مقارنة مباشرة بين تشتت رامان المحفز فوق الطيف ومجهر تشتت رامان المضاد للستوكس للتصوير الكيميائي

تقارن هذه الورقة بشكل مباشر بين الدقة والحساسية وتباين التصوير لتشتت رامان المحفز (SRS) وتشتت رامان المضاد لستوكس (CARS) المتكامل في نفس منصة المجهر. تظهر النتائج أن CARS لديها دقة مكانية أفضل ، و SRS يعطي تباينات أفضل ودقة طيفية ، وكلتا الطريقتين لهما حساسية مماثلة.

يعد تشتت رامان المحفز (SRS) والفحص المجهري المتماسك لتشتت رامان المضاد لستوكس (CARS) أكثر تقنيات التصوير تشتتا رامان تماسكا استخداما. يوفر التصوير الفائق الطيف SRS و CARS معلومات رامان الطيفية في كل بكسل ، مما يتيح فصلا أفضل للتركيبات الكيميائية المختلفة. على الرغم من أن كلتا التقنيتين تتطلبان اثنين من ليزر الإثارة ، إلا أن مخططات الكشف عن الإشارات والخصائص الطيفية مختلفة تماما. الهدف من هذا البروتوكول هو إجراء كل من التصوير فوق الطيفي SRS و CARS على منصة واحدة ومقارنة تقنيتي الفحص المجهري لتصوير عينات بيولوجية مختلفة. تستخدم طريقة التركيز الطيفي للحصول على المعلومات الطيفية باستخدام ليزر الفيمتو ثانية. باستخدام العينات الكيميائية القياسية ، تتم مقارنة الحساسية والدقة المكانية والدقة الطيفية ل SRS و CARS في نفس ظروف الإثارة (أي الطاقة في العينة ، ووقت سكن البكسل ، والعدسة الموضوعية ، وطاقة النبض). يتم تجاور التناقضات التصويرية ل CARS و SRS للعينات البيولوجية ومقارنتها. ومن شأن المقارنة المباشرة بين أداء CARS وSRS أن تسمح بالاختيار الأمثل لطريقة التصوير الكيميائي.

لوحظت ظاهرة تشتت رامان لأول مرة في عام 1928 من قبل C. V. Raman¹. عندما يتفاعل فوتون حادث مع عينة ، يمكن أن يحدث حدث تشتت غير مرن تلقائيا ، حيث يتطابق تغير طاقة الفوتون مع انتقال اهتزازي للأنواع الكيميائية التي تم تحليلها. لا تتطلب هذه العملية استخدام علامة كيميائية ، مما يجعلها أداة متعددة الاستخدامات وخالية من الملصقات للتحليل الكيميائي مع تقليل اضطراب العينات. على الرغم من مزاياه ، يعاني تشتت رامان التلقائي من مقطع عرضي منخفض التشتت (عادة 10¹¹ أقل من المقطع العرضي لامتصاص الأشعة تحت الحمراء [IR]) ، مما يتطلب أوقات اكتساب طويلة للتحليل². وبالتالي ، فإن السعي لزيادة حساسية عملية تشتت رامان أمر ضروري في دفع تقنيات رامان للتصوير في الوقت الفعلي.

إحدى الطرق الفعالة لتعزيز حساسية تشتت رامان بشكل كبير هي من خلال عمليات تشتت رامان المتماسكة (CRS) ، والتي تستخدم عادة نبضتان ليزر لإثارة التحولات الاهتزازية الجزيئية ^3,4. عندما يتطابق فرق طاقة الفوتون بين الليزرين مع الأوضاع الاهتزازية لجزيئات العينة ، سيتم توليد إشارات رامان قوية. عمليتا CRS الأكثر استخداما للتصوير هما تشتت رامان المضاد لستوكس (CARS) وتشتت رامان المحفز (SRS)⁵. على مدى العقدين الماضيين ، طورت التطورات التكنولوجية تقنيات الفحص المجهري CARS و SRS لتصبح أدوات قوية للقياس الكمي الخالي من الملصقات وتوضيح التغيرات الكيميائية في العينات البيولوجية.

يمكن تأريخ التصوير الكيميائي بواسطة الفحص المجهري CARS إلى عام 1982 عندما تم تطبيق المسح الضوئي بالليزر لأول مرة للحصول على صور CARS ، والتي أظهرها Duncan et al⁶. تم تسريع تحديث المجهر CARS بشكل كبير بعد التطبيقات الواسعة للمسح الضوئي بالليزر متعدد الفوتونات المجهرية^{الفلورية 7}. أدى العمل المبكر من مجموعة Xie باستخدام ليزر عالي معدل التكرار إلى تحويل CARS إلى منصة تصوير كيميائية عالية السرعة وخالية من الملصقات لتوصيف الجزيئات في العينات البيولوجية ^8,9,10. واحدة من القضايا الرئيسية لتصوير CARS هي وجود خلفية غير رنانة ، مما يقلل من تباين الصورة ويشوه طيف رامان. تم بذل العديد من الجهود إما لتقليل الخلفية غير الرنانة 11،^12،13،14،¹⁵ أو لاستخراج إشارات رامان الرنانة من أطياف CARS^16،17. التقدم الآخر الذي تقدم بشكل كبير في هذا المجال هو التصوير الفائق الطيف CARS ، والذي يسمح برسم الخرائط الطيفية في كل بكسل صورة مع تحسين الانتقائية الكيميائية¹⁸،^19،20،21.

تشتت رامان المحفز (SRS) هي تقنية تصوير أصغر سنا من CARS ، على الرغم من أنه تم اكتشافها في وقت سابق^{من 22}. في عام 2007 ، تم الإبلاغ عن الفحص المجهري SRS باستخدام مصدر ليزر منخفض معدل التكرار²³. سرعان ما أظهرت عدة مجموعات تصوير SRS عالي السرعة باستخدام ليزر عالي معدل التكرار^24،25،26. واحدة من المزايا الرئيسية للفحص المجهري SRS على CARS هي عدم وجود خلفية غير رنانة²⁷ ، على الرغم من أن الخلفيات الأخرى مثل التشكيل عبر الطور (XPM) ، والامتصاص العابر (TA) ، والامتصاص ثنائي الفوتون (TPA) ، وتأثير الحرارة الضوئية (PT) ، قد تحدث مع SRS²⁸. بالإضافة إلى ذلك ، فإن إشارة SRS وتركيز العينة لهما علاقات خطية ، على عكس CARS ، التي تعتمد على تركيز الإشارة التربيعية²⁹. وهذا يبسط القياس الكمي الكيميائي وفك الخلط الطيفي. تطورت SRS متعددة الألوان وفائقة الطيف في أشكال مختلفة 30،³¹،^32،33،^34،35،36 ، مع التركيز الطيفي كونها واحدة من أكثر الأساليب شعبية للتصوير الكيميائي^37،38.

