التعريف والتحقق من الصحة للشيخوخة الخلوية في الخلايا البشرية الأولية

وهنا، نحن نناقش سلسلة من البروتوكولات لتحريض والتحقق من الصحة للشيخوخة الخلوية في الخلايا المستزرعة. نركز على مختلف المحفزات الذي يحفز الشيخوخة ووصف التحديد الكمي للعلامات الشائعة المرتبطة بالشيخوخة. نحن نقدم التفاصيل التقنية باستخدام الخلايا الليفية كنموذج، ولكن البروتوكولات يمكن أن تتكيف مع مختلف النماذج الخلوية.

الشيخوخة الخلوية حالة توقيف دورة الخلية الدائمة المنشط في الاستجابة للمحفزات الضارة المختلفة. التنشيط للشيخوخة الخلوية السمة مميزة لمختلف الظروف الفيزيولوجية المرضية بما في ذلك قمع الورم، الأنسجة يعيد البناء والشيخوخة. مستحثات للشيخوخة الخلوية في فيفو تتميز لا يزال ضعيفا. ومع ذلك، يمكن استخدام عدد من المحفزات لتعزيز الشيخوخة الخلوية السابقين فيفو. فيما بينها، هي مستحثات الشيخوخة الأكثر شيوعاً استنفاد replicative الإشعاعات المؤينة وغير المؤينة، وسمية جينية، والأكسدة، وديميثيلاتينج والمخدرات أسيتيلاتينج وكلاء. هنا، سوف نقدم إرشادات مفصلة حول كيفية استخدام هذه المحفزات لحمل الليفية في الشيخوخة. هذا البروتوكول يمكن بسهولة تكييف لأنواع مختلفة من الخلايا الأولية وخطوط الخلايا، بما في ذلك الخلايا السرطانية. ونحن أيضا وصف أساليب مختلفة للتحقق من صحة الاستقراء الشيخوخة. على وجه الخصوص، نحن نركز على قياس نشاط الإنزيم الليزوزومية المرتبطة بالشيخوخة β-جالاكتوسيداسي (SA-β-غال)، معدل تركيب الدنا باستخدام 5-اثينيل-2 '--ديوكسيوريديني (إيدو) إدماج التحليل، مستويات التعبير عن دورة الخلية مثبطات p16 و p21، والتعبير وإفراز أفراد من النمط الظاهري الافرازية سينيسسينسياسوسياتيد (ساسب). وأخيراً، نحن نقدم نتائج المثال ومناقشة المزيد من التطبيقات لهذه البروتوكولات.

وأفادت هايفليك ومورهيد في عام 1961، أن الخلايا الليفية الأولية في الثقافة تفقد إمكانياتها التكاثري بعد مقاطع متتالية¹. هذه العملية بسبب تقصير التيلومير متسلسلة بعد كل انقسام الخلية. عندما يصل التيلومير إلى مدة قصيرة جداً، يتم التعرف على أنها استجابة تلف الحمض النووي (DDR) التي ينشط فيها القبض لا رجعة فيه من انتشار – كما يعرف الشيخوخة ريبليكاتيفي. الشيخوخة replicative حاليا واحدة من العديد من المحفزات التي هي معروفة لحمل دولة القبض عليه دورة الخلية الدائمة أن يجعل خلايا حساسة إلى ميتوجينس وإلى إشارات apoptotic^2،3. برنامج الشيخوخة ويتسم عادة بميزات إضافية بما في ذلك النشاط الليزوزومية عالية وخلل mitochondrial والتغيرات النووية، الكروماتين ترتيبات جديدة، الإجهاد هيولى، أضرار الحمض النووي والمرتبطة الشيخوخة النمط الظاهري الافرازية (ساسب)^3،4. مسن الخلايا لها وظائف متعددة في الجسم: التنمية، والجرح الشفاء والورم قمع². وبالمثل، كانت معروفة لتلعب دوراً هاما في الشيخوخة، ومن المفارقات أنه في تطور الورم⁵. آثار الشيخوخة سلبية، ومتناقضة جزئيا، وكثيراً ما يعزى إلى ساسب⁶.

في الآونة الأخيرة، وقد تبين أن القضاء على الخلايا مسن من الفئران يؤدي إلى تمديد عمر وإلى القضاء على العديد من الشيخوخة ميزات^7،،من^{89،10،11، 12}. بنفس الطريقة، تم تطوير أدوية متعددة أما القضاء على الخلايا مسن (سينوليتيكس) أو لاستهداف ال^13،ساسب¹⁴. إمكانات العلاج المضادة للشيخوخة اجتذبت مؤخرا المزيد من الاهتمام إلى الميدان.

دراسة الآليات المرتبطة بالشيخوخة الخلوية والعروض للتدخلات الدوائية تعتمد بشدة على السابقين فيفو النماذج، لا سيما في الخلايا الليفية الأولية البشرية. بينما هناك بعض السمات المشتركة تنشيطه بواسطة مستحثات الشيخوخة المتنوعة، التقلبات كبيرة في النمط الظاهري الشيخوخة الملاحظة وتعتمد على عوامل مختلفة بما في ذلك الخلية نوع والتحفيز والوقت النقطة^{3،15، ،}من ¹⁶¹⁷. لا بد من النظر إلى التباين لدراسة واستهداف الخلايا مسن. ولذلك، هذا البروتوكول يهدف إلى توفير مجموعة من الأساليب المستخدمة للحث على الشيخوخة في الخلايا الليفية الأولية باستخدام العلاجات المختلفة. كما سيتم شرح ذلك، يمكن بسهولة أن الأساليب تكييف أنواع الخلايا الأخرى.

