.
2. Preparação celular
   1. Semente as células em um prato de fundo de vidro de 35 mm (ou maior) no Médio De Águia Modificada (DMEM) de Dulbecco com 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% penicilina/estreptomicina.
   2. Incubar as células em uma câmara de incubação a 37 °C com uma atmosfera de CO₂ de 5% durante a noite ou mais até que ~50%-80% de confluência seja alcançada.
   3. Imagem das células vivas diretamente ou fixar as células com uma solução de 10% de formalina para imagem.

Comparações da resolução espectral
A Figura 2 compara a resolução espectral da microscopia hiperespectral SRS (Figura 2A) e CARS (Figura 2B) utilizando uma amostra de DMSO. Para o espectro SRS, duas funções lorentzianas (ver protocolo passo 2.3) foram aplicadas para se adequar ao espectro, e uma resolução de 14,6 ^{cm-1 foi obtida utilizando-se} o pico de 2.913 ^cm-1 . Para carros, foi utilizada uma função de ajuste de dois picos com fundo gaussiano (ver protocolo passo 2.3) para a montagem, o que deu a resolução espectral de 17,1 ^cm-1. Esses resultados mostram que, na mesma condição de medição, o SRS tem uma resolução espectral melhor do que o CARS. A redução da resolução espectral nos CARS é contribuida principalmente pelo envolvimento do fundo não ressonante. Além disso, verificou-se que as taxas de pico simétrica (2.913 ^cm-1) e assimétrica (2.995 ^cm-1) eram muito diferentes para SRS e CARS. Isso se deve às diferentes correlações de sinal com a suscetibilidade óptica não linear de terceira ordem, conforme descrito nas equações (1) e (2). Com a dependência quadrática dos CARROS, a diferença de intensidade entre os dois picos é amplificada. As formas de linha simétrica dos picos srs e as formas de linha assimétricas dos picos cars podem ser observadas no espectro. A assimetria no sinal CARS deve-se principalmente à presença da interferência de fundo não ressonante. Os picos espectrais dos CARS aparecem ligeiramente vermelhos (1-2 ^cm-1) para os picos srs. Isso também decorre da interferência de fundo não ressonante com picos ressonantes.

Comparações da sensibilidade de detecção
A Figura 3 compara a sensibilidade de detecção da microscopia hiperespectral SRS e CARS. O SNR dos sinais DMSO SRS (2.913 ^cm-1) em função da concentração de DMSO em D₂O em altas concentrações são traçados primeiro (1%-50%, Figura 3A). Os resultados mostram uma relação linear, uma equação satisfatória (2). A Figura 3B parcela o espectro DMSO em concentrações de 0,1% e 0,01%, nas quais o pico de 2.913 ^cm-1 pode ser resolvido no primeiro, mas não no segundo, indicando que o limite de detecção é entre 0,1% e 0,01% DMSO. Utilizando o limite de critérios em branco, estimamos que o limite de detecção do SRS é de 0,021% DMSO. A Figura 3C traça o SNR cars em função da concentração de DMSO (1%-50%), mostrando uma dependência quadrática de acordo com a equação (1). Os espectros CARS recuperados em fase são mostrados na Figura 3D para o DMSO de 0,1% e 0,01%. Para alcançar esses espectros, foi utilizado um método de recuperação de fases espectral baseado nas relações Kramers-Kronig e a remoção adicional de antecedentes^{foi realizada 16}. Semelhante ao espectro SRS, o pico DMSO de 2.913 ^cm-1 pode ser claramente resolvido para o DMSO de 0,1%, mas não o 0,01%, indicando um limite de detecção entre essas duas concentrações. Utilizando o limite de critérios em branco, estimamos que o limite de detecção de SRS é de 0,015% DMSO. O DMSO de 0,02% corresponde a 2,8 mM. Portanto, o limite de detecção do microscópio CRS hiperespectral utilizado aqui é ~2,1-2,8 mM DMSO.

Comparações da resolução espacial
A Figura 4 compara a resolução de um pequeno recurso celular detectado nas imagens SRS (Figura 4A) e CARS (Figura 4B). Os perfis de intensidade da mesma linha são exibidos e adequados usando uma função gaussiana para determinar valores FWHM para comparação de resolução. O sinal SRS deu uma resolução de 398,6 nm (Figura 4C), enquanto o sinal CARS deu uma resolução de 330,3 nm (Figura 4D). A resolução dos CARROS foi ~1,2x melhor que a do SRS. A razão para a diferença de resolução também está nas equações (1) e (2). Tanto a bomba quanto os feixes de Stokes têm uma função de spread de ponto gaussiano no foco. O sinal de CARS é então proporcional à multiplicação de três funções gaussianas, o que reduz aproximadamente a largura por um fator de √3. Da mesma forma, para o SRS, a largura é reduzida por um fator de √2. Portanto, a resolução de CARROS foi √3/√2 = 1,2 vezes melhor que a do SRS.