يتطلب كل من CARS و SRS تركيز المضخة وأشعة ليزر ستوكس على العينة لتتناسب مع الانتقال الاهتزازي للجزيئات لإثارة الإشارة. تشترك مجاهر CARS و SRS أيضا في الكثير من القواسم المشتركة. ومع ذلك ، فإن الفيزياء الكامنة وراء هاتين العمليتين ، واكتشافات الإشارات المشاركة في تقنيات الفحص المجهري هذه لها تفاوتات ^3,39. CARS هي عملية بارامترية لا تحتوي على اقتران طاقة صافي لجزيء الفوتون³. ومع ذلك ، فإن SRS هي عملية غير بارامترية ، وتساهم في نقل الطاقة بين الفوتونات والأنظمة الجزيئية²⁷. في CARS ، يتم إنشاء إشارة جديدة بتردد مضاد ل Stokes ، بينما يظهر SRS على أنه نقل الطاقة بين المضخة وأشعة ليزر Stokes.

إشارة CARS ترضي Eq (1)²⁸.

(1)

وفي الوقت نفسه ، يمكن كتابة إشارة SRS ك Eq (2) ²⁸.

(2)

هنا ، I _P و I _S و I CARS و ΔI_SRS هي شدة شعاع المضخة ، وشعاع ستوكس ، وإشارة _CARS ، وإشارات SRS ، على التوالي. χ⁽³⁾ هي القابلية البصرية غير الخطية من الدرجة الثالثة للعينة ، وهي قيمة معقدة تتكون من أجزاء حقيقية ووهمية.

تعبر هذه المعادلات عن الملامح الطيفية واعتماد تركيز الإشارة ل CARS و SRS. تؤدي الاختلافات في الفيزياء إلى مخططات كشف متباينة لهاتين التقنيتين المجهريتين. عادة ما ينطوي الكشف عن الإشارة في CARS على الفصل الطيفي للفوتونات التي تم إنشاؤها حديثا والكشف عنها باستخدام أنبوب مضاعف ضوئي (PMT) أو جهاز مقترن بالشحنة (CCD) ؛ بالنسبة ل SRS ، عادة ما يتم قياس تبادل الطاقة بين المضخة وحزم Stokes عن طريق تعديل عالي السرعة باستخدام مغير بصري وإزالة الصبغة باستخدام صمام ثنائي ضوئي (PD) مقترن بمضخم صوت قفل.

على الرغم من نشر العديد من التطورات والتطبيقات التكنولوجية في السنوات الأخيرة في كل من مجالات CARS و SRS ، لم يتم إجراء مقارنات منهجية بين تقنيتي CRS على نفس النظام الأساسي ، خاصة بالنسبة ل CARS فائقة الطيف و SRS المجهرية. ومن شأن المقارنات المباشرة في الحساسية والدقة المكانية والدقة الطيفية وقدرات الفصل الكيميائي أن تسمح لعلماء الأحياء باختيار أفضل طريقة للقياس الكمي الكيميائي. في هذا البروتوكول ، يتم توفير خطوات مفصلة لبناء منصة تصوير متعددة الوسائط مع كل من طرائق CARS و SRS فائقة الطيف على أساس نظام ليزر الفيمتو ثانية والتركيز الطيفي. تمت مقارنة التقنيتين في الاتجاه الأمامي للدقة الطيفية ، وحساسية الكشف ، والدقة المكانية ، وتباينات التصوير للخلايا.

1. الإعداد الفعال لتصوير CRS فوق الطيفي

ملاحظة: يتطلب توليد إشارة CRS استخدام ليزر عالي الطاقة (أي الفئة 3B أو الفئة 4). يجب معالجة بروتوكولات السلامة ويجب ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) في جميع الأوقات عند العمل في مثل هذه القوى الذروة العالية. استشر الوثائق المناسبة قبل التجريب. يركز هذا البروتوكول على تصميم مسار الشعاع ، ونقيق نبضات الفيمتو ثانية ، وتحسين ظروف التصوير. يوضح الشكل 1 تخطيطا بصريا عاما لهذا المجهر CRS الفائق الطيف. التكوين الموضح هنا هو واحد من العديد من التكوينات الموجودة للفحص المجهري CRS. تم بناء نظام الفحص المجهري CRS المستخدم في هذا البروتوكول على مصدر ليزر فيمتو ثانية مزدوج الإخراج ومجهر مسح بالليزر.