وبصرف النظر عن الشيخوخة replicative، يصف لنا خمسة علاجات أخرى يحفز الشيخوخة: الإشعاعات المؤينة الإشعاع والأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) الإشعاع، ميتوتريكسات، والأكسدة وتغييرات جينية (إلا وهي تعزيز acetylation هيستون أو DNA demethylation) . على حد سواء، من الإشعاع المؤين والإشعاع فوق البنفسجي يسبب ضرر مباشر على الحمض النووي، وفي الجرعة المناسبة، تؤدي إلى الشيخوخة^18،19. ميتوتريكسات أيضا لأسباب الشيخوخة أساسا عن طريق الحمض النووي الأضرار التي إينتيركالاتينج في الحمض النووي، وتعطيل وظيفة الثاني توبويسوميراسي، وهكذا وقف الحمض النووي إصلاح آليات²⁰. عادة تسيطر الجينات الأساسية للشيخوخة هيستون acetylation ومثلايشن الحمض النووي. نتيجة لذلك، مثبطات deacetylase هيستون (مثلاً، بوتيرات الصوديوم وساها) والحمض النووي ديميثيلاتينج (مثلاً، 5-عزة) عوامل تؤدي إلى الشيخوخة في الخلايا الطبيعية وإلا^21،22.

وأخيراً، سيتم شرح أربعة من العلامات الأكثر شيوعاً المرتبطة بالخلايا مسن: النشاط الشيخوخة المرتبطة-β-جالاكتوسيداسي (SA-β-غال)، المعدل لتركيب الدنا من إيدو إدماج المقايسة، overexpression المنظمين دورة الخلية و كيناز cyclin تعتمد على مثبطات p16 و p21، وأوفيريكسبريشن وإفراز أعضاء ساسب.

1-إعداد معلومات عامة

1. إعداد متوسطة D10. تكملة دميم المتوسطة-جلوتاماكس مع 10% FBS و 1% البنسلين/ستربتوميسين (التركيز النهائي: 100 يو/مليلتر).
2. إعداد برنامج تلفزيوني العقيمة. حل على أقراص في المياه وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. تعقيم اﻷوتوكﻻف.
3. إعداد 1 x التربسين. تمييع 5 مل من التربسين-فيرسيني يدتا/10 × 01:10 في 45 مل PBS العقيمة.
   ملاحظة: في جميع أنحاء البروتوكول، نستخدم شروط ثقافة الخلية التي أقرب إلى فسيولوجية شروط الليفية الأولية. وهذا يعني أننا احتضان خلايا في 37 درجة مئوية و 5% CO₂ كما عادة القيام به لكن باستخدام 5% O₂ بدلاً من 20 ٪ س "ستاندارد"_2-
4. التعامل مع جميع العينات في ظروف معقمة باستخدام غطاء الاندفاق الصفحي ومعطف المعمل والقفازات. إبقاء الخلايا في % 20 س₂ (غرفة الأحوال) فقط في حين يجري التعامل معها.

