MikroRNA'ların Kene Ex Vivo Tükürük Bezi Kültürlerinden ve Hücre Dışı Veziküllerden İzolasyonu

Mevcut protokol, mikroRNA'ların kene tükürük bezlerinden ve saflaştırılmış hücre dışı veziküllerden izolasyonunu tanımlamaktadır. Bu, yaygın olarak kullanılan reaktifleri ve sarf malzemelerini birleştiren evrensel bir prosedürdür. Yöntem aynı zamanda az sayıda kene kullanımına izin verir, bu da kolayca sıralanabilen kaliteli mikroRNA'larla sonuçlanır.

Keneler, çoklu patojenleri vektörleştirebilen önemli ektoparazitlerdir. Kenelerin tükürük bezleri beslenme için gereklidir, çünkü tükürükleri konakçı bağışıklık tepkilerini azaltabilen ve patojen iletimini artırabilen farmasötik özelliklere sahip birçok efektör içerir. Bu tür efektörlerin bir grubu mikroRNA'lardır (miRNA'lar). miRNA'lar, kene-konakçı arayüzünde ve kene organlarında konakçı gen ekspresyonunu düzenleyen kısa kodlamayan dizilerdir. Bu küçük RNA'lar, kene tükürüğünde, hücreler arası ve hücre içi iletişime hizmet eden hücre dışı veziküller (EV'ler) aracılığıyla taşınır. Kenelerin tükürüğünde miRNA'lar içeren veziküller tanımlanmıştır. Bununla birlikte, miRNA'ların kene tükürük vezikülleri ve bezlerindeki rolleri ve profilleri hakkında çok az şey bilinmektedir. Ayrıca, kene tükürüğündeki veziküllerin ve miRNA'ların incelenmesi, kene tükürüğünü toplamak için sıkıcı prosedürler gerektirir. Bu protokol, miRNA'ları ex vivo organ kültürleri tarafından üretilen saflaştırılmış hücre dışı veziküllerden izole etmek için bir yöntem geliştirmeyi ve doğrulamayı amaçlamaktadır. MiRNA'ları hücre dışı veziküllerden ve tükürük bezlerini kene tükürük bezlerinden çıkarmak için gereken materyaller ve metodoloji burada açıklanmıştır.

Keneler, birçok patojeni vahşi yaşama, hayvancılığa, insanlara ve evcil hayvanlarına vektör eden ektoparazitlerdir ^1,2. Kene besleme, saklanmaya zarar vererek, şiddetli anemi nedeniyle kilo ve süt üretimini azaltarak ve potansiyel olarak ölümcül hastalığa neden olan patojenlerin bulaşmasına neden olarak önemli ekonomik kayıplara neden olur 1,3,4,5. Kene popülasyonlarını yönetmek için mevcut kontrol uygulamaları, akarisitlerin kullanımına odaklanmıştır. Bununla birlikte, hayvancılıkta parazitleştiren kenelerde akarisit direncinin sürekli ortaya çıkması^5,6, kene ısırığı insidansının artması ⁷ ve yerleşim bölgelerinde patojen bulaşması^8,9, benzersiz kene kontrol alternatiflerine ihtiyaç duyulmasına neden olmuştur.

Kene tükürük bezleri, bir kenenin biyolojik başarısını sağlayan temel organlardır. Çeşitli fizyolojik fonksiyonlara sahip farklı acinus tipleri (I, II, III ve IV) tarafından oluşturulurlar. Tükürük bezleri, tükürük^{salgısı 2,10} yoluyla su fazlalığını ve demir içeriğini konakçıya geri döndürerek hem kapalı hem de konakçı üzerinde ozmoregülasyondan sorumludur. Tip I acini ayrıca higroskopik tükürük^10,11 salgılanmasıyla atmosferden su alımında da rol oynar. Çimento ve sistatinler gibi tükürük efektör proteinleri, tip II ve III acini^10,12'de salgı hücreleri içinde üretilir. Tip I acini kene beslenmesini etkilemez, bu da kan unu alımının bu acini tip^13,14'te morfolojik ve fizyolojik değişiklikleri tetiklemediğini gösterir. Öte yandan, Acini tip II ve III beslenme sırasında aktive edilir ve bağlanma öncesi çok az aktivite gösterir. Bu nedenle, tip II acini içindeki salgı hücrelerinin genişlemesini ve biyoaktif bileşiklerin üretimini tetiklemek için besleme gereklidir. Tip III acini, salgı granülleri¹² içindeki sekresyon nedeniyle beslenme sırasında küçültülür.

Tükürük bezleri ayrıca kene ve bulaşma yolunda patojen enfeksiyonun yeridir. Beslenme sırasında, keneler kan unu^{10,15,16'nın} başarılı bir şekilde tamamlanması için gerekli olan farmasötik etkileri olan birkaç bileşik salgılarlar. Bu bileşikler anti-enflamatuar, immünsüpresif ve vazodilatatör özelliklere sahiptir^10,15,17. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, kene tükürük bezlerinden türetilen hücre dışı veziküllerin (EV'ler) bu bileşiklerin birkaçını barındırdığını ve anti-enflamatuar ve immüno-modülatör etkileri indüklediğini göstermiştir^18,19,20. "Hücre dışı veziküller", boyutlarına ve biyogenezlerine göre eksozomlar ve mikro-parçacıklar olarak sınıflandırılan vezikülleri tanımlamak için kullanılan bir şemsiye terimdir. Genel olarak, EV'ler,²¹ boyutunda ~ 40 nm-1 μm olan çift katmanlı membranlara sahip lipit blebleridir; Genel olarak, eksozomlar 40-150 nm boyutundayken, mikro-parçacıklar ^21,22,23 boyutunda 150 nm-1 μm arasındadır. Bununla birlikte, boyut EV'lerin biyogenez yolu^22'nin göstergesi değildir.

Eksozomların biyogenezi, plazma zarının sıralı invaginasyonu ile başlar. Bu invaginasyon, multiveziküler cisimlerin oluşumuna yol açar ve son olarak ESCRT komplekslerinin veya sfingomiyelinazların (sMases) etkisiyle veziküler membranın deformasyonuna neden ^olur24,25. Eksozomlar, hücresel homeostazı korumak için lizozomlar içinde lizozomlar içinde lize edilebilir veya alıcı hücrelere hücresel bileşenler vermek için veziküler füzyon yoluyla plazma zarına çıkabilir^21,24. Öte yandan, mikro-parçacıklar, plazma zarındaki lipitlerin konformasyonunu değiştiren flopassların ve flipassların etkisiyle oluşur²⁶. EV'ler hücreden hücreye iletişim için gereklidir ve lipitler, proteinler, nükleik asitler ve mikroRNA'lar (miRNA'lar) gibi hücre içi kargolar için bir taşıma sistemi görevi görür21,27,28. Taşındıktan sonra, bu veziküller yüklerini alıcı hücrelerin sitoplazmasına teslim eder ve alıcı hücrede fenotipik değişiklikler üretir^22,29. Kene beslenmesinde hücre dışı veziküllerin önemi ve konakçı immün ve yara iyileşmesi yanıtlarının manipülasyonu^18,20 nedeniyle, hücre dışı veziküller içindeki kargo^, kene önleyici terapötiklerin gelişimi için potansiyel hedefler ve kene beslenmesini bozmak için benzersiz bir mekanizma sunmaktadır. Bu, kene tükürük bezleri içindeki miRNA'ları ve tükürük bezi kaynaklı hücre dışı vezikülleri içerir.

