Bir Ex vivo Assay Gastrointestinal Sistemde Candida albicans Hyphal Morphogenesis Çalışma

Gut homojen özler ve immünofloresan boyama kullanılarak bu çalışmada açıklanan ex vivo tsay GI sisteminde Candida albicans hiphal morfogenez incelemek için yeni bir yöntem temsil eder. Bu yöntem bağırsakta morfogenetik geçişi düzenleyen çevresel sinyalleri araştırmak için kullanılabilir.

Candida albicans gastrointestinal hyphal morfogenez (GI) yolu sıkı çeşitli çevresel sinyaller tarafından kontrol edilir, ve bu fırsatçı mantar patojenin yayılması ve patogenezönemli önemli bir rol oynar. Ancak, in vivo GI sisteminde mantar hyphae görselleştirmek için yöntemler bu morfogenez sürecini kontrol çevresel sinyallerin anlaşılmasını sınırlar zordur. Burada açıklanan protokol, gut homojen özlerde hiphal morfogenezinin görselleştirilmesi için yeni bir ex vivo yöntemi göstermektedir. Bir ex vivo tsay kullanarak, Bu çalışma göstermiştir ki antibiyotik tedavi farelerden cecal içeriği, ancak tedavi edilmemiş kontrol fareler, bağırsak içeriğinde C. albicans hiphal morfogenezi teşvik. Ayrıca, antibiyotik tedavi farelerden sekal içeriğine bağırsak metabolitleri belirli gruplar geri ekleyerek farklı hiphal morfogenez ex vivo düzenler. Birlikte ele alındığında, bu protokol tanımlamak ve C. albicans hyphal morfogenez gi sisteminde kontrol çevresel sinyalleri araştırmak için yeni bir yöntem temsil eder.

Candida albicans normalde kommensal bir fırsatçı, polimorfik mantar patojen, ancak bağışıklık tehlikeye^bireylerdeyaşamı tehdit eden enfeksiyonlara neden yeteneğine sahip öldürücü bir forma morfolojik bir değişim geçirebilir 1^{,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13}. C. albicans sistemik nosokomiyal enfeksiyonların önde gelen nedenidir, bir 40\u201260% mortalite oranı ile antifungal tedavi ile bile^2,14,15. C. albicans kadın üreme sistemi¹⁶dahil olmak üzere farklı konak nişlerde ikamet rağmen^{16 ,17}, sağlıklı bireylerin ağız boşluğu¹⁸ ve gastrointestinal (GI) yolu^19,20, sistemik enfeksiyonların çoğunluğu GI sistemi ve dahası kaynaklanan, sistemik enfeksiyon kaynağı genellikle GI yolu olduğu doğrulanır^{21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34}. C. albicans patojenite GI yolu faktörlerin geniş bir yelpazede etkilenir; ancak, virülans için gerekli önemli bir özelliği öldürücü bir hiphal hücre morfolojisi içine bir maya hücre morfolojisi geçiş^{35,36,37,38,39,40,41,42,43,44}. C. albicans eki ve enfeksiyon sırasında GI sisteminden yayılması son derece öldürücü hyphae içine bir commensal maya geçiş kapasitesi ile ilişkilidir, mantar invaziv hastalığa neden sağlayan^{44,45,46,47,48,49,50,51,52,53}.

Bağırsakta çeşitli faktörler, n-asetilglucosamine dahil, C. albicanstarafından hiphal oluşumunu düzenleyen. Bu nedenle, GI sisteminde bu mantar patojeninin hiphal morfogenezi ile ilgili bilgi açığını daraltmak çok önemlidir^54,55,56. Son kanıtlar çeşitli bağırsak metabolitlerinin farklı olarak C. albicans in vitro^57,58,59,60hipofna morfogenezini kontrol ettiğini göstermektedir. Ancak, teknik kısıtlamalar in vivo gut örneklerinde C. albicans hyphae oluşumunu incelemeye çalışırken sorunlar mevcut, özellikle maya ve hyphae hücreleri boyama ve hyplal gelişimi kantitatif analizi. Gi sisteminde C. albicans hyphal morfogenezi anlamak için, bir ex vivo yöntemi mantar hyphal morfogenez üzerinde metabolitlerin etkisini incelemek için farelerden homojenize bağırsak içeriğinin çözünür özleri kullanılarak geliştirilmiştir. C. albicans GI enfeksiyonuna dirençli ve duyarlı farelerden alınan bağırsak örneklerini kullanan bu yöntem, metabolitlerin, antibiyotiklerin ve ksenobiyotiklerin GI sistemindeki mantar lı hiphal morfogenezi üzerindeki etkisini belirlemeye ve incelemeye yardımcı olacaktır.

