Method Article
مقايسة الجسم الحي السابق المذكورة في هذه الدراسة باستخدام مستخلصات التجانس الأمعاء وتلطيخ المناعة الفلوريس يمثل طريقة جديدة لدراسة التشكل الواصل من المبيضات albicans في الجهاز الهضمي. ويمكن استخدام هذه الطريقة للتحقيق في الإشارات البيئية التي تنظم التحول المورفوجينيك في القناة الهضمية.
المبيضات albicans الواصلة morphogenesi في الجهاز الهضمي (GI) يتم التحكم بإحكام من قبل مختلف الإشارات البيئية، ويلعب دورا هاما في نشر والعوامل المسببة للأمراض الفطرية الانتهازية. ومع ذلك، طرق لتصور هيفا الفطرية في الجهاز الهضمي في الجسم الحي هي التحدي الذي يحد من فهم الإشارات البيئية في السيطرة على عملية تكوين هذه المورفون. البروتوكول الموصوف هنا يوضح طريقة رواية ex vivo للتصور من المورفينجينيات الواصلة في مقتطفات متجانسة الأمعاء. باستخدام مقايسة الجسم الحي السابق ، توضح هذه الدراسة أن محتويات cecal من الفئران المعالجة بالمضادات الحيوية ، ولكن ليس من فئران التحكم غير المعالجة ، تعزز تولد الواصلة C. alphcans في محتوى الأمعاء. وعلاوة على ذلك، إضافة مجموعات محددة من الأيض الأمعاء مرة أخرى إلى محتويات cecal من الفئران المعالجة بالمضادات الحيوية ينظم بشكل تفاضلي الفرتال morphogenesis السابقين. يمثل هذا البروتوكول، الذي يُؤخذ معًا، طريقة جديدة لتحديد الإشارات البيئية التي تتحكم في التشكل الواصلي C. albicans في الجهاز الهضمي والتحقيق فيها.
المبيضات albicans هو الانتهازية ، متعدد الأشكال المسببة للأمراض الفطرية التي عادة ما تكون commensal ، ولكن يمكن أن تخضع لتغيير مورفولوجية في شكل خبيث قادر على التسبب في التهابات تهدد الحياة في الأفراد المناعة1،2،3،4،5،6،8،9،11،12،13. C. albicans هو السبب الرئيسي للعدوى الانسومية الجهازية، مع معدل وفيات 40\u201260٪ حتى مع العلاج المضاد للفطريات2،14،15. على الرغم من أن C. albicans يقيم في مختلف المنافذ المضيفة بما في ذلك الجهاز التناسلي الإناث16,17, تجويف الفم من الأفراد الأصحاء18 والجهاز الهضمي (GI) المسالك19,20, الغالبية العظمى من الالتهابات الجهازية تنشأ من الجهاز الهضمي وعلاوة على ذلك, وكثيرا ما أكد مصدر العدوى الجهازية أن الجهاز الهضمي21،22،23،24،25،26،27،28،29،30،31،32،33،34. C. تتأثر الإمراضية albicans في الجهاز الهضمي بمجموعة واسعة من العوامل; ومع ذلك ، فإن السمة الرئيسية الضرورية للوعاء هي الانتقال من مورفولوجيا خلية الخميرة إلى مورفولوجيا الخلايا الواصلة35،36،37،38،39،40،41،42،43،44. C. albicans التعلق والنشر من الجهاز الهضمي أثناء العدوى يرتبط بشدة مع قدرته على الانتقال من خميرة commensal إلى hyphae ضراوة، مما يسمح للفطريات أن تسبب الأمراض الغازية44،45،46،47،48،49،50،51،52،53.