miRNA'lar, mRNA dizilerini^30,31 post-transkripsiyonel olarak düzenleyebilen^, bozabilen veya susturabilen ~ 18-22 nükleotid (nt) uzunluğunda kısa kodlamayan dizilerdir. Transkripsiyon sırasında, pri-miRNA'lar Dicer (RNA polimeraz III) tarafından ayrılarak ayırt edici bir saç tokası benzeri yapı oluşturur ve bir pre-miRNA haline gelir. Pre-miRNA, olgun bir miRNA dubleks oluşturmak için Drosha (RNA polimeraz III) tarafından bir kez daha kesilir. Olgun dizi, mRNA dizisini tamamlayan RNA kaynaklı susturma kompleksine (RISC) entegre olur ve translasyon baskısına veya mRNA bozulmasına neden olur 28,30,32. Konakçı beslenmesi sırasında, kene tükürüğü içindeki miRNA'lar, bağışıklık tepkilerini baskılamak ve patojen iletimini arttırmak için konakçı gen ekspresyonunu modüle edebilir 33,34,35,36,37. EV'ler ve miRNA'lar üzerinde kapsamlı çalışmalar olmasına rağmen, kene-konakçı arayüzünde beslenme sırasındaki rolleri hala tam olarak anlaşılamamıştır. Yüksek kaliteli miRNA'ların izolasyonu ve saflaştırılmasıyla kolayca sonuçlanabilecek protokollerin optimize edilmesi, bu konulardaki bilgimizi ilerletmek için çok önemlidir.

EV'leri izole etmek için ultrasantrifüjleme, eksozom çökeltme, polimer çökeltme, immünoaffinite kromatografisi ve boyut tabanlı dışlama teknikleri gibi çoklu seçenekler kullanılabilir³⁸. Bununla birlikte, bu teknikler eksozomlar veya mikro-parçacıklar arasında ayrım yapamaz. Bu nedenle, daha önce de belirtildiği gibi, EV, EV'leri farklı örneklerden izole ederken şemsiye bir terim olarak kullanılır. Burada açıklanan deneylerde izole edilen veziküller, farklı biyogenez yollarından türetilen veziküllerin bir karışımını temsil eder. Belirli bir hücre dışı vezikül popülasyonunun daha fazla saflaştırılması, ilgilenilen vezikül popülasyonuna özgü belirteçlere (yani, ekzozomal belirteçler, tümör belirteçleri) karşı antikorlarla kaplanmış boncuklar kullanılarak immünopresipitasyon ile sağlanabilir^39,40. miRNA'lar ayrıca ticari olarak temin edilebilen farklı izolasyon kitleri ^7,41,42 aracılığıyla da ekstrakte edilebilir.

Bu projenin amacı, EV'leri izole etmek ve miRNA'yı hem EV'lerden hem de beslenen kene tükürük bezlerinden çıkarmak için yaygın olarak uygulanan yöntemleri birleştiren bir protokol geliştirmekti. Biyoaktif bileşiklerin salgılanması¹² besleme ile aktive edildiğinden, konakçı immün ve yara iyileşme yanıtlarını manipüle etmek için önemli olabilecek miRNA'ları tanımlamak için kenelerin beslenmesine izin verilmelidir. Mevcut protokol, EV'leri ve ilgili miRNA'larını izole etmek için az sayıda kene (20 kene) gerektirir, 2000 kene gerektiren daha önce tanımlanmış diğer çalışmalara kıyasla⁴³. Ayrıca, tükürük sekresyonlarının pilokarpin⁴⁴ ile kirlenmesini önler, bu da EV'lerin ve miRNA'larının konakçı hücreler üzerindeki etkisini inceleyen deneyleri etkileyebilir.

Tüm hayvan deneyleri, Texas A & M Üniversitesi'ndeki kurumsal hayvan bakımı ve kullanım komitesi (AICUC) tarafından onaylanan hayvan kullanım protokolünü (AUP # 2020-0026) izleyerek gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada kene türleri, Ixodes scapularis ve Rhipicephalus (Boophilus) microplus ve 42-72 günlük Yeni Zelanda Erkek Beyaz Tavşanları kullanılmıştır. I. scapularis, patojensiz olarak sertifikalandırılan Hastalık Kontrol Merkezi (CDC) ve Oklahoma Eyalet Üniversitesi'nden alındı. R. microplus, Edinburg, Tx'teki Sığır Ateşi Kene Araştırma Laboratuvarı'nda yetiştirildi. Tavşanlar ticari kaynaklardan elde edilmiştir (bkz. Bu protokol, hücre dışı vezikülleri ve miRNA'ları farklı kene türlerinden, yaşam aşamalarından ve dokulardan evrensel olarak izole edebilir.

1. Dişi I. skapularis ve kapsül hazırlığının yetiştirilmesi

1. Sert keneleri besleyen tavşanlar için prosedürleri izleyerek bir etilen-vinil asetat köpük kapsülü hazırlayın⁴⁵. İstila başına toplam iki kapsül için tavşanın her omuz bıçağına bir kapsül yerleştirin.
   NOT: Kısaca, bu kapsüller, içi boş alana sahip iki kare etilen-vinil asetat köpüğünden oluşur. Bir kare, hayvanın arkasına (bu durumda, tavşanlar) bir doku yapıştırıcısı ile yapıştırılır (bkz. Kenelerin kaçmasını önlemek için ince ağ ikinci kareye yapıştırılır. İki kare, kendinden yapışkanlı kanca bandı kullanılarak kapatılır.
2. Kapsülü tavşanlara yapıştırmadan önce kapsüllerin 24 saat boyunca ayarlanmasına izin verin. Köpük kapsülleri oda sıcaklığında saklayın.
   NOT: Kapsüller oda sıcaklığında süresiz olarak saklanabilir.
3. Kapsülü tıraş olmuş tavşanlara yapıştırın ve kene istilasından önce 24 saat bekletin.