2-تنظيم دورات تعريفية للشيخوخة

1. الشيخوخة ريبليكاتيفي
   1. أثناء التعامل مع الخلايا أو أي المواد التي سوف تكون على اتصال بها (بيبيتس، قوارير، وسائل الإعلام، إلخ) العمل تحت ظروف معقمة، باستخدام غطاء الاندفاق الصفحي ومعطف المعمل والقفازات. إبقاء الخلايا في % 20 س₂ (غرفة الأحوال) فقط في حين يجري التعامل معها.
   2. البذور 7 × 10⁵ الليفية الأولية قابلة للتطبيق في عدد سكان منخفضة في T75 قارورة (~9.3 x 10³ خلايا/سم²) التي تحتوي على 10 مل D10 مضاعفة (PD).
   3. تنمو الخلايا في حاضنة خلية عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%₂ و % 5 س₂ حتى تصل إلى 70 – 80% التقاء (3 – 4 أيام للثقافات المنتشرة في PD منخفضة).
   4. فصل الخلايا باستخدام 3 مل 1 × التربسين وتفرخ ~ 5 – 7 دقيقة في حاضنة ثقافة خلية عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%₂ و % 5 س₂. رصد الخلايا بانتظام مع مجهر ثقافة خلية للتحقق من عملية ديتاتشينج.
   5. عندما تكون الخلايا كروية، التوقف عن رد فعل التربسين بإضافة 9 مل D10. عدم احتضان أطول من 10 دقائق.
   6. تدور الخلايا في 300 x ز لخلايا دقيقة 5 ستشكل بيليه في الجزء السفلي من الأنبوب، بينما تبقى الحطام والجزيئات الصغيرة في المادة طافية.
   7. إزالة المادة طافية وحل بيليه الخلية في 1 مل D10 وأداء عدد خلايا استخدام عداد الآلي خلية وفقا لإرشادات الشركة المصنعة أو دائرة نيوباور للعد اليدوي. حين العد، وتشمل فحص للتحقق من صلاحية الخلايا (مثلاً، تريبان الأزرق استبعاد²³).
   8. حساب PD التراكمي باستخدام هذه الصيغة:
      شعبة البرامج_{الجديدة} = 3.32* (LOG(cell number total)-(سجل (عدد الخلايا المصنف)) + بدولد
      خلية العدد الإجمالي = كافة الخلايا التي تم عدها: ميتة وعلى قيد الحياة.
      خلية رقم المصنف = عدد خلايا قابلة للحياة المصنف (8 × 10⁵ خلايا).
      PD_القديم = السكان مضاعفة في هذه اللحظة من البذر.
      شعبة البرامج_{الجديدة} = السكان مضاعفة في هذه اللحظة من العد (بعد الحضانة).
      ملاحظة: إذا كان المصنف 7 × 10⁵ الليفية الأولية (PD 35.2) في قارورة T-75، وبعد 4 أيام التوصل إلى التقاء 80%، ويتم تقسيم مرة أخرى، عد الآن 1.3 × 10⁶ مجموع الخلايا (الميت + على قيد الحياة).
      شعبة البرامج_{الجديدة} = 3.32* (LOG(1,300,000 cells)-LOG(700,000)) + 35.2
      شعبة البرامج_{الجديدة} = 36.1
   9. ريسيد 8 × 10⁵ خلايا في T75 جديدة، تكرار الخطوات 2.1.2–2.1.8.
      ملاحظة: بعد عدة فقرات متتالية، الثقافة سيستغرق وقتاً أطول للحصول على المتلاقية حتى خلايا وقف تقسيم على الإطلاق. وقف تقسيم الخلايا مرة واحدة، اختبار لعلامات الشيخوخة و/أو الحصاد للتطبيقات المتلقين للمعلومات.
   10. نعتبر أن حجم أكبر من الخلايا مسن قد تتسبب في الثقافة تظهر كاملة ولكن عدد خلايا منخفضة. وهكذا، يمكن افتراض الشيخوخة عند PD مستقرة وأخرى علامات الشيخوخة تظهر في الثقافة (انظر بروتوكولات 3.1-3.5).
       ملاحظة: استخدم تكاثر الخلايا الليفية الأولية كعنصر التحكم.
2. الشيخوخة التي يسببها الإشعاع المؤين
   1. أثناء التعامل مع الخلايا أو أي المواد التي سوف تكون على اتصال بها (بيبيتس، قوارير، وسائل الإعلام، إلخ)، العمل تحت ظروف معقمة باستخدام غطاء الاندفاق الصفحي ومعطف المعمل والقفازات. إبقاء الخلايا في % 20 س₂ (غرفة الأحوال) فقط في حين يجري التعامل معها.
   2. البذور 7 × 10⁵ قابلة للتطبيق الأساسي الليفية في PD منخفضة في قارورة T75 (~9.3 x 10³ خلايا/سم²) التي تحتوي على 10 مل D10.
   3. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في حاضنة ثقافة خلية عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%₂ و % 5 س₂.
   4. تعرض الخلايا إلى رمادي 10 من إشعاع غاما وفقا لتعليمات الجهاز قيد الاستخدام.
   5. نضح المتوسطة من الخلايا، واستبدال مع 10 مل D10.
   6. احتضان الخلايا في 10 مل D10 في حاضنة ثقافة خلية عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%₂ و % 5 س₂ لمدة 10 أيام استبدال المتوسطة بانتظام، وتقريبا كل 3 أيام.
   7. وبعد عشرة أيام، اختبار لعلامات الشيخوخة و/أو استخدام الخلايا للتطبيقات المتلقين للمعلومات.
      ملاحظة: استخدم تكاثر الخلايا الليفية الأولية من PD نفسه (قبل التشعيع) كعنصر التحكم.
3. الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) الإشعاع الشيخوخة
   1. أثناء التعامل مع الخلايا أو أي المواد التي سوف تكون على اتصال بها (بيبيتس، قوارير، وسائل الإعلام، إلخ)، العمل تحت ظروف معقمة باستخدام غطاء الاندفاق الصفحي ومعطف المعمل والقفازات. إبقاء الخلايا في % 20 س₂ (غرفة الأحوال) فقط في حين يجري التعامل معها.
   2. بذور 1.5 – 2 × 10⁵ الليفية الأولية قابلة للتطبيق في PD منخفضة في بئر واحدة للوحة 6-جيدا (1.5 – 2.0 × 10⁴ خلايا/سم²)، أضف 2 مل متوسطة D10.
   3. وضع الخلايا في حاضنة ثقافة خلية عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%₂ و % 5 س₂ والسماح لهم بالتمسك بالبلاستيك على الأقل 5 ح.
   4. تقلع في المتوسط من الخلايا. ضع لوحة 6-جيدا في منتصف الدائرة الإشعاع فوق البنفسجي وخلع غطاء بلاستيكي. تشعيع مع الأشعة فوق البنفسجية، 20-30 مللي جول/سم².
   5. إضافة 2 مل متوسطة كل بئر.
   6. احتضان الخلايا في 2 مل D10 في حاضنة ثقافة خلية عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%₂ و % 5 س₂ لآخر 7 أيام استبدال المتوسطة بانتظام، وتقريبا كل 3 أيام.
      ملاحظة: بعد 7 أيام، خلايا يمكن اختبارها لعلامات الشيخوخة ويستخدم للتطبيقات المتلقين للمعلومات. تستخدم الخلايا الليفية الأولية المتكاثرة من PD نفسه (قبل التشعيع) كعنصر التحكم.
