内因性IRF5ダイメネレーションのネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動免疫ブロット解析

CAL-1血漿細胞性樹状細胞株における内因性インターフェロン調節因子5ダイアライゼーションを分析するためのネイティブウェスタンブロット法が記載されている。このプロトコルは、他のセルラインにも適用できます。

インターフェロン調節因子5(IRF5)は、免疫応答を調節するための重要な転写因子である。トール様受容体ミエロイド分化一次応答遺伝子88(TLR-MyD88)シグナル伝達経路の下流で活性化される。IRF5活性化は、細胞質から核へのリン酸化、ダイマライゼーション、およびその後の転移を伴い、様々な炎症性サイトカインの遺伝子発現を誘導する。IRF5活性化のための検出アッセイは、IRF5関数とその関連経路を研究するために不可欠です。本論文では、CAL-1ヒト血漿細胞系樹状細胞(pDC)ラインにおける内因性IRF5活性化を検出する堅牢なアッセイについて説明する。このプロトコルは、モノマーおよびダイマーの形でIRF5を区別できる改変された非脱電性電気泳動アッセイで構成されており、IRF5活性化を分析するための手頃な価格で敏感なアプローチを提供します。

インターフェロン調節因子5(IRF5)は、特に炎症性サイトカインおよびI型インターフェロン(IFN)1、2の放出において、免疫応答を調節する上で顕著な役割を果たす重要な転写調節因子である。 ^、3.IRF5の誤認は、全身性エリテマトース、多発性硬化症、関節リウマチなどに関連するIRF5遺伝子座の様々な多型によって明らかなように、多数の自己免疫疾患の一因^{である4、5,6,7,8,9,10}.したがって、内因性IRF5活性化状態に対する堅牢な検出アッセイは、生理学的に関連する細胞コンテキストにおけるIRF5の調節経路および下流効果を理解するために重要である。

IRF5は、単球、樹状細胞(DC)、B細胞、およびマクロファー^ジ1、11で構成的に発現される。他のIRFファミリー転写因子と同様に、IRF5は潜伏状態の細胞質に存在する。活性化すると、IRF5はリン酸化され、ホモダイマーを形成し、その後核に転移し、I型IFNおよび炎症性サイトカインをコードする遺伝子の特定の調節要素に結合し、最終的にこれらの遺伝子1の発現を誘導する。 ^,2,11,12,13.IRF5は、エンドソームに局在するTLR7、TLR8、およびTLR9などの様々なトール様受容体(TLR)の下流の自然免疫応答を調節し、シグナル^{伝達1、11、14}にMyD88を使用する。これらのTTLは、主に感染15、16、17、18の症状である一本鎖RNA(ssRNA)および非メチル化CpG DNAなどの外来核酸種を認識する。IRF5は、細菌、ウイルス、および真菌感染症19、20、21に対する免疫応答を調節することが示されている。免疫系におけるIRF5の影響力と多様な役割を考えると、IRF5活性を増強または減衰させることは、^治療薬22の開発のための新しい道として役立つ可能性がある。したがって、異なる細胞型におけるIRF5活性を調節する経路およびメカニズムを徹底的に調査できるように、内因性IRF5の活性化状態を監視するプロトコルを開発することが重要である。

我々の知る限りでは、このプロトコルの開発前に、内因性IRF5活性化のための生化学的またはゲル電気泳動アッセイは公表されていない。リン酸化は、IRF5活性化の重要な第一歩であることが示されており、IRF5^活性13にとって重要なセリン残基の発見と確認につながったリン特異的IRF5抗体が開発された。しかし、抗体は、免疫沈殿または^過剰発現時にリン酸化IRF5を明確に検出する一方で、我々の手の中の全細胞リサートにおけるIRF5リン酸化を検出することができない(データは示されていない)。二量体化はIRF5活性化の次のステップであり、このステップを調査する多くの重要な研究は、通常IRF5^{11、12を発現しない無関係な細胞型において、エピトープタグ付きIRF5の過剰発現に依存していた。、24、25。}これまでの研究では、二分化されたIRF5が必ずしも核に転移するとは限らないため、必ずしも完全に活性化されるとは限らない^{ことが示されている。}内因性IRF5核局在化のためのアッセイは、イメージングフローサイトメ^トリー27によるIRF5活性化を評価するために開発された。このアッセイは、特に一次細胞^型28、29型においてIRF5活性を理解するために重要な研究に適用^され、分野の知識を大幅に進歩させた。しかし、このアッセイは、研究者が広く利用できない特殊な機器に依存しています。さらに、IRF5規制経路を解剖し、上流のレギュレータおよび経路成分を同定しながら、活性化の初期段階を調査する必要が生じることがよくあります。本研究は、分子生物学ツールを搭載したラボで行うことができるIRF5の初期活性化イベントに対して、堅牢で信頼性の高い生化学的アッセイを提供します。ここで説明するプロトコルは、特にIRF5核局在化23のイメージングフローサイトメトリック解析などの直交アッセイと組み合わせると、IRF5作用の経路とメカニズムを調べるのに非常に役立ちます。^27,28,30.