2. Vezikülsüz ortamın hazırlanması

1. Vezikülsüz ortam 13 hazırlamak için, 0.5 mL fetal sığır serumu, 0.5 mL triptoz fosfat suyu, 0.1 mL% 10 lipoprotein-kolesterol konsantresi, 0.5 mL% 5 sodyum bikarbonat (NaHCO₃), 0.25 mL 4-(2-hidroksietil)-1-piperazineetansülfonik asit (HEPES) ve^8.125 mL L15C300 ortamını birleştirin (bkz. Ortamın ses seviyesini gerektiği gibi ayarlayın. Ortamı 26,3 mL'lik bir polikarbonat santrifüj şişesine yerleştirin.
2. Ultrasantrifüjün düzgün çalışmasını sağlamak için şişeleri maksimum 0,01 g ağırlık farkı ile dengeleyin.
3. Ortamı 4 °C'de 100.000 x g'de 18 saat boyunca ultrasantrifüj edin. Süpernatantı pipet yoluyla çıkarın, oluşan herhangi bir peleti rahatsız etmediğinizden emin olun.
4. Süpernatantı yeni bir santrifüj tüpüne aktarın ve uygun denge ile 4 ° C'de 100.000 x g'de 18 saat boyunca ikinci kez ultrasantrifüj yapın.
5. Kalan süpernatantı izole edin ve kirleticileri gidermek için 0,22 μm'lik bir şırınga filtresinden geçirin. Süpernatantı 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne pipetleyin.
6. Süpernatantı -20 °C'lik bir dondurucuda ihtiyaç duyulana kadar veya 3 yıla kadar saklayın.

3. Tavşan istilası

1. Üstünü 10 mL'lik bir şırıngadan kesin ve standart bir boya fırçası kullanarak yetişkin I. scapularis dişilerini yükleyin.
2. Şırınga açıklığını steril gazlı bez kullanarak örtün (Şekil 1).
3. Tavşanı bir masa üstüne veya yatay olarak bir çalışma yüzeyine yerleştirin; tavşanı bir havluyla sıkıca sarın ve her iki gözü de örtün, hazırlanan kapsülü (adım 1.1) tavşanı kenelerle enfekte etmeye maruz bırakın.
4. Kapsülü açın ve şırınga sapını iterek keneler yerleştirin. Keneler tavşan derisine yakın bir yerde biriktirin. Kenelerin kaçmasını önlemek için kapsülleri hızla kapatın.
5. Deneysel tasarıma göre, dişi kenelerin gerektiği kadar beslenmesine izin verin. Kurumayı önlemek için erkek Ixodes skapularisin kapsül içinde 24 saatten fazla kalmasına izin vermeyin.
   NOT: Hayvanlara bulaşacak kene sayısı araştırmacının takdirindedir. Bu protokol, mortaliteyi ve replikasyonlar için yeterli materyali hesaba katmak için istila başına ~ 100 kene kullandı. Ön deneyler, miRNA'ları dizilemek için yeterli materyal elde etmek için en az 20 kene / replikasyona ihtiyaç duyulduğunu belirledi.

4. Beslenen dişilerin çıkarılması

1. İstilacı tavşanları% 2 izofluran altına bir gaz difüzörü kullanarak oksijene yerleştirin. Oksijen hızını 700-1000 L/dak arasında ayarlayın.
   NOT: Herhangi bir sıkıntı veya ağrıyı önlemek için diğer anestezikler kullanılabilir.
2. Beslenen dişileri, keneleri kapitulumlarından kavrayarak, ince forseps kullanarak, cilde mümkün olduğunca yakın tutarak çıkarın. Bakteriyel enfeksiyonu önlemek için ağız kısımlarının tamamen çıkarıldığından emin olun.
3. Kenelerin 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirilmesidir.
4. Isırık bölgesini% 70 etanol ile temizleyin ve kene ısırığı bölgesinde enfeksiyonu önlemek için az miktarda üçlü antibiyotik (parmak ucu değeri, Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin.
5. Diseksiyonlar için keneleri laboratuvara taşıyın (adım 5). Tükürük bezlerinin bozulmasını önlemek için kenelerin çıkarılmasından sonraki 24-48 saat içinde bu diseksiyonları yapın ^15,43.

5. Tükürük bezi diseksiyonu ve hücre dışı vezikül sekresyonu

1. Her bir kuyucuğa 5 μL 100x penisilin, 5 μL 100x streptomisin, 5 μL 10 mg/mL rifampisin ve 5 μL 100x amfoterisin ile 500 μL vezikülsüz ortam (adım 2) ekleyin (bkz. Bakteriyel büyümeyi önlemek için vezikülsüz ortam içermeyen kuyucuklara rifampisinli 1x PBS ekleyin.
2. Keneler, diseksiyon mikroskobu altında çift taraflı halı bandı ile şeffaf bir mikroskobik cam slayt üzerine yerleştirin. Organ kurumasını önlemek için, diseksiyondan önce her keneye 10 μL 1x PBS ekleyin.
3. 4 mm vannas makası kullanarak ( bakınız Malzeme Tablosu), her dişinin yanında ~1 mm'lik küçük bir kesi yapın. Kene sırt tarafını tamamen çıkarın (Şekil 2) ve her iki tükürük bezini de çıkarın.
4. 20-40 kene tükürük bezini, 24 kuyucuklu doku kültürü ile muamele edilmiş bir plakada tek bir kuyucuğa eklenen 500 μL vezikülsüz ortama koyun (Şekil 3).
5. EV'lerin salgılanmasına izin vermek için tükürük bezi örneklerini 24 saat boyunca 32 ° C'de inkübe edin.

6. Hücre dışı veziküllerin izolasyonu

1. 24 saatlik inkübasyondan sonra, tükürük bezlerini içeren tüm ortamları 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin.
2. Tükürük bezlerini izole etmek için numuneyi 4 ° C'de 300 x g'da 10 dakika boyunca santrifüj yapın. Bu adımda iki faz ayrılacaktır: (1) EV'leri içeren süpernatant ve (2) tükürük bezleri (pelet).
3. EV'lerin izolasyonuna devam etmek için, süpernatantı yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin. Tükürük bezlerini içeren peleti (adım 6.2) 500 μL RNAlater'da (bakınız Malzeme Tablosu) yeniden askıya alın ve kullanılana kadar veya süresiz olarak -80 ° C'de saklayın.
   NOT: Bu tükürük bezleri 8. adımda miRNA izolasyonu için kullanılacaktır.
4. Hücresel kalıntıları gidermek için süpernatantı 4 ° C'de 2000 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe pipetleyin. Peleti atın.
5. Apoptotik cisimleri ve daha büyük EV'leri çıkarmak için süpernatantı 4 ° C'de 30 dakika boyunca 10.000 x g'de santrifüj yapın. Peleti atın ve süpernatantı yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin.
6. 1 μm naylon şırınga filtresine 10 mL'lik bir şırınga takın. Şırıngayı ve filtreyi ultrasantrifüj tüpünün üzerine yerleştirin (Şekil 4A). Ardından numuneyi ekleyin (Şekil 4B) ve şırıngayı 10 mL 1x PBS (Şekil 4C) ile doldurun ve tüpü buna göre dengeleyin (Şekil 4D).
7. Tüpleri 70Ti rotora yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve 4 ° C'de 18 saat boyunca 100.000 x g'de döndürün.
8. 18 saatlik ultrasantrifüjlemeden sonra, tüpün alt ucunda bir pelet gözlemleyin (Şekil 5). Pelet konsantre hücre dışı veziküllerdir.
9. EV peletini yeniden askıya almadan süpernatantın% 90-100'ünü çıkarın. Pelet'i 1x PBS ile yeniden askıya alın. Tüm süpernatant çıkarılamazsa, peleti yeniden askıya almak için kalan süpernatantı kullanın.
10. 300 K santrifüj filtreye 500 μL EV pelet/süpernatant pipeti (bkz.
    NOT: Bu, vezikül ile ilişkili olmayan proteinleri, miRNA'ları ve diğer molekülleri ortadan kaldırırken, veziküller filtreden geçmeyecektir.
11. Ortam sıcaklığında 10 dakika boyunca 8.000 x g'de santrifüj. Tüm EV peletleri/süpernatantları filtreden geçene kadar adım 6.10'u tekrarlayın.
12. Kolona 400 μL sterilize edilmiş 1x PBS ekleyin ve membrana bağlı EV'leri çıkarmak için pipetle iyice karıştırın. Numuneyi 1,5 mL DNaz / RNaz içermeyen bir tüpe koyun. Numuneler süresiz olarak veya kullanılıncaya kadar -80 °C'de saklanabilir. Numune bozulmasını önlemek için numunenin aşırı çözülmesini önleyin.
    NOT: EV bozulmasını önlemek için ultrasantrifüjden çıkarıldığında tüpleri buz üzerine yerleştirin. Son örnek, 400 μL'lik 1x PBS'deki EV peleti olacaktır. Bu numunenin 25 μL'si nanopartikül izleme analizi (NTA, adım 7) ve miRNA izolasyonu için 375 μL (adım 8) için kullanılacaktır.

