İndüksiyon ve birincil insan hücrelerinde hücresel yaşlanma doğrulama

Burada, bir dizi indüksiyon için protokol ve kültürlü hücrelerdeki hücresel yaşlanma doğrulanmasını tartışmak. Biz farklı yaşlanma-inducing uyaranlara üzerinde odaklanmak ve ortak yaşlanma ilişkili işaretçileri miktar açıklayın. Fibroblastlar içerebilen bir model olarak kullanarak teknik ayrıntıları sağlar, ancak iletişim kuralları için çeşitli hücresel modelleri adapte edilebilir.

Hücresel yaşlanma kalıcı hücre döngüsü tutuklama farklı zararlı uyaranlara yanıt olarak aktif bir durumdur. Harekete geçirmek-in hücresel yaşlanma tümör giderme, yenileme ve yaşlanma doku dahil olmak üzere çeşitli patofizyolojik koşullar bir özelliğidir. Hücresel yaşlanma vivo içinde indükleyicileri hala kötü karakterizedir. Ancak, bir dizi uyaranlara hücresel yaşlanma ex vivotanıtmak için kullanılabilir. Bunların arasında en yaygın yaşlanma-indükleyicileri ikileştirici bitkinlik, iyonize ve iyonizan radyasyon, genotoksik uyuşturucu, oksidatif stres ve demethylating ve ajanlar acetylating vardır. Burada, bu uyaranlara fibroblastlar yaşlanma ikna etmek için kullanma hakkında ayrıntılı yönergeler sağlayacaktır. Bu iletişim kuralı kolayca primer hücre ve hücre hatları, kanser hücrelerinin de dahil olmak üzere farklı türleri için adapte edilebilir. Biz aynı zamanda yaşlanma indüksiyon doğrulama için farklı yöntemler açıklanmaktadır. Özellikle, biz lizozomal enzim yaşlanma ilişkili β-galaktozidaz (SA-β-gal), 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) birleşme tahlil, ifadesi hücre döngüsünün düzeyi kullanarak DNA sentezi oranı etkinliğini ölçme üzerinde odaklanmak inhibitörleri p16 ve p21 ve ifade ve salgı üye Senescence-Associated salgı fenotip (SASP). Son olarak, örnek sonuçlar sağlar ve uygulamalar bu iletişim kurallarının tartışmak.

1961'de Hayflick ve Moorhead kültür birincil fibroblastlar sonra art arda pasajlar¹proliferatif potansiyellerini kaybetmek bildirdi. Bu işlem sıralı telomerlerin kısalma her hücre bölünmesi sonra neden olur. Telomerlerin eleştirel kısa uzunluğu ulaştığında, nükleer silahların yayılmasına karşı geri dönüşü olmayan bir tutuklama etkinleştiren DNA hasarı yanıt (DDR) tarafından tanınır — de ikileştirici yaşlanma tanımlanır. İkileştirici yaşlanma Şu anda hücre mitogens hem apoptotik sinyal^2,3duyarsız işler kalıcı hücre döngüsü tutuklama durumunu ikna etmek için bilinen birçok uyarinin biridir. Yaşlanma program normalde yüksek lizozomal etkinlik, mitokondrial disfonksiyon, nükleer değişiklikleri, kromatin düzenlemeler, endoplazmik retikulum stres, DNA hasarı ve yaşlanma ilişkili dahil olmak üzere ek özellikler ile karakterizedir salgı fenotip (SASP)^3,4. Senescent hücreleri vücutta birden fazla işlevi var: geliştirme, yara iyileşmesi ve tümör bastırma². Aynı şekilde, yaşlanma ve paradoksal olarak, tümör ilerleme⁵önemli bir rol oynamak için bilinir. Yaşlanma negatif ve kısmen çelişkili etkileri genellikle için SASP⁶atfedilen.

Son zamanlarda, bu fareler senescent hücrelerden ortadan kaldırılması ömrü uzatma ve yaşlanma özellikleri^7,8,9,10,11, çoğunu ortadan kaldırılması yol gösterildi ¹². aynı şekilde, birden çok uyuşturucu da senescent hücreleri (senolytics) ortadan kaldırmak için veya SASP^13,14hedeflemek için geliştirilmiştir. Anti-aging tedavi potansiyel son zamanlarda alanına daha fazla dikkat çekti.

Çalışma mekanizmaları için hücresel yaşlanma ilişkili ve farmakolojik müdahaleler için gösterimleri özellikle de insan birincil fibroblastlar ex vivo modellerinde güveniyorsun. Ortak bazı özellikleri farklı yaşlanma indükleyicileri tarafından aktif olmakla birlikte, yaşlanma fenotip büyük bir değişkenlik gözlenen ve hücre türü, uyarıcı ve zaman noktası^{3,15gibi çeşitli faktörlere bağlıdır. 16,17}. Eğitim ve senescent hücreleri hedefleme için heterojenite düşünün zorunludur. Bu nedenle, bu iletişim kuralı bir dizi farklı tedavileri kullanarak birincil fibroblastlar yaşlanma ikna etmek için kullanılan yöntem sağlamayı amaçlamaktadır. Bunu izah gibi yöntemler kolayca diğer hücre tipleri için adapte edilebilir.

İkileştirici yaşlanma dışında biz beş diğer yaşlanma-inducing tedaviler tarif: iyonlaştırıcı radyasyon, ultraviyole (UV) ışınları, doksorubisin, oksidatif stres ve epigenetik değişiklikler (yani promosyon histon asetilasyon veya DNA demethylation) . Hem, iyonizan radyasyon ve UV radyasyon doğrudan DNA hasarına neden ve yaşlanma^18,19uygun doz tetik. Doksorubisin aynı zamanda yaşlanma DNA hasarı üzerinden olmak üzere DNA'ya enterkalasyon tarafından neden olur ve topoizomeraz II işlevi bozmakta ve böylece DNA durdurma mekanizmaları²⁰onarmak. Genlerin yaşlanma için temel ifade normalde histon asetilasyon ve DNA metilasyonu tarafından kontrol edilir. Sonuç olarak, histon deacetylase inhibitörleri (Örneğin, sodyum bütrat ve SAHA) ve DNA demethylating (Örneğin, 5-aza) ajanlar yaşlanma Aksi takdirde normal hücreleri^21,22tetikler.

Son olarak, dört senescent hücrelere ilişkili en yaygın veri işaretleyicilerini açıklanacaktır: yaşlanma ilişkili-β-galaktozidaz (SA-β-gal), DNA sentezi tarafından EdU birleşme tahlil, hücre döngüsü düzenleyiciler overexpression oranı etkinlik ve siklin bağımlı kinaz inhibitörleri p16 ve p21 ve overexpression ve SASP üyeleri salgılanmasını.

1. genel hazırlık

1. D10 orta hazırlayın. Ek DMEM orta-Glutamax ile % 10 FBS ve % 1 penisilin/streptomisin (son konsantrasyonu: 100 U/mL).
2. Steril PBS hazırlayın. Su üretici yönergelerine göre tablet geçiyoruz. Otoklav tarafından sterilize.
3. 1 x tripsin hazırlayın. Tripsin Versene EDTA/10 5 mL seyreltik x 1:10 45 ml steril PBS.
   Not: boyunca protokolünün, kullandığımız yakın olan hücre kültür koşulları fizyolojik koşullar için birincil fibroblastlar. Bu normalde bitmiş ama kullanma %5 O₂ "standart" %20 O yerine olduğu gibi hücreleri 37 ° C ve % 5 CO₂ kuluçkaya anlamına gelir_2.
4. Tüm örnekleri steril koşullarda laminar akış başlık, önlük ve eldiven kullanarak işlemek. Hücreler %20 O₂ ' de (Oda koşulları) yalnızca süre kontrol altında tutmak.

2. indüksiyon yaşlanma

1. İkileştirici yaşlanma
   1. Hücreleri veya onlarla temas halinde olacak herhangi bir malzeme işleme sırasında (pipets, şişeler, medya, vb) iş steril koşullarda, laminar akış başlık, önlük ve eldiven kullanarak. Hücreler %20 O₂ ' de (Oda koşulları) yalnızca süre kontrol altında tutmak.
   2. Tohum 7 x 10⁵ uygun birincil fibroblastlar (PD) D10 10 mL içeren bir T75 şişeye (~9.3 x 10³ hücreleri/cm²) iki katına bir düşük nüfus.
   3. 70-%80 izdiham (3 – 4 gün için düşük bir PD Proliferasyona kültürlerde) ulaşana kadar % 5 CO₂ ve %5 O₂ 37 ° C'de bir hücre kuluçka hücrelerin büyümesine.
   4. 3 mL 1 x tripsin ve ~ 5-7 için kuluçka kullanarak hücreleri ayırmak hücre kültür kuluçka 37 ° c % 5 CO₂ ve %5 O₂dk. Hücreleri düzenli olarak ayırmayı işlemi denetlemek için bir hücre kültür mikroskopla izlemek.
   5. Küresel hücrelerdir D10 9 mL ekleyerek tripsin reaksiyonu durdurur. 10 dakika daha uzun kuluçkaya değil.
   6. Enkaz ve daha küçük parçacıklar süpernatant içinde kalır iken 5 dk. hücreleri bir Pelet Tüp, altındaki oluşturacak için hücreleri 300 x g de spin.
   7. Süpernatant kaldırmak ve hücre Pelet D10 1 ml dağıtılması ve elle sayım için bir otomatik hücre sayaç göre üretici yönergelerine veya Neubauer odası kullanan bir hücre sayısı gerçekleştirmek. Sayım sırasında (Örneğin, Trypan mavi dışlama²³) hücre canlılığı kontrol etmek için bir tahlil içerir.
   8. Bu formülü kullanarak toplu PD Hesapla:
      PD_Yeni 3.32* (LOG(cell number total)-(günlük (numaralı seribaşı cep numarası)) + PDold =
      Hücre sayısı toplam = tüm hücre sayılır: ölü ve canlı.
      Hücre numaralı seribaşı = numaralı seribaşı hücrelerin (8 x 10⁵ hücreleri) sayısı.
      PD_eski tohum anda iki katına nüfus =.
      PD_Yeni = popülasyon (kuluçka sonra) sayma Şu anda iki katına.
      Not: Eğer, 7 x 10⁵ birincil fibroblastlar (PD 35,2) bir T-75 şişesi üzerinde tohumlari ve 4 gün sonra onlar % 80 izdiham ulaşmak ve tekrar ayrılır, şimdi 1.3 x 10⁶ toplam hücre sayım (ölü + canlı).
      PD_Yeni 3.32* = (LOG(1,300,000 cells)-LOG(700,000)) + 35,2
      PD_Yeni 36.1 =
   9. Yeni bir T75, 8 x 10⁵ hücreleri adımları 2.1.2–2.1.8 yinelenen reseed.
      Not: birden fazla arka arkaya pasajlar sonra kültür hücreleri tüm bölme durdurana kadar konfluent almak daha uzun sürer. Bir kez hücre bölünmesi durdurmak, yaşlanma işaretleri ve/veya hasat için aşağı akım uygulamaları sınayın.
   10. Senescent hücrelerin daha büyük boyutunu tam görünür ve henüz düşük hücre sayısı kültür neden olabileceğini göz önünde bulundurun. Böylece, yaşlanma PD kararlı ve kültüründe diğer yaşlanma işaretçileri görünür ne zaman kabul edilebilir (bkz: protokol 3.1-3.5).
       Not: Proliferasyona birincil fibroblastlar denetimi olarak kullanın.
2. İyonizan radyasyon kaynaklı yaşlanma
   1. Hücreleri veya onlarla temas halinde (pipets, şişeler, medya, vb)-ecek var olmak herhangi bir malzeme taşıma sırasında steril koşullar altında bir laminar akış başlık, önlük ve eldiven kullanarak çalışın. Hücreler %20 O₂ ' de (Oda koşulları) yalnızca süre kontrol altında tutmak.
   2. D10 10 mL içeren 7 x 10⁵ uygun birincil fibroblastlar içinde bir T75 şişesi (~9.3 x 10³ hücreleri/cm²) düşük bir PD içinde tohum.
   3. Bir hücre kültür kuluçka %5 CO₂ ve %5 O₂37 ° C'de gecede hücrelerde kuluçkaya.
   4. Gama ışınlama kullanılan makine talimatları doğrultusunda 10 gri hücreleri göstermek.
   5. Hücreleri ortamından Aspire edin ve D10 10 mL ile değiştirin.
   6. D10 10 mL % 5 CO₂ ve %5 O₂ 37 ° C'de bir hücre kültür kuluçka hücrelerde başka bir 10 gün düzenli olarak orta yerine, yaklaşık 3 günde kuluçkaya.
   7. 10 gün sonra yaşlanma işaretler için test ve/veya hücreleri aşağı akım uygulamaları için kullanın.
      Not: aynı PD (önce ışınlama) Proliferasyona birincil fibroblastlar denetimi olarak kullanın.
3. Ultraviyole radyasyon indüklenen-yaşlanma
   1. Hücreleri veya onlarla temas halinde (pipets, şişeler, medya, vb)-ecek var olmak herhangi bir malzeme taşıma sırasında steril koşullar altında bir laminar akış başlık, önlük ve eldiven kullanarak çalışın. Hücreler %20 O₂ ' de (Oda koşulları) yalnızca süre kontrol altında tutmak.
   2. Tohum 1,5 – 2 x 10⁵ uygun birincil fibroblastlar içinde bir iyi bir 6-şey plaka (1.5-2.0 x 10⁴ hücreleri/cm²), düşük bir PD D10 Orta 2 mL ekleyin.
   3. Bir hücre kültür kuluçka %5 CO₂ ve %5 O₂ 37 ° C'de hücreler yerleştirin ve onları en az 5 h için plastik uymak sağlar.
   4. Orta hücrelerden al. 6-şey plaka UV radyasyon odası ortasında yer ve plastik kapağı çıkarın. UVB, 20-30 mJ/cm²ışınlatayım.
   5. Orta iyi başına 2 mL ekleyin.
   6. D10 2 mL % 5 CO₂ ve %5 O₂ 37 ° C'de bir hücre kültür kuluçka hücrelerde başka bir 7 gün düzenli olarak orta yerine, yaklaşık 3 günde kuluçkaya.
      Not: 7 gün sonra hücreler olabilir yaşlanma işaretler için test ve aşağı akım uygulamaları için kullanılan. Aynı PD (önce ışınlama) Proliferasyona birincil fibroblastlar denetimi olarak kullanın.
4. Doksorubisin kaynaklı yaşlanma
   1. Doksorubisin hisse senedi çözüm x 1000 hazırlamak: 1 x PBS doksorubisin bir 250 µM hazır olun, çözüm ve steril tüp başına 500 µL aliquot filtre sterilize. Doksorubisin hisse senedi-80 ° C'de depolayın
   2. Hücreleri veya onlarla temas halinde (pipets, şişeler, medya, vb)-ecek var olmak herhangi bir malzeme taşıma sırasında steril koşullar altında bir laminar akış başlık, önlük ve eldiven kullanarak çalışın. Hücreler %20 O₂ ' de (Oda koşulları) yalnızca süre kontrol altında tutmak.
   3. D10 10 mL içeren 7 x 10⁵ uygun birincil fibroblastlar içinde bir T75 şişesi (~9.3 x 10³ hücreleri/cm²) düşük bir PD içinde tohum.
   4. Bir hücre kültür kuluçka %5 CO₂ ve %5 O₂37 ° C'de gecede hücrelerde kuluçkaya.
   5. 1.000 doksorubisin hisse senedi çözüm D10 11 ml nihai bir konsantrasyon için x 11 µL seyreltik 250 nM.
   6. Hücreleri ortamından Aspire edin ve D10 + doksorubisin 10 mL ile değiştirin.
   7. Tam olarak 24 h % 5 CO₂ ve %5 O₂37 ° C'de bir hücre kültür kuluçka için hücreleri kuluçkaya.
   8. Hücreleri ortamından Aspire edin ve dikkatli bir şekilde bir kez D10 10 mL ile yıkayın.
   9. D10 10 mL hücrelerde 6 gün düzenli olarak orta yerine, yaklaşık her 3 günde bir başka kuluçkaya.
   10. Gün 7, yaşlanma işaretler için test ve/veya aşağı akım uygulamaları için kullanın.
       Not: D10 araç (PBS) 1:1,000 ile 24 h için tedavi aynı PD birincil fibroblastlar Proliferasyona kullanımını denetlemek gibi.
5. Oksidatif stres kaynaklı yaşlanma
   1. Hücreleri veya onlarla temas halinde olacak herhangi bir malzeme işleme sırasında (pipets, şişeler, medya, vb) iş steril koşullarda laminar akış başlık, önlük ve eldiven kullanarak. Hücreler %20 O₂ ' de (Oda koşulları) yalnızca süre kontrol altında tutmak.
   2. D10 10 mL içeren 7 x 10⁵ uygun birincil fibroblastlar içinde bir T75 şişesi (~9.3 x 10³ hücreleri/cm²) düşük bir PD içinde tohum.
   3. Bir hücre kuluçka %5 CO₂ ve %5 O₂37 ° C'de gecede hücrelerde kuluçkaya.
   4. Bir çözüm ~ 200 mikron hidrojen peroksit D10 orta D10 11 mL % 30 hidrojen peroksit 22,6 μL ekleyerek hazırlayın.
      Not: toksisitesi değerlendirmek için eğri doz-yanıt yaparak tedavi faiz hücre türü için en iyi duruma getirme.
   5. Hücreleri ortamından Aspire edin ve taze hazırlanmış D10 orta + hidrojen peroksit 10 mL ekleyin. %5 CO₂ ve %5 O₂37 ° C'de 2 h için kuluçkaya.
   6. Hücreleri ortamından Aspire edin ve bir kez taze D10 olmadan hidrojen peroksit ile yıkayın.
   7. D10 olmadan hidrojen peroksit 10 mL ekleyin.
   8. Bir hücre kültür kuluçka %5 CO₂ ve %5 O₂37 ° C'de 48 h için kuluçkaya.
   9. Adımları 2.5.4–2.5.8 iki kat daha fazla toplam üç tedaviler için yineleyin.
   10. Yaşlanma işaretçileri veya hasat aşağı akım uygulamaları için kontrol edin.
       Not: Gibi kullanım 22,6 µL D10 steril su için 2 h ile tedavi aynı PD Proliferasyona hücrelerin kontrol.
6. Yaşlanma epigenetically indüklenen
   1. Hisse senedi ve çalışma çözümleri Tablo 1göre kullanmak küçük molecule(s) için hazır olun. Filtre-çözümler sterilize. Aliquot steril tüpler. -20 ° C'de mağaza
   2. Hücreleri veya onlarla temas halinde olacak herhangi bir malzeme işleme sırasında (pipets, şişeler, medya, vb) iş steril koşullarda, örneğin, laminar akış başlık, önlük ve eldiven kullanarak. Hücreler %20 O₂ ' de (Oda koşulları) yalnızca süre kontrol altında tutmak.
   3. D10 10 mL içeren 7 x 10⁵ uygun birincil fibroblastlar içinde bir T75 şişesi (~9.3 x 10³ hücreleri/cm²) düşük bir PD içinde tohum.
   4. Bir hücre kültür kuluçka %5 CO₂ ve %5 O₂37 ° C'de gecede hücrelerde kuluçkaya.
   5. D10 orta + çalışma çözüm 11 mL istenilen tedavi için hazırlayın. Tedavi başına tam seyreltme Tablo 1' de görülebilir.
      1. 1 mM SAHA çalışma çözüm D10 11 ml 11 µL hazırlayın.
      2. 1 M sodyum bütrat çalışma çözüm D10 11 ml 44 µL hazırlayın.
      3. 10 mM 5-aza çalışma çözüm D10 11 ml 11 µL hazırlayın.
         Not: ilgi tarafından hücre türü için tedaviler mesela toksisitesi değerlendirmek için eğri doz-yanıt verme optimize edin.
   6. D10 orta + çalışma çözüm istenilen tedavi için kültür için ekleyin.
   7. Bir hücre kültür kuluçka %5 CO₂ ve %5 O₂37 ° C'de 24 h için kuluçkaya.
   8. Adımları 2.6.4–2.6.6 iki kat daha fazla toplam üç tedaviler için yineleyin.
   9. Uyuşturucu olmadan basit D10 için orta değiştirin.
   10. 3 gün sonra daha fazla hücre senescent ve yaşlanma işaretleri ve aşağı akım uygulamaları test için hazır olur.
       Not: D10 orta + araç ile üç gündür tedavi aynı PD birincil fibroblastlar Proliferasyona kullanımını denetlemek gibi. D10 orta + araç her 24 h o üç gün boyunca yenilenmesi gerekiyor. Araç kullanılan tedavi bağlıdır: 1:1,000 DMSO sodyum bütrat için SAHA ve 5-aza ve 1:250 steril su için.

3. yaşlanma işaretleri

1. Hazırlık
   1. 20 mg/mL X-gal hazırlamak: X-gal 20 mg 1 ml dimethylformamide veya DMSO geçiyoruz. Işıktan korunan-20 ° C'de depolayın.
   2. 0.1 M sitrik asit çözüm hazırlamak: 2.1 g Sitrik Asit Monohidrat su 100 ml geçiyoruz. Oda sıcaklığında saklayın.
   3. 0.2 M sodyum fosfat çözüm hazırlamak: 2,84 dağıtılması g sodyum dibasic fosfat veya sodyum dibasic fosfat 3.56 g kurutmak 100 mL su. Oda sıcaklığında saklayın.
   4. 0.2 M sitrik asit sodyum fosfat pH 6.0 hazırlamak: 36.85 mL 0.1 M sitrik asit çözüm ve 0.2 M sodyum fosfat 63.15 mL geçiyoruz. Küçültme/büyütme tam olarak pH 6.0. Oda sıcaklığında saklayın.
   5. 100 mM potasyum ferrocyanide hazırlamak: 2.1 g potasyum ferrocyanide 50 mL su içinde çözülür. Işıktan korunan 4 ° C'de depolayın.
   6. 100 mM potasyum ferricyanide hazırlamak: 1,7 g potasyum ferricyanide 50 mL su içinde çözülür. Işıktan korunan 4 ° C'de depolayın.
   7. 5 M sodyum klorür hazırlamak: 14.6 g sodyum klorür 50 mL su içinde çözülür. Oda sıcaklığında saklayın.
   8. 1 M magnezyum klorür hazırlamak: 4.8 g magnezyum klorür 50 mL su içinde çözülür. Oda sıcaklığında saklayın.
   9. Hazırlamak % 2 formaldehit + PBS %0,2 oxazolidin: 800 dağıtılması µL % 25 oxazolidin ve 12.5 µL % 16 formaldehit PBS 100 μL içinde. Işıktan korunan oda sıcaklığında saklayın.
   10. Boyama çözüm hazırlamak taze göre Tablo 2.
2. Yaşlanma ile ilişkili β-galaktozidaz boyama
   1. Hücreleri seyrek olması her örnek için 1 x 10⁴ hücreleri bir 24-şey plaka (5.2 x 10³ hücreleri/cm²) içeren 500 µL D10, en az bir iyi tohum. Tedaviler (varsa) doğrudan bu plaka üzerinde gerçekleştirilebilir veya alternatif olarak, zaten tedavi hücreler yeniden bir 24-şey plaka numaralı seribaşı olabilir.
   2. Gecede 37 ° C'de % 5 CO₂ ve %5 O₂hücreleri kuluçkaya.
   3. Hücreleri iki kez PBS 500 μL ile yıkayın.
   4. 3-5 dk PBS %2 formaldehit + %0,2 oxazolidin 500 μL/iyi kullanarak oda sıcaklığında düzeltmek.
   5. Hücreleri iki kez PBS 500 μL ile yıkayın.
   6. Çözüm, leke için örnek sayısına göre boyama taze hazırlayın.
   7. Boyama çözüm (500 µL/de) ekleyin ve buharlaşma önlemek için parafilm ile plaka mühür.
      Not: Buharlaşma kristalleri forma neden olabilir ve mikroskop altında gözlem engel.
   8. 12-16 h için kuru bir kuluçka (CO₂) olmadan 37 ° C'de hücreler karanlıkta (alüminyum folyo kaplıÖrneğin ) kuluçkaya.
      Not: CO₂ pH etkiler ve bu nedenle sonuçları değiştirin. Bazı hücre tipleri daha kısa kuluçka süreleri gerektirebilir.
   9. İki kez PBS 500 μL ile yıkayın.
   10. Sonuçları değerlendirmek. Pozitif hücrelerinin mevcut bir mavi (çoğunlukla) normal ışık mikroskobunda (Şekil 1A) boyama Perinükleer.
   11. Miktar için örnek başına en az 100 hücreleri gözlemlemek ve pozitif hücrelerinin sayısını saymak. Senescent hücreleri şekli Dönüştür beri genellikle hücre kenarlıklarını tanımlamak ve hücreleri saymak için zordur. Görselleştirme ve tek tek hücreler (Şekil 1B) miktar kolaylaştırmak için DAPI ile counterstain. Örnekleri (pozitif hücrelerinin toplam tutarı hücre karşı yüzdesi) ölçmek floresan mikroskop (Şekil 1 c) kullanarak. Böylece sonunda en az 100 tek-hücreleri saymak ve SA-β-gal pozitif hücrelerinin onlara yüzdesi değerlendirmek aynı örnek birden fazla fotoğraf çekmek.
   12. Senescent hücreleri için kullanılan tedavi uygun onların denetimi karşı karşılaştırın.
       Not: Bir EdU ile aynı örnek üzerinde ortak boyama mümkündür. Hücreleri sonra coverslips seribaşı göz önünde bulundurun.
3. EdU birleşme tahlil
   1. Coverslip/iyi değerlendirmek için örnek sayısına göre 24-şey plaka koymak.
   2. 1 x 10⁴ hücre hücreleri seyrek D10 500 µL içeren koşul başına 24-şey plaka (5.2 x 10³ hücreleri/cm²) en az bir iyi tohum. Tedaviler (varsa) doğrudan bu plaka üzerinde gerçekleştirilebilir veya alternatif olarak, zaten tedavi hücreler yeniden bir 24-şey plaka numaralı seribaşı olabilir.
   3. Gecede 37 ° C'de % 5 CO₂ ve %5 O₂hücreleri kuluçkaya.
   4. EdU 20 µM çözeltisi içinde D10 yapmak (1:250) (örnek başına 250 μL) tedavisi için örnek sayısına göre.
   5. Orta (250 μL) yarısı tedavi ve D10 + EdU ile değiştirmek için her şey kaldırmak sadece hazırlanan çözüm. Son EdU 10 µM bölgedir.
   6. 18-24 h hücre kültür kuluçka %5 CO₂ ve %5 O2 ile 37 ° C'de kuluçkaya. Denetim ve senescent hücreleri aynı kuluçka zaman kullanın.
   7. 2 x 500 μL PBS ile yıkayın.
   8. 10 dk için hücreleri 500 μL PBS %4 formaldehit ile düzeltmek.
   9. 100 mm Tris (pH 7,6) 5 dakika içinde 500 μL kuluçkaya.
   10. 500 μL 10 min % 0.1 için hücreleri permeabilize PBS Triton X-100.
   11. 3 x PBS ile yıkayın.
   12. Etiket Mix 50 μL bileşenleri aşağıdaki sıraya göre ekleme her coverslip hazırlamak: PBS, 0.5 µL Cu (II) 44.45 µL SO₄, sulfo-Cy3-azid 0,05 µL, sodyum askorbat 5 µL.
   13. Etiket Mix 50 μL parafilm bir parça üzerine koy. Coverslip bir çift cımbız ve bir iğne yardımı ile Asansör ve üstünde tepe-in etiket karıştırmak, aşağıya doğru bakacak şekilde hücreleri içeren yüzey ile rahat bırak. Orada hava kabarcığı yok ve coverslip tüm yüzey etiket mix dokunuyor emin olun. Karanlıkta 30 dk için kuluçkaya.
   14. Hücreleri 24-şey plaka wells geri koymak ve PBS ile üç kez yıkayın.
   15. Cam slaytlar (DAPI çekirdeği görselleştirmek için de dahil olmak üzere) ortam takma ile dağ ve koyup gecede kuruyuncaya kadar bırakın.
   16. Floresan mikroskop kullanarak EdU birleşme görselleştirin. Cy3 için uygun filtre kullanmak (uyarma/emisyon: 552/570 nm).
   17. Daha sonra miktar koşul (Cy3 ve DAPI) başına en az 100 hücre için hücre birden fazla fotoğraf çekmek.
   18. Aşağıdaki formülü kullanarak EdU dahil hücre yüzdesi ölçmek:
       EdU pozitif hücrelerinin (%) = (EdU pozitif hücre sayısı (Cy3) / toplam hücre sayısı (DAPI)) * 100
   19. Senescent hücreleri için kullanılan tedavi uygun onların denetimi karşı karşılaştırın.
       Not: Bir SA-β-gal ile aynı örnek üzerinde ortak boyama mümkündür. Hücreler hala coverslips üzerinde seribaşı göz önünde bulundurun.
4. Gen ifadesinin p16, p21 ve SASP
   1. Astar-faiz genler (50 µM astar) kümesi hazırlayın.
      Not: P16, p21 ve ilgili bazı SASP faktörler qPCR yaşlanma durumunu bilgilendirici. Protokol burada yapar anlatılan evrensel Probe Kütüphane (UPL) sistemi gerçek zamanlı PCR kullanarak göreli miktar için kullanın. Tablo 3 algılama CDK inhibitörleri p16 ve p21 ve en alakalı SASP üyelerinin yanı sıra tübülin ve aktin, tahlil için referans gen olarak hizmet için kullanılan astar özetini gösterir. Tablo 3 son sütunu her tahlil için kullanılmak üzere belirli UPL sonda çağırır.
   2. Ayrı qPCR reaksiyon mix istenen deneyleri için hazırlayın. Her zaman referans gen Tablo 4göre de içerir.
   3. Tüm örneklerini yinelenen veya nüsha çalıştırın.
   4. Yük 7.5 µL/iyi 384-şey tabakta qPCR reaksiyon karışımı.
   5. ~ 5 ekleyin cDNA ng çözünmüş RNase free su 2.5 µL içinde.
      Not: CDNA karşılaştırılmak üzere tüm örnekleri için benzer miktarda olması tercih edilir. Bu ters transkripsiyon için RNA'ın eşit tutarlar kullanılarak elde edilebilir.
   6. Bir mühür ile plaka kapak ve o doğru bütün kuyuları plaka üzerinde eşit olarak kapsayan sopa emin olun.
   7. 2.000 x g 1 dk. için plaka Döndür.
   8. Kalenin içinde Lightcycler aşağıdaki iletişim kuralını kullanarak 40 devredir çalıştırın:
      7 dk. için 95 ° C
      95 ° C 40 döngüleri 5 s ve 60 ° C 30 s
      1 dk. için 37 ° C
   9. Sonuçları analiz için Livak ve meslektaşları için önerilen yöntem qPCR veri²⁴çözümlemek için kullanın. Başvuru genlerin ΔCt hesaplamak için değer ve hesaplamak için uygun denetimi kullanım kullanın tübülin ya da aktin belirli yaşlanma-inducing tedavisi için ΔΔCt değeri için.
5. Protein ifade ve IL6 salgılanması
   1. Tohum 5 – 10 x 10⁴ hücreleri en az bir iyi D10 2 mL içeren koşul başına 6-şey plaka (5.2-10,5 x 10³ hücreleri/cm²). Tedaviler (varsa) doğrudan bu plaka üzerinde gerçekleştirilebilir veya alternatif olarak, zaten tedavi hücreler yeniden bir 24-şey plaka numaralı seribaşı olabilir. O gecede tohum sonra stand izin.
   2. Orta kaldırın ve DMEM orta FBS2 mL için değiştirin. Normal koşullarda 24 h için kuluçkaya.
   3. 15 mL tüp ortamda toplamak.
   4. Santrifüj örneği 300 x g ' 5 dk. orta-80 ° işlenen kadar C saklanır.
   5. ELISA gerçekleştirmek için üreticinin yönergelerini izleyin.
   6. Belirli yaşlanma-inducing tedavi için uygun denetimi karşı senescent hücrelerin karşılaştırılması

SA-β-gal senescent fibroblastlar boyama zenginleştirme

Β-galaktozidaz (β-gal) bu tüm hücrelerde ifade edilir ve bir optimum pH 4.0^25,26olan lizozomal bir enzimdir. Ancak, yaşlanma sırasında organellerin Boyutu'nda artırın ve sonuç olarak, β-gal senescent hücreleri birikir. Bu enzim artan miktarda bir suboptimal pH 6,0^25,27, bile onun bir etkinlik tespit olanak sağlar. Şekil 1A karşı senescent birincil fibroblastlar Proliferasyona SA-β-gal boyama temsilcisi görüntüleri gösterir. Hücreleri de büyümüş ve düzensiz bir hücre gövdesi ile bakmak. Böylece bir boyama DAPI ile birlikte görselleştirme ve hücre (Şekil 1B) sayma kolaylaştırır belirtildiği gibi tek tek hücreler, ayırt etmek zor olabilir. Bir Floresan Mikroskobu DAPI boyama gözlemlemek için fotoğraf çekmek gereklidir. "Mavi" SA-β-gal boyama resimleri siyah görünmesi bu parlak alan kanal resimleri siyah/beyaz, alınacak anlamına gelir. Not, bir örnek içindeki tüm hücreleri β-gal için olumludur. Yaşlanma indüksiyon verimliliğini uyarıcı ve hücre tipi/kullanılan üzerindeki yükü son derece bağlıdır. Burada açıklanan protokoller vermiştir > % 50 β-gal pozitif hücrelerinin içinde bizim ellerde birincil fibroblastlar (BJ ve WI-38).

Daha az hücre EdU yaşlanma indüksiyon sonra dahil.

EdU bu etkin DNA sentezi sırasında DNA²⁸dahil edilecek nükleozit timidin bir analog var. EdU birleşme DNA içine EdU, alkin grup²⁸yoksun çünkü düzenli timidin gerçekleştirilemez reaksiyon için Copper-Catalyzed azid-alkin cycloaddition (CuAAC) yaptıktan sonra görüntülenmeyecektir. Bu belirli protokol için bir Sulfo-Cy3-azid kullanılıyor. Alkin azid kaplin yerini almıştır hücreleri floresan Cy3 filtre (Şekil 2A) altında görüntülenir. EdU birleşme tahlil gerçekleştirerek, Proliferasyona hücreleri olmayan Proliferasyona hücrelerden ayrılır ki dikkate almak önemlidir. Sigara Proliferasyona hücreler EdU birleşme tahlil hücre döngüsü tutuklama bu iki tür arasında ayırımcılık değil durgun veya senescent, anlamı olabilir.

Senescent fibroblastlar upregulate CDK inhibitörleri p16 ve p21

Senescent hücreleri oluşturmak CDKs inhibitörleri hücre döngüsü²⁹durdurmak için kullanın. Özellikle p16 ve p21 genellikle senescent hücreleri³işaretleri ölçülür. Bir veya her iki işaretleri normal upregulated senescent hücrelerdeki upregulation çoğu zaman transkripsiyon düzeyinde ifade var... Her iki işaretleyiciyi de aynı anda bazı hücreler değil upregulate p16 transkripsiyon düzeyinde ve p21 evrensel ama özgü olmayan kalem yaşlanma^15,17,30için kullanmadan önce teşvik edilmektedir. Şekil 3 p16 temsilcisi göreli quantifications gösterir ve fibroblastlar p21 mRNA yaşlanma için indüklenen. İmmunostaining ve/veya protein düzeyleri tespit etmek için Batı kurutma gibi diğer teknikleri da mümkündür.

Bir SASP senescent fibroblastlar görüntülemek

En senescent hücre transcriptionally upregulate çeşitli genler için kodlama salgılanan proteinler, SASP⁶adı verilen bir fenomen. SASP faktörler katılan inflamasyon, Örneğin, interlökin ve kemokinler dahildir veya hücre dışı matriks (ECM) bozulması, Örneğin, MMPs, ama son derece heterojen. İndüksiyon SASP faktörlerin ya mRNA ifade seviye qPCR üzerinden ya da salgılanan protein ile Enzyme-Linked IMMUNO jelleştirici Assay (ELISA) düzeyi ölçülerek değerlendirilir. Şekil 4 IL6, transkripsiyon ve salgılanan düzeyde upregulation gösterilen bir temsili resim gösterir. Biz sadece bir temsil IL6 kullanılır; Ancak, birden çok protokol 3.4 üzerinde önerilen listeden SASP üyeleri ölçmek için teşvik edilir.

Şekil 1: SA-β-gal senescent birincil fibroblastlar boyama zenginleştirme. BJ birincil sünnet derisi fibroblastlar (PD 34.1) iyonizan radyasyon (10 Gy) açarak yaşlanma için indüklenen. Hücreleri SA-βgal için on gün sonra ışınlama lekeli. SA-βgal (yukarı) tedavi edilmediği veya iyonizan radyasyon (aşağı) maruz BJ birincil fibroblastlar içinde boyama(a)temsilcisi sonuçları elde etmek için. Son büyütme: 100 X. (B) temsilcisi rakam SA-β-gal DAPI ile BJ birincil fibroblastlar için her iki tedavi edilmemiş (üç sol panel) Co lekeli veya (üç doğru panel) iyonlaştırıcı radyasyona maruz. (Mavi) boyama DAPI tek tek hücreler miktar kolaylaştırmak görselleştirmek için yardımcı olur. Parlak sahada çekilmiş olan fotoğraflar siyah/beyaz görünür. Bu nedenle, bu belirli resimleri SA-β-gal boyama siyah Perinükleer noktalar gibi görünür. Son büyütme: 100 X. SA-β-gal pozitif hücre Proliferasyona (Prol., beyaz) (C) miktar BJ fibroblastlar iyonlaştırıcı radyasyona maruz-tedavi karşılıkları (Senatör, mavi) karşı. Miktar standart hata ortalamaya gösterilen hata çubukları ile üç biyolojik çoğaltır kullanılarak gerçekleştirildi. İstatistiksel anlamlılık bir unpaired iki kuyruklu öğrenci t-testi delta-CT değerleri tarafından tespit edilmiştir. (n = 3, ± SEM, *** p değeri = < 0,01). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2: daha az sayıda hücre EdU dahil yaşlanma indüksiyon sonra. (A)temsilcisi görüntü EdU birleşme testin Proliferasyona WI-38 fibroblastlar PD 43.86 (solda) ve iyonlaşma radyasyonlu karşılıkları (sağda). Son büyütme: 100 X. EdU pozitif hücre Proliferasyona (Prol., beyaz) (B) miktar BJ fibroblastlar (PD 38,7) radyoaktif karşılıkları (Senatör, mavi) karşı. Miktar standart hata ortalamaya gösterilen hata çubukları ile üç biyolojik çoğaltır kullanılarak gerçekleştirildi. İstatistiksel anlamlılık kararlı bir unpaired iki kuyruklu öğrenci t-testi delta-CT değerleri tarafından (n = 3, ± SEM, *** p değeri = < 0,01). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: Senescent fibroblastlar upregulate CDK inhibitörleri p16 ve p21. (A)miktar p16 mRNA ifadede Proliferasyona (Prol., beyaz, PD 35,3) veya 5 aza tedavi BJ hücrelerin (Senatör, mavi). (B) miktar p21 mRNA ifade Proliferasyona (Prol., beyaz, PD 35,3) içinde veya 5 aza tedavi BJ (Senatör, mavi) hücreleri. Miktar standart hata ortalamaya gösterilen hata çubukları ile üç biyolojik çoğaltır (her iki teknik çoğaltır) kullanılarak gerçekleştirildi. İstatistiksel anlamlılık kararlı bir unpaired iki kuyruklu öğrenci t-testi delta-CT değerleri tarafından (n = 3, ± SEM, *** = p değeri < 0,01). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4: Senescent fibroblastlar görüntülemek bir salgı fenotip (SASP). BJ fibroblastlar ifadede (A) IL6 miktar mRNA ya Proliferasyona (Prol., beyaz, PD 38,7) veya indüklenen yaşlanma için iyonizan radyasyon (Senatör, mavi) tarafından. (B) miktar IL6 protein ifade Proliferasyona PD 38.6 (Prol., beyaz) veya iyonizan radyasyon tedavi WI38 fibroblastlar (Senatör, mavi). Miktar standart hata ortalamaya gösterilen hata çubukları ile üç biyolojik çoğaltır kullanılarak gerçekleştirildi. QPCR veri söz konusu olduğunda her biyolojik REPLICATE iki teknik çoğaltmaları vardı. İstatistiksel anlamlılık kararlı bir unpaired iki kuyruklu öğrenci t-testi delta-CT değerleri tarafından (n = 3, ± SEM, ***p değeri = < 0,01). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tablo 1: Stok ve çalışma çözümleri farklı Epigenetically kaynaklı yaşlanma için kullanılan tedaviler için.

Tablo 2: Boyama boyama yaşlanma ilişkili (SA) - β - gal için kullanılan çözüm bileşimi.

Tablo 3: Astar dizileri ve onların karşılık gelen UPL mRNA yaşlanma işaretlerinin içinde insan kaynaklı örnekleri algılamak için sonda.

Tablo 4: QPCR reaksiyon bileşimi UPL sistemi için karıştırın.

Burada iletişim kuralları insan birincil fibroblastlar için optimize özellikle BJ ve WI-38 hücreleri. İkileştirici yaşlanma, iyonizan radyasyon ve doksorubisin, protokollerde başarıyla uygulanan diğer türlerini fibroblastlar (HCA2 ve IMR90) ve diğer hücre tipleri (Yani yenidoğan melanosit ve Lenfositi veya IPSC elde edilen cardiomyocytes) Bizim laboratuvarda. Ancak, ek hücre tipleri için uyarlamalar numaralı seribaşı hücreleri, yöntemleri ve hücreler ekleme/ayırma için plastik destekler için yardımcı kimyasallar ve toksisite önlemek için tedavi dozu gibi bazı ayrıntılar ayarlayarak optimize edilebilir.

Birincil fibroblastlar bile kullanımı bir dizi zorluklar teşkil etmektedir. Senescent hücreleri onların Proliferasyona göre daha ayırmak genellikle daha zordur ve çoğu zaman daha fazla duyarlı trypsinization veya diğer herhangi bir tür ayırma yöntemi, ayırma sonra canlılığı biri az olduğu anlamına gelir Proliferasyona hücreleri. Farklı yöntemleri yaşlanma-inducing için uygun denetimi zor bir seçimdir. Örneğin, doksorubisin gibi uyuşturucu dayalı tedaviler araçla kısa bir tedavi öneririm: PBS için 24 saat kontrol örnekleri doksorubisin tedavi hücreler için söz konusu olduğunda hemen hasat/işlem tarafından takip. Yaşlanma için indüklenen hücre tedavisi (altı gün kültür doksorubisin tedavi hücreler için) uygulandıktan sonra bir genişletilmiş kültür zaman geçmesi ve kontrol hücreleri zaman PBS çıkarıldıktan sonra kültürlü eşit miktarda olmalıdır iddia. Ancak, uzun bir kültür hücreleri daha fazla bölmek için aşırı birleşmesi olmak için veya daha fazla passaging gerektirecek şekilde sağlayacak ve PD. aşırı izdiham artırmak için korumak hücreleri rağmen görünmesini SA-β-gal gibi yaşlanma işaretleri neden olabilir onların potansiyel³¹Proliferasyona. Artan PD çoğaltma sınırlarını (ve ikileştirici yaşlanma) onları daha yakın almak ve onları daha az doksorubisin tedavi karşılıkları karşılaştırılabilir olun. Benzer bir durum diğer tedaviler için geçerli olacak. Biz her durum için daha uygun gördüğünüz denetimleri tavsiye ettiler.

Yaşlanma hücreleri uyarmak için kullanılan tekniklerin çoğu nispeten kolay ve düz ileri gibi görünüyor, ancak birçok faktör deneyler sonucu etkileyebilir. Örneğin, normal glikoz konsantrasyonu fibroblastlar için geleneksel hücre kültür ortamının 4,5 g/l. Diğerleri için daha yüksek konsantrasyonlarda erken yaşlanma³³' e neden olabilir ancak, kök hücreler gibi bazı hücre türleri için glikoz düşük konsantrasyonlarda proliferatif onların potansiyel³², genişletebilir. Ayrıca, senescent hücreleri yüksek metabolik ve yüksek miktarda salgılanan faktörler³⁴üretmek için enerji harcamak gibi diğer yaşlanma ilişkili fenotipleri salınımlarını glikoz konsantrasyonlarda tarafından etkilenebilir.

Başka bir potansiyel hücre kültür orta serum değişkendir. Kompozisyon serum normalde tanımlı değildir ve hayvan kaynak ve toplu iş göre değişir. Özellikle, büyüme faktörleri ve pro-inflamatuar protein miktarı yaşlanma³⁵etkileyebilir. Önerdiğimiz bir serum aynı toplu iş için bütün deneyin gereksiz ve karıştırıcı değişkenlik önlemek için kullanılır. Ancak, bazı ELISA tabanlı iletişim kuralları için kullanılan orta serum ücretsiz kullanımı gibi kaçınılmaz bazı teknik koşullar SASP ifade azaltabilirsiniz.

Oksijen gerginlik tam yaşlanma indüksiyon için önemlidir. Böylece hücrelerin prolifere değil ama geri dönüşümsüz tutuklandı³⁶değildir hipoksi geroconversion, inhibe olabilir. Ancak, en yaygın sorun deneysel kurulumunda hipoksi ama hyperoxia değildir. Nitekim, standart kültür koşulları kez % 20 oksijen "normoxia" kullanın., ancak çoğu hücre tipleri için fizyolojik şartlarda düşüktür. Fare blastokistlerin mevcut yaşlanma (SA-βgal ve DNA hasarı) işaretleri ne zaman % 20 oksijen, onların içinde vivoaksine, kültürlü-türetilmiş karşıtları ya da %5 oksijen³⁷, kültürlü aynı hücreleri. Ayrıca, fare fibroblastlar daha fazla fizyolojik şartlarda (%3 oksijen) ve geleneksel görüntü olanlar (% 20 oksijen) SASP³⁸kültürlü. Burada, tüm kültürler için %5 oksijen kullandık ve deneyler ve biz araştırmacılar ilgi belirli hücre türü için kullanılan oksijen konsantrasyonları yeniden gözden geçirilmesi için çağırıyorum.

Son olarak, başka bir faktör dikkate senescent hücrelerin içsel heterojenite olduğunu. Bir taraftan, farklı hücre tipleri ve hatta hücre suşları yaşlanma ilişkili fenotipleri farklılıkları görüntülemek. Ayrıca, bir upregulation görmek nerede rağmen gösterildiği Şekil 3A, olduğu gibi örneğin fibroblastlar bazı suşları değil upregulate p16 yaşlanma indüksiyon^15,16,17, üzerine transkripsiyon düzeyinde yapmak P16, bu istatistiksel olarak anlamlı değildi. Protein düzeyleri ölçme bazı durumlarda bu CDK inhibitörü artan bir faaliyet göstermek bu yüzden P16 translasyonel ve translasyon düzeyinde de kontrol edilir. Ancak, bazı hücreler diğer CDK inhibitörleri p21 gibi sadece güveniyor olabilir. İkisi de transkripsiyon düzeylerini ölçme tavsiye ediyoruz. SASP tam bileşimi de³ürettiği cepten bağlıdır. Ayrıca, bazı hücreler yapısal β-galaktozidaz, SA-β-gal Bu yaşlanma³mutlaka göstergesi değildir boyama için olumlu bir sonuç veren yüksek seviyede hızlı. Bazı durumlarda, bu sorunu SA-β-gal boyama protokolü sırasında boyama çözüm ile kuluçka zamanı azaltarak aşmak. Belirtildiği gibi aşırı birleşmesi hücreleri de SA-β-gal ile onlar biz araştırmacılar bu boyama gerçekleştirmek için seyrek kültür hücrelere teşvik senescent³¹, varlık olmadan leke. Öte yandan, yaşlanma fenotip istikrarlı³⁹değil. SASP bileşimi ve yaşlanma diğer işaretleri görünümünü çoğu saat-bağımlı^17,40. Burada, hangi hücrelerin her tedavi sonrası zaman puan tamamen senescent olarak kabul edilir ve rutin olarak bizim Laboratuvarda kullanılan tavsiye ettiler. Önemlisi, işaretçileri daha kısa bir zamanda noktada ölçüm eksik yaşlanma⁴⁰nedeniyle olumsuz sonuçları render. Beri senescent tedaviler çoğunda hücreler yüzdesi haline değil, Ayrıca, uzun bir zaman noktası kullanarak genişletmek ve ifade senescent işaretleri azaltır kültür sollamak kaç senescent hücre için yeterli zaman verebilir. Senescent hücreleri heterojen ve farklı veri işaretleyicilerini birden çok uyarılar görünümlerinde, biz son derece araştırmacılar aynı örnek içinde birden çok yaşlanma işaretleri kullanmak için teşvik.

N/A

Biz üyeleri verimli tartışmalar için yönetici laboratuar ve Thijmen van Vliet veri ve iletişim kuralı UV kaynaklı yaşlanma üzerinde paylaştığınız için teşekkür ederiz.