Родной Полякриламимид Гель Электрофорез Иммуноблот Анализ эндогенной димеризации IRF5

Описан родной западный метод поблуждения для анализа эндогенного интерферона регулятивного фактора 5 димеризации в плазмоцитной дендритной линии CAL-1. Этот протокол может быть применен и к другим клеточным линиям.

Интерферон регулятивного фактора 5 (IRF5) является ключевым фактором транскрипции для регулирования иммунного ответа. Он активируется вниз по течению Toll-как рецептор миелоидной дифференциации первичного источника ответа гена 88 (TLR-MyD88) сигнальный путь. Активация IRF5 включает в себя фосфорилирование, димеризацию и последующее перемещение из цитоплазмы в ядро, что, в свою очередь, индуцирует экспрессию генов различных провоспалительных цитокинов. Для изучения функций IRF5 и соответствующих путей необходимо провести ажиотаж обнаружения активации IRF5. В этой статье описывается надежный анализ для обнаружения эндогенной активации IRF5 в плазмоцитной дендритной клетке CAL-1 человека (pDC). Протокол состоит из модифицированного анализа электрофорезов nondenaturing, который может различать IRF5 в его мономерных и димерных формах, обеспечивая тем самым доступный и чувствительный подход к анализу активации IRF5.

Интерферон регулятивного фактора 5 (IRF5) является важным регулятором транскрипции, который играет заметную роль в регулировании иммунного ответа, особенно в выпуске провоспалительных цитокинов и интерферонов типа I (IFNs)^{1,2 ,3}. Неправильное регулирование IRF5 является фактором, способствующим многочисленным аутоиммунным заболеваниям, о чем свидетельствуют различные полиморфизмы в локусе IRF5, связанные с системной эритематозом волчанки, рассеянным склерозом, ревматоидным артритом и т.д.^{4, 5,6,7,8,9,10}. Таким образом, надежный детектор обнаружения эндогенного состояния активации IRF5 имеет решающее значение для понимания регуляторных путей и ниже по течению эффектов IRF5 в физиологически актуальном клеточном контексте.

IRF5 является составным образом выражается в моноцитах, дендритных клетках (ДК), В-клетках и макрофагах^1,11. Как и в других факторах транскрипции семьи IRF, IRF5 находится в цитоплазме в ее скрытом состоянии. После активации IRF5 фосфорилировался и образует гомодимеры, которые затем перемещаются в ядро и связываются с определенными регуляторными элементами генов, кодирующих тип I IFNs и провоспалительных цитокинов, что в конечном итоге приводит к экспрессии этих генов^{1 ,2,11,12,13}. IRF5 регулирует врожденные иммунные реакции вниз по течению различных платных рецепторов (TLRs), таких как TLR7, TLR 8 и TLR 9, которые локализованы в эндосомомых и используют MyD88 для сигнализации^1,11,14. Эти TLRs в первую очередь признают иностранные виды нуклеиновой кислоты, такие как одноцепочечная РНК (ssRNA) и неметилированные CPG ДНК, которые являются симптомами инфекции^15,16,17,18. Было показано, что IRF5 регулирует иммунные реакции против бактериальных, вирусных и грибковых инфекций^19,20,21. Учитывая влиятельную и разнообразную роль IRF5 в иммунной системе, повышение или увлажнение активности IRF5 может послужить новым средством для развития терапевтических агентов²². Поэтому крайне важно разработать протокол для мониторинга состояния активации эндогенного IRF5, с тем чтобы обеспечить тщательное исследование путей и механизмов, регулирующих активность IRF5 в различных типах клеток.