1. تأكد من أن مصدر الليزر يوفر اثنين من قطارات نبض الفيمتو ثانية (عرض 120 fs) بمعدل تكرار يبلغ 80 ميجاهرتز ، بما في ذلك طول موجي ثابت عند 1045 نانومتر يستخدم كشعاع ستوكس ، وطول موجي قابل للضبط من 680 إلى 1300 نانومتر يستخدم كشعاع مضخة. مزامنة نبضات الإخراج مع فرق تأخير بصري. استخدم إطار المجهر لبناء منصة التصوير.
2. تصميم مسار الشعاع
   1. للتحكم في طاقة الليزر في العينة، استخدم لوحة نصف موجة ومجموعة مقسم شعاع الاستقطاب (PBS) لكل شعاع ليزر.
   2. قم بتثبيت مغير صوتي بصري (AOM) في مسار شعاع ليزر ستوكس. ركز الشعاع باستخدام عدسة ذات بعد بؤري 150 مم في AOM وأعد ترتيب^{إخراج الترتيب 0} باستخدام عدسة ذات بعد بؤري 400 مم.
   3. استخدم نفس زوج العدسات (الأطوال البؤرية 150 مم و 400 مم) لتوسيع شعاع المضخة لمطابقة حجم شعاع الليزر مع Stokes.
   4. ضع عدسات البعد البؤري مقاس 400 مم في كل من مساري المضخة وشعاع Stokes على مراحل ترجمة منفصلة أحادية البعد لضبط تباعد الحزمة وتحسين حجم الحزمة قبل دخول المجهر.
   5. قم بتوجيه شعاع المضخة باستخدام مرآة عاكسة قائمة الزاوية مثبتة على مرحلة ترجمة آلية لضبط التأخير البصري. إذا احتاج شعاع ستوكس إلى تأخير بصري ، فضع هذه المكونات بدلا من ذلك في مسار الشعاع الخاص به.
   6. اسمح بدمج كلا الحزمتين في مرآة ثنائية اللون مع طول موجي قاطع عند ~ 1000 نانومتر (بين المضخة والأطوال الموجية ستوكس) ، بحيث ينتقل شعاع ستوكس عبر المرآة ثنائية اللون بينما ينعكس شعاع المضخة بواسطة المرآة ثنائية اللون. أرسل أشعة الليزر المدمجة إلى المجهر.
   7. لتغريد المضخة وعوارض ستوكس ، ضع قضبان زجاجية في مسارات الحزم الخاصة بها. راجع الخطوة 1.5 للحصول على التفاصيل.
   8. لتأكيد المحاذاة المناسبة وحجم الشعاع ، استخدم أغشية القزحية بعد المرآة ثنائية اللون وقبل المجهر. على وجه التحديد ، قم بتثبيت أحدهما في موضع قريب من والآخر على مسافة من المرآة ثنائية اللون لتأكيد المحاذاة الجيدة وتداخل الحزمة. استخدم بطاقة عرض الأشعة تحت الحمراء أو عارض الأشعة تحت الحمراء لتصور الشعاع أثناء المحاذاة.
   9. استخدم PD سريع ومذبذب لقياس التأخير البصري تقريبا بين المضخة ونبضات ستوكس. قم بتشغيل منظار الذبذبات عن طريق أخذ عينات من قطار نبض الليزر.
   10. قم بحظر شعاع المضخة وقم بأخذ عينة من شعاع ستوكس. قم بتكبير إحدى النبضات ووضع مؤشر رأسي عليها لتحديد موقعها الزمني على الذبذبات.
   11. قم بإلغاء حظر شعاع المضخة ومنع شعاع ستوكس. ترجم مرحلة التأخير حتى تتماشى نبضات مضخة العينة مؤقتا مع الموضع المحدد.
3. المجهر الماسح الضوئي بالليزر
   1. لتكوين المجهر المستقيم ، أرسل أشعة الليزر المدمجة من خلال المنظار للصعود إلى مستوى مناسب قبل الوصول إلى مرايا المسح الضوئي 2D galvo.
   2. قم بقياس حجم شعاع الليزر قبل المجهر ، وقم بإعداد زوج العدسات المناسب بعد مرايا galvo لتوسيع شعاع الليزر ليتناسب بشكل أفضل مع حجم بؤبؤ مدخل العدسة الموضوعية.
   3. قم ببناء نظام 4-f باستخدام العدستين ، مع الفتحة الخلفية للعدسة الموضوعية ومركز مرآتي galvo كونهما طائرتين مترافقتين. بدلا من ذلك ، استخدم مرآتين منفصلتين 1D galvo مع نظامي عدسة 4-f للمسح الضوئي بالليزر.
   4. بعد المكثف ، قم بتصميم مرآة قابلة للطي 2 بوصة لتعكس أشعة الليزر لجمع الإشارات. ضع عدسة قطرها 2 في مسار الشعاع المرسل لجمع إشارات الإرسال وتركيزها بالكامل على أجهزة الكشف.
   5. قم بتوجيه إشارات CARS إلى PMT باستخدام مرآة ثنائية اللون لها انقطاع عند 776 نانومتر ، واسمح باكتشاف إشارات SRS المرسلة بواسطة PD. استخدم مرشح تمرير النطاق الترددي (655/30 نانومتر) قبل PMT لرفض نبضات ليزر الإثارة المتبقية. استخدم مرشح تمرير قصير (تمريرة قصيرة 980 نانومتر) قبل PD لمنع شعاع ستوكس من دخول الكاشف.
   6. للكشف عن إشارة CARS ، قم بتوصيل مضخم صوت مسبق ومحول جهد تيار بعد PMT وقبل إرسال الإشارة إلى نظام الحصول على البيانات. اضبط جهد PMT لتحسين تباين الإشارة والصورة.
   7. استخدم مولد دالة لتعديل AOM عند MHz 10-1 ، واستخدم نفس التردد كمرجع لإلغاء التشويش المقفل. استخدم مكبر صوت قفل لاستخراج إشارات SRS قبل الحصول على البيانات.
4. الحصول على البيانات وعرضها
   1. قم بإجراء الحصول على البيانات باستخدام بطاقة الحصول على البيانات الرقمية (DAQ) بالاقتران مع كتلة طرفية.
   2. استخدم المخرجات التناظرية من DAQ للتحكم في مرايا galvo والمدخلات التناظرية للحصول على الإشارة.
   3. استخدم البرامج المكتوبة من Lab استنادا إلى LabVIEW الذي يحتوي على شاشة عرض متعددة القنوات متزامنة لعرض الصور وحفظها في الوقت الفعلي (راجع الملف التكميلي).
5. نقيق مصدر الفيمتو ثانية وقياس الاستبانة الطيفية
