Endojen IRF5 Dimerizasyon Yerli Poliakrilamid Jel Elektroforez İmmünblot Analizi

CAL-1 plazmasitoid dendritik hücre hattında endojen interferon düzenleyici faktör 5 dimerizasyon analizi için bir yerli Batı leke yöntemi tanımlanmıştır. Bu protokol diğer hücre satırlarına da uygulanabilir.

İnterferon düzenleyici faktör 5 (IRF5) bağışıklık yanıtını düzenleyen önemli bir transkripsiyon faktörüdür. Toll benzeri reseptör miyeloid diferansiyasyon primer yanıt geni 88 (TLR-MyD88) sinyal yolu aşağı aktive edilir. IRF5 aktivasyonu fosforilasyon içerir, dimerizasyon, ve çekirdek içine sitoplazma sonraki translokasyon, hangi sırayla çeşitli pro-inflamatuar sitokinlerin gen ekspresyonuna neden olur. IRF5 aktivasyonu için bir algılama tayini IRF5 fonksiyonları ve ilgili yolları incelemek için gereklidir. Bu makalede, CAL-1 insan plazmasitoid dendritik hücre (pDC) hattında endojen IRF5 aktivasyonunu saptamak için sağlam bir teşp açıklanmaktadır. Protokol, IRF5'i monomer ve dimer formlarında ayırt edebilen modifiye nondenaturing elektroforez testinden oluşur ve böylece IRF5 aktivasyonunu analiz etmek için uygun maliyetli ve hassas bir yaklaşım sağlar.

İnterferon düzenleyici faktör 5 (IRF5) bağışıklık yanıtının düzenlenmesinde önemli bir rol oynayan önemli bir transkripsiyon düzenleyicisidir, özellikle pro-inflamatuar sitokinlerin ve tip I interferansların (IFNs) 1^{,2 ,3}. IRF5'in yanlış regülasyonu, sistemik lupus eritematozus, multipl skleroz, romatoid artrit,^vb.ile ilişkili IRF5 lokusundaki çeşitli polimorfizmler ile belirgin olarak, çok sayıda otoimmün hastalıkta katkıda bulunan bir^{faktördür. 5,6,7},^8,9,10. Bu nedenle, endojen IRF5 aktivasyon durumu için sağlam bir algılama analizi fizyolojik olarak ilgili hücresel bağlamda IRF5 düzenleyici yolları ve downstream etkilerini anlamak için çok önemlidir.

IRF5, monositler, dendritik hücreler (DC), B hücreleri ve makrofajlar 1^,11ile ifade edilir. Diğer IRF aile transkripsiyon faktörlerinde olduğu gibi, IRF5 gizli durumunda sitoplazmada bulunur. Aktivasyon üzerine, IRF5 fosforile edilir ve homodimerler oluşturur, bu da daha sonra çekirdeğe dönüşür ve tip I IFN'leri ve pro-inflamatuar sitokinleri kodlayan genlerin belirli düzenleyici unsurlarına bağlanır ve sonunda bu genlerin ekspresyonunu indükler^{1 ,2,11,12,13}. IRF5 çeşitli Toll benzeri reseptörlerin (TLR), TLR 7, TLR 8 ve TLR 9, endozos lokalize ve sinyal 1 için MyD88 kullanın gibi doğuştan gelen bağışıklık yanıtları düzenler^{1 ,11,14}. Bu TLR öncelikle tek iplikçikli RNA (ssRNA) ve bir enfeksiyon^{15, 16,17,18}semptomatik olan metillenmemiş CpG DNA gibi yabancı nükleik asit türlerini tanımak . IRF5 bakteriyel karşı bağışıklık yanıtlarını düzenleyen gösterilmiştir, viral, ve mantar enfeksiyonları^19,20,21. Bağışıklık sisteminde IRF5 etkili ve çeşitli rolü göz önüne alındığında, artırılması veya IRF5 aktivitesi nemlendirici terapötik ajanların gelişimi için yeni bir cadde olarak hizmet verebilir²². Bu nedenle, farklı hücre tiplerinde IRF5 aktivitesini düzenleyen yolların ve mekanizmaların ayrıntılı araştırılmasına olanak sağlamak için endojen IRF5'in aktivasyon durumunu izlemek için bir protokol geliştirmek önemlidir.

