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Resumen

El ensayo ex vivo descrito en este estudio utilizando extractos de homogeneización intestinal y tinción de inmunofluorescencia representa un método novedoso para examinar la morfogénesis hifágica de Candida albicans en el tracto gastrointestinal. Este método se puede utilizar para investigar las señales ambientales que regulan la transición morfogenética en el intestino.

Resumen

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) está estrechamente controlada por varias señales ambientales, y desempeña un papel importante en la difusión y patogénesis de este patógeno fúngico oportunista. Sin embargo, los métodos para visualizar las hifas fúngicas en el tracto gastrointestinal in vivo son desafiantes, lo que limita la comprensión de las señales ambientales en el control de este proceso de morfogénesis. El protocolo descrito aquí demuestra un novedoso método ex vivo para la visualización de la morfogénesis hifal en extractos de homogeneización intestinal. Utilizando un ensayo ex vivo, este estudio demuestra que el contenido de cecal de ratones tratados con antibióticos, pero no de ratones de control no tratados, promueven la morfogénesis hiphal de C. albicans en el contenido intestinal. Además, la adición de grupos específicos de metabolitos intestinales al contenido de cecal de ratones tratados con antibióticos regula diferencialmente la morfogénesis hifílo ex vivo. En conjunto, este protocolo representa un método novedoso para identificar e investigar las señales ambientales que controlan la morfogénesis hipófrica de C. albicans en el tracto gastrointestinal.

Introducción

Candida albicans es un patógeno fúngico oportunista y polimórfico que normalmente es commensal, pero puede sufrir un cambio morfológico en una forma virulenta capaz de causar infecciones potencialmente mortales en individuos inmunocomprometidos1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. C. albicans es una de las principales causas de infecciones nosocomiales sistémicas, con una tasa de mortalidad de 40-u201260% incluso con tratamiento antifúngico2,14,15. Aunque C. albicans reside en diferentes nichos de acogida, incluido el sistema reproductivo femenino16,17, la cavidad oral de individuos sanos18 y el tracto gastrointestinal (GI)19,20, la mayoría de las infecciones sistémicas se originan en el tracto gastrointestinal y, además, la fuente de infección sistémica se confirma a menudo como el tracto gastrointestinal21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34. C. patogenicidad albicans en el tracto gastrointestinal está influenciado por una amplia gama de factores; sin embargo, una característica importante necesaria para la virulencia es la transición de una morfología celular de levadura a una morfología celular hiphal virulenta35,36,37,38,39,40,41,42,43,44. C. El apego y la difusión de los hongos del tracto gastrointestinal durante la infección está altamente asociado con su capacidad de transición de una levadura commensal a hifas virulentas, permitiendo que los hongos causen enfermedades invasivas44,45,46,47,48,49,50,51,52,53.

Una variedad de factores en el intestino, incluyendo n-acetilglucosamina, regular la formación de hiphal por C. albicans. Por lo tanto, es crucial reducir la brecha en el conocimiento con respecto a la morfogénesis hifal de este patógeno fúngico en el tracto gastrointestinal54,55,56. La evidencia reciente indica que varios metabolitos intestinales controlan diferencialmente la morfogénesis hifral de C. albicans in vitro57,58,59,60. Sin embargo, las limitaciones técnicas presentan problemas al intentar estudiar la formación de las hifas de C. albicans en muestras intestinales in vivo, especialmente la tinción de células de levadura e hifas y el análisis cuantitativo del desarrollo hiphal. Para entender la morfogénesis hifrética de C. albicans en el tracto gastrointestinal, se desarrolló un método ex vivo utilizando extractos solubles de contenido intestinal homogeneizado de ratones para estudiar el efecto de los metabolitos en la morfogénesis hipófológica fúngica. Utilizando muestras intestinales de ratones que son resistentes y susceptibles a la infección por C. albicans GI, este método ayudará a identificar y estudiar el efecto de metabolitos, antibióticos y xenobióticos en la morfogénesis hipófológica fúngica en el tracto gastrointestinal.

