Análise imunoblot da electroforese do gel do polyacrylamide nativo da dimerization IRF5 endógena

Um método ocidental nativo do borrão para analisar o dimerização regulador endógeno do fator 5 do interferon na linha de pilha dendríticas do plasmacytoid Cal-1 é descrito. Este protocolo pode ser aplicado a outras linhas de célula também.

O fator regulador 5 do interferon (IRF5) é um fator chave da transcrição para regular a resposta imune. É ativado a jusante da via de sinalização do gene de resposta primária 88 (TLR-MyD88) da diferenciação Myeloid do receptor Toll-like. A ativação do IRF5 envolve a fosforilação, a dimerização e a subsequente translocação do citoplasma para o núcleo, que por sua vez induz a expressão gênica de várias citocinas pró-inflamatórias. Um ensaio de detecção para ativação IRF5 é essencial para estudar funções IRF5 e seus caminhos relevantes. Este artigo descreve um ensaio robusto para detectar a ativação IRF5 endógena na linha de célula dendrítica do plasmacytoid humano de CAL-1 (pDC). O protocolo consiste em um ensaio de eletroforese não desnaturante modificado que pode distinguir IRF5 em suas formas de monómero e dímero, proporcionando assim uma abordagem acessível e sensível para analisar a ativação do IRF5.

O fator de regulação do interferão 5 (IRF5) é um importante regulador de transcrição que desempenha um papel proeminente na regulação da resposta imune, particularmente na liberação de citocinas pró-inflamatórias e interferões tipo I (ifns)^{1,2 ,3}. A desregulação do IRF5 é um fator contribuinte em inúmeras doenças auto-imunes, como evidente por vários polimorfismos no locus IRF5 que estão associados com lúpus eritematoso sistêmico, esclerose múltipla, artrite reumatóide, etc.^{4, 5,6,7,8,9,10}. Portanto, um ensaio de detecção robusto para o estado de ativação IRF5 endógena é crucial para compreender as vias reguladoras e os efeitos a jusante da IRF5 em um contexto celular fisiologicamente relevante.

IRF5 é constitutivamente expresso em monócitos, células dendríticas (DCs), células B e^{macrófagos,11}. Como com outros fatores da transcrição da família de IRF, IRF5 reside no citoplasma em seu estado latente. Após a ativação, o IRF5 é fosforilado e forma homodimers, que então translocam para o núcleo e se ligam a elementos regulatórios específicos de genes codificadores tipo I IFNs e citocinas pró-inflamatórias, eventualmente induzindo a expressão desses genes^{1 ,2,11,12,13}. IRF5 regula as respostas imunes inatas a jusante de vários receptores de pedágio (TLRs), como TLR7, TLR 8 e TLR 9, que estão localizados em endossomos e usam MyD88 para sinalização^1,11,14. Estes TLRs reconhecem primeiramente espécies de ácido nucleico extrangeiro tais como o RNA único-encalhado (ssrna) e o ADN unmethylated do CPG que são sintomáticos de uma infecção^15,16,17,18. IRF5 foi demonstrado para regular as respostas imunes contra infecções bacterianas, virais e fúngicas^19,20,21. Considerando IRF5's papel influente e diversificado no sistema imunológico, potencializando ou umedecendo a atividade IRF5 poderia servir como uma nova avenida para o desenvolvimento de agentes terapêuticos²². Portanto, é fundamental desenvolver um protocolo para monitorar o status de ativação do IRF5 endógeno para permitir uma investigação minuciosa das vias e mecanismos que regulam a atividade IRF5 em diferentes tipos de células.