天然ポリアクリルアミドゲル電気泳動(ネイティブPAGE)は、タンパク質^{複合体31、32}を分析するために広く使用されている方法である。ドデシルスルフェートポリアクリルアミドゲル電気泳動ナトリウムとは異なり、ネイティブPAGEは、その形状、サイズ、および電荷に基づいてタンパク質を分離します。また、退^{化31、33、34、35}なしでネイティブタンパク質構造を保持します。提示されたプロトコルは、ネイティブPAGEのこれらの機能を利用し、IRF5のモノマーとダイメリックの両方の形式を検出します。この方法は、内因性リン酸化IRF5を検出できる適切な市販の抗体がないため、早期活性化事象を検出するために特に重要である。以前は、いくつかの公開された研究では、ネイティブ PAGE を使用して IRF5 ダイアライゼーションを評価していました。しかし、これらの研究の大半は、活性化状態2、13、24、36、37を分析するために外因性エピトープタグ付きIRF5の過剰発現に依存していました.本研究は、ヒト血漿細胞細胞系樹状細胞(pDC)ラインにおける改変されたネイティブPAGE技術を介して内因性IRF5ダイアライゼーションを解析するためのステップバイステッププロトコルを提示し、そこでIRF5活性がその^機能1に重要であることが示された。 38、39、40。この同じ技術は、他の細胞^株23に適用されている。

注:ここで説明するプロトコルは、TLR7/8のアゴニストであるレシキモド(R848)で処理されたCAL-1 pDC細胞株を使用しています。このプロトコルは、RAW 264.7(マウスマクロファージ株)、THP-1(ヒト単球細胞株)、BJAB(ヒトB細胞株)、ラモス(ヒトB細胞株)、およびMUTZ-3(ヒト樹状細胞^株)23を含む他のヒトおよびマウス細胞タイプに適用されている。

1. CAL-1細胞の刺激

1. 5%の胎児ウシ血清(FBS)、25 mM HEPES、および1xメルカプトエタノール(すなわち、完全なRPMI 1640培地)を含むRPMI 1640培地の20−25 mLを有する無菌_条件下でT75フラスコでCAL-1細胞培養物を維持する。
2. 細胞を50 mL円錐形チューブに移します。
   注:CAL-1細胞は非付着性である。付着細胞型の場合、細胞を収穫するために標準的なトリプシン化を行うことができる。
3. 細胞を室温(RT)で5分間200xgで遠心分離する。 上清を除去し、完全なRPMI 1640培地の8mLで細胞ペレットを再懸濁し、均質な単一細胞懸濁液を得る。
4. 血球計を使用して細胞を数えます。各ウェルに予熱された完全なRPMI 1640培地の4 mLを有する6ウェルプレートにウェルあたり1 x 10⁶細胞の密度で細胞をシードする。37°Cで20-24hをインキュベートし、5%CO₂で合流率が90%−95%に達するようにする(約1.5 x 10⁶細胞に相当する)。
5. 6ウェルプレートのウェル当たり1mg/mL R848の4 μL(最終濃度1μg/mL)を加えて細胞を刺激します。また、R848処理なしの細胞とよく無刺激制御を設定します。
6. R848がプレートを左右にゆっくりと揺らすことによって均等に分散していることを確認します。次いで、37°Cおよび5%CO2でインキュベーターで2−16hの細胞をインキュベートする。