   ملاحظة: لتحقيق دقة طيفية جيدة باستخدام التركيز الطيفي ، يتم استخدام قضبان زجاجية لإدخال التشتت ونبضات الليزر النقيق من الفيمتو ثانية إلى بيكو ثانية. لتحقيق أفضل دقة طيفية ، يجب أن يساوي معدل النقيق لشعاع المضخة معدل شعاع ستوكس. بالنسبة لنظام الليزر هذا ، يمكن تحقيق أفضل دقة طيفية عن طريق النقيق ~ 120 fs إخراج نبضات الليزر إلى 3.4 ps للمضخة و 1.8 ps ل Stokes. يتم تحقيق هذا النقيق باستخدام مجموعة 4 + 1 (أربعة في الحزمة المدمجة ، واحدة فقط في شعاع ستوكس) من مزيج قضيب زجاجي 150 مم (SF-57) ، كما هو موضح أدناه ، ويجب أن يحقق دقة طيفية ^{15 سم - 1} . يمكن قياس مدة النبض باستخدام جهاز ربط ذاتي.
   1. أدخل قضيبا زجاجيا واحدا مقاس 150 مم في مسار شعاع ستوكس فقط.
   2. أدخل قضيبين زجاجيين مقاس 150 مم في مسار شعاع المضخة/ستوكس المشترك بعد مقسم الشعاع ثنائي اللون. لزيادة النقيق ، دع أشعة الليزر المدمجة تمرر مرتين قضيبين زجاجيين عن طريق وضع مرآة عازلة في أحد طرفي القضبان.
   3. لقياس الاستبانة الطيفية، قم بإعداد مادة كيميائية قياسية (على سبيل المثال، ثنائي ميثيل سلفوكسيد [DMSO]) عينة مضغوطة بين غطاءين زجاجيين، ومسح مرحلة التأخير حتى يتم تحقيق أقصى إشارة.
   4. حرك التأخير البصري 1000 ميكرومتر في اتجاه الانزياح الأحمر. ثم قم بتشغيل 200 إطار بسرعة 10 ميكرومتر / خطوة نحو اتجاه الانزياح الأزرق لجمع مكدس الصور الطيفي الفائق.
   5. لتحويل أرقام الإطارات إلى أرقام موجية، قم بإجراء انحدار خطي باستخدام ^C-H المتماثل (2,913 سم-1) وغير المتماثل (2,994 ^سم-1) الممتد من DMSO وأرقام الإطارات المقابلة⁴⁰.
   6. استخدم إشارة XPM لقياس ملف تعريف كثافة التركيز الطيفي. أغلق الحجاب الحاجز على المكثف نصف إغلاق وانقل التركيز البؤري إلى غطاء فارغ. اجمع نفس عدد الخطوات كما هو الحال بالنسبة ل SRS فائق الطيف. لقياس خلفية CARS غير الرنانة ، ركز على الغطاء الزجاجي واجمع نفس العدد من الخطوات لقياسات CARS فائقة الطيف.
6. تحسين نسبة الإشارة إلى التشويش (SNR) للصور
   1. قم بإعداد عينة كيميائية لمحاذاة النظام. اتبع الإجراء الموضح في الخطوة 3.1 لإعداد العينة.
      ملاحظة: DMSO هو خيار جيد لأنه مادة كيميائية مختبرية شائعة مع إشارات رامان قوية وقمم C-H متماثلة وغير متماثلة مفصولة جيدا.
   2. ضع العينة على مرحلة المجهر ، وأضف الماء أو زيت الغمر إذا لزم الأمر للعدسة الموضوعية أو المكثف. حرك حافة قطرة DMSO بشكل صحيح في مجال الرؤية واضبط العدسة الموضوعية للحصول على أفضل تركيز بؤري. توسيط المكثف باستخدام طريقة إضاءة كوهلر⁴¹. افتح الحجاب الحاجز بالكامل على المكثف.
   3. اضبط الطول الموجي لشعاع المضخة إلى 800 نانومتر (1,045 نانومتر ستوكس) لاستهداف ذروة 2,913 ^سم-1 CH₃ . اضبط قوة كل من المضخة وشعاع ستوكس على ~ 30 ميجاوات قبل المجهر عن طريق ضبط لوحة نصف الموجة (~ 10 ميجاوات في مستوى العينة).
   4. بالنسبة إلى SRS ، اضبط كسب مضخم القفل على ~ 10 مع ثابت زمني قدره 7 ميكروثانية (عند استخدام وقت سكن 10 ميكروثانية بكسل). تأكد من أن ثابت الوقت أصغر من وقت سكن البكسل. استخدم Demod R لإخراج AUX لإشارات SRS.
   5. بالنسبة إلى CARS، أرسل مخرج PMT إلى مضخم الصوت المسبق ومحول الجهد الحالي. استخدم DAQ للحصول على الإخراج من المحول.
   6. قم بتعيين معلمات الحصول على الصور في برنامج الاستحواذ. استخدم رقم بكسل 200 × 200 بحجم مسح ضوئي يبلغ ~ 100 × 100 ميكرومتر². تأكد من أن الصورة تحتوي على كل من قطرة DMSO ومنطقة فارغة.
   7. امسح العينة ضوئيا وتحقق من الصورة على شاشة الكمبيوتر. امسح مرحلة التأخير الآلية في شعاع Stokes/pump أثناء مراقبة الصور في الوقت الفعلي. امسح التأخير ضوئيا حتى يتم تكبير الإشارة.
   8. حرك قطرة DMSO لتغطية مجال الرؤية بالكامل وتحقق مما إذا كان الحد الأقصى لإشارة التيار المستمر متمركزا في الصورة (تعتمد الإشارة على شعاع المضخة). اضبط إما موضع شعاع المضخة عبر مرآة أو إزاحة الجهد في برنامج التصوير.
   9. بعد تحسين التيار المستمر ، اضبط مرايا شعاع Stokes حتى يتم تكبير إشارة التيار المتردد عن طريق ضبط قيمة العتبة لعرض تشبع ~ 50٪. تحقق مما إذا كان التشبع متمركزا في الصورة. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم بضبط المرايا فقط في شعاع ستوكس. راقب الإشارة أثناء المحاذاة كملاحظات في الوقت الفعلي حول جودة المحاذاة.
   10. لتحديد SNR، حدد منطقة صغيرة من صورة DMSO وقم بقياس القيمة المتوسطة. بالنسبة للتشويش، حدد مساحة صغيرة في المنطقة الفارغة من الصورة وحدد كل من متوسط القيمة المتوسطة والانحراف المعياري. اطرح قيمة متوسط الضوضاء من قيمة متوسط الإشارة واقسم النتائج على الانحراف المعياري للمنطقة الفارغة.
   11. إذا لم يكن SNR المحسوب مرتفعا بما فيه الكفاية (عادة 800-1000 ل SRS و >10000 ل CARS عند جهد PMT من 0.4 V مع مزيج الطاقة هذا) ، تحقق من تداخل الشعاع وإعادة تحسينه ، وأحجام الحزم ، وتأخير موضع المرحلة ، وضبط AOM ، وتغيير تردد تعديل مولد الوظيفة حتى يتم الحصول على SNR المتوقع.