Насколько нам известно, до разработки этого протокола не было опубликовано ни одного биохимического или гелевого электрофоретического анализа для эндогенной активации IRF5. Фосфорилирование было показано, что важный первый шаг активации IRF5, и фосфоспецифические антитела IRF5 был разработан, что привело к открытию и подтверждению остатков serine важно для IRF5 деятельности¹³. Однако, в то время как антитела четко обнаруживает фосфорилированный IRF5, когда иммунопроцирование или overexpressed²³, он не может обнаружить IRF5 фосфорилирования в целом лизат клеток в наших руках (данные не показаны). Димеризация является следующим шагом активации IRF5, и многие важные исследования на сегодняшний день расследование этого шага опирался на переэкспрессию эпитоп-тегами IRF5, часто в нерелевантных типов клеток, которые обычно не выражают IRF5^{11,12 ,24,25}. Предыдущие исследования показали, что димеризированный IRF5 не всегда может трансвесироваться в ядро и, следовательно, не обязательно полностью активирован^25,26. Анализ эндогенной локализации ядерной энергии IRF5 был разработан для оценки активации IRF5 с помощью цитометрии потока изображений²⁷. Этот ассеия была применена в исследованиях, которые имеют решающее значение для понимания активности IRF5, особенно в первичных или редких типах клеток^28,29 и значительно продвинули знания в этой области. Однако этот асси опирается на специализированный инструмент, который не пользуется широкой доступностью для исследователей. Кроме того, часто необходимо исследовать начальные этапы активации при вскрытии регуляторных путей IRF5 и выявлении восходящих регуляторов и компонентов путей. Это исследование обеспечивает надежный и надежный биохимический анализ для ранних событий активации IRF5, которые могут быть выполнены в лабораториях, оснащенных молекулярной биологией инструментов. Описанный здесь протокол будет очень полезен при изучении путей и механизмов действий IRF5, особенно в сочетании с ортогональными ассиями, такими как цитометрический анализ циклометрического анализа ядерных локализации IRF5^{23, 27,28,30}.

Родной полиакриламид гель электрофорез (родной PAGE) является широко используемым методом для анализа белковых комплексов^31,32. В отличие от натрия dodecylsulfate полиакриламид гель электрофоресис (SDS-PAGE), родной PAGE отделяет белки на основе их формы, размера и заряда. Он также сохраняет родную структуру белка без денатурации^31,33,34,35. Представленный протокол использует эти особенности родного PAGE и обнаруживает как мономерные, так и димерические формы IRF5. Этот метод особенно важен для обнаружения ранних событий активации, поскольку нет подходящих коммерчески доступных антител, которые могут обнаружить эндогенные фосфорилированные IRF5. Ранее несколько опубликованных исследований использовали родной PAGE для оценки iRF5 димеризации. Тем не менее, большинство из этих исследований зависело от переэкспрессии экзогенных эпитопных меток IRF5 для анализа состояния активации^{2,13,24,36,37} . Эта работа представляет пошаговый протокол для анализа эндогенных IRF5 димеризации с помощью модифицированной родной техники PAGE в плазмоцитной дендритной клетки человека (pDC) линии, где IRF5 деятельности было показано, что решающее значение для его функции^{1, 38,39,40}. Этот же метод был применен к другим клеточным линиям²³.

ПРИМЕЧАНИЕ: В описанном здесь протоколе используется линия клеток CAL-1 pDC, обработанная resiquimod (R848), агонистом для TLR7/8. Этот протокол был применен к другим типам человеческих и муринных клеток, в ключая RAW 264.7 (линия макрофагов, THP-1 (линия моноцитарных клеток человека), BJAB (человеческая линия B клеток), Рамос (человеческая линия B- клеток) и MUT-3 (линия клеток человека dendritic)²³.

1. Стимулирование клеток CAL-1

1. Поддержание клеточных культур CAL-1 в колбе T75 при 37-C и 5% CO₂ при стерильных условиях с 20-25 мл среды RPMI 1640, содержащей 5% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS), 25 мМ HEPES и 1x меркаптотетанол (т.е. полный RPMI 1640 средний).
2. Перенесите клетки в коническую трубку 50 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки CAL-1 не являются придерживаться. Для типов клеток адептов, стандартная трипсизация может быть выполнена для сбора клеток.
3. Центрифуги клетки на 200 х г в течение 5 мин при комнатной температуре (RT). Удалить супернатант и resuspend клеточной гранулы в 8 мл полного RPMI 1640 среды для получения однородной одноклеточной подвески.
4. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Семена клеток при плотности 1 х 10⁶ клеток на хорошо в 6 хорошо пластины с 4 мл предварительно разогретой полной RPMI 1640 среды в каждом колодце. Инкубировать на 20-24 ч при 37 градусах Цельсия и 5% CO_2, чтобы позволить блике достичь 90%-95% (что соответствует примерно 1,5 х 10⁶ ячеек).
5. Стимулировать клетки, добавляя 4 л 1 мг/мл R848 на скважину 6 хорошо пластины (окончательная концентрация 1 мкг/мл). Также установить нестимулированный контроль хорошо с клетками без лечения R848.
6. Убедитесь, что R848 равномерно рассеивается, мягко раскачивая пластину из стороны в сторону. Затем инкубировать клетки в течение 2-16 ч в инкубаторе при 37 градусах по Цельсию и 5% CO_2.