Bilgimiz dahilinde, bu protokolün geliştirilmesinden önce endojen IRF5 aktivasyonu için biyokimyasal veya jel elektroforetik test yayınlanmamıştır. Fosforilasyon IRF5 aktivasyonunun önemli bir ilk adımı olarak gösterilmiştir ve IRF5 aktivitesi için önemli olan serin kalıntısının keşfi ve onayına yol açan fosfospesifik IRF5 antikor geliştirilmiştir¹³. Ancak, antikor immünoppresipitated veya overexpressed²³fosforilize IRF5 açıkça algılarken, elimizde bütün bir hücre lysate IRF5 fosforilasyon tespit etmek için başarısız (veri gösterilmez). Dimerization IRF5 aktivasyonunun bir sonraki adımıdır ve bu adımı araştıran bugüne kadar yapılan birçok önemli çalışma, genellikle normalde IRF5^{11,12 ifade etmeyen alakasız hücre tiplerinde, epitop etiketli IRF5'in aşırı ekspresyonuna dayanıyordu. ,24,25}. Önceki çalışmalar, dimerized IRF5 her zaman çekirdek içine translocate olmayabilir ve bu nedenle mutlaka tam olarak aktif olmadığını göstermiştir^25,26. Endojen IRF5 nükleer lokalizasyonu için bir tizin görüntüleme akışı sitometri²⁷ile IRF5 aktivasyonunu değerlendirmek için geliştirilmiştir. Bu test, özellikle primer veya nadir hücre tiplerinde^28,29 ve bu alandaki bilgiyi büyük ölçüde ilerleten IRF5 aktivitesini anlamak için çok önemli olan çalışmalarda uygulanmıştır. Ancak, bu test araştırmacılar için yaygın olarak mevcut olmayan özel bir alete dayanır. Ayrıca, IRF5 düzenleyici yollarını incelerken ve yukarı akım düzenleyicileri ve yol bileşenlerini tanımlarken aktivasyonun ilk adımlarını araştırmak genellikle gereklidir. Bu çalışma, IRF5'in moleküler biyoloji araçları ile donatılmış laboratuvarlarda yapAbilen erken aktivasyon olayları için sağlam ve güvenilir bir biyokimyasal tahlil sağlamaktadır. Burada açıklanan protokol, özellikle IRF5 nükleer lokalizasyonun görüntüleme akışı sitometrik analizi gibi ortogonal tahlillerle birleştirildiğinde, IRF5 eylemlerinin yollarını ve mekanizmalarını araştırmada çok yararlı olacaktır^{23, 27,28,30}.

Yerli poliakrilamid jel elektroforez (yerli PAGE) protein kompleksleri analiz etmek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir^31,32. Sodyum dodecylsülfat poliakrilamid jel elektroforezinin (SDS-PAGE) aksine, yerli PAGE proteinleri şekil, boyut ve yük bazında ayırır. Ayrıca denatürasyon olmadan doğal protein yapısını korur^31,33,34,35. Sunulan protokol, yerel PAGE'in bu özelliklerinden yararlanır ve IRF5'in hem monomerik hem de dimerik formlarını algılar. Endojen fosforlu IRF5'i algılayabilen uygun bir ticari antikor bulunmadığından, bu yöntem erken aktivasyon olaylarını saptayabında özellikle önemlidir. Daha önce, yayınlanan çeşitli çalışmalari IRF5 dimerization değerlendirmek için yerli PAGE kullanılır. Ancak, bu çalışmaların çoğunluğu aktivasyon durumu²,^{13,24,36,37 analiz etmek için ekzojen epitop etiketli IRF5 aşırı ekspresyonu bağlı} . Bu çalışma, iRF5 aktivitesinin işlevi için çok önemli olduğu gösterilmiştir bir insan plazmasittoid dendritik hücre (pDC) hattında değiştirilmiş bir yerli PAGE tekniği ile endojen IRF5 dimerization analiz etmek için adım adım protokol sunar^{1, 38,39,40}. Aynı teknik diğer hücre^hatları23uygulanmıştır.

NOT: Burada açıklanan protokol, TLR7/8 için bir agonist olan resiquimod (R848) ile tedavi edilen CAL-1 pDC hücre hattını kullanır. Bu protokol RAW 264.7 (murine makrofaj hattı), THP-1 (insan monositik hücre hattı), BJAB (insan B hücre hattı), Ramos (insan B hücre hattı) ve MUTZ-3 (insan dendritik hücre hattı)²³dahil olmak üzere diğer insan ve murine hücre tipleri, uygulanmıştır.