2. تحليل الصور ومعالجة البيانات

1. تحليل SNR
   1. افتح برنامج ImageJ. لاستيراد نموذج ملف DMSO .txt المحفوظ، انقر فوق ملف | | الاستيراد | صورة النص فتح.
   2. بمجرد استيراد الصورة، اضغط على CTRL+shift+C لإظهار وظيفة السطوع والتباين (B&C). للعثور على الحد الأقصى لإشارة العينة، اضغط على الزر تلقائي في B&C حتى تظهر منطقة من عينة DMSO مشبعة.
   3. انقر فوق أداة التحديد البيضاوي على واجهة ImageJ وقم بتمييز مساحة صغيرة من منطقة DMSO المشبعة. بمجرد تمييزه، اضغط على M لقياس المتوسط والانحراف المعياري للمنطقة المحددة.
   4. لقياس الخلفية، اضبط الأشرطة في وظيفة B&C حتى يمكن ملاحظة إشارة المنطقة الفارغة. انقر فوق التحديد البيضاوي وقم بتمييز منطقة من الخلفية بنفس حجم الخطوة 2.1.3. تأكد من أن المنطقة المحددة لا تحتوي على DMSO. اضغط على M لقياس إحصائيات المنطقة المحددة.
   5. حساب SNR وفقا للخطوة 1.6.10.
2. معالجة صور CRS فائقة الطيف
   1. استيراد ملف .txt وفقا للخطوة 2.1.1. بمجرد استيرادها ، انقر فوق صورة | مكدسات | أدوات | المونتاج إلى المكدس... لتحويل الملف إلى مكدس صور.
   2. قم بالتمرير عبر المونتاج حتى تظهر ذروة DMSO الأولى. حدد منطقة على DMSO وانقر على صورة | | المكدس رسم ملف تعريف المحور Z لرسم طيف الكثافة مقابل رقم الإطار. لاستخراج البيانات الطيفية الخام ، انقر فوق القائمة وانسخ بيانات ملف التعريف.
   3. لتحويل الطيف المسترد إلى وحدات عدد موجي، قم بإجراء انحدار خطي كما هو موضح في الخطوة 1.5.5.
3. مناسب لقياس الاستبانة الطيفية
   ملاحظة: تستخدم دالات لورنتزيان لتناسب أطياف SRS و CARS²⁸.
   1. افتح برنامج التركيب، ثم انسخ بيانات الانحدار الخطي والصقها في البرنامج. لتركيب بيانات SRS ، قم بتمييز البيانات ثم ارسم البيانات كمخطط مبعثر.
   2. اسحب المؤامرة المبعثرة. انقر على تحليل | القمم | الأساسية | متعددة الذروة تناسب افتح مربع الحوار لإظهار محلل الذروة. عند سحبه ، تحقق من أن الإدخال هو المخطط الحالي وقم بتغيير وظيفة الذروة إلى Lorentzian (Lorentz).
   3. انقر نقرا مزدوجا فوق كل من قمتي DMSO على الرسم البياني لتسليط الضوء على المناطق المراد تركيبها. بعد ذلك ، انقر فوق فتح NLfit لإظهار نافذة التركيب . انقر فوق الزر احتواء حتى تقارب ، ثم موافق، لرؤية ملخص مجدول لمعاملات التركيب (انظر Eq (3)).
      ملاحظة: توضح المعادلة أدناه تنسيق دالة لورنتزيان في البرنامج. _A 1/2 هي سعات القمم المناسبة ، و w₁/₂ هي عروض القمم المجهزة ، وقيم x ₀₁/₀₂ هي مراكز القمم المجهزة. المتغير المستقل هو x والمتغير التابع هو y.
      (3)
   4. للتركيب الطيفي CARS ، انقر فوق تحليل | | التركيب | تناسب المنحنى غير الخطي افتح مربع الحوار. حدد الفئة: جديدة لتحديد وظيفة جديدة ل CARS. استخدم دالة تركيب CARS ذات قبوتين المحددة أدناه (انظر Eq (4)) للتركيب الطيفي ل CARS.
      (4)
4. تحديد الدقة المكانية
   ملاحظة: قبل هذه الخطوة، من المهم معرفة التحويل بين حجم البكسل عند تكبير معين ورقم بكسل وحجم الخطوة بالميكرومتر. يمكن إجراء ذلك باستخدام عينة من قطر معروف أكبر من دقة التصوير المتوقعة ، وقياس ملف تعريف الخط الخاص به ، وتركيب دالة Gaussian لتحديد العرض الكامل عند نصف القيمة القصوى (FWHM). يمكن استخدام أهداف الدقة أو العينات الموحدة مثل الخرز البوليمري.
   1. احصل على صورة للخلايا أو جزيئات البوليمر التي يقل قطرها عن 200 نانومتر.
   2. استخدم ImageJ لرسم خط عبر أصغر جسيم في الصورة.
   3. اضغط على K لرسم ملف تعريف الكثافة.
   4. انقر فوق قائمة من النافذة المنبثقة وانسخ المعلومات إلى برنامج التركيب.
   5. ارسم الملف الشخصي في برنامج التركيب واستخدم تركيب Gaussian (انقر فوق تحليل | | التركيب | تناسب المنحنى غير الخطي فتح | الحوار الفئة: الوظائف الأساسية; الوظيفة: غاوس).
   6. اقرأ عرض الذروة بعد التركيب. استخدم تحويل حجم البكسل للحصول على الدقة الفعلية للمجهر.