Protocolo

Todos los protocolos de animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad del Medio Oeste (IACUC) como se describió antesdel 57. El Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad del Medio Oeste aprobó este estudio bajo el Protocolo MWU IACUC #2894. Las políticas de cuidado animal de MWU siguen la Política del Servicio de Salud Pública (PHS) sobre cuidado y uso humano de animales de laboratorio y las políticas establecidas en la Ley de Bienestar Animal (AWA).

1. Los ratones estudian el protocolo estándar

  1. Utilice ratones C57BL/6J machos y hembras de al menos seis semanas de edad. Suplementarlos con agua estéril con o sin cefoperazona (0,5 mg/ml).
    1. Co-casa de ratones en grupos de 5, con cada jaula que contiene todos los ratones macho o hembra. Proporcione a los ratones comida de ratón estándar y agua (a través de una botella de 400 ml) en todo momento.
    2. Revise las jaulas diariamente para asegurarse de que los niveles de alimentos y agua sean suficientes, y para examinar a los ratones en busca de signos de angustia.
  2. Sustituya el agua por cefoperazona cada 48 h para asegurarse de que se suministra antibiótico fresco independientemente del agua restante en las botellas de alimentación de la jaula.
  3. Después de 5 días de tratamiento con cefoperazona, eutanasia a los ratones a través de la asfixia porCO2 observando el protocolo establecido de la IACUC. Confirme la muerte por luxación cervical.
  4. Disecciona ratones usando tijeras afiladas esterilizadas con autoclave y fórceps esterilizadas con autoclave.
    1. Después de la eutanasia, fije el animal a una superficie de disección fijando todas las extremidades de tal manera que el abdomen esté expuesto.
    2. Rocíe la región abdominal con 70% de etanol para evitar que el pelaje se pegue a fórceps, tijeras o secciones intestinales durante la disección.
    3. Usa fórceps para pellizcar y levantar una sección de la piel en la base del abdomen y crea una pequeña incisión a través de la piel y la fascia subyacente usando tijeras. Tenga mucho cuidado al hacer esta incisión para evitar perforar el cecum o la pared intestinal.
    4. Extienda este corte a la caja torácica, exponiendo parcialmente la cavidad peritoneal. Haga un corte comenzando en el punto de la incisión inicial a cada lado extendiéndose hacia arriba y lateralmente.
    5. Tire de estas aletas lateralmente y ancle a la superficie de disección para exponer completamente la cavidad peritoneal.
  5. Extraer el tracto gastrointestinal usando fórceps, mientras que el uso de tijeras para hacer cortes superiores al estómago y en la región distal del intestino grueso para asegurar la recolección de la mayor cantidad de contenido intestinal de cada sección.
  6. Al retirar el tracto gastrointestinal, tenga cuidado de evitar la rotura de los componentes individuales. Separe el estómago, el intestino delgado, el cecum y el intestino grueso individualmente usando tijeras en sus extremos proximal y distal.
  7. Para la recolección de cada contenido intestinal de cada sección, haga una sola incisión en el extremo distal de cada sección usando tijeras, seguida de expulsar manualmente el contenido intestinal en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml utilizando fórceps.
  8. Almacene el contenido intestinal a -80 oC para ensayos ex vivos.

2. Preparación de placas de agar de extracto de levadura-peptona-dextrosa (YPD)

  1. A una botella de vidrio de 1 L añadir 25 g de extracto de levadura de caldo de peptona-dextrosa en polvo, 10 g de agar, y agua ultrapura a un volumen final de 500 mL.
  2. Autoclave a 121 oC durante 30 min en un ciclo de líquido para esterilizar el medio.
  3. Bajo una capucha de flujo laminar, vierta aproximadamente 20 ml de medios de agar en una placa petri estéril. 500 ml de soporte de agar deben producir aproximadamente 25 placas.
  4. Almacene las placas a 4oC hasta que estén listas para su uso.