Tüm hayvan protokolleri Midwestern Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından⁵⁷önce açıklandığı gibi onaylanmıştır. Midwestern Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi, #2894 MWU IACUC Protokolü kapsamında bu çalışmayı onayladı. MWU hayvan bakım politikaları, Laboratuvar Hayvanlarının İnsani Bakımı ve Kullanımına Ilişkin Halk Sağlığı Hizmeti (PHS) Politikası'nı ve Hayvan Refahı Yasası'nda (AWA) belirtilen politikaları izler.

1. Fareler çalışma standart protokol

1. Erkek ve dişi C57BL/6J fareleri en az altı haftalık kullanın. Cefoperaz (0.5 mg/mL) ile steril su ile tamamlayın.
   1. 5'li gruplar halinde, her kafeste erkek ya da tüm dişi fareleri içeren eş-ev fareleri. Farelerstandart fare chow ve su (400 mL şişe ile) her zaman sağlayın.
   2. Yiyecek ve su seviyelerinin yeterli olduğundan emin olmak ve fareleri sıkıntı belirtileri için incelemek için kafesleri günlük olarak kontrol edin.
2. Kafes besleme şişelerinde kalan suya bakılmaksızın taze antibiyotik sağlandığından emin olmak için her 48 saatte bir suyu cefoperazone ile değiştirin.
3. 5\u20127 günlük cefoperazone tedavisinden sonra, kurulan IACUC protokolünü gözlemleyerek CO₂ boğulma yoluyla fareleri ötenaziye edin. Servikal çıkığı ile ölümü doğrulayın.
4. Otoklav sterilize keskin uçlu makas ve otoklav sterilize forceps kullanarak farelerdin.
   1. Ötenaziden sonra, karın maruz kalması gibi tüm uzuvları sabitleyerek bir diseksiyon yüzeyine hayvan güvenli.
   2. Diseksiyon sırasında kürkün forceps, makas veya bağırsak bölümlerine yapışmasını önlemek için karın bölgesini %70 etanol püskürtün.
   3. Çimdik ve karın tabanında deri bir bölümünü kaldırmak ve makas kullanarak deri ve altta yatan fasya ile küçük bir kesi oluşturmak için forseps kullanın. Çekum veya bağırsak duvarı delinmeönlemek için bu kesi yaparken büyük özen.
   4. Bu kesiği göğüs kafesine kadar genişletin, kısmen periton boşluğunu teşhir edin. Yukarı ve yanal uzanan her iki tarafta ilk kesi noktasından başlayarak bir kesim olun.
   5. Bu kanatları yanal olarak çekin ve periton boşluğunu tamamen ortaya çıkarmak için diseksiyon yüzeyine sabitleyin.
5. Her bölümden bağırsak içeriğinin en büyük miktarda toplanmasını sağlamak için mide ve kalın bağırsağın distal bölgede kesim üstün hale makas kullanırken, forceps kullanarak GI yolu ayıklayın.
6. GI yolu çıkarılırken, tek tek bileşenlerin yırtılmasını önlemeye dikkat edin. Ayrı mide, ince bağırsak, çekum, ve kalın bağırsak tek tek proksimal ve distal uçlarında makas kullanarak.
7. Her bölümden her bağırsak içeriğinin toplanması için, makas kullanarak her bölümün distal ucunda tek bir kesi yapın, ardından forseps kullanarak 1,5 mL mikrocentrifuge tüpüne bağırsak içeriğini elle dışarı atın.
8. Ex vivo tahlilleri için bağırsak içeriğini -80 °C'de saklayın.