2. 細胞タンパク質の抽出

1. 6ウェルプレートから5mL遠心管にセル懸濁液を移します。
2. RTで200 x gで5分間遠心分離機を取り出し、リン酸緩衝生理食べ物(PBS)の1mLで細胞ペレットを再懸濁し、均質な単一細胞懸濁液を得た。
3. セルサスペンションを1.5mL遠心チューブに移します。
4. 4°Cで0.5−1分間12,000 x gで短時間スピンダウンし、上清を慎重に取り除きます。
5. 1 Mトリス-HCl pH 7.4(最終濃度25m)、5MNaClの7.5mL(最終濃度150mM)、0.5mEdTA0.5mL(最終濃度1mM)、NP-40の2.5mL(最終濃度1%)を含むlysisバッファーを調製グリセロールの7.5 mL(最終濃度5%)脱イオン水の250 mLで(ddH₂O)。使用直前のリシスバッファーに1xの最終濃度に100倍プロテアーゼ阻害剤単独使用カクテルを追加します。準備されたリシスバッファーを氷の上に保管してください。
   注:プロテアーゼを持たないリシスバッファーは、4°Cで保存することができる。
6. 細胞ペレットを30μLの氷冷分解バッファーに再ステープルし、上下にピペッティングして混合します。
7. 氷の上で15~20分間インキュベートします。
8. 4°Cで15−20分の12,000 x gで遠心分離してライサートを明らかにする。上清を新しい1.5mL遠心分離管に移します。抽出物は常に氷の上に保管してください。
   注:細胞の洗浄物は-20°Cまたは-80°Cで貯えることができる。サンプルを沸騰させないようにしてください。
9. ブラッドフォード試薬を使用してタンパク質濃度を測定します。

3. ネイティブページによるIRF5ダイアライゼーションの解析

1. 上部(-)および下部(+)室電気泳動バッファーを調製する。上部チャンババッファーは、1xネイティブPAGE実行バッファー内の0.3%デオキシコリントナトリウム(NaDOC)で構成され、下部チャンバは1xネイティブPAGE実行バッファのみで構成されています。
   注:すべての新しい実行のための新鮮な上部のチャンバーバッファを準備します。
2. 3%-12%ネイティブPAGEゲルを井戸をゆがめずに水で十分に洗い流します。ゲルをミニゲルタンクにセットし、櫛を取り除きます。4°Cの冷たい部屋で、または氷の上で30分間150Vでゲルを前もって実行します。
   注:プリランニングは、ゲルの実行を妨げる可能性のある過剰なアンモニアおよび過硫酸イオンを除去します。
3. プリランの間に、氷上に保持されている細胞タンパク質を4倍のネイティブサンプルバッファーと混合して、読み込み用のサンプルを準備します。
4. プリラン後、サンプルあたり10−15 μLの最終容積でタンパク質を10~15 μg積み込みます。
   注:タンパク質の過負荷は、塗りつぶしを引き起こす可能性があります。
5. ゲルを85Vで30分間、2時間150Vで走らせる。
   注:異なるラボで使用される機器や細胞株の違いを考慮すると、タンパク質サンプルの濃度、電圧、実行時間にわずかな変更を加えることで、このプロトコルを最適化するのに適している場合があります。実行時間を増やしながら、事前実行電圧と実行電圧を下げると、ダイマーの解像度と結果の一貫性が向上する場合があります。
6. ゲルをSDSランニングバッファ(25 mMトリスpH 8.3、250 mMグリシン、0.1%SDS)に30分間RTで浸します。
   注:撹拌は必要ありません。時折、バンドの強度は、主にIRF5のモノマー形態に影響を与えるデオキシコール酸(DOC)の存在下で非効率的な伝達に起因するタンパク質の量に比例しない場合があります。転送の前にSDS実行中のバッファにゲルを浸すと、この問題は解決します。ゲルは壊れやすい。ゲルの底部(すなわち、より高いパーセンテージ)の端から細かい注意を払って取り扱います。