مجموعة متنوعة من العوامل في الأمعاء، بما في ذلك ن أسيتيلغلوسكامين، تنظيم تشكيل الواصلة من قبل C. albicans . ولذلك، فمن الأهمية بمكان لتضييق الفجوة في المعرفة فيما يتعلق بتشكل الغشاء الواصل لهذا الممرض الفطري في الجهاز الهضمي54،55،56. تشير الأدلة الحديثة إلى أن مختلف الأيضات الأمعاء السيطرة بشكل تفاضلي في morphogenesis الواصلة من C. albicans في المختبر57,58,59,60. ومع ذلك، تشكل القيود التقنية قضايا عند محاولة دراسة تكوّن الأمعاء في عينات الأمعاء الحية في العينات، خاصة تلطيخ الخميرة وخلايا الواصلة والتحليل الكمي لتطوير الواصلة. لفهم C. albicans الواصلة morphogenesis في الجهاز الهضمي، تم تطوير طريقة فيفو السابق باستخدام مقتطفات قابلة للذوبان من محتوى الأمعاء المتجانسة من الفئران لدراسة تأثير الأيض على تكوين الواصلات الفطرية. استخدام عينات الأمعاء من الفئران التي هي مقاومة وعرضة لعدوى ج. albicans GI، وهذه الطريقة سوف تساعد على تحديد ودراسة تأثير الأيض والمضادات الحيوية وxenobiotics على تكوين الحمى الفطرية في الجهاز الهضمي.
تمت الموافقة على جميع بروتوكولات الحيوان من قبل جامعة الغرب الأوسط لجنة الرعاية الحيوانية المؤسسية واستخدام (IACUC) كما هو موضح قبل57. وافقت اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه في جامعة الغرب الأوسط على هذه الدراسة بموجب بروتوكول MWU IACUC #2894. وتتبع سياسات رعاية الحيوانات في وزارة المياه والحيوانات سياسة خدمات الصحة العامة بشأن الرعاية الإنسانية واستخدام الحيوانات المختبرية والسياسات المنصوص عليها في قانون رعاية الحيوان.
1. الفئران دراسة البروتوكول القياسي
2. إعداد الخميرة استخراج بيبتون ديكستروز (YPD) لوحات أجار
3. السابقين فيفو الإعدادية لم مقايسة الغشاء الواصل
4. إضافة خارجية من المستقلبات إلى مستخلصات الأمعاء المتجانسة لم مقايسة المورفينية الواصلية
5. C. albicans morphogenesis فحص (مناعة والتصوير)
هذه النتائج جنبا إلى جنب مع النتائج السابقة من مختبر ثانغاماني60 تشير إلى أنه عندما يتم زراعة C. albicans السابقين في مستخلصات تجانس الأمعاء مأخوذة من المعدة والأمعاء الدقيقة والأمعاء الغليظة من السيطرة غير المعالجة والفئران المعالجة بالمضادات الحيوية، C. albicans يتطور عموما مع مورفولوجيا الخميرة(الشكل 1B). ومع ذلك، عندما تزرع في مستخلص cecal من الفئران المعالجة بالمضادات الحيوية، C. albicans يخضع بسهولة morphogenesis، مما أدى إلى عينات تحتوي على الخميرة وأشكال hyphae (الشكل 1B); لا يحدث هذا في أجهزة الماوس التحكم. وهذا يدعم النتائج السابقة، والتي أظهرت زيادة كبيرة في أشكال hyphae في العينات التي تزرع في مستخلصات cecal المعالجة بالمضادات الحيوية، ولكن ليس في أي مستخلصات الأمعاء الأخرى المعالجة بالمضادات الحيوية60. وتشير هذه النتائج إلى أن العلاج بالمضادات الحيوية يسبب تغييرات في بيئة cecal، مما يؤدي إلى تكوين الغشاء الواصلي من C. albicans. بالإضافة إلى ذلك، فإن التعريب المحدد لهذا النمط الظاهري الذي لوحظ فقط في ال cecum يشير أيضًا إلى أن هذه الظروف المعززة للهيبا قد لا تكون موجودة بالضرورة في جميع أنحاء الجهاز الهضمي، ولكن بدلاً من ذلك تقتصر على أجزاء محددة من الجهاز الهضمي اعتمادًا على توافر العناصر الغذائية، المستقلبات والجزيئات الأخرى غير المعروفة.
