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Aquí, discutimos una serie de protocolos para la inducción y validación de senescencia celular en células cultivadas. Nos enfocamos en diferentes estímulos de inducción de senescencia y describir la cuantificación de los marcadores comunes asociados a senescencia. Proporcionamos detalles técnicos utilizando fibroblastos como modelo, pero los protocolos se adaptan a varios modelos de celulares.
Senescencia celular es un estado de detención permanente ciclo celular activado en respuesta a diversos estímulos nocivos. Activación de la senescencia celular es una de varias condiciones fisiopatológicas, incluyendo supresión tumoral, remodelación y el envejecimiento del tejido. Los inductores de la senescencia celular en vivo se caracterizan todavía mal. Sin embargo, un número de estímulos puede utilizarse para promover la senescencia celular ex vivo. Entre ellos, inductores de senescencia más comunes son agotamiento replicativa, ionizantes y no ionizantes, drogas genotóxicas, estrés oxidativo y desmetilantes y acetylating agentes. Aquí, daremos instrucciones detalladas sobre cómo usar estos estímulos para inducir a los fibroblastos en senescencia. Este protocolo puede ser fácilmente adaptado para diferentes tipos de líneas celulares, incluyendo las células cancerosas y células primarias. También se describen diferentes métodos para la validación de la inducción de senescencia. En particular, nos centramos en la medida de la actividad de la enzima lisosomal asociada a la senescencia de β-galactosidasa (SA-β-gal), la tasa de síntesis de ADN usando 5-ethynyl-2'-desoxiuridina (EdU) incorporación análisis, los niveles de expresión del ciclo celular inhibidores de la p16 y p21 y la expresión y secreción de los miembros del fenotipo secretor Senescence-Associated (spas). Por último, proporcionamos resultados de ejemplo y discutir otras aplicaciones de estos protocolos.
En 1961 Hayflick y Moorhead informaron que primaria fibroblastos en cultivo pierden su potencial proliferativo después de pasajes sucesivos1. Este proceso es causado por la reducción secuencial de telómeros después de cada división celular. Cuando los telómeros alcanzan una longitud crítica corta, son reconocidos por la respuesta al daño del ADN (DDR) que activa una detención irreversible de la proliferación, también denominado senescencia replicativa. Senescencia replicativa es actualmente uno de los muchos estímulos que son conocidos por inducir un estado de detención permanente ciclo celular que hace que las células insensibles a los mitógenos y a apoptosis señales2,3. El programa de senescencia se caracteriza normalmente por características adicionales incluyendo alta actividad lisosomal, la disfunción mitocondrial, cambios nucleares, los cambios de la cromatina, estrés de retículo endoplasmático, daño de la DNA y una senescencia asociada fenotipo secretor (spas)3,4. Las células senescentes tienen múltiples funciones en el cuerpo: el desarrollo, la herida cura y tumor supresión2. Igualmente, se sabe que desempeñan un papel importante en el envejecimiento y, paradójicamente, en la progresión de tumor5. Los efectos negativos y parcialmente contradictorios, de senescencia se atribuyen a menudo a los spas6.
Recientemente, fue demostrado que la eliminación de células senescentes en ratones conduce a la extensión de vida útil y a la eliminación de muchos de los envejecimiento características7,8,9,10,11, 12. de la misma manera, se han desarrollado varios fármacos o eliminar las células senescentes (senolytics) o a los spas13,14. El potencial terapéutico contra el envejecimiento recientemente ha atraído más atención al campo.
El estudio de los mecanismos asociados a senescencia celular y las proyecciones para las intervenciones farmacológicas dependen en gran medida en modelos ex vivo , especialmente en fibroblastos humanos primarios. Si bien existen algunas características comunes activados por inductores de senescencia diversos, una gran variabilidad en el fenotipo de senescencia es observado y depende de varios factores incluyendo la célula tipo, estímulo y tiempo punto3,15, 16,17. Es imprescindible considerar la heterogeneidad para estudiar y que dirigida a las células senescentes. Por lo tanto, este protocolo pretende ofrecer una serie de métodos utilizados para inducir la senescencia en fibroblastos primarios mediante el uso de diferentes tratamientos. Como se explicará, los métodos fácilmente adaptables a otros tipos celulares.