2. Maya özü-peptin-dekstroz (YPD) agar plakalarının hazırlanması

1. 1 L cam şişe için maya özü peptone-dekstroz suyu tozu, 10 g agar ve ultrasaf su 500 mL son hacmine ekleyin.
2. Otoklav 121 °C'de 30 dk sıvı bir döngü üzerinde ortamı sterilize etmek için.
3. Bir laminar akış kaputunun altına, steril petri plakasına yaklaşık 20 mL agar ortam dökün. 500 mL agar ortam yaklaşık 25 plaka verilmelidir.
4. Plakaları kullanıma hazır olana kadar 4 °C'de saklayın.

3. Hyphal morfogenez tayini için ex vivo hazırlık

1. Bir YPD agar plaka üzerine C. albicans SC5314 taze bir kültür çizgi ve 30 °C gecede kuluçka.
2. Gecede yetiştirilen C. albicans SC5314 kültüründen iki ila üç orta büyüklükteki bireysel koloni seçin ve 1 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile yeniden askıya alın.
3. -80 °C'lik dondurucudan dondurulmuş bağırsak içeriğini alın ve 25 °C'de çözülün.
4. Yeni bir 1.5 mL tüp içine bağırsak içeriği yaklaşık 150 mg tartın.
5. 150 μL PBS (bağırsak içeriği ve PBS 1:1 ağırlık tan hacim oranına) sahip bağırsak içeriğini yeniden askıya alın.
6. Girdap yüksek hızda 30 s bağırsak içeriğini homojeize ve yaklaşık bir dakika oda sıcaklığında oturmaya izin verir.
7. 3 dk için 1000 x g homojenates santrifüj.
8. Supernatant'ı yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın.
9. Supernatant tüm enkaz kaldırmak için adımları 3.7 ve 3.8 tekrarlayın.
10. Bu supernatant için yukarıda hazırlanan C. albicans SC5314 inoculum 10 μL ekleyin
11. İyice karıştırın ve 37 °C'de 4-5 saat kuluçkaya yatırın.

4. Hiphal morfogenez tayini için metabolitlerin bağırsak homojen ekstrelerine ekselrite

1. -80 °C'lik dondurucudan dondurulmuş bağırsak içeriğini alın ve PBS'de 1:1 oranında (ağırlık: hacim) yeniden askıya alın.
2. Bağırsak içeriği ve PBS karışımı için bağırsak metabolitleri istenilen konsantrasyonu ekleyin.
3. Girdap yüksek hızda 30 s metabolitleri içeren bağırsak içeriğini homojenize ve yaklaşık 10 dakika oda sıcaklığında oturmaya izin.
4. 3 dk için 1000 x g homojenates santrifüj.
5. Supernatant'ı yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın. Supernatant tüm enkaz kaldırmak için adımları 4.4 ve 4.5 tekrarlayın.
6. Bu supernatant için yukarıda hazırlanan C. albicans SC5314 inoculum 10 μL ekleyin. İyice karıştırın ve 37 °C'de 4-5 saat kuluçkaya yatırın.

5. C. albicans morfogenez talimi (immünboyama ve görüntüleme)

1. Numuneleri 1000 x g'da 2 dk için santrifüj edin ve supernatant'ı pipetleme yoluyla atın.
2. Numuneleri 15 dakika boyunca %2 paraformaldehit (PFA) 100 μL'lik olarak düzeltin.
3. 2 dk için 1000 x g santrifüj ve pipetleme ile supernatant atın.
4. Numuneleri 1 mL PBS ile iki kez yıkayın. Numuneleri yıkamak için pbs peletini hafifçe boruile yeniden askıya alın. Bu hiphal yapılarına zarar verebilir gibi örnek girdap etmeyin. Yeniden süspansiyon sonra, 2 dk için 1000 x g santrifüj ve pipetleme yoluyla supernatant atın.
5. Örnekleri 100 μL pbs pbs oda sıcaklığında inkübe kullanabilirsiniz poliklonal C. albicans antikor (1:100 seyreltme) içeren 30 dakika.
6. 1 mL PBS ile numuneleri üç kez yıkayın.
   NOT: Floresan antikor kullanırken, fotoğraf beyazlatma önlemek ve örnek uzun ömürlü geliştirmek için loş ışıkta tüm seyreltme ve yıkama adımları yapılması tavsiye edilir.
7. 1:500 seyreltme de anti-Rabbit IgG Alexafluor 488 antikor içeren PBS 100 μL 15 dakika oda sıcaklığında örnekleri kuluçka. Fotoğraf beyazlatma önlemek için karanlık bir çekmece veya odada kuluçka gerçekleştirin.
8. 1 mL PBS ile numuneleri üç kez yıkayın.
9. Numuneleri 100 μL PBS'de yeniden askıya alın ve görüntüleme için 96 kuyuluk bir plakaya aktarın.
   NOT: Görüntülenmezken, 96 kuyulu plakanın fotoğraf beyazlatmasını önlemek için alüminyum folyoya sarılması önerilir.
10. Floresan görüntüleme mikroskobu kullanarak 20x ve 40x objektif lensler kullanarak görüntü mantar hücreleri. Floresan'ı tespit etmek için yeşil floresan protein (GFP) filtresi (uyarma dalga boyu 470/40 ve emisyon dalga boyu 525/50) kullanın.

