原生聚丙烯酰胺凝胶电泳免疫溴分析内源性IRF5二聚化

介绍了一种用于分析CAL-1血浆细胞树突状细胞系内源干扰素调节因子5二聚化的西方原生体斑点方法。该协议也可以应用于其他细胞系。

干扰素调节因子5（IRF5）是调节免疫反应的关键转录因子。它在下游激活类似收费的受体骨髓分化初级反应基因88（TLR-MyD88）信号通路。IRF5活化涉及磷酸化、二聚体化以及随后从细胞质转移到细胞核的中转位，进而诱导各种亲炎细胞因子的基因表达。IRF5活化检测检测对于研究IRF5功能及其相关途径至关重要。本文介绍了一种强大的测定，用于检测CAL-1人类血浆细胞树突状（pDC）生产线中的内源性IRF5活化。该协议包括经过修改的非脱电电泳测定，该测定可以区分IRF5的单体和二分体形式，从而提供一种经济且灵敏的方法来分析IRF5的活化。

干扰素调节因子5（IRF5）是一种重要的转录调节器，在调节免疫反应方面起着显著作用，特别是在释放亲炎细胞因子和I型干扰素（IFN）1，2 ^{， 3.}IRF5 的调节不当是许多自身免疫性疾病的一个促成因素，IRF5 位点中与全身性红斑狼疮、多发性硬化症、类风湿性关节炎等相关的各种多态性就可见一^{斑。5，6，7，8，9，10}.因此，对内源性IRF5活化状态进行强有力的检测检测对于了解IRF5在生理相关细胞环境中的调节途径和下游效应至关重要。

IRF5以单核细胞、树突状细胞（DC）、B细胞和巨噬^细胞1、11组成表达。与其他IRF家族转录因子一样，IRF5存在于细胞质中，处于其潜伏状态。激活后，IRF5被磷酸化并形成同构体，然后转移到细胞核中，并结合编码I型IFN和亲炎细胞因子的基因的特定调控元素，最终诱导这些基因^{的表达1 ，2，11，12，13}.IRF5调节各种收费受体（TVR）下游的先天免疫反应，如TLR7、TLR 8和TLR 9，它们在内体中局部化，并使用MyD88发出信号1，11，14。这些TTL主要识别外来核酸物种，如单链RNA（ssRNA）和未甲基化CpGDNA，这些DNA是感染症状15、16、17、18。IRF5已被证明可以调节对细菌、病毒和真菌感染的免疫反应19，20，21。考虑到IRF5在免疫系统中的影响和多样化作用，增强或抑制IRF5活性可以成为开发治疗^剂22的新途径。因此，必须制定一种协议来监测内源性IRF5的激活状态，以便彻底调查调节不同细胞类型IRF5活性的途径和机制。

据我们所知，在开发本方案之前，尚未发布用于内源性IRF5活化的生化或凝胶电泳测定。磷酸化已被证明是IRF5活化的重要的第一步，并开发了一种磷酸IRF5抗体，导致发现和确认对IRF5^活性13非常重要的丝氨酸残留物。然而，虽然抗体在免疫沉淀或过度^表达23时能清楚地检测磷酸化IRF5，但它未能检测出我们手中整个细胞中IRF5磷酸化（未显示数据）。二聚化是IRF5激活的下一步，迄今为止许多研究这一步的重要研究依赖于表位标记IRF5的过度表达，通常不相干的细胞类型通常不表示IRF5^{11，12 ，24，25}.先前的研究表明，二聚化IRF5不一定总是转入细胞核，因此不一定完全^{激活25，26。}内源性IRF5核定位的测定通过成像流式细胞^测定27评估IRF5的活化。这种测定已应用于对了解IRF5活性至关重要的研究中，特别是在初级或稀有细胞^{类型28，29}中，并极大地促进了该领域的知识。然而，这种检测依赖于一个专门的仪器，这是不广泛提供给研究人员。此外，在剖析 IRF5 监管途径和识别上游调节器和路径组件时，通常需要调查激活的初始步骤。这项研究为IRF5的早期激活事件提供了一个强大而可靠的生化测定，可以在配备分子生物学工具的实验室中进行。此处描述的协议对于研究 IRF5 操作的途径和机制将非常有用，特别是与正交测定（如 IRF5 核定位的成像流细胞测定分析²³） 相结合^{时，27，28，30}.