Aparte de senescencia replicativa, Describimos cinco otros tratamientos de inducción de senescencia: radiaciones ionizantes, radiación, radiación ultravioleta (UV), la doxorrubicina, el estrés oxidativo y cambios epigenéticos (es decir, la promoción de la acetilación de las histonas o la desmetilación del ADN) . Tanto, la radiación ionizante y la radiación UV causan daño directo del ADN y, en la dosis apropiada, desencadenan senescencia18,19. Doxorrubicina también causa senescencia principalmente por daños en el ADN por intercalando en la DNA y alterar la función de Topoisomerasa II y así detener la DNA reparación mecanismos20. La expresión de genes esenciales para la senescencia es controlada normalmente por la acetilación de las histonas y la metilación del ADN. Como consecuencia, los inhibidores de la histona deacetilasa (p. ej., butirato y SAHA) y ADN desmetilantes (e.g., 5-aza) agentes gatillo senescencia de las células normales21,22.
Por último, cuatro de los marcadores más comunes asociados a las células senescentes se explicará: actividad del senescencia asociada-β-galactosidase (SA-β-gal), tasa de síntesis de ADN por análisis de la incorporación de EdU, la sobreexpresión de los reguladores del ciclo celular y inhibidores de quinasa dependiente de ciclina p16 y p21 y sobreexpresión y secreción de miembros de lo spas.
1. general preparación
2. inducción de la senescencia
3. marcadores de senescencia
Enriquecimiento de tinción SA-β-gal en fibroblastos senescentes
Β-galactosidasa (β-gal) es una enzima lisosomal que se expresa en todas las células y que tiene un pH óptimo de 4.025,26. Sin embargo, durante la senescencia, lisosomas aumentan de tamaño y, en consecuencia, las células senescentes acumulan a β-gal. La mayor cantidad de esta enzima hace posible detectar su actividad incluso a un pH subóptimo 6.025,27. Figura 1A muestra imágenes representativas de la tinción de SA-β-gal en proliferación versus senescentes fibroblastos primarios. Las células también se ven agrandados y con un cuerpo de la célula irregular. Como se mencionó, puede ser difícil de distinguir de las células individuales, para que co tinción con DAPI facilita la visualización y la célula contando (figura 1B). Es necesario tomar fotografías en un microscopio de fluorescencia para observar la tinción DAPI. Esto significa que se tomarán fotos en el canal de campo brillante en blanco y negro, por lo que la tinción "azul" de la SA-β-gal aparecerán negra en las imágenes. De la nota, no todas las celdas dentro de una muestra son positivas para β-gal. La eficacia de la inducción de senescencia es altamente dependiente de la célula y estímulo tipo, cepa utilizada. Los protocolos descritos aquí rindieron > 50% células positivas de β-gal en fibroblastos primarios (BJ y WI-38) en nuestras manos.
Menos las células incorporan EdU después de la inducción de la senescencia
EdU es un análogo de la timidina análogos de los nucleósidos que, durante la síntesis activa de ADN, será incorporado en el ADN28. La incorporación de EdU en el ADN puede visualizarse después de realizar la cicloadición Copper-Catalyzed azida-alquino (CuAAC) a EdU, reacción que no se puede realizar en timidina regular porque carece el alquino grupo28. En este protocolo en particular, se utiliza una Sulfo-Cy3-azida. Si el acoplamiento de la azida para la alquino ha tenido lugar, las células muestra fluorescencia bajo un filtro Cy3 (figura 2A). Es importante tener en cuenta que al realizar el análisis de la incorporación de EdU, las células que proliferan pueden distinguirse de las células no proliferantes. Las células no proliferantes pueden ser quieto o senescente, lo que significa que el análisis de la incorporación de EdU no puede discriminar entre estos dos tipos de detención del ciclo celular.