7. Nanopartikül izleme analizi (NTA)

1. Son numunenin 25 μL'sini alın (adım 6.12) ve 375 μL 1x PBS ekleyin.
2. Seyreltilmiş numuneyi 1 mL'lik iğnesiz bir şırıngaya yükleyin ve NTA'nın optik lensine sıkıca vidalayın.
3. Ayarları buna göre yapın ve ayar tercihlerine göre videolar çekin.
   NOT: Bu çalışmada her biri 60 saniyelik üç okuma alınmıştır. Her NTA okuması teknik bir kopyayı temsil eder. Aynı süre boyunca kene beslemesinden farklı örnekler, bireysel biyolojik kopyaları temsil eder. Kamera seviye 7'ye ayarlandı ve algılama eşiği seviye 5'e ayarlandı.
4. Son EV numaralarını aşağıdaki formülle tahmin edin:
   ((başlangıç EV'leri konsantrasyonu (seyreltme faktörü)) * (numune tüpünde kalan toplam hacim)/1000) = numunedeki toplam EV'ler
   NOT: NTA, numuneleri konsantrasyon / mL olarak okuduğu için hacim 1000'e bölünmelidir.

8. tükürük bezlerinden ve hücre dışı veziküllerden miRNA ekstraksiyonu

1. Adım 6.12'den kalan numuneye 100 μL lizis reaktifi ekleyin (bakınız Malzeme Tablosu) ve sterilize edilmiş havanelerle homojenize edin (Şekil 6).
2. Kalan 600 μL'lik lizis reaktifini ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
3. 140 μL kloroform ekleyin, 15 s boyunca kuvvetlice çalkalayın ve oda sıcaklığında 3 dakika inkübe edin.
4. 4 ° C'de 15 dakika boyunca 12.000 x g'de döndürün.
5. Ara fazdan kaçınarak şeffaf üst fazı yeni bir 1,5 mL tüpe pipetleyin. Bu, beklenen numune hacminin ~ 525 μL'sine neden olacaktır. Daha sonra, 1: 1 hacimli% 100 moleküler dereceli etanol ekleyin.
6. Numunenin 700 μL'sini bir RNA izolasyon spin sütununa ekleyin (bkz.
7. Ortam sıcaklığında 30 s için 8.000 x g'da döndürün, akışı atın.
8. Numuneyi 700 μL RTE tamponu ile yıkayın ( Malzeme Tablosuna bakınız), 30 s boyunca 8.000 x g'de döndürün, akışı atın.
9. Numuneyi 500 μL RPE tamponu ile yıkayın ( Malzeme Tablosuna bakınız), 30 s boyunca 8.000 x g'de döndürün, akışı atın.
10. 500 μL% 80 moleküler dereceli etanol ekleyin ve 2 dakika boyunca 8.000 x g'de döndürün, akışı atın.
11. Membranı kurutmak için kolonu maksimum hızda 5 dakika döndürün. Toplama tüpünü atın ve sütunu yeni bir 1,5 mL mikrofüj tüpüne yerleştirin.
12. Membrana 14 μL RNase-/DNase içermeyen su ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin.
13. Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 21.000 x g'de santrifüj.
14. Salınan miRNA'lara 1 μL RNaz inhibitörü ekleyin (bakınız Malzeme Tablosu) ve pipet yoluyla iyice karıştırın.
    NOT: Tükürük bezlerinden miRNA ekstraksiyonundan önce, 1 ml 1x PBS (1: 1 hacim) ekleyerek herhangi bir RNAlater'ı çıkarın ve tükürük bezlerini 4 ° C'de 15 dakika boyunca maksimum hızda döndürün. Bunun üç kez veya tükürük bezleri süpernatanı çıkaracak kadar azalana kadar tekrarlanması gerekir. Bu noktada, örnek ~ 20-150 bp boyutunda küçük RNA'ların bir karışımını temsil eder (Ek Şekil 1).

9. MiRNA konsantrasyonunun ölçülmesi

1. Küçük RNA'nın konsantrasyonunu, ticari olarak temin edilebilen bir RNA tahlil kiti⁴¹ ile ölçün (bakınız Malzeme Tablosu).
2. Her tüpte, üreticinin talimatlarına göre, 199 μL seyreltme tamponu (numune başına kitte sağlanan Bileşen A ve B), miRNA'ların tespitine özgü 1 μL floresan boya (ölçüm dalga boyu 260 nm) (numune başına) ve her numune için 2 μL küçük RNA (adım 8) karıştırın.
3. Numune tüplerini okumadan önce, numune ölçümünden önce standart bir eğri oluşturmak için önceden seyreltilmiş miRNA standart 1 ve standart 2'yi (kit içinde verilir) okuyun.
   NOT: Standartlar, numunelerde ölçülen miRNA konsantrasyonunu belirlemek için bir karşılaştırma aracı olarak kullanılır.
4. Konsantrasyonu ng/μL olarak ölçmek için her standart ve numune tüpünü özel florometreye yerleştirin (bkz.