3. إعداد عينات لتصوير CRS فوق الطيف

1. إعداد شرائح التصوير والعينات الكيميائية
   1. ضع قطعة من الشريط على الوجهين على غطاء ، وقم بقص شكل مستطيل صغير من الشريط من منتصف الشريط الموضوع لإنشاء منطقة مفتوحة لوضع العينة.
   2. ماصة 1-2 ميكرولتر من DMSO النقي وتوزيع القطرة في وسط الشاغر.
   3. ضع الغطاء العلوي بعناية واضغط برفق على حواف الأغطية لإغلاق الغرفة مع التأكد من أن عينة DMSO لا تلامس حواف الشريط.
   4. بالنسبة لتجارب الحساسية ، قم بإعداد تخفيفات تسلسلية ل DMSO في أكسيد الديوتيريوم (D₂O) لإعطاء نطاق تركيز يتراوح بين 50٪ و 0٪. خذ 1-2 ميكرولتر من كل محلول وقم بإعداد عينات مضغوطة كما هو موضح أعلاه.
2. إعداد الخلايا
   1. زرع الخلايا في طبق زجاجي سفلي 35 مم (أو أكبر) في وسط النسر المعدل من دولبيكو (DMEM) مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين.
   2. احتضان الخلايا في غرفة حضانة عند 37 درجة مئوية مع جو 5٪ CO₂ بين عشية وضحاها أو أكثر حتى يتم تحقيق التقاء ~ 50٪ -80٪.
   3. قم بتصوير الخلايا الحية مباشرة أو قم بإصلاح الخلايا بمحلول فورمالين بنسبة 10٪ للتصوير.

مقارنات الاستبانة الطيفية
يقارن الشكل 2 الاستبانة الطيفية للفحص المجهري SRS فائق الطيف (الشكل 2A) و CARS (الشكل 2B) باستخدام عينة DMSO. بالنسبة لطيف SRS ، تم تطبيق وظيفتين لورنتزيان (انظر خطوة البروتوكول 2.3) لتناسب الطيف ، وتم الحصول على دقة 14.6 cm-1 باستخدام ذروة 2,913 ^cm-1. بالنسبة ل CARS ، تم استخدام دالة تركيب قمتين مع خلفية غاوسية (انظر خطوة البروتوكول 2.3) للتركيب ، مما أعطى دقة طيفية تبلغ 17.1 سم ^{- 1}. تظهر هذه النتائج أنه في نفس حالة القياس ، يتمتع SRS بدقة طيفية أفضل من CARS. ويسهم في انخفاض الاستبانة الطيفية في نظام CARS أساسا إشراك الخلفية غير الرنانة. بالإضافة إلى ذلك ، وجد أن نسب الذروة المتماثلة (2,913 cm-1) وغير المتماثلة (2,995 ^cm-1) كانت مختلفة جدا بالنسبة ل SRS و CARS. ويرجع ذلك إلى ارتباطات الإشارة المختلفة مع القابلية البصرية غير الخطية من الدرجة الثالثة ، كما هو موضح في المعادلتين (1) و (2). مع الاعتماد التربيعي ل CARS ، يتم تضخيم فرق الكثافة بين القمتين. يمكن ملاحظة أشكال الخطوط المتماثلة لقمم SRS وأشكال الخطوط غير المتماثلة لقمم CARS في الطيف. يرجع عدم التماثل في إشارة CARS بشكل رئيسي إلى وجود تداخل الخلفية غير الرنان. تظهر القمم الطيفية CARS ذات إزاحة حمراء قليلا (1-2 ^سم-1) إلى قمم SRS. ينشأ هذا أيضا من تداخل الخلفية غير الرنانة مع القمم الرنانة.

مقارنات حساسية الكشف
ويقارن الشكل 3 حساسية الكشف عن المجهر SRS و CARS الفائق الطيف. يتم رسم SNR لإشارات DMSO SRS (2,913 cm-1) كدالة لتركيز DMSO في D₂O عند تركيزات عالية أولا (^{1٪ -}50٪ ، الشكل 3A). أظهرت النتائج وجود علاقة خطية، معادلة مرضية (2). ويرسم الشكل 3B أطياف DMSO بتركيزات 0.1٪ و0.01٪، حيث يمكن حل ذروة 2,913 ^سم-1 في الأولى ولكن ليس في الثانية، مما يشير إلى أن حد الكشف يتراوح بين 0.1٪ و0.01٪ DMSO. باستخدام حد المعايير الفارغة، قدرنا أن حد اكتشاف SRS هو 0.021٪ DMSO. يرسم الشكل 3C CARS SNR كدالة لتركيز DMSO (1٪ -50٪) ، مما يدل على اعتماد تربيعي بالاتفاق مع المعادلة (1). يتم عرض أطياف CARS المستردة مرحليا في الشكل 3D ل 0.1٪ و 0.01٪ DMSO. لتحقيق هذه الأطياف ، تم استخدام طريقة استرجاع الطور الطيفي القائمة على علاقات كرامرز كرونيج وتم إجراء إزالة خلفية إضافية¹⁶. على غرار أطياف SRS ، يمكن حل ذروة DMSO 2,913 ^cm-1 بوضوح ل 0.1٪ DMSO ولكن ليس 0.01٪ ، مما يشير إلى حد الكشف بين هذين التركيزين. باستخدام حد المعايير الفارغة ، قدرنا أن حد اكتشاف SRS هو 0.015٪ DMSO. يتوافق DMSO بنسبة 0.02٪ مع 2.8 mM. لذلك ، فإن حد الكشف عن مجهر CRS فوق الطيفي المستخدم هنا هو ~ 2.1-2.8 mM DMSO.

مقارنات الاستبانة المكانية
يقارن الشكل 4 دقة ميزة خلوية صغيرة تم اكتشافها في صور SRS (الشكل 4A) و CARS (الشكل 4B). يتم عرض ملفات تعريف الكثافة من نفس الخط وملاءمتها باستخدام دالة Gaussian لتحديد قيم FWHM لمقارنة الدقة. أعطت إشارة SRS دقة 398.6 نانومتر (الشكل 4C) ، في حين أعطت إشارة CARS دقة 330.3 نانومتر (الشكل 4D). كانت دقة CARS ~ 1.2x أفضل من دقة SRS. يكمن سبب اختلاف الدقة أيضا في المعادلتين (1) و (2). تحتوي كل من المضخة وعوارض ستوكس على وظيفة انتشار نقطة غاوسية عند التركيز. ثم تتناسب إشارة CARS مع ضرب ثلاث وظائف غاوسية ، مما يقلل العرض تقريبا بعامل √3. وبالمثل ، بالنسبة ل SRS ، يتم تقليل العرض بعامل √2. لذلك ، كان قرار CARS √3/√2 = 1.2 مرة أفضل من قرار SRS.