原生聚丙烯酰胺凝胶电泳（原生PAGE）是一种广泛使用的方法，用于分析蛋白质复合^{物31，32。}与多地硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE） 不同，原生 PAGE 根据蛋白质的形状、大小和电荷分离蛋白质。它也保留原生蛋白质结构，没有变性31，33，34，35。提出的协议利用了原生PAGE的这些特性，并检测了IRF5的单体和二分形式。这种方法对于检测早期激活事件尤为重要，因为没有合适的市售抗体可以检测内源磷酸化IRF5。以前，一些已发表的研究使用本机 PAGE 来评估 IRF5 二分化。然而，这些研究大多依赖于外源表位标记IRF5的过度表达来分析激活状态2，13，24，36，37.这项工作提出了一个分步协议，用于在人类血浆细胞树突状（pDC）生产线中通过改良的原生PAGE技术分析内源性IRF5二聚化，其中IRF5活性已被证明对其^功能1至关重要。 ^38，39，40.同样的技术已经应用于其他细胞^系23。

注:此处描述的协议使用 CAL-1 pDC 细胞系，使用 Resiquimod （R848） 处理，这是 TLR7/8 的激动剂。该协议已应用于其他人类和小鼠细胞类型，包括RAW 264.7（鼠大噬细胞系）、THP-1（人类单细胞系）、BJAB（人类B细胞系）、拉莫斯（人类B细胞系）和MUTZ-3（人类树突状细胞^系）23。

1. CAL-1细胞的刺激

1. 在37°C和5%CO2无菌条件下，在含有5%胎儿牛血清（FBS）、25 mM HEPES和1x汞醇（即完整的RPMI 1640介质）的20~25 mL 1640培养基下，在T75烧瓶中保持CAL-1细胞培养。
2. 将细胞转移到50 mL锥形管中。
   注:CAL-1细胞是非粘附的。对于粘附细胞类型，可以执行标准胰蛋白酶化以收获细胞。
3. 在室温 （RT） 下，在 200 x g下将细胞离心 5 分钟。去除上清液，在8 mL的完整RPMI 1640介质中重新悬浮细胞颗粒，以获得均匀的单细胞悬浮液。
4. 使用血细胞计对细胞进行计数。将每孔密度为 1 x 10⁶的细胞播种到 6 孔板中，每口孔中预热的 4 mL 完整 RPMI 1640 介质。在37°C下孵育20~24小时，_在CO2下孵育5%，使汇合达到90%~95%（相当于大约1.5 x 10⁶个细胞）。
5. 在6口井盘每孔加4μL至1mg/mL R848（最终浓度为1微克/mL）以刺激细胞。此外，无需 R848 治疗即可使用细胞设置未刺激的控制。
6. 通过轻轻摇动板侧对一侧，确保 R848 均匀分散。然后，在37°C和5%CO2的培养箱中孵育细胞2~16小时。

2. 细胞蛋白的提取

1. 将6孔板的细胞悬浮液转移到5 mL离心管中。
2. 在RT下以200 x g离心5分钟，去除上清液，将细胞颗粒重新悬浮在1 mL的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，以获得均匀的单细胞悬浮液。
3. 将细胞悬浮液转移到1.5 mL离心管中。
4. 在 12，000 x g下短暂旋转 0.5–1 分钟，在 4°C 下，小心地去除上清液。
5. 准备含有 6.25 mL 的 1 M Tris-HCl pH 7.4 （最终浓度为 25 mM）、7.5 mL 的 5 M NaCl（最终浓度为 150 mM）、0.5 mL 的 0.5 m L EDTA（最终浓度为 1 mM）、2.5 mL 的 NP-40（最终浓度为 1%）7.5 mL的甘油（最终浓度为5%）在250 mL的去离子水（ddH₂O）。在使用前将100倍蛋白酶抑制剂一次性鸡尾酒添加到1倍的最终浓度的解毒缓冲液中。将准备好的莱沙缓冲液放在冰上。
   注:没有蛋白酶的解液缓冲液可储存在4°C。
6. 将细胞颗粒重新悬浮在30μL的冰冷赖液缓冲液中，通过上下移液混合。
7. 在冰上孵育15-20分钟。
8. 在4°C下，在12，000 x g下离心15~20分钟，通过离心来澄清裂化。将上清液转移到新的预冷却 1.5 mL 离心管中。随时将提取物保存在冰上。
   注:细胞分物可储存在-20°C或-80°C。不要将样品煮沸。
9. 使用布拉德福德试剂测量蛋白质浓度。