4. الشيخوخة التي يسببها ميتوتريكسات
   1. إعداد 1,000 x ميتوتريكسات الأسهم الحل: جعل مخزون 250 ميكرون من ميتوتريكسات في برنامج تلفزيوني 1 x، تصفية تعقيم الحل وقاسمه في 500 ميليلتر في أنبوب عقيم. تخزين المخزون ميتوتريكسات في-80 درجة مئوية.
   2. أثناء التعامل مع الخلايا أو أي المواد التي سوف تكون على اتصال بها (بيبيتس، قوارير، وسائل الإعلام، إلخ)، العمل تحت ظروف معقمة باستخدام غطاء الاندفاق الصفحي ومعطف المعمل والقفازات. إبقاء الخلايا في % 20 س₂ (غرفة الأحوال) فقط في حين يجري التعامل معها.
   3. البذور 7 × 10⁵ قابلة للتطبيق الأساسي الليفية في PD منخفضة في قارورة T75 (~9.3 x 10³ خلايا/سم²) التي تحتوي على 10 مل D10.
   4. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في حاضنة ثقافة خلية عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%₂ و % 5 س₂.
   5. ميليلتر 11 1000 × الحل ميتوتريكسات الأسهم في 11 مل D10 إلى تركيز نهائي لتمييع 250 نيوتن متر.
   6. نضح المتوسطة من الخلايا، واستبدال مع 10 مل D10 + ميتوتريكسات.
   7. احتضان الخلايا الخاصة بالضبط 24 ح في حاضنة ثقافة خلية عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%₂ و % 5 س₂.
   8. نضح المتوسطة من الخلايا، وتغسل بعناية مرة واحدة مع 10 مل D10.
   9. احتضان الخلايا في 10 مل D10 لمدة 6 أيام استبدال المتوسطة بانتظام، وتقريبا كل 3 أيام.
   10. في يوم 7، اختبار لعلامات الشيخوخة و/أو استخدام لتطبيقات المتلقين للمعلومات.
       ملاحظة: كمراقبة، استخدام تكاثر الخلايا الليفية الأولية من PD نفس العلاج 24 ساعة بالسيارة (PBS) 1:1,000 في D10.
5. الشيخوخة الناجمة عن الإجهاد التأكسدي
   1. أثناء التعامل مع الخلايا أو أي المواد التي سوف تكون على اتصال بها (بيبيتس، قوارير، وسائل الإعلام، إلخ) العمل تحت ظروف معقمة باستخدام غطاء الاندفاق الصفحي ومعطف المعمل والقفازات. إبقاء الخلايا في % 20 س₂ (غرفة الأحوال) فقط في حين يجري التعامل معها.
   2. البذور 7 × 10⁵ قابلة للتطبيق الأساسي الليفية في PD منخفضة في قارورة T75 (~9.3 x 10³ خلايا/سم²) التي تحتوي على 10 مل D10.
   3. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في حاضنة خلية عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%₂ و % 5 س₂.
   4. تعد حلاً بيروكسيد الهيدروجين ~ 200 ميكرومتر في المتوسط D10 بإضافة 22.6 ميكروليتر من بيروكسيد الهيدروجين 30% في 11 مل D10.
      ملاحظة: تحسين العلاج لنوع الخلية من اهتمام بجعل منحنى جرعة واﻻستجابة لتقييم السمية.
   5. نضح المتوسطة من الخلايا، وإضافة 10 مل من الطازجة D10 متوسطة + فوق أكسيد الهيدروجين. احتضانها ح 2 في 37 درجة مئوية مع شركة 5%₂ و 5% س₂.
   6. نضح المتوسطة من الخلايا، وتغسل مرة واحدة مع D10 الطازجة دون بيروكسيد الهيدروجين.
   7. أضف 10 مل من D10 دون بيروكسيد الهيدروجين.
   8. احتضانها ح 48 في حاضنة ثقافة خلية عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%₂ و % 5 س₂.
   9. كرر الخطوات 2.5.4–2.5.8 مرتين أكثر لما مجموعة ثلاثة علاجات.
   10. التحقق من وجود علامات الشيخوخة أو الحصاد للتطبيقات المتلقين للمعلومات.
       ملاحظة: مراقبة، استخدام الخلايا المتكاثرة من PD نفس تعامل مع 22.6 ميليلتر من الماء المعقم في D10 ح 2.
6. الشيخوخة التي يسببها ابيجينيتيكالي
   1. إعداد المخزون وعمل الحلول molecule(s) الصغيرة استخدامها وفقا الجدول 1. عامل التصفية-تعقيم الحلول. قاسمة في أنابيب معقمة. مخزن في-20 درجة مئوية.
   2. أثناء التعامل مع الخلايا أو أي المواد التي سوف تكون على اتصال بها (بيبيتس، قوارير، وسائل الإعلام، إلخ) العمل تحت ظروف معقمة، على سبيل المثال، باستخدام غطاء الاندفاق الصفحي ومعطف المعمل والقفازات. إبقاء الخلايا في % 20 س₂ (غرفة الأحوال) فقط في حين يجري التعامل معها.
   3. البذور 7 × 10⁵ قابلة للتطبيق الأساسي الليفية في PD منخفضة في قارورة T75 (~9.3 x 10³ خلايا/سم²) التي تحتوي على 10 مل D10.
   4. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في حاضنة ثقافة خلية عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%₂ و % 5 س₂.
   5. إعداد 11 مل من المتوسطة D10 + حل عملي للعلاج المطلوب. تمييع الدقيقة الواحدة المعاملة يتبين في الجدول 1.
      1. إعداد ميليلتر 11 مم 1 ساها العامل الحل في 11 مل D10.
      2. إعداد ميليلتر 44 م 1 الصوديوم butyrate العامل الحل في 11 مل D10.
      3. إعداد ميليلتر 11 مم 10 5-عزة عمل حل في 11 مل D10.
         ملاحظة: تحسين العلاجات للخلية نوع من الاهتمام بها، وعلى سبيل المثال، مما يجعل منحنى جرعة واﻻستجابة لتقييم السمية.
   6. إضافة D10 المتوسطة + حل عملي للعلاج المطلوب للثقافة.
   7. احتضانها ح 24 في حاضنة ثقافة خلية عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%₂ و % 5 س₂.
   8. كرر الخطوات 2.6.4–2.6.6 مرتين أكثر من ذلك، لما مجموعة ثلاثة علاجات.
   9. تغيير المتوسطة ل D10 بسيطة دون المخدرات.
   10. وبعد 3 أيام أكثر، تصبح الخلايا مسن وجاهز للاختبار من علامات الشيخوخة وتطبيقات المتلقين للمعلومات.
       ملاحظة: كمراقبة، استخدام تكاثر الخلايا الليفية الأولية من PD نفس معاملة لمدة ثلاثة أيام مع D10 متوسطة + مركبة. D10 متوسطة + السيارة تحتاج إلى تحديث كل 24 ساعة خلال تلك الأيام الثلاثة. السيارة يعتمد على العلاج المستخدمة: 1:1,000 [دمس] للماء المعقم ساها وعزة 5 و 1: 250 "الصوديوم بوتيرات".