مقارنات صور الخلايا
يقارن الشكل 5 صور SRS و CARS من خلايا MIA PaCa-2 في مواضع تأخير بصرية مختلفة. يوضح الشكل 5A صور SRS عند التأخير البصري الذي أعطى أقوى إشارة. في هذه الصورة، يمكن الكشف عن قطرات الدهون (LDs)، والشبكة الإندوبلازمية (ER)، والنواة (NU)، حيث تحتوي LDs على أقوى الإشارات التي تظهر كنقاط ساطعة. ويبين الشكل 5B صورة قناة CARS في نفس التأخير البصري، مع وجود تباينات أقل بكثير ل LDs. الأسباب الرئيسية لهذا الاختلاف في التباين هي وجود الخلفية غير الرنانة والانزياح الأحمر لنفس قمة رامان في أطياف CARS. في هذا التأخير البصري ، يكون للإشارة المتولدة مساهمة كبيرة من الخلفية غير الرنانة للماء. لتعزيز تباين الدهون في CARS، تم ضبط التأخير البصري على قيمة تحول اللون الأحمر. أدى الانزياح الأحمر إلى تحسين تباينات الدهون من خلال تركيز المزيد من الطاقة على 2,850 ^cm-1 لكل من SRS (الشكل 5C) و CARS (الشكل 5D) ، على الرغم من انخفاض مستوى الإشارة الإجمالي. بالنسبة ل CARS ، تم تحقيق تباين مماثل ل LDs مثل SRS من خلال انزياح أحمر ~ 98 ^cm-1 في التركيز الطيفي (الشكل 5D) ، على الرغم من أنه لا يزال يتم ملاحظة خلفية أعلى من تلك الموجودة في صورة SRS. في هذا التأخير البصري ، تظهر صورة SRS محتويات أقل بكثير من البروتين والأحماض النووية ولكن محتويات دهنية قوية في LDs و ER وأغشية الخلايا (الشكل 5C).

CARS هي عملية بارامترية في حين أن SRS غير بارامترية. ويسهم هذا الاختلاف أيضا في تباين الاختلافات بين الطريقتين. يتم تحديد إشارات CARS البارامترية من خلال تداخل إشارات CARS من طبقات مختلفة قريبة من تركيز الليزر ، والتي قد تظهر تباينات سلبية كما هو موضح في الأسهم في الشكل 5B والشكل 5D (أيضا في الشكل 4B). مثل هذه التناقضات السلبية الناجمة عن تداخل الإشارة غائبة في صور SRS. قد يوفر التباين السلبي في CARS معلومات حول الموقع المحوري للهدف محل الاهتمام.

إشارات SRS لها علاقة خطية مع التركيز الجزيئي ، في حين أن إشارات CARS تلبي اعتمادا على التركيز شبه التربيعي. لذلك ، تظهر LDs الغنية ب CH₂ إشارة أقوى بكثير من ER وأغشية الخلايا في صورة CARS مقارنة بصورة SRS (الشكل 5E ، F). يمكن استخراج أطياف SRS من الصور فوق الطيفية. يوضح الشكل 5G أطياف SRS النموذجية من LDs و ER و cytosol (CY) و NU. تختلف كل من الكثافة والشكل الطيفي باختلاف المقصورات الخلوية. يظهر LD إشارة أقوى بكثير عند 2850 ^سم-1 من العضيات الأخرى. أما بالنسبة ل CARS ، فيمكن الحصول على أطياف مماثلة ، على الرغم من اختلافها في الأشكال. تظهر أطياف CARS الخام انزياحا أحمر صغيرا مقارنة بأطياف SRS المقابلة. يمكن استخدام استرجاع الطور الطيفي بشكل أكبر لاستخراج استجابات رامان باستخدام أطياف CARS.

الشكل 1: مخطط لمجهر CARS/SRS الطيفي الفائق. الاختصارات: CARS = متماسك مناهض لستوكس رامان مبعثر. SRS = تحفيز تشتت رامان. PBS = مقسم شعاع الاستقطاب ؛ PD = الصمام الثنائي الضوئي; PMT = أنبوب المضاعف الضوئي ؛ AOM = المغير الصوتي البصري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: أطياف DMSO. (A) SRS و (B) أطياف CARS من DMSO. النقاط هي بيانات تجريبية. المنحنيات هي نتائج مناسبة طيفية. الاختصارات: CARS = متماسك مناهض لستوكس رامان مبعثر. SRS = تحفيز تشتت رامان. DMSO = ثنائي ميثيل سلفوكسيد; w = الدقة الطيفية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: نسب الإشارة إلى الضوضاء وأطياف DMSO. (A) نسبة الإشارة إلى الضوضاء للذروة المتماثلة DMSO عند 2,913 ^cm-1 كدالة للتركيز في D₂O مقاسة بواسطة SRS. النقاط هي بيانات تجريبية. الخط هو نتيجة التركيب الخطي. (ب) أطياف SRS البالغة 0.1٪ و 0.01٪ DMSO في D 2 O. (C) نسبة الإشارة إلى الضوضاء للذروة المتماثلة DMSO عند 2,913 ^cm-1 كدالة للتركيز في D₂O مقاسة بواسطة CARS. النقاط هي بيانات تجريبية. المنحنى هو نتيجة تركيب متعدد الحدود من الدرجة الثانية. (د) أطياف CARS بنسبة 0.1 في المائة و 0.01 في المائة DMSO في D₂O. الاختصارات: CARS = تشتت رامان متماسك مضاد لستوكس ؛ SRS = تحفيز تشتت رامان. DMSO = ثنائي ميثيل سلفوكسيد; SNR = نسبة الإشارة إلى الضوضاء; D₂O = أكسيد الديوتيريوم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: صور SRS و CARS وملامح كثافة خلية MIA PaCa-2. (A) صورة SRS لخلية MIA PaCa-2. (ب) صورة CARS لخلية MIA PaCa-2 في نفس مجال الرؤية مثل اللوحة A. (ج) ملامح كثافة نظام SRS على طول الخط الأصفر في اللوحة ألف. (د) موجز سمات كثافة نظام CARS على طول الخط الأصفر في اللوحة باء. النقاط هي بيانات تجريبية. المنحنيات هي نتائج مناسبة للوظيفة الغاوسية. أشرطة المقياس = 5 ميكرومتر. الاختصارات: CARS = متماسك مناهض لستوكس رامان مبعثر. SRS = تحفيز تشتت رامان. w = القرار. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: الصور وملف تعريف الكثافة لخلايا MIA PaCa-2. (أ) صورة SRS لخلايا MIA PaCa-2 في التأخير الزمني الأمثل لكثافة SRS. (ب) صورة CARS في نفس التأخير كما في اللوحة A. (ج) صورة SRS عند التأخيرات ذات الانزياح الأحمر 98 ^سم-1 كما هو الحال في اللوحة A. (د) صورة CARS بنفس التأخير البصري كما في اللوحة C. (E,F) تم رسم ملفات تعريف كثافة SRS و CARS على طول الخطوط المنقطة في اللوحتين A و D. (ز) أطياف SRS النموذجية من قطرات الدهون والشبكة الإندوبلازمية والسيتوسول والنواة. (ح) أطياف CARS النموذجية للتركيبات الخلوية الأربعة. الخطان المنقطان الأخضر والأحمر هما وضعان متأخران للولاءين A / B و C / D ، على التوالي. أشرطة المقياس = 10 ميكرومتر. الاختصارات: CARS = متماسك مناهض لستوكس رامان مبعثر. SRS = تحفيز تشتت رامان. LD = قطرات الدهون. ER = الشبكة الإندوبلازمية; CY = سيتوسول; NU = النواة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ملف تكميلي: برنامج مكتوب في المختبر يستند إلى LabVIEW يحتوي على شاشة عرض متعددة القنوات في وقت واحد لعرض الصور وحفظها في الوقت الفعلي. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