Alza de fibroblastos senescente el CDK inhibidores p16 y p21
Las células senescentes hacen uso de los inhibidores de las CDKs para detener el ciclo celular29. Particularmente p16 y p21 se miden a menudo como marcadores de las células senescentes3. Uno o ambos marcadores normalmente son upregulated en las células senescentes, y la regulación al alza a menudo se mide a nivel transcripcional. Se recomienda utilizar ambos marcadores simultáneamente ya que algunas células no alza p16 a nivel transcripcional y p21 es un marcador universal pero no específico de senescencia15,17,30. La figura 3 muestra representativas cuantificaciones relativas de p16 y p21 mRNA en fibroblastos induce a la senescencia. Otras técnicas como la inmunotinción o western blot para la detección de niveles de proteína también son posibles.
Fibroblastos senescentes mostrar un SASP
Las células senescentes más transcripcionalmente alza secretan varios genes que codifican para proteínas, un fenómeno llamado spas6. La spas incluye factores que intervienen en la inflamación, por ejemplo, interleucinas y quimiocinas, o en la degradación de la matriz extracelular (ECM), por ejemplo, MMPs, pero es altamente heterogénea. Inducción de factores de spas puede evaluarse mediante la medición de niveles de expresión de mRNA mediante qPCR o niveles de la proteína secretada por genitals inmuno Sorbent ensayo (ELISA). La figura 4 muestra una imagen representativa que muestra el upregulation de IL6 a nivel transcripcional y secretada. Utilizamos IL6 sólo como representación; sin embargo, se recomienda medir varios miembros de lo spas de la lista sugerida de protocolo 3.4.
Figura 1: enriquecimiento de la SA-β-gal tinción en senescentes fibroblastos primarios de. Fibroblastos de prepucio primaria BJ (PD 34.1) fueron inducidos a la senescencia mediante la exposición a la radiación ionizante (10 Gy). Las células fueron manchadas para SA-βgal diez días después de la irradiación. (A) resultados representativos para la tinción de SA-βgal en fibroblastos primarios de BJ sin tratamiento (arriba) o expuestos a la radiación ionizante (abajo). Ampliación final: 100 X. (B) figura representativa de SA-β-gal Co teñido con DAPI para fibroblastos primarios de BJ o sin tratamiento (tres paneles izquierdos) o expuestos a la radiación ionizante (tres paneles derecho). El DAPI (azul) la coloración permite para visualizar células individuales, facilitando la cuantificación. Fotografías tomadas en campo brillante aparecen en blanco y negro. Por lo tanto, en estas fotos particular SA-β-gal la coloración se verá como puntos negro perinuclear. Ampliación final: 100 X. (C) cuantificación de las células positivas SA-β-gal en proliferación (Prol., blanco) fibroblastos BJ contra radiaciones ionizantes homólogos tratados irradiado (senador, azul). Cuantificación se realizó utilizando tres réplicas biológicas con barras de error mostrando el error estándar de la media. Significación estadística fue determinada por un impar dos colas prueba t de Student-valores delta-CT. (n = 3, ± SEM, *** = valor de p < 0.01). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: células menos incorporan EdU después de la inducción de la senescencia. (A) imagen representativa del ensayo de incorporación de EdU en proliferación fibroblastos WI-38 43,86 PD (izquierda) y sus homólogos irradiación ionizantes (derecha). Ampliación final: 100 X. (B) cuantificación de EdU positivo células en proliferación (Prol., blanco) fibroblastos BJ (PD 38.7) versus sus homólogos irradiados (senador, azul). Cuantificación se realizó utilizando tres réplicas biológicas con barras de error mostrando el error estándar de la media. Significación estadística fue determinada por un impar dos colas prueba t de Student-valores delta-CT (n = 3, ± SEM, *** = valor de p < 0.01). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: fibroblastos senescentes alza el CDK inhibidores p16 y p21. (A) la cuantificación de la expresión de mRNA de p16 en proliferación (Prol., blanco, PD 35,3) o las células tratadas con 5-aza BJ (senador, azul). (B) cuantificación de la expresión de mRNA de p21 en proliferación (Prol., blanco, PD 35,3) o tratados con aza 5 BJ células (senador, azul). Cuantificación se realizó utilizando tres réplicas biológicas (cada uno con dos técnicos replica) con barras de error mostrando el error estándar de la media. Significación estadística fue determinada por un impar dos colas prueba t de Student-valores delta-CT (n = 3, ± SEM, *** = p valor < 0,01). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: fibroblastos senescentes mostrar un fenotipo secretorio (SASP). (A) la cuantificación de IL6 mRNA expresión en fibroblastos BJ ya sea proliferando (Prol., blanco, PD 38.7) o inducido a senescencia por radiación ionizante (senador, azul). (B) cuantificación de la expresión de la proteína de IL6 en proliferación PD 38.6 (Prol., blanco) o tratado con radiación ionizante WI38 fibroblastos (senador, azul). Cuantificación se realizó utilizando tres réplicas biológicas con barras de error mostrando el error estándar de la media. En el caso de los datos de la qPCR, cada repetición biológico tuvo dos técnicos duplicados. Significación estadística fue determinada por un impar dos colas prueba t de Student-valores delta-CT (n = 3, ± SEM, *** = valor dep < 0.01). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Diluyente | Solución madre de | Solución de trabajo | Dilución para el tratamiento | Concentración final | |
SAHA | DMSO | 100 mM | 1 mM | 1:1,000 | 16:00 |
Butirato de sodio | Agua estéril | --- | 1 M | 1: 250 | 4 mM |
5-aza-2'-desoxicitidina (5-aza) | DMSO | 100 mM | 10 mM | 1:1,000 | 10 ΜM |
Tabla 1: Acciones y soluciones de trabajo para los diferentes tratamientos utilizados para la senescencia inducida epigenéticamente.
Componente | Volumen | Concentración final |
20 mg/mL X-gal | 1 mL | 1 mg/mL |
0,2 M ácido cítrico/sodio fosfato tampón, ph 6.0 | 4 mL | 40 mM |
ferrocianuro de potasio de 100 mM | 1 mL | 5 mM |
Ferricianuro de potasio 100 mM | 1 mL | 5 mM |
Cloruro de sodio de 5 M | 0,6 mL | 150 mM |
Cloruro de magnesio de 1 M | 0,04 mL | 2 mM |
Agua | 12,4 mL | - |
Total | 20 mL |
Tabla 2: Composición de la solución de tinción utilizada para la senescencia asociada (SA) - β - gal la coloración.
Blanco | Avance Primer (5'--> 3') | Reverse Primer (5'--> 3') | Sonda UPL | ||
Tubulina | CTTCGTCTCCGCCATCAG | CGTGTTCCAGGCAGTAGAGC | #40 | ||
Actina B | ccaaccgcgagaagatga | ccagaggcgtacagggatag | #64 | ||
P16 | GAGCAGCATGGAGCCTTC | CGTAACTATTCGGTGCGTTG | #67 | ||
P21 | tcactgtcttgtacccttgtgc | ggcgtttggagtggtagaaa | #32 | ||
IL6 | CAGGAGCCCAGCTATGAACT | GAAGGCAGCAGGCAACAC | #45 | ||
IL8 | GAGCACTCCATAAGGCACAAA | ATGGTTCCTTCCGGTGGT | #72 | ||
IL1a | GGTTGAGTTTAAGCCAATCCA | TGCTGACCTAGGCTTGATGA | #6 | ||
CXCL1 | CATCGAAAAGATGCTGAACAGT | ATAAGGGCAGGGCCTCCT | #83 | ||
CXCL10 | GAAAGCAGTTAGCAAGGAAAGGT | GACATATACTCCATGTAGGGAAGTGA | #34 | ||
CCL2 | AGTCTCTGCCGCCCTTCT | GTGACTGGGGCATTGATTG | #40 | ||
CCL20 | GCTGCTTTGATGTCAGTGCT | GCAGTCAAAGTTGCTTGCTG | #39 | ||
PAI1 | AAGGCACCTCTGAGAACTTCA | CCCAGGACTAGGCAGGTG | #19 | ||
MMP1 | GCTAACCTTTGATGCTATAACTACGA | TTTGTGCGCATGTAGAATCTG | #7 | ||
MMP3 | CCAGGTGTGGAGTTCCTGAT | CATCTTTTGGCAAATCTGGTG | #72 | ||
MMP9 | GAACCAATCTCACCGACAGG | GCCACCCGAGTGTAACCATA | #53 |
Tabla 3: Secuencias de la cartilla y su correspondiente sonda UPL para la detección de ARNm de marcadores de senescencia en muestras de origen humano.