منذ استخراج cecal الفئران المعالجة بالمضادات الحيوية يعزز morphogenesis من C. albicans57,58,59,60, درسنا ما إذا كانت إضافة خارجية لمجموعة مختارة من الأيض الأمعاء (التي تم تحديدها من الدراسات المختبرية السابقة) إلى محتوى cecal من الفئران cef المعالجة سوف تؤثر على تشكيل مورف من C. albicans ex vivo. وقد تميزت الأعمال السابقة التي قام بها مختبر ثانغاماني ملف تعريف الأيض من التجانس محتوى cecal المستخرجة من الفئران غير المعالجة والمضادات الحيوية، وكشف عن تغييرات كبيرة في وفرة من الأيض المختلفة نتيجة للعلاج بالمضادات الحيوية - على وجه التحديد، وانخفاض وفرة من الأحماض الصفراوية الثانوية وزيادة وفرة الكربوهيدرات60. وعلاوة على ذلك، حددت هذه الدراسة أن الأحماض الصفراوية الثانوية والأحماض الكربوكسيلية تمنع التنمية hyphae، في حين أن الكربوهيدرات بما في ذلك الجلوكوز، وتعزيز morphogenesi الواصلة من C. albicans في المختبر60. وتشير النتائج إلى أن إضافة إلى الوراء مجموعة من المستقلبات الأمعاء المثبطة التي تحتوي على حمض ديوكسيكوليك (DCA, 0.5 ملغ / مل), حمض ليثوخوليك (LCA, 0.1 ملغم /مليلتر), حمض البالمتيك (0.1 ملغ / مل), p-حمض السلال (0.1 ملغ / مل), حمض السيباسيك (0.5 ملغ / مل), 2 حمض الميثيلbutyric (0.5 ملغ / مل) ، وحمض اللاكتيك (5 ملغ / مل) إلى التجانس cecal من الفئران cef المعالجة تماما منعت الواصلة morphogenesis السابقين. من ناحية أخرى، إضافة خارجية من الجلوكوز (1 ملغ / مل) إلى التجانس cecal من الفئران cef المعالجة أظهرت تطوير الواصلة الضخمة ex vivo (الشكل 2B). بشكل جماعي ، تشير هذه النتائج إلى أن إضافة المستقلبات الأمعاء مرة أخرى إلى تجانس cecal من الفئران المعالجة cef ينظم بشكل تفاضلي morphogenesis من C. albicans ، وبالتالي تأكيد النتائج السابقة في المختبر. وتشير هذه النتائج إلى أن الأيضات الأمعاء تلعب دورا حاسما في التشكل الواصلي من C. albicans وفهم الأهداف الجينية وإشارات مسارات التضمين من قبل هذه الأيضات سوف تساعد في تطوير نهج علاجية جديدة لمنع وعلاج العدوى C. albicans.
الشكل 1: مقايسة الجسم الحي السابق لتحديد تأثير علاج cefoperazone على C. albicans الظهارة الواصلة مورفوجينسيس في محتويات الأمعاء. (A) مخطط بروتوكول التخطيطي. (ب)تم أخذ محتويات الأمعاء المعالجة بالمضادات الحيوية (الألواح العلوية) وغير المعالجة (الألواح السفلية) من المعدة والأمعاء الدقيقة وال cecums والأمعاء الغليظة للفئران C57BL/6J. تم احتضان محتويات الأمعاء الملقّح مع C. albicans SC5314 عند 37 درجة مئوية مقابل 4\u20125 ساعة وملطخة بالأجسام المضادة C. albicans. تم تصوير الخلايا في التكبير 40x. تظهر الصور التمثيلية هنا. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إضافة خارجية من المستقلبات الأمعاء لمحتويات cecal من الفئران المعالجة cef على تشكيل هيفاي من C. albicans السابقين فيفو. (A) مخطط بروتوكول التخطيطي. (ب) بركة مستقلبات الأمعاء المثبطة التي تحتوي على DCA (0.5 ملغ /مل), LCA (0.1 ملغ /مليلتر), حمض البالميتيك (0.1 ملغ/مل), p-tolylace acid (0.1 ملغ/مل), حمض sebacic (0.5 ملغ/مل); 2-حمض الميثيلbutyric (0.5 ملغ / مل), وحمض اللاكتيك (5 ملغ / مل) أو الجلوكوز (1 ملغ / مل) وأضيفت مرة أخرى إلى محتوى cecal من الفئران cef المعالجة, مختلطة جيدا ومحتضنة في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لتنفيذ اختبار الهينة الكفو ex. محتويات Cecal تلقيح مع C. albicans SC5314 كانت محتضنة في 37 درجة مئوية ل 4\u20125 ح وملطخة مع الأجسام المضادة albicans C. تم تصوير الخلايا في التكبير 40x. تظهر الصور التمثيلية هنا. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الطريقة الموصوفة هنا تقدم طريقة جديدة للتحقيق في تأثير المضادات الحيوية، والآثار الغذائية، وxenobiotic والعلاجية على C. albicans الهضاب المورفيجن في الجهاز الهضمي. منذ غالبية الالتهابات الجهازية تنشأ من الجهاز الهضمي21،22،23،24،25،26،27،28،29،30،31،32،33،34 ، تشكيل hyphae هو عامل الفوعة الحرجة التي تعزز نشر C. albicans من الجهاز الهضمي ، وفهم العوامل التي تتحكم في هذا morphogenesis في الجهاز الهضمي توسيع المعرفة حول آليات التسبب في الأمراض وتحديد خيارات العلاج جديدة.
