Ex vivo Assay для изучения Candida Albicans Hyphal Morphogenesis в желудочно-кишечном тракте

Ex vivo анализ, описанный в этом исследовании с использованием экстрактов гомогената кишечника и иммунофторесценции окрашивания представляет собой новый метод для изучения гипхал морфогенез Candida albicans в желудочно-кишечном тракте. Этот метод может быть использован для исследования экологических сигналов, регулирующих морфогенетический переход в кишечнике.

Candida albicans hyphal morphogenesis в желудочно-кишечном тракте (ГИ) жестко контролируется различными экологическими сигналами, и играет важную роль в распространении и патогенезе этого оппортунистического грибкового патогена. Тем не менее, методы визуализации грибковых гиф в желудочно-кишечном тракте in vivo являются сложными, что ограничивает понимание экологических сигналов в контроле этого процесса морфогенеза. Описанный здесь протокол демонстрирует новый метод ex vivo для визуализации гипхал-морфогенеза в экстрактах гомогената кишечника. Используя анализ ex vivo, это изучение демонстрирует что cecal содержание от антибиотика обработанных мышей, но не от untreated мышей управления, повысить C. albicans гипхальный морфогенез в содержании кишки. Кроме того, добавление назад конкретных групп метаболитов кишечника к содержимому cecal от антибиотико-обработанных мышей дифференциально регулирует гипхальный морфогенез ex vivo. Взятые вместе, этот протокол представляет собой новый метод для выявления и исследования экологических сигналов, которые контролируют C. Albicans гифаль морфогенез в желудочно-кишечном тракте.

Candida albicans является оппортунистическим, полиморфным грибковым патогеном, который обычно commensal, но может пройти морфологические изменения в вирулентной форме, способной вызвать опасные для жизни^{инфекции у людей с ослабленным иммунитетом 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13}. C. albicans является ведущей причиной системных нозокомиальных инфекций, с 40-201260% смертности даже при противогрибковом^{лечении 2,14,15}. Хотя C. albicans проживает в различных нишах хозяина включая^{женскую репродуктивную систему 16,17}, устную полость^{здоровых индивидуалов 18} и желудочно-кишечный тракт (GI)^{тракта 19,20}, большинство системных инфекций возникают от тракта GI и более того, Источником системной инфекции часто подтверждается^{желудочно-кишечный тракт 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34.} C. микробиканы патогенности в желудочно-кишечном тракте зависит от широкого спектра факторов; Однако главной характеристикой, необходимой для вирулентности, является переход от морфологии дрожжевых клеток к вирулентной морфологии^{гипхал-клеток 35,36, 37,38, 39,40,41,42,43,44.} C. Albicans крепления и распространения из желудочно-кишечного тракта во время инфекции тесно связано с его способностью к переходу от commensal дрожжей в вирулентной гифы, что^{позволяет грибам вызывать инвазивные заболевания 44,45,46,47,48,49,50,51,52,53}.

Разнообразие факторов в кишечнике, в том числе n-acetylglucosamine, регулируют образование гифаля C. albicans. Поэтому крайне важно сократить пробел в знаниях относительно гипхал-морфогенеза этого грибкового патогена в желудочно-кишечном^{тракте 54,55,56.} Последние данные свидетельствуют о^том,что различные метаболиты кишечника дифференциально контролируют гипхалморфогенез C. Albicans in vitro⁵⁷,^58,59,60. Тем не менее, технические ограничения представляют проблемы при попытке изучения C. Albicans гифы формирования в образцах кишечника in vivo, особенно окрашивания дрожжей и клеток гифы и количественного анализа развития гипхала. Чтобы понять гипахал-морфогенез C. albicans в желудочно-кишечном тракте, был разработан метод ex vivo с использованием растворимых экстрактов гомогенизированного содержимого кишечника у мышей для изучения влияния метаболитов на грибковый гипхалморфез. Используя образцы кишечника у мышей, которые устойчивы и восприимчивы к инфекции C. Albicans GI, этот метод поможет определить и изучить влияние метаболитов, антибиотиков и ксенобиотиков на грибковый гипахал морфогенез в желудочно-кишечном тракте.

Все протоколы животных были одобрены Midwestern University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), как описано до⁵⁷. Институциональный комитет по уходу за животными и использованию в Среднем Западе университета одобрил это исследование в соответствии с протоколом MWU IACUC #2894. Политика MWU по уходу за животными следует политике Службы общественного здравоохранения (PHS) по гуманному уходу и использованию лабораторных животных и политике, изложенной в Законе о защите животных (AWA).

1. Мыши изучают стандартный протокол

1. Используйте мышей мужского и женского пола C57BL/6J по крайней мере шесть недель. Дополните их стерильной водой с цефоперазоном или без него (0,5 мг/мл).
   1. Со-дом мышей в группах по 5, с каждой клетке, содержащей либо всех мужчин или всех самок мышей. Обеспечить мышей стандартной мыши чау и воды (через бутылку 400 мл) во все времена.
   2. Проверьте клетки ежедневно, чтобы обеспечить питание и уровень воды достаточно, и изучить мышей на наличие признаков бедствия.
2. Замените воду цефоперазоном каждые 48 ч, чтобы гарантировать, что свежий антибиотик предоставляется независимо от оставшейся воды в бутылках для кормления в клетке.
3. После 5-20127 дней лечения цефоперазоном, усыпляйте мышей с помощью CO₂ удушья наблюдения установлен протокол IACUC. Подтвердите смерть через вывих шейки матки.
4. Рассекают мышей с помощью автоклав-стерилизованных острых ножниц и автоклав-стерилизованных типсов.
   1. После эвтаназии, закрелите животное на поверхности вскрытия, прижав все конечности так, чтобы живот подвергался воздействию.
   2. Спрей брюшной области с 70% этанола, чтобы предотвратить меха от прилипания к тиски, ножницы, или кишечника разделов во время вскрытия.
   3. Используйте щипцы, чтобы ущипнуть и поднять часть кожи у основания живота и создать небольшой разрез через кожу и основные фасции с помощью ножниц. Позаботьтесь при принятии этого разреза, чтобы избежать прокола cecum или кишечной стенки.
   4. Расширьте этот разрез до грудной клетки, частично обнажая брюшную полость. Сделайте разрез, начиная с точки первоначального разреза с обеих сторон, простирающихся вверх и боково.
   5. Потяните эти закрылки боковой и контактный к поверхности вскрытия, чтобы полностью подвергать брюшной полости.
5. Извлекайте желудочно-кишечный тракт с помощью типсов, используя ножницы, чтобы сделать порезы выше желудка и в дистальной области толстой кишки, чтобы обеспечить сбор наибольшего количества содержимого кишечника из каждого раздела.
6. При удалении желудочно-кишечного тракта, позаботьтесь, чтобы избежать разрыва отдельных компонентов. Отделяйте желудок, тонкий кишечник, cecum, и толстой кишки индивидуально с помощью ножниц на проксимальных и дистальных концах.
7. Для сбора каждого содержимого кишечника из каждого раздела, сделать один разрез на дистальной конце каждого раздела с помощью ножниц, а затем вручную изгонять содержимое кишечника в 1,5 мл микроцентрифуг трубки с помощью типсов.
8. Храните содержимое кишечника при -80 градусов по Цельсию для анализа ex vivo.

2. Приготовление дрожжевой экстракт-пептон-декстроза (YPD) агар пластин

1. К стеклянной бутылке объемом 1 л добавьте 25 г дрожжевого экстракта бульона пептон-декстроза, 10 г агара и ультрачистую воду до конечного объема 500 мл.
2. Автоклав при 121 градусе по Цельсию в течение 30 минут на жидком цикле для стерилизации средств массовой информации.
3. Под капотом ламинарного потока вылейте около 20 мл агар-медиа в стерильную пластину Петри. 500 мл агар-медиа должны дать около 25 пластин.
4. Храните тарелки при 4 градусах Цельсия до готовности к использованию.

3. Ex vivo подготовка к анализу гипхал морфогенеза

1. Streak свежей культуры C. albicans SC5314 на YPD агар пластины и инкубировать на ночь при 30 градусов по Цельсию.
2. Выберите два-три средних отдельных колоний из ночных выращенных C. albicans SC5314 культуры и повторно приостановить в 1 мл фосфата буферного солевого раствора (PBS).
3. Извлекит замороженное содержимое кишечника из морозильной камеры -80 градусов по Цельсию и оттаивать при 25 градусах Цельсия.
4. Взвесить около 150 мг содержимого кишечника в новую трубку 1,5 мл.
5. Повторно приостанавливать содержимое кишечника с 150 йЛ PBS (содержимое кишечника и PBS при соотношении веса 1:1 к объему).
6. Vortex на высокой скорости в течение 30 с, чтобы гомогенизировать содержимое кишечника и позволяют сидеть при комнатной температуре около минуты.
7. Центрифуга гомогенатов при 1000 х г в течение 3 мин.
8. Перенесите супернатант на новую трубку 1,5 мл.
9. Повторите шаги 3.7 и 3.8, чтобы удалить все обломки в супернатанте.
10. Добавьте 10 МКЛ инокулума C. albicans SC5314, подготовленного выше, к этому супернатанту
11. Хорошо перемешать и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение 4 до 5 ч.