Componente | Volumen de la muestra |
Sensifast sonda Lo-Rox mix | 5 ΜL |
Primer conjunto (50 μm) | 0.1 ΜL |
Sonda UPL | 0.1 ΜL |
Agua libre de nucleasas | 2.3 ΜL |
cDNA (~ 4 ng) | 2,5 ΜL |
Total | ΜL DE 7.5 |
Tabla 4: Composición de la reacción de qPCR de la mezcla para el sistema UPL.
Los protocolos explicados aquí fueron optimizados para fibroblastos primarios humanos, particularmente las células BJ y WI-38. Los protocolos para la senescencia replicativa, radiaciones ionizantes y doxorrubicina, se han aplicado con éxito a otros tipos de fibroblastos (HCA2 y IMR90) y en otros tipos celulares (es decir neonatales melanocitos y queratinocitos o cardiomiocitos derivados de iPSC) en nuestro laboratorio. Sin embargo, las adaptaciones de los tipos de células adicionales pueden optimizarse ajustando algunos detalles como el número de células sembradas, los métodos y productos químicos para ayudar a las células para colocar y quitar para soportes de plástico y la dosis del tratamiento para evitar la toxicidad.
Incluso el uso de fibroblastos primarios plantea una serie de desafíos. Las células senescentes son generalmente más difíciles de soltar que sus contrapartes de proliferación, y suelen ser más sensible a la tripsinización o cualquier otro tipo de extracción método, lo que significa que la viabilidad después de separar es ligeramente inferior a la de células proliferantes. La elección del control adecuado de los diferentes métodos de inducción de senescencia es difícil. Por ejemplo, para los tratamientos basados en drogas como la doxorubicina, sugerimos un tratamiento corto con el vehículo: PBS durante 24 h en el caso de las muestras de control para células tratadas con doxorrubicina seguida de cosecha y procesamiento inmediato. Podría aducirse que induce a la senescencia de las células pasan por un tiempo extendido de la cultura después de que el tratamiento fue aplicado (seis días adicionales de cultivo para células tratadas con doxorrubicina) y que las células del control deben ser cultivada igual cantidad de tiempo después del retiro de PBS. Sin embargo, una cultura tan largo le permitiría a las células para dividir aún más, a convertirse en confluentes excesiva o exigir más pases y aumentar PD. confluencia excesiva puede causar marcadores de senescencia, como SA-β-gal a aparecer a pesar de las células manteniendo sus potencial de proliferación31. El mayor PD conseguir más cercano a su límite de replicación (y a la senescencia replicativa) y hacerlas menos comparables a sus homólogos tratados con doxorrubicina. Una situación similar se aplicaría para los otros tratamientos. Hemos sugerido los controles que consideremos más apropiados para cada caso.