10. MiRNA kalitesinin belirlenmesi

1. Üreticinin talimatlarını izleyerek bir biyoanalizör⁴⁶ kullanarak jel elektroforezi yoluyla miRNA ve diğer küçük RNA'ların kalitesini belirleyin (bkz.
2. Numune okumadan önce, numuneleri aynı konsantrasyonda olacak şekilde normalleştirin.
3. Numuneleri, üreticinin talimatlarını izleyerek küçük bir RNA çipi ^41,46 aracılığıyla okuyun (bkz.
   NOT: miRNA kalitesini belirlemek için, jel benzeri görüntüler (bantlar) ve elektroferogramlar (pikler) numune kalitesinin göstergeleridir. Jeldeki bant ne kadar koyu olursa, miRNA kalitesi o kadar iyidir. Bant ne kadar hafif olursa (veya bant yoksa), kalite o kadar düşük olur veya numune bozulmasını kanıtlar^46,47.

11. mikroRNA zenginleştirme

1. Küçük RNA numune hazırlama kitinin üreticisinin talimatlarını izleyerek küçük bir RNA dizileme kiti kullanarak miRNA'yı zenginleştirin (bkz.
2. Her numuneyi 3' denillenmiş bir adaptörle bağlayın ve boncuk temizleme yoluyla fazla adaptörü çıkarın. Ardından, bir 5' adaptör ekleyin ve fazla adaptörü boncuk temizleme⁴⁸ ile çıkarın.
   NOT: Temizleme için hem adaptörler hem de boncuklar, bölüm 11.1'deki küçük RNA dizileme kitinde sağlanmıştır (bkz.
3. İlk ipliği sentezlemek için, her iki adaptör, RT tamponu ve kitte sağlanan M-MuLV Ters transkriptaz ile bağlanmış numunelerin ana karışımını hazırlayın (bkz. Daha sonra, karışımı 42 ° C'de 30 dakika ve 90 ° C'de 10 dakika boyunca inkübe edin. Talimatlarda belirtildiği gibi bir numune temizliği ile takip edin.
4. 1. ipliği RT ileri astarı kullanarak ve kitte sağlanan ters üniversal astarı kullanarak ( bakınız Malzeme Tablosu) geleneksel bir polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) aracılığıyla 95 ° C'de 2 dakika, daha sonra 95 ° C'de 20 sn, 60 ° C'de 30 s ve 72 ° C'de 15 s için 12-25 döngü için yükseltin. Son olarak, 72 ° C'de 2 dakika.
   NOT: PCR ürün boyutunun ~150 bp olması beklenmektedir (Şekil 7).
5. PCR ürününün kalitesini, üreticinin talimatlarını izleyerek bant istasyonu aracılığıyla ölçün (bkz.
6. Numuneleri, üreticinin talimatlarını izleyerek yeni nesil bir sıralama sistemi (75 döngü ) kullanarak sıralayın (bkz.
   NOT: miRNA zenginleştirme için, kütüphane hazırlığından önce numune miktarı ve kalitesi kontrol edilmelidir (adım 9-10).

12. Biyoinformatik analiz

1. MiRNA tanımlaması için entegre bir uygulama aracı kullanarak korunmuş ve benzersiz miRNA'ları tanımlayın.
   NOT: Bu çalışmada miRDeep2^49,50 ile miRNA tanımlaması yapılmıştır. miRDeep2, çeşitli türlerde bulunan tüm tanımlanmış korunmuş ve yeni miRNA'ların ücretsiz bir çevrimiçi kataloğudur^49,50 (bkz.
2. Yazılımla entegre edilmiş haritalayıcıyı kullanarak okumaları ilgili genomla hizalayın.
3. Eşleyici modülüne aşağıdaki parametreleri girin.
   1. Adım 11.2'den eklenen adaptör dizilerini kesin ve uzunluğu 18 nükleotidden az olan dizileri kaldırın. Gereksiz okuma dizilerini kaldırın.
   2. Ayrıştırma parametresini kullanarak dosyaları FASTA biçimine dönüştürün, ancak dosya FASTA biçimi^49'da değilse.
   3. Filtrelenmiş ve kesilmiş dizileri karşılık gelen genoma hizalayın. İlgilenilen türler için genom yoksa, en yakın homolog türe hizalayın.
   4. Çıktı dosyalarını "reads.fa" ve "reads_vs_genome.arf" olarak gösterin. "read.fa" sadece gereksiz olmayan okumaları içerecek ve "reads_vs_genome.arf" genomla hizalanmış haritalanmış okumaları içerecektir.
4. Adım 12.2'deki her iki çıktı dosyasını kullanarak, yazılımla entegre niceleyiciyi kullanarak miRNA ekspresyon profillemesini gerçekleştirin.
   1. İlgili miRNA öncü dizileri türlerini ve miRBase^{51,52,53,54,55,56'dan} olgun miRNA dizilerini indirin. İlgilenilen türler için öncü veya olgun diziler yoksa, miRBase'de bulunan tüm organizmalar için tüm öncülleri ve olgun dizileri içeren "hairpin.fa.gz" ve "olgun.fa.gz" dosyalarını indirin.
   2. "hairpin.fa.gz" ve "mature.fa.gz" dosyalarının sıkıştırmasını açın.
   3. Bölüm 12.3.4'teki "reads.fa" ve "read_vs_genome.arf" dosyalarını ve 12.4.2'deki sıkıştırılmamış dosyaları girin.
   4. Çıktı dosyalarını "outputname".csv", "outputname".html ve "outputname.pdf" olarak okuyun. Çıktı dosyası adı araştırmacıya göre ayarlanabilir.
      Not: "outputname.csv" dosyası ifade profillerini içerecektir. Spesifik olarak, ekspresyon profilinde miRNA kimliği, miRNA ile eşlenen tüm örnekler için okumaların toplamı, her örnek için belirli bir miRNA ile eşlenen okuma sayısı ve olgun miRNA'lara karşılık gelen öncü kimlik bulunacaktır. Adım 12.4.4'teki "çıktı adı.html", Santa Cruz Üniversitesi Genom Tarayıcısı (USCS), Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi (NCBI) ve miRBase'ye bağlantıları içerecektir. USCS ve NCBI, mevcut öncüllerin sorgu dizilerini yedekli olmayan nükleotid veritabanına karşı içerecek ve miRBase, mevcut miRNA öncülünün bilgisine sahip olacaktır. "Çıktı adı.pdf", ifade edilen miRNA'ların RNA ikincil yapısına ve öncü dizinin hizalamasına sahip olacaktır.
5. Benzersiz ve korunmuş miRNA'ları tanımlamak için miRDeep2 kullanın.
   1. Giriş dosyaları olarak adım 12.3.4 ve adım 12.4.2'deki çıktı dosyalarını kullanın.
      NOT: "outputname.html" olarak okunan çıktı dosyaları, numunedeki benzersiz ve korunmuş miRNA'ların tahminlerini içerecektir.
   2. MiRNA profillemesi için >1 puanlarını ve miRNA inhibisyonu ve endojen miRNA'ları taklit etme ^34,36,57 gibi daha ileri deneysel analizler için >⁴ puanlarını kullanın.
   3. MiRbase'den benzersiz miRNA'ları aşağıdakilere göre seçin ve tanımlayın: miRDeep2 skoru (adım 12.5.3), gerçek olasılık tahmini (% >90), anlamlı randfold p-değeri (<0.05)49,50,56.
      NOT: Biyoinformatik analizi, biyoinformatik analizi için ücretsiz bir çevrimiçi platform olan Cyverse Discovery Environment^58,59'daki miRDeep2 aracılığıyla yapılmıştır. MiRDeep2 ile tanımlanan korunmuş ve benzersiz miRNA'lar, miRbase'deki tüm türlerle karşılaştırıldı. Gelecekteki miRDeep2 tanımlaması, ilgili türlerin karşılık gelen genomu ile karşılaştırılabilir.