3-علامات الشيخوخة

1. إعداد
   1. إعداد 20 ملغ/مل غال X: حل 20 ملغ من X-غال في 1 مل من ديميثيلفورماميدي أو [دمس]. تخزين في-20 درجة مئوية محمية من الضوء.
   2. إعداد 0.1 M حمض الستريك الحل: حل غ 2.1 من مونوهيدرات حامض الستريك في 100 مل الماء. تخزين في درجة حرارة الغرفة.
   3. إعداد الحل فوسفات الصوديوم 0.2 M: 3.56 غرام من فوسفات الصوديوم مائي أو ز حل 2.84 من فوسفات الصوديوم مائي يذوي في 100 مل الماء. تخزين في درجة حرارة الغرفة.
   4. إعداد 0.2 M حمض الستريك/صوديوم فوسفات pH 6.0: حل مل 36.85 حل حمض الستريك 0.1 م ومل 63.15 من فوسفات الصوديوم 0.2 متر. ضبط بالضبط على درجة الحموضة 6.0. تخزين في درجة حرارة الغرفة.
   5. إعداد فيروسيانيد البوتاسيوم 100 مم: حل غ 2.1 من فيروسيانيد البوتاسيوم في 50 مل الماء. تخزين في 4 درجات مئوية محمية من الضوء.
   6. تحضير سيانيد البوتاسيوم 100 مم: حل ز 1.7 من سيانيد البوتاسيوم في 50 مل الماء. تخزين في 4 درجات مئوية محمية من الضوء.
   7. تحضير كلوريد الصوديوم 5 م: حل ز 14.6 من كلوريد الصوديوم في 50 مل الماء. تخزين في درجة حرارة الغرفة.
   8. يعد كلوريد المغنيسيوم م 1: حل ز 4.8 من كلوريد المغنيسيوم في 50 مل الماء. تخزين في درجة حرارة الغرفة.
   9. إعداد 2% فورمالدهايد + 0.2 ٪ glutaraldehyde في برنامج تلفزيوني: حل 800 ميليلتر من جلوتارالديهيدي 25% و 12.5 ميليلتر من فورمالدهايد 16% في 100 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني. تخزين في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء.
   10. إعداد الحل المصبوغة جديدة استناداً إلى الجدول 2-
2. تلوين المرتبطة بالشيخوخة β-جالاكتوسيداسي
   1. لكل عينة، البذور 1 × 10⁴ خلايا في بئر واحدة على الأقل من جيدا 24 لوحة (5.2 × 10³ خلايا/سم²) تحتوي على 500 ميليلتر من D10 حيث تكون الخلايا المتفرقة. يمكن إجراء العلاج (أن وجد) مباشرة على هذه اللوحة، أو بدلاً من ذلك، يمكن أن تكون الخلايا تعامل فعلا إعادة المصنف في لوحة 24-جيدا.
   2. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع شركة 5%₂ و % 5 س₂.
   3. تغسل الخلايا مرتين مع 500 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني.
   4. إصلاح 3 – 5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة باستخدام من 2% فورمالدهايد + 0.2 ٪ glutaraldehyde 500 ميكروليتر/جيدا في برنامج تلفزيوني.
   5. تغسل الخلايا مرتين مع 500 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني.
   6. إعداد الطازجة تلطيخ الحل، وفقا لعدد العينات وصمة عار.
   7. إضافة حل المصبوغة (500 ميليلتر في البئر) وختم اللوحة مع بارافيلم لتجنب التبخر.
      ملاحظة: قد تسبب البلورات بشكل التبخر وتعوق الملاحظة تحت المجهر.
   8. احتضان خلايا في الظلام (مثلاً المشمولة في رقائق الألومنيوم) عند 37 درجة مئوية في حاضنة جافة (دون CO₂) ح 12 – 16.
      ملاحظة: قد يؤثر على درجة الحموضة CO₂ وذلك تعديل النتائج. قد تتطلب بعض أنواع الخلايا حضانة أقصر.
   9. تغسل مرتين مع 500 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني.
   10. تقييم النتائج. تعرض الخلايا إيجابية أزرق (في الغالب) بيرينوكلير تلطيخ تحت مجهر ضوء عادي (الشكل 1A).
   11. للتحديد الكمي، نلاحظ خلايا على الأقل 100 كل عينة وحساب عدد الخلايا إيجابية. منذ خلايا مسن تغيير الشكل، غالباً ما يصعب تحديد حدود الخلية وحساب الخلايا. كونتيرستاين مع DAPI تيسيرا للتصور والتقدير الكمي للخلايا المفردة (الشكل 1B). التحديد الكمي لهذه العينات (النسبة المئوية للخلايا إيجابية مقابل مبلغ إجمالي قدرة الخلايا) باستخدام مجهر فلوري (الشكل 1). أن صور متعددة من نفس العينة حتى نهاية يمكنك عد الخلايا واحد على الأقل 100 وتقييم النسبة المئوية للخلايا سا-β-غال الإيجابية في نفوسهم.
   12. مقارنة نتائج الخلايا مسن مقابل سيطرتها المناسبة للمعالجة المستخدمة.
       ملاحظة: تلطيخ يشترك مع إيدو على نفس العينة من الممكن. نعتبر أن الخلايا ثم يجب أن يكون المصنف في كوفيرسليبس.
3. إيدو إدماج التحليل
   1. وضع بئر ساترة في لوحة 24-جيدا وفقا لعدد العينات لتقييم.
   2. البذور 1 × 10⁴ خلايا في بئر واحدة على الأقل من صفيحة 24-جيدا (5.2 × 10³ خلايا/سم²) كل شرط يتضمن 500 ميليلتر من D10 حيث تكون الخلايا المتفرقة. يمكن إجراء العلاج (أن وجد) مباشرة على هذه اللوحة، أو بدلاً من ذلك، يمكن أن تكون الخلايا المعالجة مسبقاً إعادة المصنف في لوحة 24-جيدا.
   3. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع شركة 5%₂ و % 5 س₂.
   4. جعل حلاً 20 ميكرون من إيدو في D10 (1: 250) وفقا لعدد العينات لعلاج (250 ميكروليتر كل عينة).
   5. إزالة نصف المتوسط (250 ميكروليتر) من كل بئر لعلاج واستبدله مع D10 + إيدو الحل الذي أعد فقط. النهائي إيدو تركيز من 10 ميكرون.