La mayoría de las técnicas utilizadas para inducir las células en senescencia parece relativamente fácil y sencilla, pero muchos factores pueden afectar el resultado de los experimentos. Por ejemplo, la concentración de glucosa normal célula convencional de medios de cultivo de fibroblastos es de 4,5 g. Sin embargo, para algunos tipos de células como las células madre, concentraciones menores de glucosa extienden su potencial proliferativo32, mientras que para otros concentraciones más altas pueden conducir a envejecimiento prematuro33. Por otra parte, las células senescentes son altamente metabólicas y gastan grandes cantidades de energía para producir factores secretados34, otros fenotipos asociados a senescencia puedan verse afectados por las oscilaciones en las concentraciones de glucosa.
Otra variable de potencial en el medio de cultivo celular es suero. La composición del suero normalmente no está definida y varía según la fuente de animales y el lote. Particularmente, la cantidad de proteínas proinflamatorias y factores de crecimiento puede influir en la senescencia35. Recomendamos que el mismo lote de suero se utiliza para el experimento entero para evitar variabilidad innecesaria y confusión. Sin embargo, algunas inevitables condiciones técnicas como el uso de medio sin suero utilizado para algunos protocolos basados en ELISA pueden reducir la expresión de spas.
Tensión de oxígeno es importante para la inducción de senescencia completa. La hipoxia puede inhibir la geroconversion, para que las células no proliferan pero no irreversible arrestado36. Sin embargo, el problema más común en la configuración experimental no es hipoxia pero hiperoxia. De hecho, las condiciones de cultivo estándar suelen ser de 20% de oxígeno como "normoxia", pero las condiciones fisiológicas para más tipos de células son menores. Blastocistos de ratón presentan marcadores de senescencia (SA-βgal y DNA daños) cuando cultivadas en el 20% de oxígeno, a diferencia de los ines vivo-derivados homólogos o las mismas células cultivadas en el 5% oxígeno37. Además, los fibroblastos de ratón cultivan en condiciones más fisiológicas (3% de oxígeno) y no en pantalla de unos (20% oxígeno) convencional un SASP38. Aquí, utilizamos el 5% de oxígeno para todas las culturas y experimentos y nos instan a los investigadores a reconsiderar las concentraciones de oxígeno utilizadas para el tipo de célula particular de interés.
Finalmente, otro factor a considerar es la heterogeneidad intrínseca de las células senescentes. Por un lado, incluso células cepas y diferentes tipos de células muestran diferencias en los fenotipos asociados a senescencia. Por ejemplo, algunas cepas de fibroblastos hacen no alza p16 a nivel transcripcional sobre inducción de senescencia15,16,17, como también se muestra en la Figura 3A, donde a pesar de ver un upregulation de P16, esto no fue estadísticamente significativo. P16 también se controla a nivel traduccional y poste-de translación, por lo que la medición de los niveles de proteína podría en algunos casos demuestran un aumento de la actividad de este inhibidor de la CDK. Sin embargo, es posible que algunas células simplemente dependen de otros inhibidores CDK, como p21. Se recomienda medir los niveles transcripcionales de ambos. La composición exacta de la spas también depende de la célula que lo produce3. Además, algunas células constitutivamente expresan altos niveles de β-galactosidasa, dando un resultado positivo para la tinción de SA-β-gal que no es necesariamente indicativa de senescencia3. En algunos casos, este problema puede ser superado reduciendo el tiempo de incubación con solución de tinción durante el protocolo de tinción SA-β-gal. Como se mencionó, las células confluentes sobre también podrían mancha con SA-β-gal sin ellos siendo senescentes31, por lo que instamos a los investigadores a células en cultivo escasamente para realizar esta tinción. Por otra parte, el fenotipo de envejecimiento sí mismo no es estable39. La composición de la spas y la aparición de otros marcadores de senescencia son dependientes del tiempo17,40. Aquí, hemos sugerido los puntos del tiempo después de cada tratamiento en el que las células se consideran totalmente senescentes y que se utilizan habitualmente en nuestro laboratorio. Lo importante es medir los marcadores en un punto del tiempo más corto puede hacer resultados negativos debido a la senescencia incompleta40. Por otra parte, ya que en la mayoría de los tratamientos de un porcentaje de células no se convierten en senescentes, utilizando un punto de tiempo más largo puede dar tiempo suficiente para que las pocas células no senescentes ampliar y superar a la cultura, reducción de la expresión de marcadores de senescencia. En vista de la heterogeneidad de las células senescentes y las múltiples advertencias de los diferentes marcadores, altamente animamos a los investigadores a utilizar múltiples marcadores de senescencia dentro de la misma muestra.