يصف البروتوكول المعروض هنا بناء مجهر CRS متعدد الوسائط والمقارنة المباشرة بين تصوير CARS و SRS. بالنسبة لبناء المجهر ، فإن الخطوات الحاسمة هي تداخل الحزم المكانية والزمانية وتحسين حجم الحزمة. يوصى باستخدام عينة قياسية مثل DMSO قبل التصوير البيولوجي لتحسين SNR ومعايرة نوبات رامان. تكشف المقارنة المباشرة بين صور CARS و SRS أن CARS لديها دقة مكانية أفضل ، بينما تعطي SRS دقة طيفية أفضل وتباينات كيميائية أقل تعقيدا. كل من CARS و SRS لهما حدود كشف مماثلة.

يستخدم تصوير CARS و SRS ليزر نبضي عالي الطاقة للإثارة. وهذا يسمح للمنصة بدمج طرق التصوير البصري غير الخطي الأخرى مثل تألق الإثارة متعدد الفوتونات ، والجيل التوافقي ، والامتصاص العابر للتباينات الكيميائية الإضافية^28,39.

تم استخدام CARS و SRS على نطاق واسع لدراسة تكوين الدهون مع انتقائية كيميائية عالية. ومع ذلك ، فإن التقنيات لا تقتصر على تحديد كمية الدهون. تم تطبيق SRS لرسم خريطة توزيع الأدوية⁴² ، وتخليق البروتين⁴³ ، والحمض النووي⁴⁴. كما تم تطبيق CARS و SRS على المكونات الصيدلانية والسواغات المصورة في أقراص⁴⁵،^46،47،48. وقد وجدت Hyperspectral CARS و SRS تطبيقات في تشخيص السرطان⁴⁹ ، وتقييم أمراض القلب والأوعية الدموية⁵⁰ ، والتصوير العصبي⁵¹. يمكن أيضا تطبيقها على دراسات COVID-19⁵². يمكن ل Broadband CARS ، التي يمكن أن تغطي النوافذ الطيفية التي يصل عرضها إلى 3000 سم ^{- 1} ، توضيح الهياكل الكيميائية الغنية في العينات البيولوجية⁵³. ومع ذلك ، نظرا لبطء معدل قراءة CCD ، يكون وقت سكن البكسل على مستوى المللي ثانية ، وهو أبطأ بكثير من وقت سكن البكسل الميكروثانية للفحص المجهري SRS³⁴. يحتوي الفحص المجهري SRS الفائق الطيف حاليا على عرض نطاق ترددي نموذجي يتراوح بين 200 و 300 ^سم-1 ، محدود بعرض النطاق الترددي الليزري وعدم وجود كاشفات صفيف مدمجة³⁴. يعد الفحص المجهري SRS لتحويل فورييه طريقة بديلة لتوسيع التغطية الطيفية SRS³⁵.

على الرغم من أن CARS و SRS يوفران معلومات كيميائية غنية دون الحاجة إلى وضع العلامات ، إلا أن الانتقائية الكيميائية تكمن في الروابط الكيميائية ، مما يجعل من الصعب التمييز بين بروتينات محددة. أظهرت علامات رامان القدرة على تعزيز الانتقائية الكيميائية ل CARS و SRS^54,55. ومع ذلك ، لا يزال تصوير رامان المتماسك يتمتع بحساسية أقل بكثير مقارنة بالكشف عن التألق. تم استخدام تحسين السطح للتحليل الطيفي التلقائي لتشتت رامان لتحسين مستويات الإشارة⁵⁶. كما تم تطبيقه على CARS و SRS لتضخيم الإشارة⁵⁷،^58،59. على الرغم من أن عامل التحسين ليس مرتفعا مثل تشتت رامان التلقائي ، إلا أن الفحص المجهري CARS و SRS المحسن على السطح لا يزالان يظهران إمكانية اكتشاف جزيئات مفردة^59,60. ومع ذلك ، فإن استخدام الجسيمات المعدنية أو الأسطح يحرم من ميزة النهج الخالي من التسميات. إن تحسين حساسية مجهر رامان المتماسك دون استخدام الأسطح المعدنية من شأنه أن يوسع إلى حد كبير تطبيق التكنولوجيا في العلوم البيولوجية.

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

تم دعم هذا البحث من قبل صندوق بدء التشغيل التابع لقسم الكيمياء بجامعة بوردو.