   6. احتضان ح 18 – 24 في حاضنة ثقافة خلية عند 37 درجة مئوية مع 5% CO₂ و 5% O2. استخدم في نفس الوقت حضانة في خلايا مسن والتحكم.
   7. أغسل x 2 مع 500 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني.
   8. إصلاح الخلايا لمدة 10 دقائق مع 500 ميكروليتر من 4% فورمالدهايد في برنامج تلفزيوني.
   9. احتضان 5 دقيقة في 500 ميكروليتر من 100 ملم تريس (درجة الحموضة 7.6).
   10. بيرميبيليزي الخلايا لمدة 10 دقائق في 500 ميكروليتر 0.1% X-100 تريتون في برنامج تلفزيوني.
   11. أغسل x 3 مع برنامج تلفزيوني.
   12. إعداد 50 ميكروليتر من مزيج التسمية لكل ساترة، إضافة المكونات بالترتيب التالي: 44.45 ميليلتر من برنامج تلفزيوني، 0.5 ميليلتر من النحاس (II) هكذا₄ميليلتر 0.05 من سالفو-Cy3-أزيد، 5 ميليلتر من اسكوربات الصوديوم.
   13. وضع 50 ميكروليتر من مزيج التسمية على قطعة من بارافيلم. رفع ساترة مع المعونة من زوج من ملاقط وابرة والسماح لها بالراحة على رأس هذا المزيج التسمية، مع السطح الذي يحتوي على الخلايا التي تواجه أسفل. التأكد من أن هناك لا فقاعات وأنه لمس السطح كله ساترة ميكس التسمية. احتضان لمدة 30 دقيقة في الظلام.
   14. وضع الخلايا في الآبار التي بليت 24-جيدا وغسلها ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
   15. جبل مع تركيب وسائل الإعلام (بما في ذلك DAPI لتصور نوى) على الشرائح الزجاجية والسماح لهم الجافة بين عشية وضحاها.
   16. تصور إدماج إيدو استخدام مجهر فلوري. استخدام عامل تصفية مناسب Cy3 (الإثارة/الانبعاثات: 552/570 نانومتر).
   17. التقاط صور متعددة من الخلايا بعد التقدير الكمي للخلايا على الأقل 100 كل شرط (Cy3 و DAPI).
   18. تقدير النسبة المئوية للخلايا التي أدرجت إيدو باستخدام الصيغة التالية:
       الخلايا إيجابية إيدو (%) = (عدد الخلايا إيجابية إيدو (Cy3)/إجمالي عدد الخلايا (DAPI)) * 100
   19. مقارنة نتائج الخلايا مسن مقابل سيطرتها المناسبة للمعالجة المستخدمة.
       ملاحظة: تلطيخ يشترك مع سا-β-غال على نفس العينة من الممكن. نعتبر أن الخلايا لا يزال يجب أن يكون المصنف في كوفيرسليبس.
4. التعبير الجيني p16، p21، وساسب
   1. إعداد مجموعات التمهيدي "الجينات للفائدة" (التمهيدي كل 50 ميكرومتر).
      ملاحظة: qPCR p16، p21، وبعض العوامل ساسب ذات الصلة مفيدة لحالة الشيخوخة. البروتوكول الموصوفة هنا يجعل استخدام نظام المكتبة التحقيق العالمي (الأسعار) للتحديد الكمي النسبي باستخدام الوقت الحقيقي-PCR. ويبين الجدول 3 لمحة عامة عن أجهزة الإشعال المستخدمة للكشف عن CDK مثبطات p16 و p21 وأعضاء ساسب الأكثر صلة بالموضوع، فضلا عن Tubulin واكتين، والتي تكون بمثابة مرجع الجينات للفحص. وتنتقي العمود الأخير من الجدول 3 المسبار الأسعار خاصة لاستخدامها لكل فحص.
   2. إعداد مزيج رد فعل qPCR منفصلة لفحوصات المرجوة. وتشمل دائماً الجين المرجعية، وكذلك وفقا الجدول 4.
   3. تشغيل جميع العينات في تكرار أو ثلاث نسخ.
   4. تحميل 7.5 ميليلتر/جيدا من هذا المزيج رد فعل قبكر على لوحة 384-جيدا.
   5. إضافة ~ 5 نانوغرام كدنا حله في 2.5 ميليلتر من المياه خالية من رناسي.
      ملاحظة: من الأفضل أن تحتوي على كميات مماثلة من كدنا لجميع العينات بالمقارنة. ويمكن تحقيق ذلك باستخدام كميات متساوية من الحمض النووي الريبي للنسخ العكسي.
   6. تغطية اللوحة مع ختم وتأكد من أنه عصي تغطي جميع الآبار بالتساوي على اللوحة بشكل صحيح.
   7. تدور اللوحة في 2,000 س ز لمدة 1 دقيقة.
   8. تشغيل اللوحة في لايتسيكلير لدورات 40 استخدام بروتوكول التالية:
      95 درجة مئوية لمدة 7 دقائق
      دورات 40 من 95 درجة مئوية ل 5 s و 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية
      37 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة
   9. لتحليل النتائج، استخدم الأسلوب المقترح ليفاك والزملاء لتحليل البيانات قبكر²⁴. استخدام توبولين أو أكتين الجينات المرجعية لحساب ΔCt القيمة واستخدام عنصر التحكم المناسب لحساب القيمة ΔΔCt للعلاج الذي يحفز الشيخوخة محددة.
5. تعبير البروتين وإفراز IL6
   1. البذور 5 – 10 × 10⁴ خلايا في بئر واحدة على الأقل من لوحة 6-جيدا (5.2 – 10.5 × 10³ خلايا/سم²) كل شرط يتضمن 2 مل D10. يمكن إجراء العلاج (أن وجد) مباشرة على هذه اللوحة، أو بدلاً من ذلك، يمكن أن تكون الخلايا تعامل فعلا إعادة المصنف في لوحة 24-جيدا. فلنقف بين عشية وضحاها بعد البذر.
   2. إزالة المتوسطة واستبدال لمل 2 من دميم المتوسط دون FBS. احتضان في ظروف عادية ح 24.
   3. جمع المتوسطة في أنبوب 15 مل.
   4. يمكن تخزين أجهزة الطرد المركزي العينة في 300 x ز لأدنى 5 المتوسطة في-80 درجة مئوية حتى تتم معالجتها.
   5. اتبع إرشادات الشركة المصنعة لأداء ELISA.
   6. مقارنة نتائج الخلايا مسن مقابل عنصر التحكم المناسب لعلاج الشيخوخة المسببة محددة