Ao melhor de nosso conhecimento, nenhum ensaio electrophoretic bioquímico ou do gel para a ativação IRF5 endógena foi publicado antes do desenvolvimento deste protocolo. O phosphorylation foi mostrado para ser um primeiro passo importante da ativação IRF5, e um anticorpo IRF5 phosphospecific foi desenvolvido que conduziu à descoberta e à confirmação de um resíduo serina importante para a atividade IRF5¹³. Entretanto, quando o anticorpo detectar claramente o IRF5 fosforilada quando Immunoprecipitated ou overexpressado²³, não detecta a fosforilação IRF5 em um lisado inteiro da pilha em nossas mãos (dados não mostrados). A dimerização é a próxima etapa da ativação do IRF5, e muitos estudos importantes até o momento investigando este passo dependiam da superexpressão de IRF5 com a tag epitope, muitas vezes em tipos de células irrelevantes que normalmente não expressam IRF5^{,11,12 ,24,25}. Estudos prévios mostraram que a IRF5 dimerizada nem sempre pode ser translocada para o núcleo e, portanto, não é necessariamente totalmente ativada^25,26. Um ensaio para a localização nuclear IRF5 endógena foi desenvolvido para avaliar a ativação IRF5 pelo fluxo de imagem citometria²⁷. Este ensaio tem sido aplicado em estudos que foram cruciais para a compreensão da atividade IRF5, especialmente nos tipos de células primárias ou raras^28,29 e avançou grandemente o conhecimento no campo. No entanto, este ensaio baseia-se em um instrumento especializado que não está amplamente disponível para os pesquisadores. Além disso, muitas vezes é necessário investigar os passos iniciais de ativação, enquanto dissecando IRF5 vias reguladoras e identificando os reguladores upstream e componentes da via. Este estudo fornece um ensaio bioquímico robusto e confiável para os eventos de ativação precoce de IRF5 que podem ser realizados em laboratórios equipados com ferramentas de biologia molecular. O protocolo aqui descrito será muito útil na investigação das vias e mecanismos das ações IRF5, especialmente quando combinados com ensaios ortogonais como a análise citométrica do fluxo de imagem da localização nuclear de IRF5^{23, 27,28,30}.

A electroforese nativa do gel do poliacrilamida (página nativa) é um método amplamente utilizado para analisar complexos da proteína^31,32. Ao contrário do dodecylsulfate do sódio a electroforese do gel do poliacrilamida (SDS-PAGE), página nativa separa proteínas com base em seus forma, tamanho, e carga. Igualmente retém a estrutura nativa da proteína sem desnaturação^31,33,34,35. O protocolo apresentado aproveita esses recursos da página nativa e detecta formas monoméricas e diméricas de IRF5. Este método é particularmente importante para a detecção de eventos de ativação precoce, pois não há nenhum anticorpo comercialmente disponível adequado que possa detectar a IRF5 fosforilada endógena. Anteriormente, vários estudos publicados utilizavam a página nativa para avaliar a dimerização do IRF5. No entanto, a maioria desses estudos dependeu da superexpressão do epítopo exógeno-Tagged IRF5 para analisar o status de ativação^{2,13,24,36,37} . Este trabalho apresenta um protocolo passo-a-passo para analisar a dimerização endógena de IRF5 por meio de uma técnica de página nativa modificada em uma linha de células dendríticas de plasmacitoides humanas (pDC), onde a atividade de IRF5 demonstrou ser crucial para sua função^{1, 38,39,40}. Esta mesma técnica foi aplicada a outras linhas celulares²³.

Nota: O protocolo descrito aqui utiliza a linha de célula pDC de CAL-1 tratada com resiquimod (R848), um agonista para TLR7/8. Este protocolo foi aplicado a outros tipos de células humanas e murinas, incluindo RAW 264,7 (linha de macrófago murino), THP-1 (linha celular monocítica humana), BJAB (linha celular B humana), ramos (linha celular B humana) e MUTZ-3 (linha celular dendrítica humana)²³.

1. estimulação das células CAL-1

1. Manter culturas de células CAL-1 em um balão de T75 a 37 ° c e 5% CO₂ em condições estéreis com 20 − 25 ml de meio rpmi 1640 contendo 5% de soro bovino FETAL (FBS), 25 mm de HEPES e 1x mercaptoetanol (i.e., completo rpmi 1640 médio).
2. Transfira as células para um tubo cônico de 50 mL.
   Nota: As células CAL-1 são não aderentes. Para os tipos de células aderentes, a tripsinização padrão pode ser realizada para colher células.
3. Centrifugue as células a 200 x g durante 5 min à temperatura ambiente (RT). Remova o sobrenadante e Ressuspenda o pellet de células em 8 mL do meio completo RPMI 1640 para obter uma suspensão de célula única homogênea.
4. Conte as células usando um Hemocytometer. Semente as pilhas em uma densidade de 1 x 10⁶ pilhas por o poço em uma placa de 6 poços com 4 ml do meio completo pré-aquecido de rpmi 1640 em cada poço. Incubar por 20 − 24 h a 37 ° c e 5% CO₂ para permitir que a confluência atinja 90% − 95% (correspondendo a aproximadamente 1,5 x 10⁶ células).
5. Estimular as células adicionando 4 μL de 1 mg/mL R848 por poço da placa de 6 poços (concentração final de 1 μg/mL). Também configurar um controle não estimulado bem com as células sem o tratamento R848.
6. Assegure-se de que o R848 está uniformemente disperso, balançando suavemente o lado da placa para o lado. Em seguida, incubar as células por 2 − 16 h na incubadora a 37 ° c e 5% CO₂.