10 - وفي حين أن الطريقة المعروضة هنا واضحة نسبيا، فإن بعض الخطوات التي نوقشت أدناه قد حددت بوصفها خطوات حاسمة وهامة. '1' ينبغي أن يكون الإبوكولوم الأولي للفوسفات الـ C. albicans الأمثل للسماح بنمو الفطريات وتشكلها الواصلة. مع محدودية توافر المواد الغذائية في مستخلصات الأمعاء المتجانسة، قد يقلل حجم أكبر من الإنوكولوم بشكل كبير من النمو الفطري وعملية تكوين المورفين. ومع ذلك، فإن نمو العزلات السريرية المختلفة والسلالات من المرجح أن تكون متغيرة، وبالتالي تحسين وقت الحضانة وحضانة معينة C. albicans عزل أمر ضروري. '2' تبين أن خطوات الطرد المركزي المتعددة عند إعداد مستخلصات الأمعاء المتجانسة هي خطوات حاسمة لإزالة الحطام الموجود في محتويات الأمعاء قدر الإمكان. '3' نظراً للسرعة المنخفضة نسبياً للطرد المركزي (لتجنب تلف الهياكل الواصلة)، يجب توخي الحذر لتجنب فقدان الخلايا أثناء خطوات الاحتواء المناعي في هذا البروتوكول.
وقد استخدمت أساليب بديلة لتصور هيفا الفطرية في الجهاز الهضمي في الماضي، مع بعض المزايا والقيود المرتبطة بكل طريقة. وقد أظهرت مؤخرا طريقة واحدة بارزة نسبيا باستخدام التهجين الفلورسنت في الموقع (FISH) لتصور hyphae الفطرية في الجهاز الهضمي من قبل Witchleyوآخرون. 61،62. هذا هو واعد في طريقة vivo المتاحة حاليا للكشف عن hyphae C. albicans مباشرة في الجهاز الهضمي، ولكن تعقيد هذا البروتوكول يجعل من الصعب تكييفها مع دراسات الفحص الأولية السريعة واسعة النطاق. كما استخدمت أساليب علم الأنسجة التقليدية في الماضي لإضفاء الحيوية على الخميرة وhyphae C. albicans أشكال في الجهاز الهضمي. ومع ذلك ، فإن الملاحظة والتصوير للخلايا الفطرية مع علم الأنسجة الهستوولوجي الأساسي ، و البقع الهماتوسيلين و Eosin (H / E) لا تزال صعبة ، حيث أن العديد من طرق التثبيت القياسية لديها القدرة على تعطيل الطبقة المخاطية لعينات المسالك الهضمية ، وغالبا ما تضر بهياكل الواصل في العملية وتؤدي إلى تقارير متناقضة حول الوفرة النسبية لتحول الخلايا الواصلة خلال العدوى63،64،65،66. وقد تم تطوير هذه الطريقة لتجنب تلف الهين أثناء المعالجة لمعالجة هذه المسألة. بالإضافة إلى ذلك، وقد استخدمت explants الأنسجة كوسيلة لدراسة الظروف البيولوجية السابق vivo، ولكن هذه الأساليب عموماً مركزة ومفيدة لدراسة الالتزام أو الغزو المحتملة من C. albicans67، ولكن أيضا أنها تستبعد عموماً غالبية مكونات المستقلبومي والميكروبيوم التي تساهم في التسبب في أمراض الجسم الحي. على الرغم من أن البروتوكول السابق vivo الموصوف هنا لا يحاكي تماما في بيئة GI الجسم الحي كما هو موضح سابقا61،62، فإنه يوفر أقرب الظروف الممكنة التي يواجهها C. albicans في بيئة الأمعاء بالمقارنة مع الأساليب في المختبر باستخدام ظروف النمو الاصطناعي.