تخصيب اليورانيوم لتلطيخ سا-β-غال في الخلايا الليفية مسن

باء-جالاكتوسيداسي (β-غال) هو الإنزيمات الليزوزومية التي تتجلى في كافة الخلايا ويحتوي على درجة حموضة أمثل 4.0^،من²⁵إلى²⁶. بيد أثناء الشيخوخة، ليسوسوميس زيادة في حجم، ونتيجة لذلك، تتراكم مسن الخلايا β-غال. المبالغ المتزايدة لهذا الإنزيم يجعل من الممكن الكشف عن نشاطها حتى في الرقم الهيدروجيني الأمثل 6.0^25،27. ويبين الشكل 1A الصور التمثيلية لتلطيخ سا-β-غال في تكاثر مقابل مسن الليفية الأولية. كما تبدو الخلايا الموسع ومع هيئة الخلية غير نظامية. كما ذكر، يمكن أن يكون الثابت لتمييز الخلايا الفردية، حيث أن تلطيخ يشترك مع DAPI يسهل التصور وخلية العد (الشكل 1B). من الضروري أن تأخذ الصور في مجهر الأسفار ليتمكن من مراقبة تلطيخ DAPI. وهذا يعني أن تؤخذ صور على قناة الحقل مشرقة في أبيض وأسود، حتى أن تلطيخ "الأزرق" من SA-β-غال ستظهر سوداء على الصور. من المذكرة، ليست كافة الخلايا داخل عينة إيجابية لبيتا-غال. كفاءة التعريفي الشيخوخة يعتمد اعتماداً كبيرا على التحفيز وخلية النوع/سلالة المستخدمة. أسفرت عن البروتوكولات المذكورة هنا > 50% β-غال الخلايا إيجابية في الخلايا الليفية الأولية (BJ وأي-38) في أيدينا.