4. Экзогенное добавление метаболитов в экстракты гомогената кишечника для анализа гипхал-морфогенеза

1. Извлеким замороженное содержимое кишечника из морозильной камеры -80 градусов по Цельсию и повторно приофлив в PBS при соотношении 1:1 (вес: объем).
2. Добавьте желаемую концентрацию метаболитов кишечника к содержанию кишечника и смеси PBS.
3. Вихрь на высокой скорости в течение 30 с, чтобы гомогенизировать содержимое кишечника, содержащего метаболиты и позволяют сидеть при комнатной температуре около 10 мин.
4. Центрифуга гомогенатов при 1000 х г в течение 3 мин.
5. Перенесите супернатант на новую трубку 1,5 мл. Повторите шаги 4.4 и 4.5, чтобы удалить все обломки в супернатанте.
6. Добавьте к этому супернатанту 10 МКЛ Инокулума C. albicans SC5314, подготовленного выше. Хорошо перемешать и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение 4 до 5 ч.

5. Анализ морфогенеза К. Альбикана (иммуностимулирование и визуализация)

1. Центрифуга образцов на 1000 х г в течение 2 мин и отказаться от супернатанта через пипетки.
2. Исправьте образцы в 100 МКЛ 2% параформальдегида (PFA) в течение 15 мин.
3. Центрифуга на 1000 х г в течение 2 мин и отказаться от супернатанта через пипетки.
4. Вымойте образцы дважды с 1 мл PBS. Чтобы вымыть образцы, повторно приостановить гранулы в PBS путем трубопроводов мягко. Не вихрь образца, как это может повредить гипхал структур. После повторной суспензии центрифуга при 1000 х г в течение 2 мин и отбросить супернатант через пипетку.
5. Инкубировать образцы при комнатной температуре в 100 МКЛ PBS, содержащих поликлональные антитела C. albicans (1:100 разбавления) в течение 30 мин.
6. Вымойте образцы три раза с 1 мл PBS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании флуоресцентных антител рекомендуется выполнять все шаги по разбавлению и мытью в тусклом свете, чтобы избежать отбеливания фотографий и улучшить долговечность образца.
7. Инкубировать образцы при комнатной температуре в течение 15 мин в 100 МКЛ PBS, содержащих анти-Rabbit IgG Alexafluor 488 антител в 1:500 разбавления. Выполните инкубацию в темном ящике или комнате, чтобы избежать отбеливания фотографий.
8. Вымойте образцы три раза с 1 мл PBS.
9. Повторно приостанавливать образцы в 100 МКЛ PBS и передавать на 96-хорошо пластины для визуализации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Когда не изображены, рекомендуется, чтобы 96-хорошо пластины быть завернуты в алюминиевую фольгу, чтобы избежать фото отбеливания.
10. Изображение грибковых клеток с использованием 20x и 40x объективных линз с помощью флуоресценции изображения микроскопа. Для обнаружения флуоресцентной лампы 470/40 и длины волны выбросов 525/50 используйте зеленый флуоресцентный белок (GFP) (возбуждение длиной волны 470/40).

Эти результаты наряду с предыдущими выводами из лаборатории Thangamani^{60 показывают,} что, когда C. albicans выращивается ex vivo в кишечнике гомогенатных экстрактов, взятых из желудка, тонкого кишечника и толстой кишки необработанных контроля и антибиотиков обработанных мышей, C. Albicans обычно развивается с дрожжамиморфологии ( Рисунок 1B). Однако, когда выращивается в cecal экстракт из антибиотиков обработанных мышей, C. Albicans легко проходит морфогенез, в результате чего образцы, содержащие дрожжи и гифе формы(рисунок 1B); это не происходит в контрольных мышей. Это подтверждает предыдущие результаты, которые показали значительное увеличение форм гифы в образцах, выращенных в антибиотико-обработанных экстрактах cecal, но не в любых других обработанных антибиотиками^{экстрактах кишечника 60}. Эти результаты показывают, что лечение антибиотиками вызывает изменения в cecal окружающей среды, которые вызывают гипхальный морфогенез C. albicans. Кроме того, специфическая локализация этого фенотипа, замеченная только в cecum, также предполагает, что эти гифа-продвигающие условия не обязательно присутствуют по всему желудочно-кишечному тракту, а вместо этого ограничиваются определенными сегментами желудочно-кишечного тракта в зависимости от наличия питательных веществ, метаболитов и других неизвестных молекул.