2. Извлечение клеточных белков

1. Перенесите клеточные суспензии из 6 скважинной пластины в центрифугные трубки 5 мл.
2. Центрифуга при 200 х г в течение 5 мин на RT. Удалите супернатант и resuspend клеточной гранулы в 1 мл фосфат-буферного соления (PBS) для получения однородной одноклеточной подвески.
3. Перенесите суспензию клетки в центрифугу мощностью 1,5 мл.
4. Спин вниз кратко на 12000 х г в течение 0,5 х 1 мин при 4 градусах Цельсия и тщательно удалить супернатант.
5. Подготовьте буфер лисиса, содержащий 6,25 мл 1 М Tris-HCl pH 7.4 (окончательная концентрация 25 мМ), 7,5 мл 5 М НКЛ (окончательная концентрация 150 мМ), 0,5 мл 0,5 М ЭДТА (окончательная концентрация 1 мМ), 2,5 мл NP-40 (окончательная концентрация 1%) и 7,5 мл глицерола (окончательная концентрация 5%) в 250 мл деионированной воды (ddH₂O). Добавьте 100x ингибитор протеазы одноразовый коктейль к окончательной концентрации 1x в буфер лиза непосредственно перед использованием. Держите подготовленный буфер лисиса на льду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер лисиса без протеаза может храниться при 4 градусах Цельсия.
6. Приостановите действие клеточных гранул в 30 зликатледяного буфера лиза и смешайте путем трубоукладки вверх и вниз.
7. Инкубировать на льду в течение 15-20 мин.
8. Уточните лизат путем центрифуга при 12000 х г в течение 15-20 мин при 4 градусах Цельсия. Перенесите супернатант в новую центрифугу длиной 1,5 мл. Храните экстракты на льду в любое время.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сотовые лисаты могут храниться при -20 градусах или -80 градусов по Цельсию. Не кипятите образцы.
9. Измерьте концентрацию белка с помощью реагента Брэдфорда.

3. Анализ димеризации IRF5 по родным PAGE

1. Подготовьте верхние (-) и нижние (я) камерные электрофорусные буферы. Буфер верхней камеры состоит из 0,3% дезоксихолата натрия (NaDOC) в 1x родном беговом буфере PAGE, а нижняя палата состоит только из 1x родного бегового буфера PAGE.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте свежий буфер верхней камеры для каждого нового запуска.
2. Промыть 3%-12% родной ГЕЛЬ PAGE тщательно с водой, не искажая скважины. Установите гель в мини-гель танк и удалить гребень. Prerun гель в холодной комнате 4 градуса цельсия или на льду при 150 В в течение 30 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Prerunning удаляет чрезмерное аммиака и ионов persulfate, которые могут помешать запуску геля.
3. Во время prerun, подготовить образцы для загрузки путем смешивания клеточных белков, хранящихся на льду с 4x родной образец буфера.
4. После предварительного запуска нагрузите 10–15 мкг белка с окончательным объемом 10–15 л на образец.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перегрузка белка может привести к размазывания.
5. Выполнить гель на 85 V в течение 30 мин, затем 150 V в течение 2 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывая различия в оборудовании и клеточных линиях, используемых в различных лабораториях, незначительные изменения в концентрации образцов белка, напряжения и времени работы могут быть целесообразными для оптимизации этого протокола. Снижение предварительного запуска и бегового напряжения при увеличении времени работы может помочь улучшить разрешение димера и привести к согласованности.
6. Замочите гель в SDS работает буфер (25 мм Tris pH 8,3, 250 мм Глицин, 0,1% SDS) в течение 30 минут на RT.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Агитация не требуется. Иногда интенсивность полосы не может быть пропорциональна количеству белка, загруженного из-за неэффективной передачи в присутствии дезоксихолата (DOC), который в основном влияет на мономерную форму IRF5. Замачивание геля в SDS работает буфер до передачи решает эту проблему. Гель хрупкий. Ручка с крайней осторожностью снизу (т.е. более высокий процент) конец геля.