1. CAL-1 Hücrelerinin Uyarılması

1. %5 fetal sığır serumu (FBS), 25 mM HEPES ve 1x mercaptoetanol (yani tam RPMI 1640 orta) içeren 20−25 mL RPMI 1640 orta ile steril koşullarda 37 °C ve %5 CO_2'de Bir T75 şişesinde CAL-1 hücre kültürlerini koruyun.
2. Hücreleri 50 mL konik bir tüpe aktarın.
   NOT: CAL-1 hücreleri yapışık değildir. Yapışık hücre tipleri için, standart tripsinizasyon hücreleri hasat yapılabilir.
3. Hücreleri 200 x g'de 5 dk oda sıcaklığında (RT) santrifüj edin. Homojen tek hücreli süspansiyon elde etmek için tam RPMI 1640 ortamının 8 mL'sinde süpernatantı çıkarın ve hücre peletini yeniden askıya alın.
4. Hemositometre kullanarak hücreleri say. Her kuyuda 4 mL önceden ısıtılmış komple RPMI 1640 orta ile 6 kuyu plakası iyi başına 1 x 10⁶ hücre yoğunluğunda hücreleri tohumlayın. 37 °C'de 20−24 saat ve %5 CO_2'de inkübün le biraraya gelmesi %90−95'e (yaklaşık 1,5 x 10⁶ hücreye karşılık gelen) ulaşabilirsiniz.
5. 6 kuyu plakasının (1 μg/mL nihai konsantrasyonu) her biri için 4 μL 1 mg/mL R848 ekleyerek hücreleri uyarın. Ayrıca R848 tedavisi olmadan hücreler ile iyi bir uyarılmamış kontrol kurmak.
6. R848'in plakayı yan yana hafifçe sallayarak eşit şekilde dağıldığından emin olun. Daha sonra, 37 °C ve% 5 CO₂kuvözde 2−16 saat için hücreleri kuluçkaya yatırın.

2. Hücresel Proteinlerin Çıkarılması

1. Hücre süspansiyonlarını 6 kuyu plakasından 5 mL santrifüj tüpe aktarın.
2. Sentrifüj 200 x g için 5 dk RT. Süpernatant çıkarın ve homojen tek hücreli süspansiyon elde etmek için fosfat tamponlu salin (PBS) 1 mL hücre pelet yeniden askıya.
3. Hücre süspansiyonuna 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
4. 4 °C'de 0,5−1 dk için 12.000 x g'de kısa bir süre aşağı doğru döndürün ve süpernatantı dikkatlice çıkarın.
5. 6,25 mL 1 M Tris-HCl pH 7,4 (25 mM nihai konsantrasyonu), 5 M NaCl 7,5 mL (150 mM nihai konsantrasyon), 0,5 mL 0,5 mL 0,5 MED (1 mM nihai konsantrasyon), 2,5 mL NP-40 (son konsantrasyon% 1) içeren lysis tamponunu hazırlayın ve 7.5 mL gliserol (%5 nihai konsantrasyon) deiyonize su (ddH₂O) 250 mL içinde. Kullanmadan hemen önce lysis tamponuna 1x'lik son konsantrasyona 100x proteaz inhibitörü tek kullanımlık kokteyl ekleyin. Hazırlanan lysis tamponu buz üzerinde saklayın.
   NOT: Proteaz olmadan lysis tampon 4 °C'de saklanabilir.
6. Hücre peletini 30 μL buz gibi lisis tamponunda yeniden askıya alın ve yukarı ve aşağı borular oluşturarak karıştırın.
7. 15−20 dk boyunca buz üzerinde kuluçka.
8. 4 °C'de 15−20 dk için 12.000 x g'de santrifüj ile lysate'yi netleştirin. Supernatant'ı yeni bir önceden soğutulmuş 1,5 mL santrifüj tüpe aktarın. Özleri her zaman buzda saklayın.
   NOT: Hücre lisatları -20 °C veya -80 °C'de saklanabilir. Örnekleri kaynatmayın.
9. Bradford reaktifini kullanarak protein konsantrasyonu ölçün.