Thangamani laboratuvarı⁶⁰ önceki bulgular ile birlikte bu sonuçlar C. albicans mide, ince bağırsak ve tedavi edilmemiş kontrol ve antibiyotik tedavi farelerin kalın bağırsak alınan bağırsak homojenate özleri ex vivo yetiştirilen zaman, C. albicans genellikle bir maya morfolojisi ile gelişir göstermektedir(Şekil 1B). Ancak, antibiyotik le tedavi edilen farelerden sekal ekstresinde yetiştiğinde, C. albicans kolayca morfogenez uğrar, maya ve hyphae formları içeren örnekler sonuçlanan(Şekil 1B); bu kontrol farelerde oluşmaz. Bu önceki sonuçları destekler, hangi antibiyotik tedavi secal özleri yetiştirilen örneklerde hyphae formlarında önemli bir artış gösterdi, ama başka bir antibiyotik tedavi bağırsak özleri⁶⁰. Bu sonuçlar antibiyotik tedavisi nin cekal ortamda değişikliklere yol açtığını düşündürmektedir, bu da C. albicans'ın hiphal morfogenezini tetikler. Ayrıca, bu fenotip sadece çekum fark belirli lokalizasyon da bu hidra teşvik koşulları mutlaka GI yolu boyunca mevcut olmayabilir düşündürmektedir, ama bunun yerine besinlerin durumuna bağlı olarak GI belirli segmentleri ile sınırlıdır, metabolitleri ve diğer bilinmeyen moleküller.

Antibiyotik le tedavi edilen farelerin cekal ekstresi C. albicans^57,58,59,⁶⁰morfogenezini teşvik ettiği için, seçili bağırsak metabolitlerinin (önceki in vitro çalışmalardan tanımlanan) cef-tedavi edilen farelerin cekal içeriğine ekselenek ekinin C. albicans ex vivo'nun morfogenezini etkileyip etkilemeyeceğini inceledik. Thangamani laboratuvarı tarafından yapılan önceki çalışma, tedavi edilmeyen ve antibiyotik le tedavi edilen farelerden elde edilen cekal içeriğihomojenate metabolomik profilini karakterize etti, antibiyotik tedavisi sonucunda çeşitli metabolitlerin bolluğunda önemli değişiklikler ortaya koyarak-özellikle, sekonder safra asitlerinin bolluğu azaldı ve karbonhidrat ların bolluğu⁶⁰. Ayrıca, bu çalışmada sekonder safra asitleri ve karboksilik asitler inhibe hyphae gelişimini inhibe, glikoz dahil karbonhidratise, in vitro C. albicans hiphal morfogenezi teşvik⁶⁰. Sonuçlar, deoksikolik asit (DCA, 0.5 mg/mL), litokolik asit (LCA, 0.1 mg/mL), palmitik asit (0.1 mg/mL), p-tolilatik asit (0.1 mg/mL), sebasik asit (0.5 mg/mL), 2-metilbütirik asit (0.5 mg/mL) ve laktik asit (5 mg/mL) sef-tedavi edilmiş farelerin sekal homojenine tamamen inhibe hyp morfogenezin inhibe edilmesi. Öte yandan, cef-tedavi edilen farelerin sekal homojenate glukoz ekselans (1 mg/mL) büyük bir hiphal gelişim ex vivo gösterdi (Şekil 2B). Bu bulgular, bağırsak metabolitlerinin cef-tedavi edilen farelerin cekal homojenate'ine eklenmesinin C. albicans'ın morfogenezini farklı olarak düzenlediğini ve böylece önceki in vitro bulguları doğruladığını göstermektedir. Bu sonuçlar, bağırsak metabolitlerinin C. albicanların hiphal morfogenezinde kritik bir rol oynadığını ve gen hedeflerinin ve bu metabolitler tarafından modüle edilen sinyal yollarının anlaşılmasının C. albicans enfeksiyonlarını önlemek ve tedavi etmek için yeni terapötik yaklaşımların geliştirilmesine yardımcı olacağını göstermektedir.