Mevcut protokol, miRNA'ları tükürük bezlerinden ve EV'lerden çıkarmak için ayrıntılı bir metodoloji sunmaktadır. Sonuçlara göre, bu protokol miRNA'nın iki farklı kene türünün, I. scapularis ve R. microplus'ın yetişkinlerinden izolasyonu için etkilidir ve potansiyel olarak diğer kene türlerinde de kullanılabilir. EV'lerin konsantrasyonu (partiküller / mL) NTA ile ölçüldü. R. microplus için, her cinsiyet ve yaşam aşaması, üç teknik kopyada ölçülen üç biyolojik kopya içeriyordu. Örnekler, her bir örneklemdeki varyasyonu göstermek için cinsiyet ve yaşam aşamasına (Şekil 8) göre ayrıldı. Daha sonra, örnekler iki yönlü ANOVA ve Tukey'in çoklu karşılaştırma testleri²⁰ (p-değeri = < 0.05) kullanılarak varyasyon ve istatistiksel farklılıkları görüntülemek için birleştirildi (Şekil 9). Her örnek, 20 dişi, erkek ve nimflerden disseke edilmiş ~ 40 tükürük bezinden oluşuyordu. EV'lerin izolasyonu ve miktarının belirlenmesinden sonra, örnekler küçük RNA saflaştırması için kullanıldı.

Her numune içindeki küçük RNA'nın konsantrasyonu Qubit (Tablo 1) ile ölçüldü ve kalite standart jel elektroforezi^46,47 kullanılarak bir biyoanalizör ile ölçüldü. Konsantrasyonlar, her iki kene türü için 14 μL'lik bir hacimde nanogramlar halindedir (Tablo 1). I. scapularis organlarından gelen küçük RNA konsantrasyonlarının ortalama toplamı 45.92-6.356 ng arasında değişmiştir. I. scapularis veziküllerinin RNA konsantrasyonu 72.24-2.128 ng arasında değişmiştir. R. microplus için organ konsantrasyonu 259-2.142 ng arasında değişmekte olup, veziküller 59.22-1.848 ng arasında değişmekteydi. Numuneler aynı konsantrasyonda normalleştirildi ve kaliteleri daha sonra bir biyoanalizör ile ölçüldü (Şekil 10). Jelde kalite değerlendirmesi için bir belirteç olarak bir referans merdiveni kullanılmıştır. Bant bütünlüğü, yoğunluğu ve pikleri, her numunedeki potansiyel bozulmanın veya toplam konsantrasyonun temsilcileriydi. 5 s ve 5.8 s ribozomal RNA'lara karşılık gelen bantlar sadece tükürük bezi organ örneklerinde (Şekil 10, şerit A-D) mevcuttu ve tükürük bezi örneklerinden vezikülde yoktu (Şekil 10, şeritler E, F), organlar ve hücre dışı veziküller arasındaki küçük RNA profillerindeki farklılıkları gösterdi. Numune bozulması, jeldeki bantların yokluğundan kaynaklandı; bu, önemli örneklem bozulması olduğunu gösteriyordu. Önemli bozunmaya sahip numunelerin atılması önerilir.

Preparatlar içinde miRNA örneklerinin varlığını göstermek için, küçük RNA izolasyonundan sonra 3-4 ay boyunca saklanan RNA örneklerinden küçük RNA cDNA kütüphaneleri hazırlanmıştır. İlginçtir ki, bu örneklerde daha yüksek örneklem bozulması bulunmuştur. A-D ve G şeritleri bozulma belirtileri gösterdi; aksine, E, F ve H-K, MIRNA CDNA KÜTÜPHANESI HAZıRLıĞı için minimum bozulma ve yeterli konsantrasyon göstermiştir (Ek Şekil 1). Numuneler saflaştırmadan hemen sonra kullanıldığında sadece bir örnek parçalandı (Şekil 10), bu da miRNA örneklerinin EV'lerden saflaştırıldıktan sonra bozulmaya daha yatkın olduğunu düşündürmektedir. Böylece, zenginleştirme analizi için E, F, H ve I örnekleri seçildi. Yıldız işaretleri, cDNA kütüphanesi hazırlığından sonra beklenen boyutlar olan ~ 150 bp'lik bant boyutlarını göstermektedir (Şekil 7). Alt soluk bantlar astar dimerini gösterir.

EV izolasyonu sırasında, santrifüjleme hızı ve süresi nihai EV konsantrasyonunu etkileyebilir. EV peletini 300 k sütunlara pipetlerken, daha önce adım 6.10'da belirtildiği gibi, EV'lerin membrandan geçmesini önlemek için düşük bir hacim ve hız gereklidir. Önceki çalışmalar, farklı bir santrifüjlü konsantratör kullanarak 20 dakika boyunca 12.000 x g'de 700 μL'nin, EV'leri çözünür proteinlerden düzgün bir şekilde ayırmak için yeterli olduğunu göstermiştir²⁰; Bununla birlikte, NTA'da farklı bir filtre kullanılarak düşük EV konsantrasyonları görüntülendi. Bu nedenle, filtrelerin ve diğer mevcut malzemelerin optimize edilmesi esastır. 300 k sütunları ilk kez kullanırken, hangisinin en yüksek EV konsantrasyonunu verdiğini belirlemek için farklı hız aralıkları test edildi. Santrifüjleme sırasında kaybedilen veziküllerin sayısı NTA analizi ile ölçüldü; daha düşük hızların akışta daha yüksek vezikül konsantrasyonuna neden olduğu sonucuna varılmıştır (gösterilmemiştir). EV'leri izole etmek için 6.000-8.000 x g'de 500 μL'nin tatmin edici olduğu sonucuna varılmıştır. Bu belirlendikten sonra, bu protokol vezikülleri I. scapularis ve R. microplus'tan izole etmek için kullanıldı. Her kene türünden izole edilen veziküllerin konsantrasyonu NTA ile ölçüldü (Şekil 8). EV konsantrasyonları 7.07 x 10 7 ila 7.94 x 10 9 parçacık /^mL arasında değişiyordu. EV miktarı, daha fazla miktarda EV'nin ekstrakte edilen daha yüksek bir miRNA konsantrasyonu ile sonuçlandığı miRNA konsantrasyonları ile korelasyon gösterdi.