3. IRF5 Dimerization Analizi Yerli SAYFA

1. Üst (-) ve alt (+) oda elektroforez tamponlarını hazırlayın. Üst oda tampon 1x yerli PAGE çalışan tampon% 0.3 sodyum deoksikolat (NaDOC) oluşur ve alt oda tampon çalışan sadece 1x yerli PAGE oluşur.
   NOT: Her yeni çalışma için taze bir üst oda tampon hazırlayın.
2. Kuyuları bozmadan %3−%12 yerli PAGE jelini suyla iyice durulayın. Jeli mini jel tankına ayarlayın ve tarak çıkarın. Jeli 4 °C'lik soğuk bir odada veya 150 V'de 30 dk boyunca buz üzerinde pişirin.
   NOT: Prerunning jel çalışmasını engelleyebilir aşırı amoni ve persülfat iyonları kaldırır.
3. Prerun sırasında, 4x yerli örnek tampon ile buz üzerinde tutulan hücresel proteinlerkarıştırarak yükleme için örnekleri hazırlamak.
4. Prerun'dan sonra, numune başına son hacmi 10−15 μL olan 10−15 μg protein yükleyin.
   NOT: Proteinin aşırı yüklenmesi bulaşmaya neden olabilir.
5. 30 dk için 85 V jel çalıştırın, sonra 2 saat için 150 V.
   NOT: Farklı laboratuvarlar tarafından kullanılan ekipman ve hücre hatlarındaki farklılıklar göz önünde bulundurularak, bu protokolü optimize etmek için protein numunelerinin konsantrasyonu, voltaj ve çalışma süresinde küçük değişiklikler yapılabilir. Çalışma süresini artırırken ön çalıştırma ve çalışma gerilimini düşürmek dimer çözünürlüğünü ve sonuç tutarlılığını artırmaya yardımcı olabilir.
6. Jeli RT'de 30 dakika boyunca SDS çalışan tampon (25 m Tris pH 8.3, 250 mM Glisin, %0.1 SDS) ile ıslatın.
   NOT: Ajitasyon gerekmez. Bazen, bandın yoğunluğu esas olarak IRF5 monomerik formunu etkileyen deoksikolat (DOC) varlığında verimsiz transferi nedeniyle yüklenen protein miktarı ile orantılı olmayabilir. Aktarımdan önce sds çalışan tampon jel ıslatma bu sorunu çözer. Jel kırılgan. Jelin alt kısmından (yani, daha yüksek yüzde) aşırı özenle işlayın.

4. IRF5 İmmünoblot Analizi

1. Yaklaşık 5 dakika boyunca metanol içinde ıslatarak poliviniliden diflorür (PDVF) membran etkinleştirin.
2. Yönünü belirtmek için membranın bir köşesinde bir kesim yapın. Transfer sandviçini, içinde hava kabarcıklarının sıkışmadığından emin olmak için üretici protokolünde belirtilen sıralı sıraya göre ekstra özenle monte edin.
3. Transfer kasetini tanka yerleştirin ve 20 V'de 1 saat buzüzerinde aktarın.
   NOT: Sallanan bir çalkalama ile sonraki adımlarda tüm kuluçka ve yıkıntıgerçekleştirin.
4. Aktarım tamamlandıktan sonra membranı plastik pratisyen lerle kasetten çıkarın. RT'de 45 dakika boyunca membranı bloke eden tampon (TBS) bloğunu kapatın.
   NOT: %5 BSA içeren TBS arabelleği engelleme tamponu olarak da kullanılabilir.
5. Membranı Tablo 1'delistelenen primer antikorile inkübe edin. Membranı 1x TBST yıkama tamponu (20 mM Tris, pH 7.0, 150 mM NaCl ve %0.1 Ara 20) ile 3 dakika boyunca yıkayın. Yıkama 2x tekrarlayın.

Tablo 1: İmmünoblotlama işleminde kullanılan antikorların özellikleri.

6. Membranı Tablo 1'delistelenen ikincil antikorla kuluçkaya yatırın. Membranları 1x TBST yıkama tamponunda 3 dk yıkayın. Yıkama 2x tekrarlayın.
7. Uygun bir jel dokümantasyon sistemi kullanarak lekeyi tazyik.