3. 原生 PAGE 对 IRF5 的分解分析

1. 准备上部 （-） 和下部 （+） 室电泳缓冲器。上腔缓冲液由 1x 本机 PAGE 运行缓冲液中的 0.3% 脱氧胆酸钠 （NaDOC） 组成，下腔室仅包含 1x 本机 PAGE 运行缓冲液。
   注:为每个新的运行准备一个新的上腔缓冲器。
2. 用清水彻底冲洗3%~12%的原生PAGE凝胶，而不会扭曲水井。将凝胶放入迷你凝胶罐中，然后取出梳子。在4°C冷室或150 V的冰上预碾30分钟。
   注:预运行可去除过多的氨离子和过硫酸离子，这些离子会干扰凝胶的运行。
3. 在预置过程中，通过将保存在冰上的细胞蛋白与 4x 原生样品缓冲液混合，准备加载样品。
4. 预处理后，加载10~15μg的蛋白质，每个样品的最终体积为10~15μL。
   注:蛋白质过载会导致涂片。
5. 在 85 V 下运行凝胶 30 分钟，然后运行 150 V 2 小时。
   注:考虑到不同实验室使用的设备和细胞系的差异，对蛋白质样品的浓度、电压和运行时间稍作修改可能适合优化此方案。降低预运行和运行电压，同时增加运行时间，有助于提高二分器的分辨率和结果一致性。
6. 在 RT 将凝胶浸泡在 SDS 运行缓冲液中（25 mM Tris pH 8.3，250 mM 甘氨酸，0.1% SDS）30 分钟。
   注:无需搅拌。有时，由于脱氧胆酸酯 （DOC） 的存在，由于低氧胆汁 （DOC） 的存在，蛋白质的输送效率低，因此带的强度可能与蛋白质的含量成正比，后者主要影响 IRF5 的单体形式。在转移前将凝胶浸泡在SDS运行缓冲液中可解决此问题。凝胶易碎。从凝胶的底部（即更高的百分比）端非常小心地处理。

4. IRF5的免疫博数分析

1. 将聚苯乙烯二氟化（PDVF）膜浸泡在甲醇中约5分钟，激活该膜。
2. 在膜的一角进行切割，以指示其方向。根据制造商协议中详述的顺序组装转移三明治，并格外小心，以确保没有气泡被困住。
3. 将转印盒放入油箱，在 20 V 下在冰上传输 1 小时。
   注:在后续步骤中使用摇摇器执行所有孵育和洗牌。
4. 传输完成后，用塑料钳从盒中取出膜。在RT处将膜阻塞缓冲液（TBS）45分钟。
   注:具有 5% BSA 的 TBS 缓冲区也可用作阻塞缓冲区。
5. 用表1所列原抗体孵育膜。在摇动时，使用 1x TBST 洗涤缓冲液（20 mM Tris、pH 7.0、150 mM NaCl 和 0.1% 补间 20）清洗膜 3 分钟。重复洗涤 2 次。

表1:免疫印迹过程中使用的抗体规格。

6. 用表1所列的二级抗体孵育膜。在 1x TBST 洗涤缓冲液中清洗膜 3 分钟。重复洗涤 2 次。
7. 使用适当的凝胶文档系统扫描污点。

带有抗IRF5抗体的免疫球（IB）在CAL-1细胞上进行未刺激或刺激的1μg/mL R8482小时（图1）。细胞内分物制备，并执行本机PAGE。在未刺激的CAL-1细胞中，IRF5被检测为原生PAGE上的单个带，与其单体形式相对应。在用R848治疗CAL-1细胞2小时后，IRF5单体水平随着与IRF5的二分状的缓慢迁移带的积累而同时增加而降低。

图1:使用TLR7/8激动剂刺激时，在CAL-1细胞中二聚。CAL-1细胞在指定时间内未经治疗或用R848治疗。蛋白质样本由原生PAGE解析，然后使用抗IRF5抗体进行IB。请点击此处查看此图的较大版本。

用抗IRF5抗体的免疫球体在IRF5-过度表达的293T细胞上进行未转染和转染的各种结构。细胞莱沙被制备，并执行本机PAGE（图2）。在未转染的293T细胞中未检测到IRF5，表明抗IRF5抗体的特异性。仅在293T细胞中检测到与单体IRF5对应的单波段，该细胞过度表达IRF5。当构造编码IRF5激活蛋白，包括NRIG（构成活性RIG-I），MAVS和IKK+被共转，一个缓慢迁移的带对应于IRF5的二分形式。然而，NMDA5（构成活性MDA5）是RIG-I的一种相关蛋白质，在共转染时没有诱导IRF5二分法化。