Так как цикальный экстракт обработанных антибиотиками мышей способствует морфогенезу C. albicans⁵⁷,^58,59,60, мы рассмотрели ли экзогенное добавление выбранной группы метаболитов кишечника (выявленные из предыдущих исследований in vitro) к содержимому cecal цеф-обработанных мышей повлияет на морфогенез C. albicans ex vivo. Предыдущая работа, выполненная лабораторией Thangamani, характеризовала метаболомический профиль гомогената cecal content, извлеченного из необработанных и обработанных антибиотиками мышей, выявляя значительные изменения в изобилии различных метаболитов в результате лечения антибиотиками, в частности, уменьшилось обилие вторичных желчных кислот и увеличилось^{изобилие углеводов 60.} Кроме того, это исследование показало, что вторичные желчные кислоты и карбоксилиновые кислоты подавляют развитие гифа, в то время как углеводы, включая глюкозу, способствуют гипальному морфогенезу C. albicans in vitro⁶⁰. Результаты показывают, что добавление обратно пула ингибирующие метаболиты кишечника, содержащие дезоксихолевая кислота (DCA, 0,5 мг/мл), литохолевая кислота (LCA, 0,1 мг/мл), пальмитальная кислота (0,1 мг/мл), р-толякетическая кислота (0,1 мг/мл), себациальная кислота (0,5 мг/мл), 2-метилбутриевая кислота (0,5 мг/мл) и молочная кислота (5 мг/мл) к cecal гомогенату цеф-обработанных мышей полностью ингибируют гипальный морфогенез ex vivo. С другой стороны, экзогенное добавление глюкозы (1 мг/мл) к cecal гомогенату цеф-обработанных мышей показало массивное hyphal развитие ex vivo (Рисунок 2B). В совокупности, эти выводы показывают, что добавление метаболитов кишечника обратно в cecal гомогенат цеф-обработанных мышей дифференциально регулирует морфогенез C. albicans, тем самым подтверждая предыдущие выводы in vitro. Эти результаты показывают, что метаболиты кишечника играют решающую роль в гипхал-морфогенезе C. albicans и понимание целей генов и сигнальных путей, модулированных этими метаболитами, поможет в разработке новых терапевтических подходов к профилактике и лечению инфекций C. albicans.

Рисунок 1: Ex vivo анализ, чтобы определить влияние лечения цефоперазона на C. Albicans гипхал морфогенез в содержимом кишечника. (A)Схема протокола наброски. (B) Антибиотико-обработанные (верхние панели) и необработаемые (нижние панели) содержимое кишечника были взяты из желудка, тонкого кишечника, cecums, и толстой кишки C57BL/6J мышей. Содержимое кишки, привитое C. albicans SC5314, инкубировался при 37 градусов по Цельсию в течение 4-20125 ч и окрашивается антителами C. albicans. Клетки были изображены при увеличении в 40 раз. Репрезентативные изображения показаны здесь. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Экзогенное добавление метаболитов кишечника к содержимому cecal от цеф-обработанных мышей на формировании гифа C. albicans ex vivo. (A)Схема протокола наброски. (B) Ингибирующие метаболиты кишечника, содержащие DCA (0,5 мг/мл), LCA (0,1 мг/мл), пальмитовую кислоту (0,1 мг/мл), р-толилакетическую кислоту (0,1 мг/мл), себаковую кислоту (0,5 мг/мл); 2-метилбутриновой кислоты (0,5 мг/мл) и молочной кислоты (5 мг/мл) или глюкозы (1 мг/мл) были добавлены обратно в cecal содержание cef-обработанных мышей, смешанные тщательно и инкубируется при 37 градусов по Цельсию в течение 15 минут для выполнения ex vivo hyphae анализа. Содержимое cecal, привитое C. albicans SC5314, инкубировался при 37 градусах цельсия в течение 4-20125 ч и окрашивается антителами C. albicans. Клетки были изображены при увеличении в 40 раз. Репрезентативные изображения показаны здесь. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Метод, описанный здесь представляет собой новый способ исследовать влияние антибиотиков, диетических, ксенобиотических и терапевтических воздействий на C. Albicans hyphal морфогенез в желудочно-кишечном тракте. Поскольку большинство системных инфекций происходят^{из желудочно-кишечного тракта 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34 и гифа} формирования является критическим фактором вирулентности, что способствует распространению C. альбиканы из желудочно-кишечного тракта, понимая факторы, которые контролируют этот морфогенез в желудочно-кишечном тракте расширит знания о механизмах патогенеза и определить новые варианты лечения.