Anti-IRF5 antikorlu immünoblot (IB) CAL-1 hücrelerinde uyarılmamış veya 1 μg/mL R848 ile uyarılmamış olarak 2 saat(Şekil 1)uygulandı. Hücre lisatları hazırlandı ve ana SAYFA yapıldı. Uyarılmamış CAL-1 hücrelerinde, IRF5 yerel SAYFADA monomerik formuna karşılık gelen tek bir bant olarak algılandı. CAL-1 hücrelerinin R848 ile 2 saat tedavi edilmesi üzerine, IRF5 monomer seviyesi, IRF5'in dimerik formuna karşılık gelen yavaş göç eden bir bandın birikiminde eşzamanlı bir artışla azaldı.

Şekil 1: TLR7/8 agonist ile uyarıldığında CAL-1 hücrelerinde dimerized Endojen IRF5. CAL-1 hücreleri belirtilen süre boyunca R848 ile tedavi edilmedi veya tedavi edildi. Protein örnekleri yerli PAGE ile çözüldü ve ardından anti-IRF5 antikor kullanılarak IB alındı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Anti-IRF5 antikorlu immünoblot, Çeşitli yapılarla transfeced ve transfected 293T hücreleri üzerinde IRF5-overexpressing yapıldı. Hücre lisatları hazırlandı ve yerli PAGE yapıldı (Şekil 2). Transfektasyonsuz 293T hücrelerinde anti-IRF5 antikor özgüllüğünü gösteren IRF5 saptanmadı. Monomerik IRF5'e karşılık gelen tek bir bant sadece IRF5'i aşırı ifade eden 293T hücrelerinde tespit edildi. NRIG (constitutively active RIG-I), MAVS ve IKKβ gibi IRF5 aktive edici proteinleri kodlayan yapılar cotransfected olduğunda, IRF5'in dimerik formuna karşılık gelen yavaş bir göç bandı ortaya çıktı. Ancak RIG-I ile ilgili bir protein olan NMDA5 (institutively aktif MDA5), cotransfected olduğunda IRF5 dimerizasyonunu tetiklememiştir.

Şekil 2: IRF5 aktive edici faktörlerin 293T hücrelerinde IRF5 dimerizasyonuna neden olan kotransfeksiyonu. 293T hücreleri transfekslenmemiş (şerit 1) veya çeşitli IRF5 regülatörleri (şerit 3−6) ile birlikte IRF5 (şerit 2) ile transfected edildi. Protein örnekleri yerli PAGE ile çözüldü ve ardından anti-IRF5 antikor kullanılarak IB alındı. NRIG = RIG-I'nin N-terminali; NMDA5 = MDA5'in N-terminali. (Başlangıçta Journal of Immunologyyayınlandı . KT Chow, C Wilkins, M Narita, R Green, M Knoll, YM Loo ve M Gale Jr. 2018. Plazmasittoid Dendritik Hücrelerde IRF3 ve IRF5 tarafından düzenlenen Diferansiyel ve Örtüşen Bağışıklık Programları. J. İmmünl. 201 (10) 3036-3050. Telif Hakkı © 2018 Amerikan İmmünolojiciler Derneği,^{Inc. 23}). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Burada açıklanan protokol, endojen IRF5'in hem monomerik hem de dimerik formlarını birbirinden ayıran değiştirilmiş bir yerel SAYFAdır. Özel görüntüleme akış sitometri tekniği²³,^27,28,30kullanarak endojen IRF5 aktivasyonu tespiti raporlama birkaç çalışma olmuştur. Bu protokol, aktivasyonun ilk olayları sırasında endojen IRF5 etkinleştirme durumunu değerlendirmek için yaygın bir teknik ve olağan reaktifler ve araçlar kullanır. Protokol, IRF5'in monomerik ve dimeric formları arasında ayrım sağlamak için standart bir yerel PAGE protokolünde basit değişiklikler gerektirir. Kolayca diğer hücre hatları²³kullanarak çalışmalara adapte edilebilir. Bu değiştirilmiş yerel SAYFA protokolü endojen IRF5'i spesifik olmayan protein girişimleri olmaksızın iki şekilde net bir şekilde çözebilir(Şekil 2). Uyarılmamış hücrelerden endojen IRF5 bu jel sisteminde açık tek bant olarak saptanırken, R848 ile 2 saat tedavi, IRF5 dimers'a karşılık gelen bir bandın görünümüyle sonuçlandı (Şekil 1).