Resim 1: Kadın yetişkin I. skapularis ile yüklenmiş ve sterilize gazlı bezle kaplanmış 1 mL iğnesiz şırıngalar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Resim 2: Engorge olmuş bir dişinin sırt tarafı 4 mm vannas makası ile çıkarıldı. Dişi, organ kurumasını önlemek için 1x PBS'ye batırıldı. Sarı oklar açıkta kalan tükürük bezlerine işaret eder. Rakam, yüksek çözünürlüklü objektif bir lensle 50x büyütmede çekildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Resim 3: 32 °C'de 24 saatlik bir inkübasyondan sonra bir hücre kültürü plakası. İlk kuyu sırası vezikülsüz ortamı ve disseke tükürük bezlerini içerir. Kuyuların geri kalanı Rifampisin ile 1x PBS içerir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Ultra santrifüj döngüsü için numune hazırlama işlemi. (A) 1 μm şırınga filtresi ile tepesinde 10 mL iğnesiz bir şırınga. (B) Üç tur santrifüjlemeden sonra süpernatant, şırıngaya pipetlenir. (C) Şırınganın geri kalanı 1x sterilize PBS ile 10 mL'ye kadar doldurulur. (D) Şırınga kaplanır ve 1x PBS'li süpernatant ultrasantrifüj tüpüne süzülür. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: 18 saatlik ultrasantrifüjlemeden sonra, ultrasantrifüj tüpünün dibinde hücre dışı veziküllerden oluşan bir pelet oluşur.

Şekil 6: Tükürük bezi organlarını ve hücre dışı vezikülleri homojenize etmek için sterilize edilmiş bir havane kullanılır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Bir zenginleştirme analizinden sonra miRNA hazırlanmış kütüphaneleri gösteren bant istasyonu aracılığıyla ölçülen bir jel elektroforezi. Kadın R. microplus tükürük bezi organlarından ve EV'lerden alınan örnekler, cDNA kütüphanesi sentezi için minimum bozulma ve yeterli miRNA konsantrasyonuna dayanıyordu. Merdiven (L) nükleotidlerdeki referans noktalarını ve üst ve alt belirteçleri gösterir. Yıldız işaretleri, küçük RNA cDNA kütüphanelerini gösteren ~ 150 bp boyutundaki ürün bantlarını gösterir. Alt bantlar primer dimer gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 8: Biyolojik replikasyonlar (A) dişiler, (B) erkekler ve (C) nimfler arasındaki varyasyonun temsili bir figürü. X ekseni EV boyutunu (nm) ve y ekseni EV konsantrasyonunu (parçacıklar/mL) gösterir. İki yönlü bir ANOVA ve Tukey'in karşılaştırma testi istatistiksel farklılıklar gösterdi (P değeri = < 0.05). Hata çubukları, varyasyonu hesaba katmak için standart hatayı temsil eder. Her örnek, üç biyolojik replikasyona sahip 20 kene içeriyordu. Örnekler, her biri üç kez olmak üzere 60 saniye boyunca kaydedildi. Kamera seviye 7'ye ayarlandı ve algılama eşiği seviye 5'e ayarlandı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 9: Perileri (kırmızı), dişiler (mavi) ve erkekler (siyah) için tüm kombine biyolojik replikasyonlar için varyasyonun temsili bir figürü. X ekseni EV boyutunu (nm) gösterir ve y ekseni EV konsantrasyonunu (parçacıklar/mL) gösterir. İki yönlü bir ANOVA ve Tukey'in karşılaştırma testi istatistiksel farklılıklar gösterdi (P değeri = < 0.05). Hata çubukları, varyasyonu hesaba katmak için standart hatayı temsil eder. Her örnek, üç biyolojik replikasyona sahip 20 kene içeriyordu. Yıldız işaretleri, p < 0.05'lik önemli bir farkı sembolize eder. Her kayıt, her biri üç kez, 60 saniye boyunca yapıldı. Kamera seviye 7'ye ayarlandı ve algılama eşiği seviye 5'e ayarlandı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 10: Biyoanalizör aracılığıyla temsili bir jel. Jel elektroforezi, referans olarak bir baz merdiveni kullanılarak gerçekleştirildi. Olgun bir miRNA dizisi ~ 18-22 nt uzunluğundadır, burada soluk bantlar belirlenen boyut aralığında gösterilir. Küçük nükleer RNA'lar, transfer mesajcısı RNA'lar ve düzenleyici RNA'lar gibi diğer küçük RNA'lar da örneklerde bulunur. Küçük RNA'ların boyutları ~ 20-150 nt arasında değişiyordu. Örnekler kene türlerine, dokulara ve cinsiyete göre değişir. G şeridi için, örnek bozulma örneği bant göstermez. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: Biyoanalizör aracılığıyla bir jel elektroforezi ölçüldü ve R. microplus dişi tükürük bezi organlarından ve EV'lerden ekstrakte edilen miRNA'ların kalitesini gösterdi. Merdiven (L), olgun miRNA'ların ~ 18-22 nt uzunluğunda ölçüldüğü nükleotitlerdeki referans boyutlarını gösterir. A-D ve G şeritleri bozulma gösterir ve E, F ve H-K şeritleri minimum bozulma gösterir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 1: Hem tükürük bezleri hem de hücre dışı veziküller için miRNA konsantrasyonlarına bir örnek. MiRNA konsantrasyonları sütunu, her kene türü için en düşük ila en yüksek konsantrasyonları temsil eder.

Tablo 2: Farklı kene türlerinde korunmuş miRNA'lar. (P) miRNA'nın yaygın olarak eksprese edildiğini veya mevcut olduğunu gösterir ve (A) miRNA'ların yaygın olarak eksprese edilmediğini veya tespit edilmediğini gösterir.

Tablo 3. Korunmuş ve benzersiz miRNA'lar, EV'lerde R. microplus dişileri, erkekleri ve nimfleri için tespit edildi. *Profil oluşturma için kullanılan miRNA skoru. ^γfonksiyonel deneyler için kullanılan miRNA skoru.