Şekil 1: Ex vivo tetkik bağırsak içeriğinde C. albicans hyphal morfogenez üzerinde cefoperaz tedavisinin etkisini belirlemek için. (A) Protokol şematik anahattı. (B) C57BL/6J farelerin mide, ince bağırsak, çekum ve kalın bağırsaklardan antibiyotik le tedavi edilen (üst paneller) ve tedavi edilmeyen (alt paneller) bağırsak içeriği alındı. C. albicans SC5314 ile aşılanmış bağırsak içeriği 4\u20125 saat için 37 °C'de inkübe edildi ve C. albicans antikor ile boyandı. Hücreler 40x büyütme de görüntülendi. Temsili görüntüler burada gösterilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: C. albicans ex vivo hyphae oluşumu nda cef-tedavi farelerden cekal içeriğine bağırsak metabolitlerinin eksojen eklenmesi. (A) Protokol şematik anahattı. (B) DCA (0.5 mg/mL), LCA (0.1 mg/mL), palmitik asit (0.1 mg/mL), p-tolilatik asit (0.1 mg/mL), sebasik asit (0.5 mg/mL) içeren inhibitör bağırsak metabolitleri havuzu; 2-metilbütirik asit (0.5 mg/mL) ve laktik asit (5 mg/mL) veya glikoz (1 mg/mL) cef-treated farelerin sekal içeriğine geri eklendi, iyice karıştırıldı ve 37 °C'de 15 dakika boyunca inkübe edilip ex vivo hyphae testini gerçekleştirildi. C. albicans SC5314 ile aşılanmış cekal içeriği 4\u20125 saat için 37 °C'de kuluçkaya yatırıldı ve C. albicans antikorile boyandı. Hücreler 40x büyütme de görüntülendi. Temsili görüntüler burada gösterilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Burada açıklanan yöntem, antibiyotik, diyet, ksenobiyotik ve terapötik etkileri nin C. albicans hyphal morfogenezi üzerindeki etkisini araştırmak için yeni bir yol sunar GI sisteminde. Sistemik enfeksiyonların çoğunluğu GI sistemi kaynaklanan olduğundan^{21,22,23,24,25,26,27,28,29,30},^31,32,33,34 ve hyphae oluşumu C yayılmasını teşvik kritik bir virülans faktörüdür. GI sisteminden albicanlar, GI sistemindeki bu morfogenezi kontrol eden faktörleri anlamak patogenez mekanizmaları hakkındaki bilgiyi genişletecek ve yeni tedavi seçeneklerini belirleyecektir.

Burada sunulan yöntem nispeten basit olmakla birlikte, aşağıda tartışılan bazı adımlar kritik ve önemli olarak tanımlanmıştır. (i) C. albicans ilk inoculum mantarların hem büyüme ve hiphal morfogenez için izin vermek için optimal olmalıdır. Bağırsak homojen özleri besin lerin sınırlı durumu ile, inokül yüksek hacimli önemli ölçüde mantar büyüme ve morfogenez sürecini azaltabilir. Ancak, farklı klinik izole ve suşların büyümesi değişken olması muhtemeldir, bu nedenle belirli C. albicans izole için inoculum ve kuluçka süresi optimize esastır. (ii) Bağırsak homojen ekstresi hazırlanırken birden fazla santrifüj adımları bağırsak içeriğinde mümkün olduğunca enkaz kaldırmak için çok önemli olduğu bulunmuştur. (iii) Santrifüjün nispeten düşük hızı nedeniyle (hiphal yapılarına zarar vermemek için), bu protokoldeki immünboyama adımları sırasında hücre kaybını önlemeye özen gerekir.