3. Preparación ex vivo para el ensayo de morfosis hifígena

  1. Raya un nuevo cultivo de C. albicans SC5314 en una placa de agar YPD e incuba durante la noche a 30oC.
  2. Escoja de dos a tres colonias individuales de tamaño mediano del cultivo de C. albicans SC5314 cultivado durante la noche y vuelva a suspender en 1 ml de solución salina tamponada de fosfato (PBS).
  3. Recuperar el contenido del intestino congelado del congelador de -80 oC y descongelar a 25 oC.
  4. Pesar alrededor de 150 mg de contenido intestinal en un nuevo tubo de 1,5 ml.
  5. Re-suspender el contenido intestinal con 150 s de PBS (contenido intestinal y PBS en una relación peso-volumen de 1:1).
  6. Vórtice a alta velocidad durante 30 s para homogeneizar el contenido intestinal y dejar reposar a temperatura ambiente durante aproximadamente un minuto.
  7. Centrifugar los homogeneizas a 1000 x g durante 3 min.
  8. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 ml.
  9. Repita los pasos 3.7 y 3.8 para eliminar todos los residuos del sobrenadante.
  10. Añadir 10 l del inóculo C. albicans SC5314 preparado arriba a este sobrenadante
  11. Mezclar bien e incubar a 37oC durante 4 a 5 h.

4. Adición exógena de metabolitos a los extractos de homogeneato intestinal para el ensayo de morfosis hifígena

  1. Recuperar el contenido intestinal congelado del congelador de -80 oC y volver a suspenderlo en PBS a una relación 1:1 (peso: volumen).
  2. Añadir la concentración deseada de metabolitos intestinales al contenido intestinal y la mezcla de PBS.
  3. Vórtice a alta velocidad durante 30 s para homogeneizar el contenido intestinal que contiene metabolitos y permitir sentarse a temperatura ambiente durante unos 10 min.
  4. Centrifugar los homogeneizas a 1000 x g durante 3 min.
  5. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 ml. Repita los pasos 4.4 y 4.5 para eliminar todos los residuos del sobrenadante.
  6. Añadir 10 l del inóculo C. albicans SC5314 preparado arriba a este sobrenadante. Mezclar bien e incubar a 37oC durante 4 a 5 h.

5. C. Ensayo de morfogénesis de C. albicans (inmunosu manchado e imágenes)

  1. Centrifugar las muestras a 1000 x g durante 2 min y deseche el sobrenadante a través de pipeteo.
  2. Fijar las muestras en 100 l de 2% de paraformaldehído (PFA) durante 15 min.
  3. Centrifugar a 1000 x g durante 2 min y deseche el sobrenadante a través de pipeteo.
  4. Lave las muestras dos veces con 1 ml de PBS. Para lavar las muestras, vuelva a suspender el pellet en PBS pipeteando suavemente. No vórtice la muestra, ya que esto puede dañar las estructuras hiphales. Después de la re-suspensión, centrifugar a 1000 x g durante 2 minutos y deseche el sobrenadante a través de pipeteo.
  5. Incubar las muestras a temperatura ambiente en 100 ml de PBS que contenga anticuerpo policlonal C. albicans (1:100 dilución) durante 30 min.
  6. Lave las muestras tres veces con 1 ml de PBS.
    NOTA: Cuando se utiliza un anticuerpo fluorescente, se recomienda que todos los pasos de dilución y lavado se realicen con poca luz para evitar el blanqueo fotográfico y mejorar la longevidad de la muestra.
  7. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 15 minutos en 100 ml de PBS que contenga anticuerpos anti-Rabbit IgG Alexafluor 488 a 1:500 dilución. Realice la incubación en un cajón oscuro o habitación para evitar el blanqueo fotográfico.
  8. Lave las muestras tres veces con 1 ml de PBS.
  9. Vuelva a suspender las muestras en 100 oL de PBS y transfiera a una placa de 96 pocillos para la toma de imágenes.
    NOTA: Cuando no se está tomando una imagen, se recomienda que la placa de 96 pozos se envuelva en papel de aluminio para evitar el blanqueo fotográfico.
  10. Imagen de células fúngicas utilizando lentes objetivo 20x y 40x utilizando un microscopio de imágenes de fluorescencia. Utilice un filtro de proteína fluorescente verde (GFP) (longitud de onda de excitación 470/40 y longitud de onda de emisión 525/50) para detectar la fluorescencia.