Хотя представленный здесь метод является относительно простым, некоторые шаги, о них говорилось ниже, были определены как критические и важные. i) первоначальный инокулЬ C. albicans должен быть оптимальным, чтобы обеспечить как рост, так и гипальный морфогенез грибов. При ограниченной доступности питательных веществ в экстрактах гомогената кишечника, более высокий объем инокулума может значительно уменьшить грибковый рост и процесс морфогенеза. Тем не менее, рост различных клинических изолятов и штаммов, вероятно, будет переменной, таким образом, оптимизация времени инокуляции и инкубации для конкретных изолятов C. albicans имеет важное значение. ii) при подготовке экстракта гомогената кишечника было установлено, что при подготовке экстракта гомогената имеет решающее значение для как можно большего удаления мусора в кишечнике. iii) в связи с относительно низкой скоростью центрифугации (чтобы избежать повреждения гипхалных структур) необходимо позаботиться о том, чтобы избежать потери клеток во время иммуностепенингных мер в этом протоколе.

Альтернативные методы визуализации грибковых гифа в желудочно-кишечном тракте были использованы в прошлом, с определенными преимуществами и ограничениями, связанными с каждым методом. Один относительно заметный метод использования флуоресцентных на месте гибридизации (FISH) для визуализации грибковых гиф в желудочно-кишечном тракте был недавно продемонстрирован Witchley et al.^61,62. Это перспективный метод in vivo, доступный в настоящее время для обнаружения гифа C. albicans непосредственно в желудочно-кишечном тракте, однако сложность этого протокола затрудняет адаптацию его к быстрым, крупномасштабным первоначальным скрининг-исследованиям. Традиционные методы гистопатологии также были использованы в прошлом, чтобы оцифровать C. Albicans дрожжей и гифы формы в желудочно-кишечном тракте. Тем не менее, наблюдение и визуализация грибковых клеток с основной гистопатологии, и гематоксилин и эозин (H/E) пятна остается сложной задачей, так как многие стандартные методы фиксации имеют потенциал, чтобы нарушить слизистый слой образцов желудочно-кишечного тракта, часто повреждения гипальных структур в этом процессе и приводит к противоречивым сообщениям об относительном изобилии гипхальной морфологии клеток во время^{инфекции 63 , 64,65 , 65.} Этот метод был разработан, чтобы избежать повреждения гифы во время обработки для решения этой проблемы. Кроме того, ткани explants были использованы в качестве способа изучения биологических условий ex vivo, однако эти методы, как правило, сосредоточены и полезны для изучения присоединения или вторжения потенциал C. albicans⁶⁷, но и они обычно исключают большинство метаболомики и микробиома компонентов, которые способствуют in vivo патогенеза. Хотя протокол ex vivo описанный здесь не вполне имитирует в окружающей среде GI vivo как описано ранее^61,62, оно обеспечивает самые близкие возможные условия c. albicans встречает в окружающей среде кишки сравненной к методам in vitro используя искусственние условия роста.

Этот протокол может быть использован для основных анализов скрининга для выявления воздействия экологических сигналов в желудочно-кишечном тракте на гипхалморфез C. albicans. Этот метод позволяет быстро проверять большие группы соединений, включая ингибиторы малых молекул, новые антимикотики и метаболиты для развития гифаля, и может быть использован при скрининге терапевтического лечения или выявлении факторов риска системных заболеваний. Так как C. albicans колонизирует по всему желудочно-кишечному тракту, этот протокол будет дополнительно помогать в выявлении экологических сигналов, присутствующих в конкретных сегментах желудочно-кишечного тракта, которые контролируют гипхалморфез у лиц, принимающих антибиотики, химиотерапевтические агенты, и у пациентов с нарушениями обмена веществ, включая сахарный диабет. В конечном счете метод, описанный здесь, позволяет быстро охарактеризовать гипахал морфогенез в C. albicans по широкому кругу факторов окружающей среды таким образом, что является более биологически актуальным, чем нынешние методы in vitro и значительно быстрее и более ресурсоемким, чем нынешние методы in vivo.

Авторы не имеют конкурирующих финансовых интересов или других конфликтов интересов.

Авторы признают ресурсы и поддержку со стороны Среднего Запада университета сотовых и молекулярных основных научно-исследовательских объектов.