4. Иммуноблот Анализ IRF5

1. Активируйте мембрану дифлуорид поливилиден (PDVF), замачивая ее в метаноле в течение примерно 5 мин.
2. Сделайте разрез на одном углу мембраны, чтобы указать его ориентацию. Соберите сэндвич с передачей в соответствии с последовательным порядком, описанным в протоколе производителя, с дополнительной осторожностью, чтобы гарантировать, что пузырьки воздуха не оказались в ловушке внутри.
3. Поместите кассету передачи в бак и перенесите при 20 В на 1 ч на льду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все инкубации и стирки в последующих шагах с качания шейкер.
4. Удалить мембрану из кассеты с помощью пластиковых щипцы после передачи завершена. Блокируйте мембрану в блокирующем буфере (TBS) в течение 45 минут на RT.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер TBS с 5% BSA также может быть использован в качестве блокирующего буфера.
5. Инкубировать мембрану с первичным антителом, перечисленным в таблице 1. Вымойте мембрану с 1x TBST стиральный буфер (20 мм Tris, рН 7.0, 150 mM NaCl и 0,1% Tween 20) в течение 3 мин во время качания. Повторите мыть 2x.

Таблица 1: Спецификации антител, используемых в иммуноблоттинге.

6. Инкубировать мембрану вторичными антителами, перечисленными в таблице 1. Вымойте мембраны в течение 3 мин в 1x TBST стирального буфера. Повторите мыть 2x.
7. Сканирование подьение с помощью соответствующей системы документации геля.

Иммуноблот (IB) с антителами против IRF5 был выполнен на клетках CAL-1 без стимуляции или стимулировали с 1 мкг/мл R848 для 2 ч(Рисунок 1). Были подготовлены клеточные лисаты, и был выполнен родной PAGE. В нестимулированных клетках CAL-1 IRF5 был обнаружен как единая полоса на родном PAGE, соответствующая его мономической форме. При лечении клеток CAL-1 с R848 на 2 ч уровень момера IRF5 снижался с одновременным увеличением накопления медленно мигрирующей полосы, что соответствовало димерической форме IRF5.

Рисунок 1: Эндогенные IRF5 димеризованы в клетках CAL-1 при стимуляции с агонистом TLR7/8. Клетки CAL-1 не лечились или лечились R848 в указанное время. Образцы белков были решены родным PAGE и затем IB с помощью анти-IRF5 антитела. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Иммуноблот с антителами IRF5 был выполнен на IRF5-overexpressing 293T-клеток untransfected и трансфицируется с различными конструкциями. Сотовые лисаты были подготовлены и родной PAGE была выполнена(Рисунок 2). IRF5 не было обнаружено в нетрансинфицированных 293T-клетках, демонстрирующих специфику антитела IRF5. Одна полоса, соответствующая мономерному IRF5, была обнаружена только в 293T-клетках, перевыражающих IRF5. При построении кодирования IRF5-активирующих белков, включая NRIG (в обязательно мейлирующее RIG-I), MAVS и IKK, были котрансфицированы, появилась медленно мигрирующая полоса, соответствующая димерической форме IRF5. Тем не менее, NMDA5 (в обязательном порядке активный MDA5), связанный с RIG-I, не вызывал димеризации IRF5 при котрансезации.

Рисунок 2: Котрансфекция iRF5-активизирующие факторы индуцированные IRF5 димеризации в 293T клеток. 293T-клетки были нетрансфицировали (полоса 1) или трансфицировали с Помощью IRF5 (полоса 2) вместе с различными регуляторами IRF5 (полосы 3'6). Образцы белков были решены родным PAGE и затем IB с помощью анти-IRF5 антитела. NRIG - N-терминал RIG-I; NMDA5 - N-терминал MDA5. (Первоначально опубликовано в журнале иммунологии. KT Чоу, C Уилкинс, M Нарита, R Грин, M Нолл, YM Loo и M Гейл младший 2018. Дифференциальные и перекрывающиеся иммунные программы, регулируемые IRF3 и IRF5 в плазмоцитоидных дендритных клетках. J. Иммунол. 201 (10) 3036-3050. Авторское право © 2018 Американская ассоциация иммунологов, Inc²³). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Описанный здесь протокол представляет собой модифицированный родной PAGE, который отличает как мономерные, так и димерические формы эндогенных IRF5. Там было несколько исследований, сообщающих об обнаружении эндогенной активации IRF5 с использованием специализированных методов цитометрии потока изображений^23,27,28,30. Этот протокол использует общий метод и обычные реагенты и инструменты для оценки эндогенного состояния активации IRF5 во время ранних событий активации. Протокол предполагает простые изменения в стандартный родной протокол PAGE, позволяющий проводить различие между мономерными и димерическими формами IRF5. Он может быть легко адаптирован к исследованиям с использованием других клеточных^{линий 23}. Этот модифицированный родной протокол PAGE может решить эндогенные IRF5 в двух формах четко без неспецифических белковых помех(рисунок 2). Эндогенный IRF5 из нестимулированных клеток был обнаружен как четкая единая полоса в этой гель-системе, в то время как лечение R848 для 2 ч привело к появлению полосы, соответствующей димерам IRF5(рисунок 1).