Resultados

Estos resultados junto con los hallazgos anteriores del laboratorio Thangamani60 indican que cuando C. albicans se cultiva ex vivo en extractos de homogeneato intestinal tomados del estómago, intestino delgado e intestino grueso de control no tratado y ratones tratados con antibióticos, C. albicans generalmente se desarrolla con una morf levaduraología (Figura 1B). Sin embargo, cuando se cultiva en el extracto de cecal de ratones tratados con antibióticos, C. albicans se somete fácilmente a la morfogénesis, dando como resultado muestras que contienen formas de levadura e hifas (Figura 1B); esto no ocurre en ratones de control. Esto apoya los resultados anteriores, que mostraron un aumento significativo en las formas de hifas en muestras cultivadas en extractos de cecal tratados con antibióticos, pero no en ningún otro extracto intestinal tratado con antibióticos60. Estos resultados sugieren que el tratamiento con antibióticos causa cambios en el entorno cecal, que inducen morfogénesis hifífala de C. albicans. Además, la localización específica de este fenotipo que sólo se nota en el cecum también sugiere que estas condiciones de promoción de hifas pueden no estar necesariamente presentes en todo el tracto gastrointestinal, sino que se limitan a segmentos específicos del tracto gastrointestinal dependiendo de la disponibilidad de nutrientes, metabolitos y otras moléculas desconocidas.

Dado que el extracto cecal de ratones tratados con antibióticos promueve la morfogénesis de C. albicans57,58,59,60, examinamos si la adición exógena de un grupo seleccionado de metabolitos intestinales (identificados a partir de estudios in vitro anteriores) al contenido cecal de ratones tratados con cef afectará a la morfogénesis de C. albicans ex vivo. El trabajo previo realizado por el laboratorio de Thangamani ha caracterizado el perfil metabolómico del homogeneizado de contenido cecal extraído de ratones no tratados y tratados con antibióticos, revelando cambios significativos en la abundancia de diversos metabolitos como resultado del tratamiento con antibióticos, específicamente, la disminución de la abundancia de ácidos biliares secundarios y el aumento de la abundancia de carbohidratos60. Además, este estudio identificó que los ácidos biliares secundarios y los ácidos carboxílicos inhiben el desarrollo de hifas, mientras que los carbohidratos incluyendo la glucosa, promueven la morfogénesis hifal de C. albicans in vitro60. Los resultados indican que la adición de un grupo de metabolitos intestinales inhibitorios que contienen ácido desoxicólico (DCA, 0,5 mg/ml), ácido litoólico (LCA, 0,1 mg/ml), ácido palmítico (0,1 mg/ml), ácido p-tolylacetic (0,1 mg/ml), ácido sebáceo (0,5 mg/ml), 2-ácido metilbutírico (0,5 mg/ml) y ácido láctico (5 mg/ml) al homogeneato cecal de ratones tratados con cef inhibió completamente la morfogénesis hifía ex vivo. Por otro lado, la adición exógena de glucosa (1 mg/ml) al homogeneato cecal de ratones tratados con cef mostró un desarrollo hiphal masivo ex vivo (Figura 2B). En conjunto, estos hallazgos indican que la adición de metabolitos intestinales al homogeneato cecal de los ratones tratados con cef regula diferencialmente la morfogénesis de C. albicans, confirmando así hallazgos in vitro anteriores. Estos resultados indican que los metabolitos intestinales desempeñan un papel crítico en la morfogénesis hifígena de C. albicans y la comprensión de las dianas genéticas y las vías de señalización moduladas por estos metabolitos ayudará en el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos para prevenir y tratar las infecciones por C. albicans.