2. extração de proteínas celulares

1. Transfira as suspensões de células da placa de 6 poços para tubos de centrifugação de 5 mL.
2. Centrifugador em 200 x g por 5 minutos em RT. Retire o sobrenadante e Ressuspenda o pellet de células em 1 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) para obter uma suspensão homogênea de uma única célula.
3. Transfira a suspensão da célula para um tubo de centrifugação de 1,5 mL.
4. Gire para baixo brevemente em 12.000 x g para 0.5 − 1 minuto em 4 ° c e remova com cuidado o sobrenadante.
5. Prepare o tampão de Lise contendo 6,25 mL de pH Tris-HCl de 1 M 7,4 (concentração final de 25 mM), 7,5 mL de NaCl de 5 M (concentração final de 150 mM), 0,5 mL de EDTA de 0,5 M (concentração final de 1 mM), 2,5 mL de NP-40 (concentração final de 1%) e 7,5 mL de glicerol (concentração final de 5%) em 250 mL de água desionizada (ddH₂O). Adicione o cocktail do único-uso do inibidor de protease 100x a uma concentração final de 1x ao amortecedor do lysis apenas antes de usar. Mantenha o tampão de Lise preparado no gelo.
   Nota: O tampão de Lise sem a protease pode ser armazenado a 4 ° c.
6. Ressuscitar o pellet celular em 30 μL de gelo-frio lise tampão e misture por pipetagem para cima e para baixo.
7. Incubar no gelo por 15 − 20 min.
8. Esclareça o lisado centrifugação a 12.000 x g durante 15 − 20 min a 4 ° c. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de centrífuga 1,5 mL pré-refrigerado. Mantenha os extratos no gelo em todas as vezes.
   Nota: Os lisados de células podem ser armazenados a-20 ° c ou-80 ° c. Não Ferva as amostras.
9. Meça a concentração da proteína usando o reagente de Bradford.

3. análise de IRF5 dimerization por Native PAGE

1. Prepare os amortecedores superiores (-) e inferiores (+) da electroforese da câmara. O tampão superior da câmara consiste em 0,3% desoxicolato do sódio (nadoc) no amortecedor running da página do nativo 1x, e a câmara mais baixa consiste somente no amortecedor running da página 1x nativa.
   Nota: Prepare um buffer de câmara superior fresco para cada nova corrida.
2. Enxágüe um gel nativo da página de 3% − 12% completamente com água sem distortar os poços. Ajuste o gel no mini tanque do gel e remova o pente. Prerun o gel em uma sala fria de 4 ° c ou no gelo em 150 V por 30 minutos.
   Nota: Prerunning remove a amônia excessiva e os íons do persulfato que podem interferir com o funcionamento do gel.
3. Durante o pré-lançamento, prepare as amostras para o carregamento misturando as proteínas celulares mantidas no gelo com 4x tampão de amostra nativa.
4. Após o pré-lançamento, carregar 10 − 15 μg de proteína com um volume final de 10 − 15 μL por amostra.
   Nota: O sobrecarregamento da proteína pode causar manchas.
5. Run gel em 85 V por 30 min, então 150 V para 2 h.
   Nota: Considerando as diferenças em equipamentos e linhas celulares utilizadas por diferentes laboratórios, pequenas modificações na concentração de amostras de proteínas, tensão e tempo de funcionamento podem ser apropriadas para otimizar esse protocolo. Reduzindo a tensão pre-running e running ao aumentar o tempo running pode ajudar a melhorar a definição do dímero e a consistência do resultado.
6. Mergulhe o gel em SDS running buffer (25 mM TRIS pH 8,3, 250 mM Glycine, 0,1% SDS) para 30 min em RT.
   Nota: Nenhuma agitação é exigida. Ocasionalmente, a intensidade da banda pode não ser proporcional à quantidade de proteínas carregadas devido à transferência ineficiente na presença de desoxicolato (DOC), que afeta principalmente a forma monomérica de IRF5. Embebendo o gel no amortecedor running do SDS antes da transferência resolve este problema. O gel é frágil. Manuseie com extremo cuidado da extremidade inferior (i.e., maior percentagem) do gel.