4. IRF5の免疫ブロット分析

1. ポリビニリデレンジフッ化物(PDVF)膜をメタノールに約5分間浸して活性化します。
2. 膜の一角に切り取って、その向きを示します。気泡が内部に閉じ込められていないことを確認するために、特別な注意を払って、メーカーのプロトコルに記載されている順次注文に従って転送サンドイッチを組み立てます。
3. 転写カセットをタンクに入れ、氷の上で1時間20Vで転送します。
   注:すべてのインキュベーションを実行し、ロッキングシェーカーで後続のステップで洗います。
4. 転送が完了した後、プラスチック鉗子でカセットから膜を取り外します。RTで45分間ブロッキングバッファー(TBS)で膜をブロックします。
   注:5% BSA を持つ TBS バッファーは、ブロッキング バッファとしても使用できます。
5. 表1に記載されている一次抗体で膜をインキュベートする。1x TBST洗浄バッファー(20 mMトリス、pH 7.0、150 mM NaClおよび0.1%ツイーン20)で膜を3分間洗浄します。洗浄2xを繰り返します。

表1:免疫ブロッタ化手順で使用される抗体の仕様。

6. 表1に記載されている二次抗体で膜をインキュベートする。1x TBST洗浄バッファーで3分間膜を洗浄します。洗浄2xを繰り返します。
7. 適切なゲルドキュメンテーションシステムを使用してブロットをスキャンします。

抗IRF5抗体を用いた免疫ブロット(IB)を、2時間1μg/mL R848で無刺激または刺激したCAL-1細胞に対して行った(図1)。細胞リサテを調製し、ネイティブPAGEを行った。非刺激されたCAL-1細胞では、IRF5は、その単数形に対応するネイティブPAGE上の単一バンドとして検出された。R848を用いたCAL-1細胞を2時間治療すると、IRF5モノマーのレベルは、IRF5の薄暗い形態に対応したゆっくりと移動するバンドの蓄積の同時増加と共に減少した。

図1:TLR7/8アゴニストで刺激した場合、CAL-1細胞で内因性IRF5を二質化した。CAL-1細胞を未処理またはR848で処理した。タンパク質サンプルは、天然のPAGEによって解決され、続いて抗IRF5抗体を用いてIBが続いた。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

抗IRF5抗体を用いた免疫ブロットは、様々な構成要素でトランスフェクトおよびトランスフェクトされたIRF5オーバー発現293T細胞に対して行った。細胞リサエートを調製し、ネイティブPAGEを行った(図2)。トランスフェクトされていない293T細胞ではIRF5は検出されず、抗IRF5抗体の特異性を実証した。モノマーIRF5に対応する単一バンドは、IRF5を過剰発現する293T細胞でのみ検出された。NRIG(構成的に活性RIG-I)、MAVS、およびIKKβを含むIRF5活性化タンパク質をコードする構築物を共生すると、IRF5の薄暗い形態に対応するゆっくりと移動するバンドが現れた。しかし、RIG-Iに関連するタンパク質であるNMDA5(構成的に活性なMDA5)は、コトランスフェクト時にIRF5ダイマ化を誘導しなかった。

図2:293T細胞におけるIRF5活性化因子の共生化。293T細胞は、様々なIRF5レギュレータ(レーン3−6)と共に、トランスフェクトされていない(レーン1)またはIRF5(レーン2)でトランスフェクトされた。タンパク質サンプルは、天然のPAGEによって解決され、続いて抗IRF5抗体を用いてIBが続いた。NRIG = RIG-I の N 端子;NMDA5 = MDA5 の N 端子。(もともと免疫学のジャーナルに掲載されました.KTチョウ、Cウィルキンス、M成田、Rグリーン、Mノル、YMルー、Mゲールジュニア2018。血漿細胞性樹状細胞におけるIRF3およびIRF5によって調節される差分および重複免疫プログラムJ. イムノル201 (10) 3036-3050.著作権© 2018 免疫学者協会, Inc.²³⁾この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