Родной PAGE димеризации асссы для IRF3, аналогичный фактор транскрипции IRF5 в той же семье, был разработан и широко используется в последние два десятилетия³². Несмотря на обширные испытания и устранение неполадок, мы не смогли применить тот же протокол, в котором используется система Laemmli Tris-glycine для решения проблемiii iRF5 monomer и dimer. Протокол, описанный в этой статье, использует гели градиента Bis-Tris, которые имеют очень различную химию к гелям Tris-glycine один процент используемых в протоколе IRF3. Различные рН и химический состав электрофоретических систем геля могут иметь решающее значение для различения различных форм IRF3 и IRF5. Действительно, IRF3 и IRF5, хотя и похожи, имеют различные свойства (например, изоэлектрические точки и места модификации), вероятно, приводят к различному поведению при разделении на различных гелевых системах.

1x родной PAGE работает буфер, содержащий DOC был использован для геля перспективе. Буфер должен быть подготовлен свежим или храниться в чистой и без белковой среде, чтобы избежать появления белых осадков, омрачающих раствор в верхней камере в результате doc осаждая неспецифические белки. Настоятельно рекомендуется, чтобы извлеченные эндогенные образцы IRF5 были подвергнуты родной PAGE КАК можно скорее, предпочтительно в течение недели с минимальными циклами замораживания оттепели. В противном случае может быть значительная деградация белка. Деградация наблюдается при хранении как при -80, так и в -20 градусов. Кроме того, pH буфера SDS и буфера стирки TBST должны быть скорректированы на RT.

Идеальный окончательный объем образца, загруженного в каждую скважину, составлял 10–15 л, но в зависимости от различных типов клеток могут потребоваться небольшие корректировки. После первоначального запуска на 85 V в течение 30 минут, рекомендуется продолжать работать гель на 150 V в течение примерно 2 до 3 ч для достижения четкого разделения и разрешения IRF5 мономер и димер. После завершения запуска, крайне важно обрабатывать гель тщательно из его нижней части из-за его дифференциальных уровней плотности, начиная от 3% в верхней части и увеличение до 12% в нижней части. В этом случае предпочтительнее удалить гель из пластины, погрузив его в использованный бегущий буфер, который действует как ударная подушка, чтобы свести к минимуму трение и позволяет гелю уплыть от пластины, чтобы избежать поломки.

Некоторые незначительные недостатки этого протокола включают ограниченный выбор гелей, доступных для достижения желаемых результатов. Домашние гели и несколько других марок коммерчески доступных гелей были протестированы безуспеха. В наших руках использование коммерческого бегущего буфера и гелевой системы способствовало надежности и воспроизводимости этого протокола, хотя масштабное тестирование самодельных буферов не проводилось. Внимание к деталям имеет важное значение, и опыт является ключом к успеху в получении четких результатов. Наконец, для того, чтобы получить идеальное разделение мономера и димера, потребовалось долгое время (т.е. 2,3 ч). Дальнейшее совершенствование и внесение изменений в будущем может повысить эффективность и свести к минимуму недостатки этого протокола.

В заключение, этот протокол является надежным ассеаром для обнаружения эндогенных iRF5 мономер и димер. Он подходит для применения в различных типах человеческих и муринных клеток, выражающих эндогенные IRF5. Это будет ценным инструментом для изучения регулятивных путей IRF5 и сигнальных компонентов в различных типах клеток.

Авторам нечего раскрывать.

Работа была поддержана финансированием из Фонда Краучера и стартап-фондов Городского университета. Мы благодарим всех сотрудников лаборатории Чоу за помощь в эксперименте и критическое чтение рукописи.