Comparações das imagens das células
A Figura 5 compara as imagens SRS e CARS das células MIA PaCa-2 em diferentes posições de atraso óptico. A Figura 5A mostra as imagens srs no atraso óptico que deu o sinal mais forte. Nesta imagem, gotículas lipídicas (LDs), ânticulo endoplasmático (ER) e núcleo (NU) podem ser detectados, com LDs tendo os sinais mais fortes mostrados como pontos brilhantes. A Figura 5B mostra a imagem do canal CARS com o mesmo atraso óptico, tendo contrastes muito reduzidos para LDs. As principais razões para essa diferença de contraste são a presença do fundo não ressonante e a mudança vermelha do mesmo pico de Raman nos espectros cars. Neste atraso óptico, o sinal gerado tem uma grande contribuição do fundo não ressonante da água. Para melhorar o contraste lipíduo em CARS, o atraso óptico foi ajustado a um valor vermelho.deslocado. A mudança vermelha melhorou os contrastes lipídicos concentrando mais energia aos 2.850 ^cm-1 tanto para SRS (Figura 5C) quanto para CARS (Figura 5D), embora o nível geral de sinal tenha sido reduzido. Para carros, um contraste semelhante de LDs como SRS foi alcançado por uma mudança vermelha de ~98 ^cm-1 no foco espectral (Figura 5D), embora um fundo maior do que o da imagem SRS ainda foi observado. Neste atraso óptico, a imagem srs mostra muito menos teor de proteína e ácido nucleico, mas conteúdo lipídico forte em LDs, ER e membranas celulares (Figura 5C).

Cars é um processo paramétrico enquanto o SRS não é paramétrico. Essa diferença também contribui para diferenças de contraste nas duas modalidades. Os sinais paramétricos de CARS são determinados pela interferência de sinais CARS de diferentes camadas próximas ao foco do laser, o que pode mostrar contrastes negativos como indicado por setas na Figura 5B e Figura 5D (também na Figura 4B). Esses contrastes negativos induzidos por interferência de sinal estão ausentes nas imagens srs. O contraste negativo em CARS pode fornecer informações sobre a posição axial do alvo de interesse.

Os sinais srs têm uma relação linear com a concentração molecular, enquanto os sinais CARS satisfazem uma concentração quase quadrática- dependência. Portanto, os LDs ch_2-rich mostram um sinal muito mais forte do que o ER e as membranas celulares na imagem CARS do que na imagem SRS (Figura 5E,F). Os espectros SRS podem ser extraídos de imagens hiperespectrais. A Figura 5G mostra os espectros típicos de SRS de LDs, ER, cytosol (CY) e NU. Tanto a intensidade quanto a forma espectral são diferentes para diferentes compartimentos celulares. LD mostra um sinal muito mais forte a 2.850 ^cm-1 do que outras organelas. Quanto aos CARS, espectros semelhantes, embora diferentes em formas, podem ser obtidos. Os espectros de CARROS brutos mostram uma pequena mudança vermelha em comparação com o espectro srs correspondente. A recuperação de fases espectrais pode ser usada para extrair as respostas de Raman usando o espectro CARS.

Figura 1: Um esquema do microscópio hiperespectral CARS/SRS. Abreviaturas: CARS = dispersão coerente anti-Stokes Raman; SRS = dispersão estimulada de Raman; PBS = divisor de feixe de polarização; PD = fotodiodo; PMT = tubo fotomultiplier; AOM = modulador acousto-óptico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Espectros DMSO. (A) SRS e (B) ESPECTROS DE CARROS de DMSO. Pontos são dados experimentais; curvas são resultados espectrais de ajuste. Abreviaturas: CARS = dispersão coerente anti-Stokes Raman; SRS = dispersão estimulada de Raman; DMSO = sulfóxido de dimetila; w = resolução espectral. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Relação sinal-ruído e espectros de DMSO. (A) Relação sinal-ruído do pico simétrico DMSO em 2.913 ^cm-1 em função da concentração em D₂O medida pelo SRS. Os pontos são dados experimentais; a linha é o resultado linear de montagem. (B) Os espectros SRS de 0,1% e 0,01% DMSO em D₂O. (C) Relação sinal-ruído do pico simétrico DMSO a 2.913 ^cm-1 em função da concentração em D₂O medida pelos CARROS. Os pontos são dados experimentais; a curva é o resultado de encaixe polinomial de segundo grau. (D) Os espectros cars de 0,1% e 0,01% DMSO em D₂O. Abreviaturas: CARS = dispersão coerente anti-Stokes Raman; SRS = dispersão estimulada de Raman; DMSO = sulfóxido de dimetila; SNR = relação sinal-ruído; D₂O = óxido de deutério. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Imagens SRS e CARS e perfis de intensidade de uma célula MIA PaCa-2. (A) Uma imagem SRS de uma célula MIA PaCa-2. (B) Uma imagem CARS de uma célula MIA PaCa-2 no mesmo campo de visão do painel A. (C) Perfil de intensidade do SRS ao longo da linha amarela no painel A. (D) Perfil de intensidade de CARROS ao longo da linha amarela no painel B. Pontos são dados experimentais; curvas são resultados de montagem de função gaussiana. Barras de escala = 5 μm. Abreviaturas: CARS = dispersão coerente anti-Stokes Raman; SRS = dispersão estimulada de Raman; w = resolução. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Imagens e perfil de intensidade das células MIA PaCa-2. (A) Uma imagem SRS das células MIA PaCa-2 no tempo otimizado de atraso para intensidade srs. (B) Uma imagem CARS no mesmo atraso do painel A. (C) Uma imagem SRS nos atrasos de 98 ^cm-1 em vermelho como no painel A. (D) Uma imagem CARS com o mesmo atraso óptico do painel C. (E,F) Os perfis de intensidade SRS e CARS plotados ao longo das linhas pontilhadas nos painéis A e D. (G) Espectro típico de SRS das gotículas lipídicas, órticulum endoplasmático, citosol e núcleo. (H) Espectros típicos de CARROS das quatro composições celulares. As linhas pontilhadas verde e vermelha são posições de atraso para os painéis A/B e C/D, respectivamente. Barras de escala = 10 μm. Abreviaturas: CARS = dispersão coerente anti-Stokes Raman; SRS = dispersão estimulada de Raman; LD = gotículas lipídicas; ER = rcúlume endoplasmático; CY = citosol; NU = núcleo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo Suplementar: Software escrito em laboratório baseado no LabVIEW tem uma tela multicanal simultânea para visualização e salvamento de imagens em tempo real. Clique aqui para baixar este Arquivo.