ここで説明するプロトコルは、内因性IRF5のモノマーと薄暗の両方の形態を区別する修正されたネイティブPAGEです。特殊なイメージングフローサイトメトリー^{技術23、27、28、30}を用いて内因性IRF5活性化の検出を報告する研究はほとんど行われていない。このプロトコルは、一般的な技術と一般的な試薬とツールを使用して、活性化の初期イベント中に内因性IRF5活性化状態を評価します。このプロトコルは、IRF5 のモノマー形式と薄暗い形式を区別できるように、標準のネイティブ PAGE プロトコルを簡単に変更する必要があります。それは他の細胞^株23を使用して研究に容易に適応することができる。この改変されたネイティブPAGEプロトコルは、非特異的タンパク質干渉なしで、その2つの形態で内因性IRF5を明確に解決することができる(図2)。このゲル系では未刺激細胞からの内因性IRF5が明確な単一バンドとして検出されたが、R848を2時間用に処理すると、IRF5ダイマーに対応するバンドの出現が得られた(図1)。

IRF3のネイティブPAGE二枚化アッセイは、同じファミリーのIRF5と同様の転写因子であり、過去20年間に開発され、広く使用されています^32.広範なテストとトラブルシューティングにもかかわらず、Laemmli Tris-glycine システムを使用して IRF5 モノマーとダイマーを解決するのと同じプロトコルを適用できませんでした。この記事で説明するプロトコルは、IRF3プロトコルで使用されるトリスグリシン単一パーセントゲルとは非常に異なる化学を有するBis-Tris勾配ゲルを使用しています。ゲル電気泳動系の異なるpHおよび化学組成は、IRF3およびIRF5の様々な形態を区別する上で重要でありうたである。実際、IRF3およびIRF5は、同様である一方で、異なるゲルシステム上で分離されている間に異なる挙動をもたらす可能性が異なる特性(例えば、等電点および修飾部位)を有する。

DOC を含む 1x ネイティブ PAGE 実行バッファーがゲル実行に使用されました。DOCが非特異的タンパク質を沈殿させた結果として、白色沈殿物が上部のチャンバー内の溶液を曇らせるのを避けるために、バッファーを新鮮に調製するか、または清潔でタンパク質のない環境に保つ必要があります。抽出された内因性IRF5サンプルは、できるだけ早くネイティブPAGEに従うことを強くお勧めします。さもなければ、著しいタンパク質分解が生じる可能性がある。劣化は-80°Cと-20°Cの両方で貯蔵で観察される。さらに、SDS実行バッファとTBST洗浄バッファのpHはRTで調整する必要があります。

各ウェルにロードされたサンプルの理想的な最終容積は10−15 μLでしたが、セルタイプによってはわずかな調整が必要になる場合があります。最初の走行時間は85Vで30分間、IRF5モノマーとダイマーの明確な分離と分解能を得るために、約2~3時間150Vでゲルを走り続けることをお勧めします。実行が終了した後、上部の3%から下部の12%に向かって増加する密度の差分レベルのために、その下端から細心の注意を払ってゲルを処理することが最も重要です。この場合、使用済みのランニングバッファーに浸漬してプレートからゲルを取り出すことを好ましく、摩擦を最小限に抑え、ゲルがプレートから離れて破損を避けることができます。

このプロトコルのいくつかのマイナーな欠点は、所望の結果を達成するために利用可能なゲルの限られた選択を含みます。自家製ゲルと市販のゲルのいくつかの他のブランドは、成功せずにテストされています。私たちの手の中では、市販のランニングバッファとゲルシステムの使用は、自家製バッファの広範なテストが行われていないが、このプロトコルの堅牢性と再現性に貢献しました。細部への注意は不可欠であり、経験は明確な結果を得る上で成功の鍵です。最後に、IRF5の分解能は、モノマーとダイマーの理想的な分離を得るために長い時間(すなわち、2−3 h)を必要としました。将来のさらなる強化と変更により、効率が向上し、このプロトコルの欠点を最小限に抑えることができます。

結論として、このプロトコルは、内因性IRF5モノマーおよびダイマーの検出のための堅牢なアッセイである。内因性IRF5を発現する様々なヒトおよびマウス細胞型の用途に適しています。様々な細胞タイプのIRF5調節経路およびシグナル伝達成分を研究する貴重なツールとなります。

著者は何も開示していない。

このプロジェクトは、クローチャー財団とシティ大学のスタートアップファンドからの資金援助によって支援されました。私たちは、原稿の実験と批判的な読書の助けをチャウ研究所のすべてのメンバーに感謝します。