N / A
Agradecemos a los miembros del laboratorio Demaria para discusiones fructíferas y Thijmen van Vliet para compartir datos y protocolo en la senescencia inducida por UV.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
DMEM Media - GlutaMAX | Gibco | 31966-047 | |
Fetal Bovine Serum | Hyclone | SV30160.03 | |
Penicillin-Streptomycin (P/S; 10,000 U/ml) | Lonza | DE17-602E | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | SC-202581 | |
Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated) | Ambion | AM9937 | |
T75 flask | Sarstedt | 833911002 | |
Trypsin/EDTA Solution | Lonza | CC-5012 | |
PBS tablets | Gibco | 18912-014 | |
1.5 ml microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | T9661-1000EA | |
Corning 15 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
6-well plate | Sarstedt | 83.3920 | |
24-well plate | Sarstedt | 83.3922 | |
13mm round coverslips | Sarstedt | 83.1840.002 | |
Steriflip | Merck Chemicals | SCGP00525 | |
Cesium137-source | IBL 637 Cesium-137γ-ray machine | ||
UV radiation chamber | Opsytec, Dr. Göbel BS-02 | ||
Doxorubicin dihydrochloride | BioAustralis Fine Chemicals | BIA-D1202-1 | |
Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 7722-84-1 | |
5-aza-2’-deoxycytidine | Sigma-Aldrich | A3656 | |
SAHA | Sigma-Aldrich | SML0061 | |
Sodium Butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) | Fisher Scientific | 7240-90-6 | |
Citric acid monohydrate | Sigma-Aldrich | 5949-29-1 | |
Sodium dibasic phosphate | Acros organics | 7782-85-6 | |
Potassium ferrocyanide | Fisher Scientific | 14459-95-1 | |
Potassium ferricyanide | Fisher Scientific | 13746-66-2 | |
Sodium Chloride | Merck Millipore | 7647-14-5 | |
Magnesium Chloride | Fisher Chemicals | 7791-18-6 | |
25% glutaraldehyde | Fisher Scientific | 111-30-8,7732-18-5 | |
16% formaldehyde (w/v) | Thermo-Fisher Scientific | 28908 | |
EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine) | Lumiprobe | 10540 | |
Sulfo-Cyanine3 azide (Sulfo-Cy3-Azide) | Lumiprobe | D1330 | |
Sodium ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
Copper(II) sulfate pentahydrate (Cu(II)SO4.5H2O) | Sigma-Aldrich | 209198 | |
Triton X-100 | Acros organics | 215682500 | |
TRIS base | Roche | 11814273001 | |
LightCycler 480 Multiwell Plate 384, white | Roche | 4729749001 | |
Lightcycler 480 sealing foil | Roche | 4729757001 | |
Sensifast Probe Lo-ROX kit | Bioline | BIO-84020 | |
UPL Probe Library | Sigma-Aldrich | Various | |
Human IL-6 DuoSet ELISA | R&D | D6050 | |
Bio-Rad TC20 | Bio-Rad | ||
Counting slides | Bio-Rad | 145-0017 | |
Dry incubator | Thermo-Fisher Scientific | Heratherm | |
Dimethylformamide | Merck Millipore | 1.10983 | |
Parafilm 'M' laboratory film | Bemis | #PM992 | |
Tweezers | |||
Needles |
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