يمكن استخدام هذا البروتوكول للفحص الأساسي لتحديد تأثير الإشارات البيئية في الجهاز الهضمي على الفروغينات الضمانية C. alphcans. هذه الطريقة تسمح لمجموعات كبيرة من المركبات بما في ذلك مثبطات جزيء صغير، مضادة الميكيكوtic الجديدة، و المستقلبات ليتم فحصها بسرعة لتطوير الواصلة، ويمكن استخدامها في فحص العلاجات العلاجية أو تحديد عوامل الخطر للأمراض الجهازية. منذ C. albicans استعمار في جميع أنحاء الجهاز الهضمي، وهذا البروتوكول سوف تساعد في تحديد الإشارات البيئية الموجودة في أجزاء محددة من الجهاز الهضمي التي تتحكم في الحمى الواصلة مورفوجينسيس في الأفراد الذين يتناولون المضادات الحيوية، وكلاء العلاج الكيميائي، وفي المرضى الذين يعانون من اضطرابات التمثيل الغذائي بما في ذلك داء السكري. في نهاية المطاف الأسلوب الموصوف هنا يسمح للتوصيف السريع لmorphogenesi الواصلة في C. albicans على مجموعة واسعة من العوامل البيئية بطريقة أكثر أهمية بيولوجيا من الطرق الحالية في المختبر وأسرع بكثير وأكثر كفاءة في الموارد من الحالية في أساليب الجسم الحي.
ولا يملك أصحاب البلاغ مصالح مالية متنافسة أو تضارباً آخر في المصالح.
الكتاب الاعتراف الموارد والدعم من جامعة الغرب الأوسط الخلوية والجزيئية مرفق البحوث الأساسية.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1 - 10 µL Pipet Tips | Fisher Scientific | 02-707-454 | Misc |
100 - 1000 µL Pipet Tips | Fisher Scientific | 02-707-400 | Misc |
20 - 200 µL Pipet Tips | Fisher Scientific | 02-707-451 | Misc |
2-methylbutyric acid | Sigma | 193070-25G | hyphal-inhibitory compound |
488 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen (Fisher) | A11008 | IF Staining secondary ab |
Agar | Fisher | BP1423-500 | YPD agar component |
Automated Imaging Microscope | Keyence | BZX700 | |
Candida Albicans Antibody | Invitrogen (Fisher) | PA1-27158 | IF Staining primary ab |
cefoperazone | Cayman | 16113 | antibiotic |
deoxycholic acid | Sigma | 30960 | hyphal-inhibitory compound |
D-Glucose | Fisher | D16-500 | hyphal-promoting compound |
forceps | Fisher | 08-885 | |
lactic acid | Alfa Aesar | AAAL13242-06 | hyphal-inhibitory compound |
lithocholic acid | Sigma | L6250-10G | hyphal-inhibitory compound |
palmitic acid | Sigma | P5585-10G | hyphal-inhibitory compound |
Paraformaldehyde | Alfa Aesar | A11313 | IF Staining fixative |
Phosphate-buffered saline (PBS), 10x | Alfa Aesar | J62692 | PBS component |
p-tolylacetic acid | SCBT | sc-257959 | hyphal-inhibitory compound |
sebacic acid | Sigma | 283258-250G | hyphal-inhibitory compound |
sharp ended scissors | Fisher | 28301 | |
sterile Milli-Q water | N/A | N/A | Misc |
YPD Broth | BD Biosciences | 242810 | YPD agar component |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved