유도 및 기본 인간 세포에서 세포 노화의 유효성 검사

여기, 우리 유도 대 한 프로토콜의 시리즈 및 경작된 한 세포에 세포 노화의 유효성 검사를 설명합니다. 우리는 다른 노화 유도 자극에 집중 하 고 일반적인 노화 관련 마커의 정량화를 설명. 우리 모델, 섬유 아 세포를 사용 하 여 기술 정보를 제공 하지만 프로토콜은 다양 한 휴대 전화 모델에 적용할 수 있습니다.

세포 노화의 영구 세포 주기 검거 다른 손상 자극에 반응에서 활성화 상태입니다. 세포 노화의 활성화는 다양 한 병 태 생리 조건 종양 억제, 조직 리 모델링 및 노화 등의 특징입니다. Vivo에서 세포 노화의 inducers는 아직도 가난 하 게 특징 이다. 그러나, 자극의 수 ex vivo세포 노화 촉진 사용할 수 있습니다. 그 중 가장 일반적인 노화-inducers 일차 피로, 이온화 및 비 이온화 방사선, 차적인 약물, 산화 스트레스, 그리고 demethylating와 acetylating 대리인 있습니다. 여기, 우리가 노화에 섬유 아 세포를 유도 하는 것이 자극을 사용 하는 방법에 자세한 지침을 제공 합니다. 이 프로토콜은 쉽게 1 차 셀 및 셀 라인, 암 세포를 포함 하 여 다른 유형의 적용할 수 있습니다. 우리는 또한 노화 유도의 유효성 검사를 위해 다른 방법을 설명합니다. 특히, 우리는 lysosomal 효소 노화 관련 된 β-galactosidase (SA-β-gal), 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (듀) 합동 분석 결과, 세포 주기 식의 레벨을 사용 하 여 DNA 합성의 속도의 활동을 측정에 초점 억제제 p16, p21, 식 그리고의 Senescence-Associated 분 비 형 (SASP)의 분 비. 마지막으로, 우리 예제에서는 결과 제공 하 고 이러한 프로토콜의 응용 프로그램을 추가 논의.

1961 년, Hayflick와 무어 헤드 문화에 기본 fibroblasts 연속 구절¹후 그들의 증식 잠재력을 잃고 보고. 이 프로세스는 각 세포 분열 후 telomeres의 순차 단축에 의해 발생 합니다. Telomeres 비판적으로 짧은 길이 도달, 그들은 활성화 확산의 돌이킬 수 없는 체포 하는 DNA 손상 응답 (DDR)에 의해 인식 됩니다-또한 일차 노 쇠로 정의. 일차 노화 현재 구분 mitogens와 apoptotic 신호^2,3셀을 렌더링 하는 영구 세포 주기 검거의 상태를 유도 하는 것으로 알려져 있습니다 많은 자극 중 하나입니다. 노화 프로그램은 일반적으로 높은 lysosomal 활동, 미토 콘 드 리아 기능 장애, 핵 변화, chromatin 재배열, 바인딩과 그물 스트레스, DNA 손상 및 노화 관련을 포함 하 여 추가 기능 특징 분 비 형 (SASP)^3,4. 노화 세포는 신체에 여러 기능을가지고: 개발, 상처 치유 및 종양 억제². 똑같이, 그들은 노화와, 역설적으로, 종양 진행⁵에서 중요 한 역할을 알려져 있습니다. 노화의 부정, 그리고 부분적으로 모순 된 효과 종종 SASP⁶에 기인 된다.

최근에, 그것은 생쥐에서 노화 세포의 수명 연장 하 고 노화 기능^7,,89,10,11, 의 많은 것의 제거에 지도 표시 했다 ¹². 같은 방식으로, 여러 약물 개발 되었습니다 하거나 노화 세포 (senolytics)를 제거 하거나 대상 SASP^13,14. 안티 에이징 치료 잠재력 최근 분야에 더 많은 관심을 모으고 있다.

세포 노화에 관련 된 메커니즘의 연구 그리고 약리학 내정간섭에 대 한 검 진 무 겁 게 비보 전 모델, 특히 인간의 기본 fibroblasts에 의존. 노화 표현 형에 있는 큰 가변성 관찰 이며 셀 유형, 자극 및 시간 포인트^{3,15, 등 다양 한 요인에 따라 다양 한 노화 inducers에 의해 활성화 하는 몇 가지 일반적인 기능을 확인 하 고는, 16,17}. 공부 및 노화 세포를 대상으로 고려 하는 것이 필수적입니다. 따라서,이 프로토콜 일련의 다른 치료를 사용 하 여 기본 섬유 아 세포에서 노화를 유도 하는 데 사용 하는 메서드를 제공 하는 것을 목표로. 로 설명 될 것입니다 방법을 쉽게 다른 셀 형식에 적용할 수 있습니다.

일차 노화 외에도 다른 5 노화 유도 치료 설명: 이온화 방사선, 자외선 (UV) 방사선, 독 소 루비, 산화 긴장 및 epigenetic 변화 (즉 histone acetylation 또는 DNA demethylation의 진흥) . 둘 다, 이온화 방사선 및 자외선 직접적인 DNA 손상 그리고, 적절 한 복용량에 트리거 노화^18,19. 독 소 루비 또한 DNA 손상을 통해 주로 노화 DNA로 intercalating 하 여 원인과 topoisomerase II 기능을 방해 하 고 따라서 중단 DNA 수리 메커니즘²⁰. 노화에 대 한 필수적인 유전자의 표현은 일반적으로 histone acetylation와 DNA 메 틸 화에 의해 제어 됩니다. 결과적으로, DNA demethylating (예를 들어, 5-아 자) 에이전트 및 히스톤 deacetylase 억제제 (예를 들면, 나트륨 낙 산 염 및 사 하) 그렇지 않으면 정상 세포^21,22노화를 트리거합니다.

마지막으로, 노화 세포에 관련 된 가장 일반적인 마커의 4 설명 될 것 이다:는 노화 관련-β-galactosidase (SA-β-gal) 듀 합동 분석 결과, 세포 주기 규칙의 overexpression에 의해 DNA 종합의 비율의 활동 및  종속 kinase 억제제 p16, p21, 및 overexpression 멤버는 SASP의 분 비

1. 일반 준비

1. D 10 매체를 준비 합니다. DMEM 매체-Glutamax 10 %FBS 1% 페니실린/스와 보충 (최종 농도: 100 U/mL).
2. 살 균 PBS를 준비 합니다. 제조업체의 지침에 따라 물에 정제 분해. 압력솥에 의해 소독.
3. 1 x 트립 신을 준비 합니다. 트립 신-Versene EDTA/10의 5 mL를 희석 1:10 살 균 PBS의 45 mL에 x.
   참고: 프로토콜을 통해 우리가 사용 하 여 가까이 있는 셀 문화 조건에 생리 적인 기본 fibroblasts에 대 한 조건. 이 의미는 우리가 품 어 37 ° C, 5% CO₂ 셀 5% O₂ "표준" 20 %O 일반적으로 수행 하지만 사용은_2.
4. 층 류 흐름 후드, 실험실 코트와 장갑을 사용 하 여 메 마른 조건에서 모든 샘플을 처리 합니다. 처리 되는 동안에 20% O₂ (룸 조건)에서 세포를 유지.

2입니다. 노화의 유도

1. 일차 노화
   1. 셀 또는 그들과 접촉 될 모든 자료를 처리 하는 동안 (pipets, 플라스 크, 미디어, 등) 무 균 조건 하에서 층 류 후드, 실험실 코트와 장갑을 사용 하 여 작동. 처리 되는 동안에 20% O₂ (룸 조건)에서 세포를 유지.
   2. 7 x 10⁵ 가능한 기본 섬유 아 세포 T75 플라스 크 (~9.3 x 10³ 셀/cm²) 포함 하는 d 10의 10 mL (PD)를 두 배로 낮은 인구에 씨앗
   3. 70-80% 합류 (낮은 PD에 문화 확산에 대 한 3-4 일)에 도달할 때까지 5% CO₂ 와 5% O₂ 37 ° C에서 셀 인큐베이터에서 세포를 성장 한다.
   4. 트립 신, 잠복기 ~ 5-7에 대 한 x 1의 3 mL를 사용 하 여 셀을 분리 5% CO₂ 와 5% O₂37 ° C에서 셀 문화 인큐베이터에서 분. 파견 프로세스를 확인 하려면 셀 문화 현미경으로 세포를 정기적으로 모니터링 합니다.
   5. 셀은 구형, d 10의 9 mL를 추가 하 여 트립 신 반응 하지. 마십시오 하지 품 어 10 분 이상.
   6. 파편과 작은 입자는 상쾌한에 남아 있을 것 이다 하는 동안 5 분 셀 튜브의 하단에 펠 릿 형성에 대 한 300 x g 에서 세포를 스핀.
   7. 제거는 상쾌한 고 셀 펠 릿 d 10의 1 mL에 녹이 고 수동 계산에 대 한 제조업체의 지침 또는 Neubauer 챔버 자동된 셀 카운터를 사용 하 여 셀 수를 수행. 하는 동안 (예를 들어, Trypan 블루 제외²³) 세포의 생존 능력을 확인 하는 분석 결과 포함 합니다.
   8. 이 수식을 사용 하 여 누적 PD를 계산.
      _새로운 PD = 3.32* (LOG(cell number total)-(로그 (휴대폰 번호 시드)) + PDold
      총 수를 셀 = 모든 셀 계산: 죽은 살아.
      시드 번호 셀 = 수 가능한 셀 시드 (8 × 10⁵ ).
      _{오래 된} PD = 인구 뿌리기의 순간에 두 배로.
      _새로운 PD = 인구 (부 화) 후 세의 순간에 두 배로.
      참고: 경우 7 x 10⁵ 기본 섬유 아 세포 (PD 35.2) 했다 T-75 플라스 크에 시드, 4 일 후 그들은 80% 합류를 도달 하 고 다시 분할 세 지금 1.3 x 10⁶ 총 세포 (죽은 + 살아있는).
      _새로운 PD = 3.32* (LOG(1,300,000 cells)-LOG(700,000)) + 35.2
      _새로운 PD = 36.1
   9. 8 × 10⁵ 셀 새로운 T75 2.1.2–2.1.8 단계를 반복을 다시 시드하십시오.
      참고: 여러 개의 연속 통행 후 문화 소요 됩니다 셀 분할 전혀 멈출 때까지 confluent 얻을 하는 데 시간이 오래. 일단 세포 분열을 중지, 노화 마커 및 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 수확에 대 한 테스트.
   10. 노화 세포의 더 큰 크기 전체 표시 하 여 아직 낮은 셀 수가 문화를 발생할 수 있습니다는 것이 좋습니다. 따라서, 노화 PD 안정적 이며 다른 노화 마커 문화에 표시 하는 때 추측 될 수 있다 (참조 프로토콜 3.1-3.5).
       참고: 기본 섬유 아 세포 확산을 사용 하 여 제어.
2. 이온화 방사선-유도 노화
   1. 셀 또는 그들 (pipets, 플라스 크, 미디어, 등)에 접촉 될 모든 자료 처리, 층 류 후드, 실험실 코트와 장갑을 사용 하 여 무 균 조건 하에서 작동 합니다. 처리 되는 동안에 20% O₂ (룸 조건)에서 세포를 유지.
   2. 7 x 10⁵ 가능한 기본 fibroblasts T75 플라스 크 (~9.3 x 10³ 셀/cm²)에서 낮은 PD에서 d 10의 10 mL를 포함 된 씨앗
   3. 셀 5% CO₂ 와 5% O₂37 ° C에서 셀 문화 인큐베이터에 밤새 품 어.
   4. 사용 중인 컴퓨터의 지시에 따라 감마 방사선의 10 회색 셀을 표시 합니다.
   5. 세포에서 매체를 발음 하 고 d 10의 10 mL를 바꿉니다.
   6. 다른 매체를 정기적으로 교체 하는 10 일, 3 일 마다 약 5% CO₂ 와 5% O₂ 37 ° C에서 셀 문화 인큐베이터에서 d 10의 10 mL에 셀을 품 어.
   7. 10 일 후 노화 표식에 대 한 테스트 하거나 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 셀을 사용 합니다.
      참고: 제어로 확산 기본 섬유 아 세포 (조사) 하기 전에 같은 PD의를 사용 합니다.
3. 자외선 (UV) 방사선-유도 된 노화
   1. 셀 또는 그들 (pipets, 플라스 크, 미디어, 등)에 접촉 될 모든 자료 처리, 층 류 후드, 실험실 코트와 장갑을 사용 하 여 무 균 조건 하에서 작동 합니다. 처리 되는 동안에 20% O₂ (룸 조건)에서 세포를 유지.
   2. 10⁵ 가능한 기본 fibroblasts에 6 잘 플레이트 (1.5-2.0 x 10⁴ 셀/cm²)의 한 잘 낮은 PD에 x 씨 1.5-2 d 10 매체의 2 개 mL를 추가합니다.
   3. 5% CO₂ 와 5% O₂ 37 ° C에서 셀 문화 인큐베이터에 셀을 배치 하 고 적어도 5 h에 대 한 플라스틱을 준수 하도록 허용.
   4. 세포에서 매체를 벗어. 자외선 챔버 중간 6-잘 접시를 놓고 플라스틱 뚜껑을 벗고. UVB, 20-30 mJ/cm²와 비추는.
   5. 잘 당 매체의 2 개 mL를 추가 합니다.
   6. 다른 매체를 정기적으로 교체 하는 7 일, 3 일 마다 약 5% CO₂ 와 5% O₂ 37 ° C에서 셀 문화 인큐베이터에서 d 10의 2 mL에 셀을 품 어.
      참고: 7 일 후 세포 노화 마커 테스트 고 다운스트림 응용 프로그램에 사용. 확산 기본 섬유 아 세포 (조사) 하기 전에 같은 PD의를 사용 하 여 제어.
4. 독 소 루비-유도 노화
   1. 독 소 루비 재고 솔루션 x 1000 준비: 1 x PBS에서 독 소 루비의 250 µ M 재고, 필터-솔루션 및 무 균 튜브 당 500 µ L에 약 수를 소독. 독 소 루비 재고-80 ° c.에서 저장
   2. 셀 또는 그들 (pipets, 플라스 크, 미디어, 등)에 접촉 될 모든 자료 처리, 층 류 후드, 실험실 코트와 장갑을 사용 하 여 무 균 조건 하에서 작동 합니다. 처리 되는 동안에 20% O₂ (룸 조건)에서 세포를 유지.
   3. 7 x 10⁵ 가능한 기본 fibroblasts T75 플라스 크 (~9.3 x 10³ 셀/cm²)에서 낮은 PD에서 d 10의 10 mL를 포함 된 씨앗
   4. 셀 5% CO₂ 와 5% O₂37 ° C에서 셀 문화 인큐베이터에 밤새 품 어.
   5. 독 소 루비 재고 솔루션의 최종 농도에 d 10의 11 ml x 1000의 11 µ L를 희석 250 nM.
   6. 세포에서 매체를 발음 하 고 d 10 + 독 소 루비의 10 mL를 바꿉니다.
   7. 5% CO₂ 와 5% O₂37 ° C에서 셀 문화 인큐베이터에 정확히 24 h에 대 한 셀을 품 어.
   8. 세포에서 매체를 발음 하 고 신중 하 게 한 번 d 10의 10 mL로 씻어.
   9. 다른 매체를 정기적으로 교체 하는 6 일, 3 일 마다 약 10 mL D10 셀을 품 어.
   10. 7 일에 노화 표식에 대 한 테스트 및/또는 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 사용.
       참고: 제어, 사용 차량 (PBS) 1:1,000 d 10에서 24 h에 대 한 치료 같은 PD의 기본 섬유 아 세포 확산으로.
5. 산화 스트레스 유발 노화
   1. 셀 또는 그들과 접촉 될 모든 자료를 처리 하는 동안 (pipets, 플라스 크, 미디어, 등) 무 균 조건 하에서 층 류 후드, 실험실 코트와 장갑을 사용 하 여 작동. 처리 되는 동안에 20% O₂ (룸 조건)에서 세포를 유지.
   2. 7 x 10⁵ 가능한 기본 fibroblasts T75 플라스 크 (~9.3 x 10³ 셀/cm²)에서 낮은 PD에서 d 10의 10 mL를 포함 된 씨앗
   3. 셀 5% CO₂ 와 5% O₂37 ° C에서 셀 인큐베이터에 밤새 품 어.
   4. 30%의 과산화 수소의 22.6 μ d 10의 11 mL에 추가 하 여 ~ 200 μ M의 d 10 매체에 과산화 수소 솔루션을 준비 합니다.
      참고: 독성 평가 곡선 복용량 응답 함으로써 관심의 세포 유형에 대 한 치료를 최적화 합니다.
   5. 세포에서 매체를 발음 하 고 갓된 D10 중간 + 과산화 수소의 10 mL를 추가 합니다. 5% CO₂ 와 5% O₂37 ° C에서 2 시간에 대 한 품 어.
   6. 세포에서 매체를 발음 하 고 신선한 d 10 없이 과산화 수소와 함께 한 번 씻어.
   7. D 10 없이 과산화 수소의 10 mL를 추가 합니다.
   8. 5% CO₂ 와 5% O₂37 ° C에서 셀 문화 인큐베이터에서 48 h에 품 어.
   9. 3 치료의 총 단계 2.5.4–2.5.8를 두 번 더 반복 합니다.
   10. 노화 마커 또는 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 수확에 대 한 확인 합니다.
       참고:로 제어, 2 h d 10에 살 균 물의 22.6 µ L로 치료 같은 PD의 사용 확산 셀.
6. Epigenetically-유도 노화
   1. 재고 및 표 1에 따라 사용 하는 작은 molecule(s)에 대 한 작업 솔루션을 준비 합니다. 필터-소독 솔루션. 무 균 튜브에 약 수입니다. -20 ° c.에 게
   2. 셀 또는 그들과 접촉 될 모든 자료를 처리 하는 동안 (pipets, 플라스 크, 미디어, 등) 작동 살 균 조건 예를 들어, 층 류 후드, 실험실 코트와 장갑을 사용 하 여. 처리 되는 동안에 20% O₂ (룸 조건)에서 세포를 유지.
   3. 7 x 10⁵ 가능한 기본 fibroblasts T75 플라스 크 (~9.3 x 10³ 셀/cm²)에서 낮은 PD에서 d 10의 10 mL를 포함 된 씨앗
   4. 셀 5% CO₂ 와 5% O₂37 ° C에서 셀 문화 인큐베이터에 밤새 품 어.
   5. 원하는 치료에 대 한 d 10 매체 + 작업 솔루션 11 mL를 준비 합니다. 치료 당 정확한 희석 표 1에서 볼 수 있습니다.
      1. 11 µ L d 10의 11 mL의 1 m m 사 작업 솔루션의 준비.
      2. 44 µ L d 10의 11 ml에서 1 M 나트륨 낙 산 염 작업 솔루션의 준비.
      3. 11 µ L d 10의 11 ml에서 10 m m 5-아 자 작업 솔루션의 준비.
         참고: 최적화, 관심의 셀 형식에 대 한 치료 예를 들어, 독성을 평가 하기 위해 곡선 복용량 응답을 만들기.
   6. 문화에 D10 매체 + 원하는 치료에 대 한 작업 솔루션을 추가 합니다.
   7. 5% CO₂ 와 5% O₂37 ° C에서 셀 문화 인큐베이터에서 24 h에 대 한 품 어.
   8. 3 치료의 총 단계 2.6.4–2.6.6를 두 번 더 반복 합니다.
   9. 약물 없이 간단한 d 10에 대 한 매체를 변경 합니다.
   10. 더 많은 3 일 후 세포 노화 및 노화 마커 및 다운스트림 응용 프로그램 테스트를 위해 준비 된다.
       참고: 컨트롤로 사용 같은 PD D10 중간 + 차량 3 일에 대 한 치료의 기본 섬유 아 세포 확산. D10 중간 + 차량 그 3 일 동안 모든 24 h 새로 고쳐야 할 필요가 있다. 차량 사용 하는 치료에 따라 달라 집니다: 1:1,000 DMSO 나트륨 낙 산 염에 대 한 사 하 고 5-아 자 1: 250 살 균 물.

3입니다. 노화의 표식

1. 준비
   1. 20 mg/mL X gal 준비: 해산 dimethylformamide 또는 DMSO의 1 mL에 20mg의 X. 빛에서 보호 하는-20 ° C에서 저장 합니다.
   2. 0.1 M 구 연산 산 성 솔루션을 준비: 물 100 mL에 시트르산 일 수화물 2.1 g을 분해. 실내 온도에 상점.
   3. 0.2 M 나트륨 인산 염 해결책 준비: 염기 인산 나트륨의 분해 2.84 g 또는 염기 인산 나트륨의 3.56 g 물 100 mL에 탈수. 실내 온도에 상점.
   4. 0.2 M 구 연산/나트륨 인산 염 pH 6.0 준비: 36.85 mL의 0.1 M 구 연산 산 성 솔루션 및 0.2 M 나트륨 인산 염의 63.15 mL 해산. PH 6.0에 정확 하 게 조정. 실내 온도에 상점.
   5. 100 mM 칼륨 ferrocyanide 준비: 물 50 mL에 칼륨 ferrocyanide의 2.1 g을 분해. 빛에서 보호 하는 4 ° C에서 저장 합니다.
   6. 100 mM 칼륨 ferricyanide 준비: 1.7 g 물 50 mL에 칼륨 ferricyanide의 해산. 빛에서 보호 하는 4 ° C에서 저장 합니다.
   7. 염화 나트륨 5 M 준비: 14.6 g 물 50 mL에 염화 나트륨의 분해. 실내 온도에 상점.
   8. 1 M 염화 마그네슘 준비: 물 50ml에 염화 마그네슘의 4.8 g을 분해. 실내 온도에 상점.
   9. 2% 포름알데히드 + PBS에 0.2%도 준비: 25%도 및 PBS의 100 μ에 16% 포름알데히드의 12.5 µ L의 분해 800 µ L. 빛에서 보호 하는 실내 온도에 상점.
   10. 얼룩 솔루션 준비 신선한 에 따라 표 2.
2. 노화 관련 된 β-galactosidase 얼룩
   1. 각 샘플에 대 한 셀은 스파스에 24-잘 접시 (5.2 x 10³ 셀/cm²) 포함 500 µ L d 10의의 하나 이상 잘 1 x 10⁴ 셀 씨. 이 접시에 직접 치료 (있는 경우)를 수행할 수 있습니다 하거나, 또는 이미 치료 셀 24-잘 접시에 다시 시드 수 있습니다.
   2. 5% CO₂ 와 5% O₂37 ° C에서 하룻밤 셀을 품 어.
   3. 두 번 PBS의 500 μ를 가진 세포를 씻어.
   4. PBS에서 2% 포름알데히드 + 0.2%도 500 μ/잘을 사용 하 여 실 온에서 3-5 분을 수정.
   5. 두 번 PBS의 500 μ를 가진 세포를 씻어.
   6. 신선한 얼룩 얼룩 샘플 수에 따라 솔루션을 준비 합니다.
   7. 얼룩 솔루션 (500 µ L/잘)을 추가 하 고 증발을 피하기 위해 parafilm으로 접시를 봉인.
      참고: 증발 될 형태를 결정 하 고 현미경 관찰을 방해 수 있습니다.
   8. 12-16 h (CO₂) 없이 건조 인큐베이터에서 37 ° C에서 셀 (예: 알루미늄 호 일에 커버) 어둠 속에서 품 어.
      참고: CO₂ pH에 영향을 미칠 하 고 따라서 결과 수정할 수 있습니다. 일부 세포 유형 부 화 시간 단축을 요구할 수 있습니다.
   9. PBS의 500 μ 두 번 씻어.
   10. 결과 평가 합니다. 긍정적인 세포 현재는 블루 (주로) perinuclear 정상적인 가벼운 현미경 (그림 1A)에서 얼룩.
   11. 정량화에 대 한 샘플 당 적어도 100 셀을 관찰 하 고 긍정적인 세포의 수를 계산 합니다. 노화 세포 모양 변경, 그것은 종종 어려운 셀 경계를 정의 하 고는 셀입니다. DAPI 시각화 및 개별 셀 (그림 1B)의 정량화와 counterstain. 샘플 (긍정적인 세포 대 세포의 총 금액의 비율)을 계량 형광 현미경 (그림 1C)을 사용 하 여. 끝에 적어도 100 단일 셀 하 고 그들에 SA-β-gal 긍정적인 세포의 비율을 평가 수 있도록 동일한 샘플의 여러 그림을 가져가 라.
   12. 사용 하는 치료를 위해 그들의 적절 한 제어 대 노화 세포의 결과 비교 합니다.
       참고: 동일한 샘플에는 듀와 공동 얼룩 가능 하다. 셀 coverslips에 다음 시드 되어야 합니다 고려.
3. 듀 합동 분석 결과
   1. 평가 샘플 수에 따라 24-잘 접시에 coverslip/잘 넣어.
   2. 씨앗 1 x 10 d 10의 500 µ L를 포함 하는 셀은 스파스 상태 당 24-잘 접시 (5.2 x 10³ 셀/cm²)의 하나 이상 잘⁴ 셀. 이 접시에 직접 치료 (있는 경우)를 수행할 수 있습니다 하거나, 또는 이미 대우 셀 24-잘 접시에 다시 시드 수 있습니다.
   3. 5% CO₂ 와 5% O₂37 ° C에서 하룻밤 셀을 품 어.
   4. D 10에 듀의 20 µ M 솔루션 만들기 (1: 250) 샘플 (샘플 당 250 μ) 치료의 수에 따라.
   5. 치료 하 고 d 10 + 듀로 교체 각 우물에서 매체 (250 μ)의 절반을 제거 그냥 준비 된 솔루션. 최종 듀 농도 10 µ M입니다.
   6. 18-24 h 5% O2 5% CO₂ 와 37 ° C에서 셀 문화 인큐베이터에서 품 어. 제어 및 노화 세포에 동일한 부 화 시간을 사용 합니다.
   7. PBS의 500 μ 2 x 워시.
   8. PBS에서 4% 포름알데히드의 500 μ와 10 분에 대 한 셀을 수정 합니다.
   9. 100 mM Tris (pH 7.6)의 500 μ에 5 분을 품 어.
   10. 0.1%의 500 μ에 10 분 동안 세포를 permeabilize PBS에 트라이 톤 X-100.
   11. PBS로 3 회 세척.
   12. 다음과 같은 순서로 구성 요소를 추가 하는 각 coverslip 레이블 혼합의 50 μ 준비: 44.45 µ L의 PBS, 0.5 µ L의 Cu (II) 등₄, sulfo Cy3 아 지 드의 0.05 µ L, 5 µ L의 나트륨 하는데.
   13. 레이블 혼합의 50 μ parafilm의 조각에 넣어. 한 쌍의 족집게와 바늘의 도움으로 coverslip 리프트 그리고 아래쪽으로 직면 하는 셀을 포함 하는 표면 위에 레이블 믹스 휴식. 아니 거품은 고는 coverslip의 전체 표면 라벨 믹스를 만지고 있다 확인 하십시오. 어둠 속에서 30 분 동안 품 어.
   14. 24-잘 접시의 우물에 다시 세포를 넣어 하 고 PBS를 가진 세 번 그들을 씻어.
   15. 유리 슬라이드에 (를 포함 하 여 핵을 시각화 DAPI) 미디어를 마운트 마운트 하 고 그들이 하룻밤 말리 면.
   16. 형광 현미경을 사용 하 여에 듀 설립을 시각화. Cy3에 대 한 적절 한 필터를 사용 하 여 (여기/방출: 552/570 nm).
   17. 조건 (Cy3와 DAPI) 당 적어도 100 셀의 나중 정량화에 대 한 셀의 여러 그림을 가져가 라.
   18. 다음 수식을 사용 하 여 듀를 통합 하는 셀의 비율 척도:
       듀 긍정적인 세포 (%) = (듀 긍정적인 세포 수 (Cy3) / 총 세포 수 (DAPI)) * 100
   19. 사용 하는 치료를 위해 그들의 적절 한 제어 대 노화 세포의 결과 비교 합니다.
       참고: 동일한 샘플에는 SA-β-gal 함께 공동 얼룩 가능 하다. 세포는 아직도 coverslips에 시드 합니다 것이 좋습니다.
4. P16, p21, SASP의 유전자 발현
   1. 뇌관-유전자의 관심 (50 µ M 뇌관)의 세트를 준비 합니다.
      참고: p16, p21, 몇 가지 관련 SASP 요인의 정량 노화 상태의 유익한입니다. 프로토콜 설명 여기 게 실시간 PCR를 사용 하 여 상대 정량화에 대 한 범용 프로브 라이브러리 (그러지 마세요) 시스템의 사용. 표 3 CDK 억제제 p16, p21의와 가장 관련성이 높은 SASP 회원의 탐지는 물론 Tubulin와 말라, 참조 유전자 분석 결과 대 한 역할에 대 한 사용 하는 뇌관의 개요를 보여 줍니다. 표 3 의 마지막 열에는 각 분석 결과에 사용할 특정 그러지 마세요 프로브를 참여 시킵니다.
   2. 원하는 분석 실험에 대 한 별도 정량 Pcr 반응 혼합을 준비 합니다. 항상 또한 표 4에 따라 참조 유전자를 포함 합니다.
   3. 또는 3 중에서 모든 샘플을 실행 합니다.
   4. 로드 7.5 µ L/384-잘 접시에 정량 Pcr 반응 혼합의 음.
   5. ~ 5 추가 cDNA의 ng RNase 무료 물 2.5 µ L에 녹아.
      참고: 그것은 비교할 모든 샘플에 대 한 cDNA의 비슷한 금액을가지고 하는 것이 좋습니다. 이 반전 녹음 방송에 대 한 동일한 양의 RNA 사용 하 여 얻을 수 있습니다.
   6. 물개와 함께 접시를 커버 하 고 그것 스틱 제대로 접시에 균등 하 게 모든 우물을 덮고 있는지 확인 하십시오.
   7. 2000 x g 1 분 동안에 접시를 회전 합니다.
   8. 접시는 Lightcycler에서 40 주기 다음 프로토콜을 사용 하 여 실행:
      7 분 동안 95 ° C
      95 ° C의 40 주기 5 s와 30에 대 한 60 ° C에 대 한 s
      1 분 동안 37 ° C
   9. 결과의 분석을 위해 분석 정량 데이터²⁴Livak와 동료에 대 한 제안 된 메서드를 사용 합니다. 또는 사용 하 여 Tubulin 걸 참조 유전자는 ΔCt 계산를 가치 고 적절 한 컨트롤을 사용 하 여 계산 하는 특정 노화 유도 하는 치료에 대 한 ΔΔCt 값에 대 한.
5. 단백질 표정과 IL6의 분 비
   1. 씨 5-10에 하나 이상 잘 10⁴ 셀 x d 10의 2 개 mL를 포함 하는 조건 당 6 잘 플레이트 (5.2-10.5 x 10³ 셀/cm²)의. 이 접시에 직접 치료 (있는 경우)를 수행할 수 있습니다 하거나, 또는 이미 치료 셀 24-잘 접시에 다시 시드 수 있습니다. 시드 후 하룻밤 사이 서 보자.
   2. 매체를 제거 하 고 DMEM 매체 FBS 없이2 mL에 대 한 대체. 24 h에 대 한 정상적인 조건에서 품 어.
   3. 15 mL 튜브에 매체를 수집 합니다.
   4. 원심 분리기 샘플 x 300g에 5 분 매체에 대 한 처리 될 때까지-80 ° C에 저장할 수 있습니다.
   5. ELISA를 수행 하려면 제조업체의 지침을 따릅니다.
   6. 노화 세포 노화 유도 하는 특정 치료에 대 한 적절 한 제어 대의 결과 비교

SA-β-gal 노화 섬유 아 세포에서 얼룩의 농축

Β-galactosidase (β-gal)는 모든 세포에 표현 되 고 4.0^25,26의 최적 pH는 lysosomal 효소 이다. 그러나, 노화, 동안 리소좀 크기가 증가 하 고, 따라서, 노화 세포 축적 β-gal. 이 효소의 증가 금액 차선 pH 6.0^25,27에서도 그 활동 감지를 가능 하 게. 그림 1A 대 노화 기본 섬유 아 세포 확산에 SA-β-gal 얼룩의 대표 이미지를 보여줍니다. 세포는 또한 확대 하 고 불규칙 한 셀 시체와 함께 보세요. 앞에서 언급 했 듯이, 그것은 시각화 및 셀 (그림 1B) 계산을 용이 하 게 DAPI와 공동 얼룩을 개별 셀을 구별 하기 어려울 수 있습니다. 그것은 DAPI 얼룩이 관찰 수 형광 현미경에서 사진을 찍을 필요가 있다. 즉 사진을 밝은 필드 채널에 블랙/화이트에서 찍은 것입니다 사진에 검은 표시 됩니다 SA-β-gal의 "블루" 얼룩. 메모의 샘플 내 모든 세포는 β-gal에 대 한 긍정적 이다. 노화 유도의 효율성 높은 자극 및 셀 형식/변형 사용에 따라 달라 집니다. 여기에 설명 된 프로토콜 나왔고 > 우리 손에 기본 fibroblasts (BJ 및 WI-38)에서 50% β-gal 긍정적인 세포.

적은 세포 노화의 유도 후 듀 통합

듀는 nucleoside 티 미 딘 동안 활성 DNA 합성, DNA²⁸에 통합 됩니다, 그의 아날로그 이다. DNA에 듀 설립 듀, alkyne 그룹²⁸부족 하기 때문에 일반 티 미 딘에서 수행할 수 없는 반응에 Copper-Catalyzed 아 지 드-Alkyne cycloaddition (CuAAC)를 수행한 후 구상 될 수 있다. 이 특정 프로토콜에 한 Sulfo-Cy3-아 지 드를 사용 중입니다. 커플링은 alkyne에 아 지 드의 자리를 차지 하 고, 세포 형광 Cy3 필터 (그림 2A)에서 표시 됩니다. 고려는 듀 통합 시험을 수행 하 여 확산 됩니다 셀 구별 될 수 있다 비 증식 세포에서 중요 하다. 비 확산 셀 듀 합동 분석 결과 세포 주기 검거의 이러한 두 종류 사이 차별 없는 무부하 또는 노화, 의미 될 수 있습니다.

노화 섬유 아 세포 upregulate는 CDK 억제제 p16, p21

노화 세포를 만드는 세포 주기²⁹를 막으려고는 CDKs의 억제제의 사용. 특히 p16, p21 종종 노화 세포³의 표식으로 측정 됩니다. 중 하나 또는 둘 다 표시는 일반적으로 upregulated 노화 세포, 그리고는 upregulation는 transcriptional 수준에서 측정 자주. 그것은 일부 셀 transcriptional 수준에서 upregulate p16 하지 않습니다 p21 노화^15,,1730에 대 한 보편적인 하지만 특정 마커 이후 두 마커를 동시에 사용을 권장 합니다. 그림 3 은 p16의 대표적인 상대 quantifications 및 노화를 유도 하는 섬유 아 세포에서 p21 mRNA. Immunostaining 단백질 레벨을 검출 하 게 더 럽 히기 서양 등 다른 기술도 있습니다.

노화 섬유 아 세포는 SASP 표시

가장 노화 세포 transcriptionally upregulate에 대 한 인코딩을 여러 유전자 분 비 단백질, SASP⁶이라고 하는 현상. SASP 염증, 예를 들면, interleukins, 발산, 관련 된 요인 또는 세포 외 기질 (ECM) 저하, 예를 들어, MMPs, 하지만 그것은 매우 이질적인 있습니다. SASP 요소의 유도 mRNA 정량 통해 식 수준 또는 분 비 단백질을 통해 Enzyme-Linked 면역 매 분석 결과 (ELISA)의 수준을 측정 하 여 평가할 수 있습니다. 그림 4 는 두 IL6 transcriptional 및 분 비 수준에서의 upregulation를 보여주는 대표 이미지. 우리 IL6만 사용 표현; 그러나, 그것은 프로토콜 3.4 제안된 목록에서 SASP의 여러 멤버를 측정을 권장 합니다.

그림 1: SA-β-gal 노화 기본 fibroblasts에 얼룩의 농축. BJ 기본 포 피 섬유 아 세포 (PD 34.1)는 이온화 방사선 (10 Gy)에 그들을 노출 함으로써 노화를 유도 했다. 방사선 조사 후 10 일 셀 했다 SA βgal 얼룩이 진다. (A) SA βgal 얼룩 BJ 기본 섬유 아 세포 치료 (최대) 또는 (아래) 이온화 방사선에 노출에 대 한 대표적인 결과. 최종 확대: 100 X. SA-β-gal의 대표 그림 (B) 공동 물 DAPI BJ 기본 fibroblasts에 대 한 어느 치료 (3 왼쪽된 패널) 또는 이온화 방사선 (3 오른쪽 패널)에 노출. (파란색) 얼룩 DAPI는 정량화를 촉진 하는 개별 셀을 시각화 수 있습니다. 사진을 찍은 밝은 필드에 블랙/화이트에 나타납니다. 따라서, 이러한 특정 사진을 SA-β-gal에 얼룩 처럼 보이게 됩니다 검은 perinuclear 명소. 최종 확대: 100 X. SA-β-gal 긍정적인 세포의 확산 (Prol., 화이트) (C) 정량화 BJ fibroblasts 이온화 방사선 처리 대응 (상원 의원, 블루) 대. 정량화는 의미의 표준 오차를 보여주는 오차 막대와 3 개의 생물 복제를 사용 하 여 수행 되었다. 통계적 의미는 짝이 없는 양측 스튜던트 t-검정 델타 CT 값에 의해 결정 되었다. (n = 3, ± SEM * * * p 값 = < 0.01). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2: 적은 세포 노화의 유도 후 듀 통합. (A) 확산 WI-38 fibroblasts PD 43.86 (왼쪽)와 그들의 이온화 방사능된 대응 (오른쪽)에 듀 설립 분석 결과의 대표 이미지. 최종 확대: 100 X. 듀 긍정적인 세포의 확산 (Prol., 화이트) (B) 부 량 조사 들 (상원 의원, 블루) 대 BJ 섬유 아 세포 (PD 38.7). 정량화는 의미의 표준 오차를 보여주는 오차 막대와 3 개의 생물 복제를 사용 하 여 수행 되었다. 통계적 의미는 짝이 없는 양측 스튜던트 t-검정 델타 CT 값에 의해 결정 되었다 (n = 3, ± SEM * * * p 값 = < 0.01). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3: 노화 섬유 아 세포 upregulate는 CDK 억제제 p16, p21. P16 mRNA 식 확산 (Prol., 흰색, PD 35.3) 또는 5-아 자-치료 BJ 셀 (상원 의원, 파랑)의 (A) 정량화. P21 mRNA 확산 (Prol., 흰색, PD 35.3) 식의 부 량 (B) 또는 블 로우 5-아 자 처리 (상원 의원, 블루) 세포. 정량화는 의미의 표준 오차를 보여주는 오차 막대와 3 개의 생물 복제 (각각 2 개의 기술 복제)를 사용 하 여 수행 되었다. 통계적 의미는 짝이 없는 양측 스튜던트 t-검정 델타 CT 값에 의해 결정 되었다 (n = 3, ± SEM * * * = p 값 < 0.01). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4: 노화 섬유 아 세포 분 비 형 (SASP) 표시. BJ fibroblasts에 (A) 정량화의 IL6 mRNA 식 (Prol., 화이트, PD 38.7) 중 확산 또는 이온화 방사선 (상원 의원, 청색)에 의해 노화를 유발. IL6 단백질 식 확산 PD 38.6 (Prol., 화이트) 또는 이온화 방사선 처리 WI38 섬유 아 세포 (상원 의원, 파랑)의 (B) 정량화. 정량화는 의미의 표준 오차를 보여주는 오차 막대와 3 개의 생물 복제를 사용 하 여 수행 되었다. 정량 데이터의 경우 각 생물 복제는 두 기술 중복 했다. 통계적 의미는 짝이 없는 양측 스튜던트 t-검정 델타 CT 값에 의해 결정 되었다 (n = 3, ± SEM * * *p 값 = < 0.01). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

표 1: 주식 및 Epigenetically-유도 노화에 대 한 사용 하는 다른 치료에 대 한 작업 솔루션

표 2: 노화 관련 (SA)-β-gal 얼룩 사용 얼룩이 솔루션의 구성.

표 3: 뇌관 순서 및 그들의 해당 그러지 마세요 인간의 원산지의 샘플에서 mRNA 노화 마커의 검출을 위한 조사.

표 4: 정량 Pcr 반응의 구성 그러지 마세요 시스템에 대 한 믹스.

여기 설명 하는 프로토콜은 인간의 기본 섬유 아 세포, 최적화 된 특히 BJ와 WI-38 셀. 일차 노화, 전리 방사선, 독 소 루비에 대 한 프로토콜을 성공적으로 다른 세포 유형 즉 신생아 melanocytes와 keratinocytes (iPSC 파생 cardiomyocytes)과 섬유 아 세포 (HCA2 및 IMR90)의 다른 종류에 적용 우리의 실험실. 그러나, 몇 가지 세부 사항을 시드 셀, 방법 및 플라스틱 지원에 연결/분리에 대 한 셀 수 있도록 화학 물질의 수 등의 독성을 피하기 위해 치료 복용량을 조정 하 여 추가 셀 형식에 대 한 적응을 최적화할 수 있습니다.

기본 섬유 아 세포의 사용에도 다양 한 도전 포즈. 노화 세포는 일반적으로 더 어려운 proliferating 들 보다 분리 하 고 그들은 종종 trypsinization에 더 민감한 또는 분리 메서드를 분리 후 생존의 것 보다 약간 낮은 의미의 다른 종류 확산 셀입니다. 다른 노화 유도 하는 방법에 대 한 적절 한 제어의 선택은 어렵습니다. 예를 들어, 독 소 루비 같은 약물을 기반으로 치료에 대 한 것이 좋습니다 차량으로 짧은 치료: 독 소 루비 치료 셀 컨트롤 샘플의 경우 24 h에 대 한 PBS 다음 즉시 수확/처리. 그것은 노화를 유발 하는 세포 치료 (6 여분의 일 문화의 독 소 루비 취급 셀) 적용 후 확장된 문화 시간을 통해 이동 하 고 제어 셀 교양된 같은 양의 시간 PBS의 제거 후 해야 주장 수도 있습니다. 그러나, 긴 문화 셀 추가 분할 오버 합칠 될 하거나 더 뿌리고 필요 허용 하 고 증가 PD. 과도 합류 하 노화 마커, SA-β-gal 표시 셀 유지에 불구 하 고 같은 발생할 수 있습니다 그들의 잠재적인³¹확산 증가 PD 것 그들의 복제 제한 (그리고 일차 노화) 가까이 얻을 그리고 덜 독 소 루비 취급 들을 비교 합니다. 비슷한 상황에서 다른 치료에 대 한 적용 됩니다. 우리는 우리가 더 각 경우에 대 한 적절 한 고려 하는 컨트롤을 제안 했다.

세포 노화를 유도 하는 데 사용 하는 기술의 대부분 비교적 간단 하 고 직선-앞으로, 보이지만 많은 요인 실험의 결과 영향을 미칠 수 있습니다. 예를 들어, 기존 셀 문화 미디어 섬유 아 세포의 정상적인 포도 당 농도 4.5 g/l. 그러나, 줄기 세포 등 일부 세포 유형의 낮은 농도의 포도 당 확장 그들의 증식 잠재적인³², 동안 다른 사람에 대 한 높은 농도 조기 노화³³으로 이어질 수 있습니다. 또한,와 노화 세포는 높은 신진 대사 분 비 요인³⁴를 생산 하는 에너지의 높은 금액을 지출, 기타 노화 관련 고기 수도 영향을 받을 포도 당 농도에 진동.

세포 배양 매체에서 또 다른 잠재적인 변수는 혈 청. 혈 청의 구성은 일반적으로 정의 되 고 동물 소스 및 일괄 처리에 따라 다릅니다. 특히, 성장 인자 및 프로-염증 성 단백질의 양은 노화³⁵를 좌우할 수 있다. 혈 청의 동일한 배치는 모든 실험 방지 하기 위해 사용 불필요 하 고 혼동 변화 하는 것이 좋습니다. 그러나, 일부 ELISA 기반 프로토콜에 사용 되는 혈 청 자유로운 매체의 사용 등 몇 가지 피할 수 없는 기술적인 조건 SASP 식을 줄일 수 있습니다.

산소 긴장은 완전 한 노화 유도 대 한 중요 하다. 세포 증식 하지 않습니다 하지만 돌이킬 체포³⁶는 hypoxia geroconversion, 억제 수 있습니다. 그러나, 실험적인 체제에서 가장 일반적인 문제는 hypoxia 하지만 hyperoxia이 지 않다. 실제로, 표준 문화 조건 자주 "normoxia"로 20% 산소를 사용 하지만 대부분 셀 형식에 대 한 생리 적 조건이 낮은. 마우스 blastocysts 노화 (SA βgal 및 DNA 손상)의 표시가 제시 그들의 비보에달리 20% 산소에서 경작 하는 때-대응 또는 5% 산소³⁷에 교양 같은 세포 파생. 또한, 마우스 섬유 아 세포 배양에서 더 많은 생리 적 조건 (3% 산소)와 전통적인 것 들 (20% 산소) 디스플레이에 SASP³⁸. 여기, 우리 모든 문화에 대 한 5% 산소를 사용 하 고 실험과 우리 연구원 관심의 특정 종류에 사용 되는 산소 농도 재고 하는 촉구.

마지막으로 고려해 야 할 또 다른 요소는 내장이 노화 세포의. 한 반면에, 다른 세포 유형 및 심지어 셀 긴장 노화 관련 된 고기에서 차이 표시합니다. 예를 들어, 섬유 아 세포의 일부 변종 할 하지 upregulate p16 노화 유도^15,,1617, 따라 transcriptional 수준에서 그것은 또한 어디에 불구 하 고 보고의 upregulation에 표시 된 그림 3A, p16,이 통계적으로 중요 한 되지 않았습니다. 그래서 측정 단백질 수준을 보여줄 수 있습니다 어떤 경우에이 CDK 억제 물의 증가 활동 P16 또한 변환 및 포스트 번역 상 수준에서 제어 됩니다. 그러나, 일부 셀 단순히 p21 같은 다른 CDK 억제 물에 의존 수 있습니다. 그들 둘 다의 transcriptional 수준을 측정 하는 것이 좋습니다. SASP의 정확한 구성 또한 그것에 게³를 생산 하는 셀에 따라 달라 집니다. 또한, 일부 셀은 constitutively β-galactosidase, SA-β-gal은 반드시 노화³암시 하는 얼룩에 대 한 긍정적인 결과 주는 높은 수준의 표현. 경우에 따라 SA-β-gal 얼룩 프로토콜 중 얼룩 솔루션 부 화 시간을 줄임으로써이 문제를 극복할 수 있습니다. 앞에서 언급 했 듯이, 오버 합칠 셀 수도 또한 그들 노화³¹, 그래서 우리는 띄엄띄엄이 얼룩을 수행 하기 위한 문화 셀에 연구원을 촉구 하지 않고 SA-β-gal와 얼룩. 다른 한편으로, 자체 노화 형 안정³⁹아니다. SASP의 구성 및 노화의 다른 표식 모양을 시간에 따라^17,40있습니다. 여기, 우리는 제안 시간 포인트 셀에 각각의 치료 후 완전히 노화 간주 됩니다 우리의 실험실에서 일상적으로 사용 되는. 중요 한 것은, 짧은 시간에 마커를 측정 불완전 노화⁴⁰부정적인 결과 렌더링 수 있습니다. 또한, 치료의 대부분에서 세포의 노화가 되지 않습니다, 때문에 긴 시간 포인트를 사용 하 여 확장 하 고 감소 노화 마커의 식 문화를 추월 몇 비 노화 세포에 대 한 충분 한 시간을 줄 수도 있습니다. 노화 세포의이 고 다른 마커와의 여러 주의의 보기에서 우리는 매우 동일한 샘플 내에서 여러 노화 마커를 사용 하 여 연구자 격려 한다.

N/A

우리는 유익한 토론에 대 한 관리자 실험실 및 데이터와 UV-유도 노화에 프로토콜을 공유 하기 위한 Thijmen 밴 Vliet의 회원을 감사 합니다.