O protocolo aqui apresentado descreve a construção de um microscópio CRS multimodal e a comparação direta entre carros e imagens SRS. Para a construção do microscópio, as etapas críticas são a sobreposição do feixe espacial e temporal e a otimização do tamanho do feixe. Recomenda-se o uso de uma amostra padrão como o DMSO antes da imagem biológica para otimizar o SNR e calibrar as mudanças de Raman. A comparação direta entre as imagens cars e srs revela que o CARS tem uma melhor resolução espacial, enquanto o SRS oferece melhor resolução espectral e contrastes químicos menos complicados. Tanto os CARROS quanto o SRS têm limites de detecção semelhantes.

Os carros e as imagens SRS usam lasers de pulso de alta energia para excitação. Isso permite que a plataforma integre outras modalidades de imagem óptica não linear, como fluorescência de excitação multifotônica, geração harmônica e absorção transitória para contrastes químicos adicionais^28,39.

Carros e SRS têm sido amplamente utilizados para estudar a composição lipídica com alta seletividade química. No entanto, as tecnologias não se limitam à quantificação de lipídios. O SRS foi aplicado na distribuição de medicamentos⁴², síntese proteica⁴³ e DNA⁴⁴. CARROS e SRS também foram aplicados a ingredientes farmacêuticos de imagem e excipientes em comprimidos 45,46,47,48. Carros hiperespectrais e SRS encontraram aplicações no diagnóstico de câncer⁴⁹, avaliação de doenças cardiovasculares⁵⁰ e imagem neural⁵¹. Também podem ser aplicados para estudos COVID-19⁵². Os CARROS de banda larga, que podem cobrir janelas espectrais tão largas quanto 3.000 ^cm-1, podem elucidar estruturas químicas ricas em amostras biológicas⁵³. No entanto, devido à taxa de leitura lenta do CCD, o tempo de habitação do pixel está no nível de milissegundos, muito mais lento do que o tempo de consumo de pixels microsegundos para microscopia^{SRS 34}. A microscopia hiperespectral SRS atualmente tem uma largura de banda típica de 200-300 ^cm-1, limitada pela largura de banda laser e pela falta de detectores de matriz³⁴. A microscopia de RS de fourier é uma maneira alternativa de potencialmente ampliar a cobertura espectral srs³⁵.

Embora os CARROS e o SRS forneçam informações químicas ricas sem a necessidade de rotulagem, a seletividade química está em ligações químicas, dificultando a distinção de proteínas específicas. As etiquetas Raman mostraram o potencial para aumentar a seletividade química de CARROS e SRS^54,55. No entanto, a imagem coerente de Raman ainda tem sensibilidade muito menor em comparação com a detecção de fluorescência. O aprimoramento da superfície foi usado para espectroscopia espontânea de dispersão de Raman para melhorar os níveis de sinal⁵⁶. Também foi aplicado a CARS e SRS para amplificação de sinal 57,58,59. Embora o fator de aprimoramento não seja tão alto quanto a dispersão espontânea de Raman, carros melhorados pela superfície e microscopia SRS ainda mostram o potencial de detectar moléculas únicas^59,60. No entanto, o uso de partículas metálicas ou superfícies priva a vantagem da abordagem livre de rótulos. Melhorar a sensibilidade da microscopia raman coerente sem o uso de superfícies metálicas expandiria muito a aplicação da tecnologia em ciência biológica.

Os autores não declaram conflitos de interesse.

Esta pesquisa foi apoiada pelo fundo de startup do Departamento de Química da Universidade purdue.