IRF3 için bir yerli SAYFA dimerization tsay, aynı ailede IRF5 benzer bir transkripsiyon faktörü, geliştirilmiş ve yaygın olarak son yirmi yıl içinde kullanılmıştır³². Kapsamlı test ve sorun giderme rağmen, Biz IRF5 monomer ve dimer çözmek için Laemmli Tris-glisin sistemi kullanan aynı protokolü uygulamak mümkün değildi. Bu makalede açıklanan protokol, IRF3 protokolünde kullanılan Tris-glisin tek yüzdeli jellerden çok farklı bir kimyaya sahip Olan Bis-Tris gradyan jelleri kullanır. Jel elektroforetik sistemlerinin farklı pH ve kimyasal bileşimi IRF3 ve IRF5'in çeşitli formlarını ayırt etmede çok önemli olabilir. Nitekim, IRF3 ve IRF5, benzer iken, farklı özelliklere sahip (örneğin, izoelektrik noktaları ve modifikasyon siteleri) muhtemelen farklı jel sistemlerinde ayrılırken farklı davranış ile sonuçlanan.

Jel çalıştırmak için DOC içeren 1x yerel PAGE çalışan arabellek kullanılmıştır. Tampon taze hazırlanmış veya temiz ve protein içermeyen bir ortamda beyaz çökelti görünümünü önlemek için üst haznede doc spesifik olmayan proteinler çökelti sonucu çözelti bulutlu olmalıdır. Çıkarılan endojen IRF5 örneklerinin en kısa sürede, tercihen en az donma-çözülme döngüsü ile bir hafta içinde yerel SAYFAya tabi tutulması son derece tavsiye edilir. Aksi takdirde, önemli protein bozulması olabilir. Bozulma hem -80 °C hem de -20 °C'de depolanır. Buna ek olarak, SDS çalışan tampon ve TBST yıkama tampon pH RT ayarlanmalıdır.

Her kuyuya yüklenen numunenin ideal son hacmi 10−15 μL'dir, ancak farklı hücre türlerine bağlı olarak hafif ayarlamalar gerekebilir. 30 dakika boyunca 85 V'de ilk çalıştırmadan sonra, IRF5 monomer ve dimer'in farklı ayrışması ve çözünürlüğü elde etmek için jeli yaklaşık 2-3 saat boyunca 150 V'de çalıştırmaya devam etmesi önerilir. Çalışma bittikten sonra, üstte %3'ten en alttaki %12'ye doğru artan diferansiyel yoğunluk seviyeleri nedeniyle jeli alt ucundan titizlikle işlemek son derece önemlidir. Bu durumda, sürtünmeyi en aza indirmek için bir darbe yastığı görevi görür ve jelkırılmasını önlemek için plaka uzak yüzen sağlar kullanılan çalışan tampon, daldırma tarafından plaka jel kaldırmak için tercih edilir.

Bu protokolün birkaç küçük dezavantajları istenilen sonuçları elde etmek için kullanılabilir jellerin sınırlı seçim içerir. Ev yapımı jeller ve ticari olarak mevcut jeller birkaç diğer markalar başarı olmadan test edilmiştir. Ellerimizde, ticari çalışan tampon ve jel sisteminin kullanımı bu protokolün sağlamlığına ve tekrarlanabilirliğine katkıda bulunmuştur, ancak ev yapımı tamponlar üzerinde kapsamlı testler yapılmamıştır. Detaylara dikkat esastır ve deneyim, net sonuçlar elde etmede başarının anahtarıdır. Son olarak, IRF5'in çözünürlüğü monomer ve dimer'in ideal bir ayrımını elde etmek için uzun bir süre (yani 2−3 saat) gerekti. Gelecekte daha fazla geliştirme ve değişiklik verimliliği artırabilir ve bu protokolün sakıncalarını en aza indirebilirsiniz.

Sonuç olarak, bu protokol endojen IRF5 monomer ve dimer tespiti için sağlam bir testtir. Endojen IRF5'i ifade eden çeşitli insan ve rürin hücre tiplerinde uygulamalar için uygundur. Çeşitli hücre tiplerinde IRF5 düzenleyici yolları ve sinyal bileşenlerini incelemek için değerli bir araç olacaktır.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Çalışma Croucher Vakfı ve City Üniversitesi başlangıç fonları fon tarafından desteklendi. Chow laboratuvarının tüm üyelerine deney ve makalenin eleştirel okuması ile ilgili yardımları için teşekkür ederiz.