4. análise de immunoblot de IRF5

1. Ative a membrana do difluoreto do polyvinylidene (PDVF) mergulhando a no metanol por aproximadamente 5 minutos.
2. Faça um corte em um canto da membrana para indicar sua orientação. Monte o sanduíche de transferência de acordo com a ordem seqüencial detalhada no protocolo do fabricante com cuidado extra para assegurar-se de que nenhumas bolhas de ar estejam prendidas dentro.
3. Coloque a gaveta de transferência no tanque e transfira a 20 V por 1 h no gelo.
   Nota: Realize todas as incubações e lavagens em etapas subsequentes com um agitador de balanço.
4. Retire a membrana da gaveta com fórceps plástico depois que a transferência é terminada. Bloqueie a membrana no buffer de bloqueio (TBS) por 45 min em RT.
   Nota: TBS buffer com 5% BSA também pode ser usado como um buffer de bloqueio.
5. Incubar a membrana com o anticorpo primário listado na tabela 1. Lave a membrana com 1x TBST tampão de lavagem (20 mM Tris, pH 7,0, 150 mM NaCl e 0,1% Tween 20) para 3 min durante o balanço. Repita a lavagem 2x.

Tabela 1: especificações dos anticorpos utilizados no procedimento de imunoblotação.

6. Incubar a membrana com o anticorpo secundário listado na tabela 1. Lave as membranas durante 3 min em 1x tampão de lavagem TBST. Repita a lavagem 2x.
7. Escaneie o Borrão usando um sistema apropriado da documentação do gel.

O immunoblot (IB) com um anticorpo IRF5 foi executado em pilhas de CAL-1 não estimuladas ou estimulado com 1 μg/mL R848 para 2 h (Figura 1). Os lysates da pilha foram preparados, e o nativo PAGE foi executado. Em células CAL-1 não estimuladas, o IRF5 foi detectado como uma única banda na página nativa, correspondendo à sua forma monomérica. Em cima do tratamento de pilhas de cal-1 com R848 para 2 h, o nível do monômero IRF5 diminuiu com um aumento simultâneo na acumulação de uma faixa lentamente migrando que correspondesse à forma dimérica de IRF5.

Figura 1: IRF5 endógena dimerizado em células Cal-1 quando estimulado com TLR7/8 agonista. As células de CAL-1 não foram tratadas ou tratados com R848 pelo tempo indicado. As amostras da proteína foram resolvidas pelo nativo PAGE e seguidas pelo IB usando o anticorpo IRF5. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O immunoblot com anticorpo anti-IRF5 foi executado em IRF5-overexpressando as pilhas 293T untransfected e transfected com vários constructos. Os lisados celulares foram preparados e a página nativa foi realizada (Figura 2). Nenhum IRF5 foi detectado em células 293T não transfectadas, demonstrando a especificidade do anticorpo IRF5. Uma única faixa correspondente ao IRF5 monomérico só foi detectada nas células de 293T que superexpressam IRF5. Quando constrói a codificação IRF5-ativando proteínas, incluindo nrig (constitutivamente ativo Rig-I), Mavs, e ikkβ foram cotransfected, uma faixa lentamente migrando correspondente à forma de diméricas de IRF5 apareceu. Entretanto, NMDA5 (MDA5 constitutivamente ativo), uma proteína relacionada ao RIG-I, não induziu IRF5 dimerização quando cotransfected.

Figura 2: a Cotransfecção dos fatores ativadores da IRF5 induziu a dimerização IRF5 em células de 293T. As pilhas 293T eram untransfected (pista 1) ou transfected com IRF5 (pista 2) junto com os vários reguladores IRF5 (pistas 3 − 6). As amostras da proteína foram resolvidas pelo nativo PAGE e seguidas pelo IB usando o anticorpo IRF5. NRIG = N-terminal de RIG-I; NMDA5 = N-terminal de MDA5. (Publicado originalmente no jornal de Imunologia. KT Chow, C Wilkins, M Narita, R Green, M Knoll, YM Loo e M Gale Jr. 2018. Diferenciais e sobreposição de programas imunes regulado por IRF3 e IRF5 em células dendríticas Plasmacytoid. J. Immunol. 201 (10) 3036-3050. Copyright © 2018 a associação americana de imunologistas, Inc.²³). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O protocolo descrito aqui é uma página nativa modificada que distingue formas monoméricas e diméricas de IRF5 endógenas. Há poucos estudos relatando a detecção da ativação endógena de IRF5 utilizando a técnica de citometria de fluxo de imagem especializada^23,27,28,30. Este protocolo usa uma técnica comum e reagentes e ferramentas comuns para avaliar o estado de ativação IRF5 endógena durante os primeiros eventos de ativação. O protocolo implica modificações simples a um protocolo nativo padrão da página para permitir a distinção entre as formas monoméricas e diméricas de IRF5. Pode facilmente ser adaptado aos estudos que usam outras linhas de pilha²³. Este protocolo nativo modificado da página pode resolver o IRF5 endógeno em suas duas formas claramente sem interferências não específicas da proteína (Figura 2). A IRF5 endógena de células não estimuladas foi detectada como uma única banda clara neste sistema de gel, enquanto o tratamento com R848 por 2 h resultou no aparecimento de uma banda correspondente a dímeros IRF5 (Figura 1).