Gi sisteminde mantar hyphae görselleştirmek için alternatif yöntemler geçmişte, bazı avantajları ve sınırlamalar her yöntem ile ilişkili kullanılmıştır. Bir nispeten önemli yöntem situ hibridizasyon floresan kullanarak (FISH) GI yolu mantar hyphae görselleştirmek için son witchley ve ark⁶¹tarafından gösterilmiştir^,62. Bu, c. albicans hyphae doğrudan GI sisteminde tespit etmek için şu anda mevcut bir in vivo yöntemidir, ancak bu protokolün karmaşıklığı zor hızlı, büyük ölçekli ilk tarama çalışmaları adapte yapar. Geleneksel histopatoloji yöntemleri de gi sisteminde C. albicans maya ve hyphae formları canlandırmak için geçmişte kullanılmıştır. Ancak, gözlem ve temel histopatoloji ile mantar hücrelerinin görüntüleme, ve Hematoksilin ve Eosin (H / E) lekeleri zorlu kalır, birçok standart fiksasyon yöntemleri GI yolu örneklerinin mukozal tabakası bozmak için potansiyele sahip olarak, genellikle süreç içinde hyphal yapıları zarar ve enfeksiyon sırasında hyphal hücre morfolojisi göreceli bolluk üzerinde çelişkili raporlara yol^63,64,6566. Bu yöntem, bu sorunu gidermek için işleme sırasında hyphae zarar görmesini önlemek için geliştirilmiştir. Buna ek olarak, doku eksplorler biyolojik koşulları ex vivo incelemek için bir yol olarak kullanılmıştır, Ancak bu yöntemler genellikle odaklanmış ve C. albicans⁶⁷bağlılık veya invazyon potansiyelini incelemek için yararlı , ama aynı zamanda genellikle in vivo patogenezi katkıda metabolomik ve mikrobiyom bileşenlerinin çoğunluğu hariç. Burada açıklanan ex vivo protokolü daha önce^61,62olarak açıklandığı gibi in vivo GI ortamını tamamen taklit etmese de, C. albicans'ın yapay büyüme koşulları kullanarak in vitro yöntemlere göre bağırsak ortamında karşılaştığı en yakın koşulları sağlar.

Bu protokol, Gi sistemindeki çevresel sinyallerin C. albicans hiphal morfogenez üzerindeki etkisini belirlemek için temel tarama tahlilleri için kullanılabilir. Bu yöntem, küçük molekül inhibitörleri, yeni antimikotikler ve metabolitler de dahil olmak üzere bileşiklerin büyük gruplar için hızlı bir şekilde hiphal gelişimi için taranacak sağlar, ve tarama terapötik tedaviler veya sistemik hastalık için risk faktörlerinin belirlenmesinde kullanılabilir. C. albicans GI yolu boyunca kolonize olduğundan, Bu protokol daha fazla antibiyotik alarak bireylerde hiphal morfogenez kontrol GI tetkik belirli segmentlerinde mevcut çevresel sinyalleri belirlenmesinde yardımcı olacaktır, kemoterapötik ajanlar, ve diabetes mellitus dahil metabolik bozuklukları olan hastalarda. Sonuç olarak burada açıklanan yöntem, c. albicans'da hiphal morfogenezinin, mevcut in vitro yöntemlerden biyolojik olarak daha alakalı ve mevcut in vivo yöntemlere göre önemli ölçüde daha hızlı ve daha verimli bir şekilde çevresel faktörlerin geniş bir yelpazede hızlı bir şekilde nitelendirilmesine olanak sağlar.

Yazarların hiçbir rakip mali çıkarları veya diğer çıkar çatışmaları var.

Yazarlar, Midwestern Üniversitesi Hücresel ve Moleküler Çekirdek Araştırma tesisinin kaynaklarını ve desteğini kabul ediyor.