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Figura 1: Ensayo ex vivo para determinar el efecto del tratamiento de cefoperazona en C. albicans morfogénesis hifílica en el contenido intestinal. (A) Esquema de protocolo. (B) El contenido intestinal tratado con antibióticos (paneles superiores) y no tratado (paneles inferiores) se tomó de los estómagos, intestinos delgados, cecums y intestinos gruesos de ratones C57BL/6J. El contenido de la tripa inoculado con C. albicans SC5314 se incuba a 37 oC durante 4-u20125 h y se tiñe con anticuerpo C. albicans. Las células fueron se imaginaron con un aumento de 40x. Las imágenes representativas se muestran aquí. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Adición exógena de metabolitos intestinales al contenido de cef de ratones tratados con cef en la formación de hifas de C. albicans ex vivo. (A) Esquema de protocolo. (B) Grupo de metabolitos intestinales inhibitorios que contienen DCA (0,5 mg/ml), LCA (0,1 mg/ml), ácido palmítico (0,1 mg/ml), ácido p-tolacetic (0,1 mg/ml), ácido sebácico (0,5 mg/ml); 2-ácido metilbutírico (0,5 mg/ml), y ácido láctico (5 mg/ml) o glucosa (1 mg/ml) se añadieron de nuevo al contenido de cef-tratados, mezclados a fondo e incubados a 37 oC durante 15 min para llevar a cabo el ensayo de hifas ex vivo. El contenido de Cecal inoculado con C. albicans SC5314 se incuba a 37 oC durante 4-u20125 h y se tiñe con anticuerpo C. albicans. Las células fueron se imaginaron con un aumento de 40x. Las imágenes representativas se muestran aquí. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

El método descrito aquí presenta una forma novedosa de investigar el efecto de los impactos antibiótico, dietético, xenobiótico y terapéutico en la morfogénesis hiphal de C. albicans en el tracto gastrointestinal. Dado que la mayoría de las infecciones sistémicas se originan en el tracto gastrointestinal21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34 y la formación de hifas es un factor de virulencia crítica que promueve la difusión de C. albicans del tracto gastrointestinal, la comprensión de los factores que controla esta morfogénesis en el tracto gastrointestinal ampliará el conocimiento sobre los mecanismos de patogénesis e identificará nuevas opciones de tratamiento.

Si bien el método presentado aquí es relativamente sencillo, ciertos pasos que se describen a continuación se identificaron como críticos e importantes. (i) El inóculo inicial de C. albicans debe ser óptimo para permitir tanto el crecimiento como la morfogénesis hifílica de los hongos. Con la disponibilidad limitada de nutrientes en los extractos de homogeneización intestinal, mayor volumen de inóculo puede reducir significativamente el crecimiento de hongos y el proceso de morfogénesis. Sin embargo, es probable que el crecimiento de diferentes aislados clínicos y cepas sea variable, optimizando así el inóculo y el tiempo de incubación para aislados específicos de C. albicans es esencial. (ii) Múltiples pasos de centrifugación al preparar el extracto de homogeneato intestinal fueron encontrados cruciales para eliminar los residuos en el contenido intestinal tanto como sea posible. (iii) Debido a la velocidad relativamente baja de la centrifugación (para evitar dañar las estructuras hifrales), se debe tener cuidado para evitar la pérdida de células durante las medidas de inmunostaining en este protocolo.