图2:IRF5激活因子的共变诱导293T细胞中的IRF5二聚化。293T 电池未转染（通道 1）或与 IRF5（通道 2）以及各种 IRF5 稳压器（通道 3⁄6）进行转染。蛋白质样本由原生PAGE解析，然后使用抗IRF5抗体进行IB。NRIG = RIG-I 的 N 终端;NMDA5 = MDA5 的 N 端子。（最初发表在《免疫学杂志》上。KT Chow， C 威尔金斯， M 成田， R 格林， M 诺尔， YM Loo 和 M Gale Jr. 2018.由IRF3和IRF5在血浆细胞中调节的差分和重叠免疫程序。J. 免疫学.201 (10) 3036-3050.版权所有 © 2018 美国免疫学家协会， Inc.²³.请点击此处查看此图的较大版本。

此处描述的协议是经过修改的本机 PAGE，它区分了内源性 IRF5 的单体和二分形式。很少有研究报告使用专门的成像流细胞测定技术23，27，28，30检测内源性IRF5活化。该协议使用常用技术和常用试剂和工具来评估激活早期事件的内源性 IRF5 激活状态。该协议需要对标准的本机 PAGE 协议进行简单的修改，以便区分 IRF5 的单体和二分形式。它可以很容易地适应使用其他细胞^系23的研究。这种经过修改的本机PAGE协议可以清楚地解析其两种形式的内源性IRF5，没有非特异性蛋白质干扰（图2）。从这个凝胶系统中，从未刺激的细胞中检测出无刺激的IRF5为明显的单带，而使用R848治疗2小时导致出现与IRF5二聚子对应的带（图1）。

IRF3的原生PAGE二分测定，是同一家族中与IRF5相似的转录因子，在过去二十年中已经开发并^{广泛使用32。}尽管进行了广泛的测试和故障排除，我们仍无法应用使用莱姆利 Tris-甘氨酸系统解决 IRF5 单体和二丁二体的相同协议。本文中描述的协议使用 Bis-Tris 梯度凝胶，其化学性质与 IRF3 协议中使用的 Tris-甘氨酸单百分比凝胶具有非常不同的化学性质。凝胶电泳系统的不同pH和化学成分对于区分IRF3和IRF5的各种形式的可能是至关重要的。事实上，IRF3 和 IRF5 虽然相似，但具有不同的特性（例如，等电点和修饰位点），在不同的凝胶系统上分离时，可能导致不同的行为。

含有 DOC 的 1x 本机 PAGE 运行缓冲液用于凝胶运行。缓冲液需要新鲜准备或保存在清洁和无蛋白质的环境中，以避免由于DOC沉淀非特异性蛋白质而使溶液在上腔中出现白色沉淀。强烈建议尽快将提取的内源性IRF5样品放在原生PAGE中，最好在一周内，以最小的冻融周期进行。否则，可能会有显著的蛋白质降解。在-80°C和-20°C的存储中观察到降解。此外，SDS 运行缓冲液和 TBST 洗涤缓冲器的 pH 应在 RT 处进行调整。

每口井中加载的样品的理想最终体积为10~15 μL，但可能需要根据不同的细胞类型进行细微调整。在 85 V 初始运行 30 分钟后，建议在 150 V 下继续运行凝胶约 2 到 3 小时，以实现 IRF5 单体和二分器的明显分离和分辨率。运行完成后，由于凝胶的密度水平不同，从顶部的 3% 到底部的 12% 不等，因此从底部精心处理凝胶至关重要。在这种情况下，最好将凝胶浸入用过的运行缓冲液中，将其从板中取出，作为冲击垫，以尽量减少摩擦，并允许凝胶从板中浮离，以避免破损。

该协议的一些小缺点包括有限的凝胶选择，以达到预期的结果。自制凝胶和其他几个品牌的商用凝胶已经测试成功。在我们手中，使用商业运行缓冲液和凝胶系统有助于该协议的鲁棒性和可重复性，尽管尚未对自制缓冲液进行广泛的测试。注重细节至关重要，而经验是取得明确成果成功的关键。最后，IRF5 的分辨率需要很长时间（即 2⁄3 小时）才能理想地分离单体和二分体。今后进一步改进和修改可以提高效率，最大限度地减少该协议的缺点。

总之，该协议是检测内源性IRF5单体和二聚体的有力测定。它适用于表达内源性IRF5的各种人类和小鼠细胞类型。这将是研究各种细胞类型的IRF5调节途径和信号组分的宝贵工具。

作者没有什么可透露的。

这项工作得到了克劳彻基金会和城市大学创业基金的资助。我们感谢周实验室的所有成员对手稿的实验和批判性阅读的帮助。