Um ensaio de dimerização de página nativa para IRF3, um fator de transcrição semelhante a IRF5 na mesma família, foi desenvolvido e amplamente utilizado nas últimas duas décadas³². Apesar dos testes e da solução de problemas extensivos, nós éramos incapazes de aplicar o mesmo protocolo que emprega o sistema de Laemmli Tris-Glycine para resolver IRF5 monómero e dímero. O protocolo descrito neste artigo utiliza géis de gradiente bis-Tris, que têm uma química muito diferente para os géis de porcentagem única de tris-glicina usados no protocolo IRF3. O pH e a composição química diferentes dos sistemas electrophoretic do gel podem ser cruciais em distinguir as várias formas de IRF3 e de IRF5. Na verdade, IRF3 e IRF5, embora semelhantes, têm propriedades diferentes (por exemplo, pontos isoelétricos e sites de modificação) provavelmente resultando em comportamento diferente, sendo separados em diferentes sistemas de gel.

Um buffer de execução de página nativa 1x contendo DOC foi usado para a execução de gel. O tampão precisa de ser preparado fresco ou mantido em um ambiente limpo e proteína-livre para evitar a aparência dos precipitados brancos que turvação a solução na câmara superior em conseqüência do doc que precipitam proteínas não específicas. É altamente recomendável que as amostras de IRF5 endógenas extraídas sejam submetidas à página nativa o mais rápido possível, preferencialmente dentro de uma semana com ciclos mínimos de congelamento-degelo. Caso contrário, pode haver degradação significativa da proteína. A degradação é observada com armazenamento a-80 ° c e-20 ° c. Além disso, o pH do tampão de execução SDS e o tampão de lavagem TBST devem ser ajustados em RT.

O volume final ideal da amostra carregada em cada poço era 10 − 15 μL, mas os ajustes ligeiros puderam ser exigidos dependendo dos tipos diferentes da pilha. Após a execução inicial em 85 V por 30 min, recomenda-se continuar a funcionar o gel em 150 V por aproximadamente 2 a 3 h para alcançar a separação e a definição distintas do monómero IRF5 e do dímero. Depois que o funcionamento é terminado, é da importância máxima segurar o gel meticulosamente de sua extremidade inferior devido a seus níveis diferenciais de densidade, variando de 3% na parte superior e do aumento para 12% na parte inferior. Neste caso, é preferível remover o gel da placa mergulhá-lo no tampão running usado, que actua como um coxim do impacto para minimizar a fricção e permite que o gel flutue afastado da placa para evitar a ruptura.

Alguns inconvenientes menores deste protocolo incluem a seleção limitada dos géis disponíveis para conseguir os resultados desejados. Géis caseiros e algumas outras marcas de géis comercialmente disponíveis foram testados sem sucesso. Em nossas mãos, o uso de um tampão running comercial e de um sistema do gel contribuiu à robustez e à reprodutibilidade deste protocolo, embora o teste extensivo de bufferes caseiros não fosse executado. A atenção aos detalhes é essencial, e a experiência é fundamental para o sucesso na obtenção de resultados claros. Finalmente, a resolução de IRF5 exigiu um longo tempo (i.e., 2 − 3 h) para obter uma separação ideal do monómero e dímero. Uma melhoria mais adicional e umas modificações no futuro podem melhorar a eficiência e minimizar as desvantagens deste protocolo.

Em conclusão, este protocolo é um ensaio robusto para a detecção de monômero IRF5 endógeno e dímero. É adequado para aplicações em vários tipos de células humanas e murinas expressando IRF5 endógena. Será uma ferramenta valiosa para estudar as vias reguladoras IRF5 e componentes de sinalização em vários tipos de células.

Os autores não têm nada a revelar.

O trabalho foi apoiado pelo financiamento dos fundos de arranque da Fundação Croucher e da City University. Agradecemos a todos os membros do laboratório Chow por ajuda com o experimento e leitura crítica do manuscrito.