En el pasado se han utilizado métodos alternativos para visualizar las hifas fúngicas en el tracto gastrointestinal, con ciertas ventajas y limitaciones asociadas con cada método. Un método relativamente notable utilizando hibridación fluorescente in situ (FISH) para visualizar hifas fúngicas en el tracto gastrointestinal ha sido demostrado recientemente por Witchley et al.61,62. Este es un método in vivo prometedor actualmente disponible para detectar C. albicans hifae directamente en el tracto gastrointestinal, sin embargo, la complejidad de este protocolo hace que sea difícil adaptarlo a estudios de cribado iniciales rápidos y a gran escala. Métodos tradicionales de histopatología también se han utilizado en el pasado para vitalizar C. albicans levadura y formas de hifas en el tracto gastrointestinal. Sin embargo, la observación y la toma de imágenes de células fúngicas con histopatología básica, y las manchas de Hematoxilina y Eosina (H/E) siguen siendo un reto, ya que muchos métodos de fijación estándar tienen el potencial de interrumpir la capa mucosa de las muestras del tracto gastrointestinal, a menudo dañando las estructuras hiphales en el proceso y dando lugar a informes contradictorios sobre la abundancia relativa de morfología de células hifáricas durante la infección63,64,65,66. Este método fue desarrollado para evitar daños a las hifas durante el procesamiento para abordar este problema. Además, los explantes de tejidos se han utilizado como una forma de examinar las condiciones biológicas ex vivo, sin embargo estos métodos son generalmente enfocados y útiles para examinar la adherencia o el potencial de invasión de C. albicans67,pero también generalmente excluyen la mayoría de los metabolómicos y componentes del microbioma que contribuyen a la patogénesis in vivo. Aunque el protocolo ex vivo descrito aquí no imita completamente el entorno GI in vivo como se describió anteriormente61,62, proporciona las condiciones más cercanas posibles que C. albicans encuentra en el entorno intestinal en comparación con los métodos in vitro utilizando condiciones de crecimiento artificial.

Este protocolo se puede utilizar para ensayos de cribado básicos para identificar el impacto de las señales ambientales en el tracto gastrointestinal en la morfogénesis hifrética de C. albicans. Este método permite que grandes grupos de compuestos, incluidos inhibidores de moléculas pequeñas, nuevos antimicóticos y metabolitos, se tomografías rápidamente para el desarrollo de la hipófala, y podría utilizarse en la detección de tratamientos terapéuticos o la identificación de factores de riesgo de enfermedad sistémica. Dado que C. albicans coloniza a lo largo del tracto gastrointestinal, este protocolo ayudará aún más a identificar las señales ambientales presentes en los segmentos específicos del tracto gastrointestinal que controlan la morfogénesis hifal en individuos que toman antibióticos, agentes quimioterápicos y en pacientes con trastornos metabólicos como la diabetes mellitus. En última instancia, el método descrito aquí permite una caracterización rápida de la morfogénesis hifígena en C. albicans en una amplia gama de factores ambientales de una manera que es más biológicamente relevante que los métodos in vitro actuales y es sustancialmente más rápida y eficiente en los recursos que los métodos in vivo actuales.

Divulgaciones

Los autores no tienen intereses financieros competidores u otros conflictos de intereses.

Agradecimientos

Los autores reconocen los recursos y el apoyo de la central de investigación de núcleos celulares y moleculares de la Universidad del Medio Oeste.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
1 - 10 µL Pipet TipsFisher Scientific02-707-454Misc
100 - 1000 µL Pipet TipsFisher Scientific02-707-400Misc
20 - 200 µL Pipet TipsFisher Scientific02-707-451Misc
2-methylbutyric acidSigma193070-25Ghyphal-inhibitory compound
488 goat anti-rabbit IgGInvitrogen (Fisher)A11008IF Staining secondary ab
AgarFisherBP1423-500YPD agar component
Automated Imaging MicroscopeKeyenceBZX700
Candida Albicans AntibodyInvitrogen (Fisher)PA1-27158IF Staining primary ab
cefoperazoneCayman16113antibiotic
deoxycholic acidSigma30960hyphal-inhibitory compound
D-GlucoseFisherD16-500hyphal-promoting compound
forcepsFisher08-885
lactic acidAlfa AesarAAAL13242-06hyphal-inhibitory compound
lithocholic acidSigmaL6250-10Ghyphal-inhibitory compound
palmitic acidSigmaP5585-10Ghyphal-inhibitory compound
ParaformaldehydeAlfa AesarA11313IF Staining fixative
Phosphate-buffered saline (PBS), 10xAlfa AesarJ62692PBS component
p-tolylacetic acidSCBTsc-257959hyphal-inhibitory compound
sebacic acidSigma283258-250Ghyphal-inhibitory compound
sharp ended scissorsFisher28301
sterile Milli-Q waterN/AN/AMisc
YPD BrothBD Biosciences242810YPD agar component

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