Ek Tablo 1: Tükürük bezlerinden salgılanan R. microplus erkek EV'ler için yeni nesil dizileme sonuçlarını gösteren bir tablo. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Tablo 2: Tükürük bezlerinden salgılanan R. microplus dişi EV'ler için yeni nesil dizileme sonuçlarını gösteren bir tablo. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Tablo 3: Tükürük bezlerinden salgılanan R. microplus nimf EV'ler için yeni nesil dizileme sonuçlarını gösteren bir tablo. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Mevcut protokol, tükürük bezlerinden ve EV'lerden miRNA'nın çıkarılması için ayrıntılı bir metodoloji sunmaktadır. Bununla birlikte, hepsi bu protokolün her bölümünün notlarında ayrıntılı olarak açıklanan önemli hususlar vardır. Kenelerin kaçmasını önlemek için kene besleme sırasında kapsül ve ağ ağı sabitlenmelidir. Kapsül hazırlama ve yerleştirme Koga ve ^ark.40'ta açıklanmıştır. Uygun olmayan bir numune atılırsa, kene diseksiyonlarının birkaç kopyasının yapılması gerekir. Ek olarak, kene dokusu ^18,20,43'ten EV izolasyon tekniklerini kullanırken çeşitli zorluklar ortaya çıkabilir. Örneğin, kurumayı önlemek için diseksiyon sırasında dokular nemli tutulmalıdır. Bu, diseksiyon boyunca PBS eklenerek yapılır. Hem PBS hem de organların diseksiyonu ve kültürü için kullanılan medya, kene mikrobiyomundan bakteriyel kontaminasyonu önlemek için antibiyotiklerle korunmalıdır. Bunlar, Gram-negatif ve Gram-pozitif bakterileri hedef alan antibiyotikleri içermelidir, çünkü her ikisi de kene dokularında bulunabilir⁶⁰. Aynı şekilde, diseksiyon sırasında diğer organlardan dokularla kontaminasyonu azaltmak için dikkatli olunmalıdır. Bu nedenle, diseksiyonların yavaşça yapılması gerekir ve kullanıcı deneyim kazandıkça, daha fazla kene diseke edilebilir. Son olarak, EV'ler patojenle enfekte olmuş hücreler de dahil olmak üzere tüm hücrelerden salgılandığından, EV izolasyonunu yürüten kene çalışmaları, çapraz EV kontaminasyonunu önlemek için EV'siz ortam ve tamponlar kullanmalıdır^25,61.

Bununla birlikte, bu protokol, kene tükürüğü EV'leri üretmek için gerekli olan kene sayısının azaltılmasına izin verir. Önceki protokoller, önemli ölçüde daha fazla sayıda kenenin tükürük salgılamasını gerektiriyordu. Örneğin, Haemaphysalis longicornis'teki tükürük EV'lerinde salgılanan miRNA'lar, 2.000 yetişkin kenenin tükürük salgılamasına ihtiyaç duyuyordu⁴³. Bu, keneleri destekleme kapasitesine sahip olmayan laboratuvarlar için son derece pahalı olabilir. Benzer şekilde, EV izolasyonu için kullanılan Amblyomma makulatum dokuları, izolasyondan önce kısmen dondurulmuş ve EV sekresyonu^19'un orijinalliğini etkileyebilecek 75 U / mL kollajenaz tip 3 ile muamele edilmiştir. Ayrıca, bu çalışmalar 80-100 çift tükürük bezi gerektirdi¹⁸.

Karşılaştırmalı olarak, bu protokol birden fazla kene türüne uygulanabilir ve EV'leri izole etmek ve kaliteli korunmuş ve yeni miRNA'ları çıkarmak için düşük sayıda kene gerektirir (Tablo 2) 33,36,37,43. MiRNA konsantrasyonları büyük ölçüde değişmekle birlikte yeni nesil dizileme için yeterliydi (Tablo 3 ve Ek Tablo 1-3). Bu protokol, daha büyük miRNA konsantrasyonlarına ihtiyaç duyulduğunda daha büyük bir numune boyutuna uyacak şekilde ayarlanabilir. Ayrıca, bu protokolde kullanılan malzemeler, malzeme mevcudiyetine bağlı olarak değiştirilebilir. Bununla birlikte, numune hacimleri ve santrifüjleme hızı, kullanılan kitler ve sütunlar için üreticinin talimatlarına uygun olarak ayarlanmalıdır.

Bu yöntemin bir dezavantajı, miRNA'ların ve EV'lerin ekstraksiyon ve izolasyon adımları boyunca kolayca bozulabilmesidir. Bu nedenle, protokol hızlı ve verimli bir şekilde gerçekleştirilmelidir. Belirtildiğinde, numuneler buz üzerinde tutulmalı ve miRNA ekstraksiyonu sterilize edilmiş bir ortamda yapılmalıdır. Ek olarak, EV membranına bağlı büyük RNA'ları ortadan kaldırmak için izole EV'ler üzerinde bir RNaz tedavisi yapılabilir. Bu, miRNA ekstraksiyonları sırasında büyük RNA'ların numuneyi kirletmesini önleyebilir. Son olarak, EV'lerden veya organlardan izolasyondan sonra miRNA örneğine bir RNAse inhibitörü eklenmesi, bozulma için önemli bir önleyici tedbirdir. Bu protokol, yürütülen deneyin hedeflerine paralel olarak değiştirilebilir ve uygulanabilir.

Bu protokol için gelecekteki uygulamalar, patojenlerin kene tükürüğü EV'leri içindeki miRNA'yı ve diğer genomik kargoyu nasıl etkilediğini anlamak için patojen-vektör etkileşimlerinin incelenmesini içerebilir. Benzer şekilde, bu protokol, miRNA'ların kene EV'lerine paketlenmesinde yer alan spesifik proteinleri ve hücresel süreçleri ve bu EV'lerin ve miRNA'ların yara iyileşmesi ve bağışıklık tepkileri üzerindeki spesifik etkisini tanımlayabilir. Akarisitlere karşı artan kene direnci nedeniyle, benzersiz kontrol yöntemlerine umutsuz bir ihtiyaç vardır. EV'ler, akarisitlere kıyasla alternatif bir kontrol yöntemi potansiyeline sahiptir. EV'ler terapötik uygulamalarda nano-taşıyıcı olarak kullanılabilir 18,23,61. İnsanlarda, miRNA'ları taşıyan EV'ler, kanser immünoterapisi sırasında tümör büyümesini baskılamak için kullanılmıştır^62,63. Benzer şekilde, kenelerde, EV'ler, hayati kene biyolojik fonksiyonlarını ve patojen iletimini etkilediği gösterilen genetiği değiştirilmiş miRNA'ları taşıyabilir 36,57,64. Gelecekteki yön, fonksiyonel çalışmalar için ilgi çekici miRNA'ları tanımlamak için çoklu kene türlerinin miRNA profillerini belirlemek için bu protokolü kullanmaktır.

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Edinburg, Teksas'taki Sığır Ateşi Kene Laboratuvarı'nın yardımı için çok minnettarız. Michael Moses, Jason Tidwell, James Hellums, Cesario Agado ve Homer Vasquez'e teşekkür ederiz. Proje boyunca Sarah Sharpton, Elizabeth Lohstroh, Amy Filip, Kelsey Johnson, Kelli Kochcan, Andrew Hillhouse, Charluz Arocho Rosario ve Stephanie Guzman Valencia'nın yardımlarına da teşekkür ederiz. Texas A&M Aggie Women in Entomology (AWE) Writing Group'a bu makalenin yazılması sırasındaki yardım ve tavsiyeleri için teşekkür ederiz. Aşağıdaki reaktifler BEI Resources, NIAID, NIH tarafından dağıtılmak üzere Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri tarafından sağlanmıştır: Ixodes scapularis Adult (Live), NR-42510. Dişi I. scapularis keneleri de Oklahoma Eyalet Üniversitesi'ndeki Kene Yetiştirme Tesisi'nden alındı. Bu proje Texas A & M Üniversitesi T3 tarafından finanse edildi: dönüşüm hibesi için üçlü ve USDA-ARS tarafından AOC'ye yapılan işbirliği anlaşması #58-3094-1-003.