دمج خلايا أقل إيدو بعد التعريفي للشيخوخة

إيدو هو تمثيلي من thymidine نوكليوزيد أنه، أثناء نشاط تركيب الدنا، ستدمج في الحمض النووي²⁸. يمكن تصور إدماج إيدو في الحمض النووي بعد أداء سيكلواديشن أزيد كوبيركاتاليزيد-ألكاين (كواك) إلى إيدو، رد الفعل الذي لا يمكن تنفيذه في thymidine العادية نظراً لأنها تفتقر إلى مجموعة ألكاين²⁸. في هذا البروتوكول معينة، يستخدم سالفو-Cy3-أزيد. إذا كان قد حدث اقتران أزيد إلى ألكاين، سيتم عرض الخلايا الأسفار ضمن عامل تصفية Cy3 (الشكل 2A). من المهم أن تأخذ في الاعتبار أن عن طريق إجراء تحليل إدماج إيدو، يمكن تمييز الخلايا التي تنتشر من الخلايا غير المنتشرة. يمكن أن تكون الخلايا غير المنتشرة معنى هادئة أو مسن، أما تحليل إدماج إيدو لا تميز بين هذين النوعين من دورة الخلية اعتقال.

مسن الليفية upregulate CDK مثبطات p16 و p21

الخلايا مسن جعل استخدام مثبطات كدكس لوقف دورة الخلية²⁹. غالباً ما يتم قياس خاصة p16 و p21 كعلامات لخلايا مسن³. عادة علامات واحد أو كلا أوبريجولاتيد في خلايا مسن، وكثيراً ما يقاس أوبريجوليشن على المستوى النسخي. تشجع الدولة الطرف على استخدام علامات على حد سواء في نفس الوقت نظراً للقيام ببعض الخلايا لا upregulate p16 على المستوى النسخي و p21 علامة عالمية ولكن غير محددة للشيخوخة^15،،من¹⁷³⁰. ويبين الشكل 3 الممثل كوانتيفيكيشنز النسبية ل p16 ومرناً p21 في الخلايا الليفية التي يسببها للشيخوخة. تقنيات أخرى مثل إيمونوستاينينج و/أو النشاف الغربية للكشف عن مستويات البروتين من الممكن أيضا.

عرض الليفية مسن ساسب

خلايا أكثر مسن ترانسكريبتيونالي أوبريجولاتي يفرز عدة الجينات ترميز للبروتينات، وهي ظاهرة تسمى ساسب⁶. ساسب يشمل العوامل الداخلة في التهاب، مثلاً، إينتيرليوكينس، والمستقطبات، أو في تدهور المصفوفة خارج الخلية (ECM)، مثلاً، يتولى، إنما متغايرة جداً. ويمكن تقييم التعريفي لعوامل ساسب بقياس مستويات التعبير مرناً عن طريق قبكر أو مستويات البروتين يفرز عبر Enzyme-Linked المناعية ماصة بالانزيم (ELISA). ويبين الشكل 4 صورة تمثيلية عرض upregulation IL6 كلا الصعيدين النسخي ويفرزها. كنا IL6 فقط كتمثيل؛ ومع ذلك، أنها تشجع على قياس أعضاء متعددة من ساسب من قائمة مقترحة على بروتوكول 3.4.

رقم 1: الإثراء لتلطيخ سا-β-غال في الخلايا الليفية الأولية مسن. تم فعل BJ القلفة الابتدائي الليفية (PD 34.1) للشيخوخة بتعريضها للإشعاع المؤين (10 غراي). كانت الملون الخلايا ل SA-βgal عشرة أيام بعد التشعيع. (أ) نتائج تمثيلية لتلطيخ SA-βgal في BJ الليفية الأولية دون علاج (لأعلى) أو تعرضوا للإشعاع المؤين (أسفل). التكبير النهائي: 100 X. الشكل (ب) ممثل من SA-β-غال شارك ملطخة ب DAPI ل BJ الليفية الأولية أما غير المعالجة (اليسار الأفرقة الثلاثة) أو المعرضين للإشعاع المؤين (ثلاثة أفرقة الحق). DAPI تلطيخ (الأزرق) يساعد على تصور خلايا فردية تيسير التحديد الكمي. تظهر الصور التي تم التقاطها في حقل مشرق في أبيض وأسود. ولذلك، في هذه الصور خاصة سا-β-غال تلطيخ سيبدو البقع السوداء بيرينوكلير. التكبير النهائي: 100 X. (ج) التحديد الكمي للخلايا إيجابية سا-β-غال في المتكاثرة (Prol، الأبيض)-BJ الليفية مقابل الإشعاعات المؤينة المشع-معاملة نظرائهم (السناتور، الأزرق). وأجرى القياس الكمي باستخدام ثلاثة replicates البيولوجية مع أشرطة الخطأ عرض الخطأ المعياري للوسط. دلالة إحصائية تحددها مزاوج-التائي الاختبار t على قيم دلتا-CT. (n = 3، ± ووزارة شؤون المرأة، * * * قيمة p = < 0.01). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 2: إدراج خلايا أقل إيدو بعد التعريفي للشيخوخة- (أ) الصورة الممثل للمقايسة إدماج إيدو في تكاثر أي 38 الليفية 43.86 PD (يسار) ونظرائهم الإشعاع المؤين (يمين). التكبير النهائي: 100 X. (ب) التحديد الكمي للخلايا إيجابية إيدو في تكاثر (Prol، الأبيض)-BJ الليفية (PD 38.7) مقابل نظيراتها المشع (السناتور، الأزرق). وأجرى القياس الكمي باستخدام ثلاثة replicates البيولوجية مع أشرطة الخطأ عرض الخطأ المعياري للوسط. دلالة إحصائية يحدده مزاوج-التائي الاختبار t على قيم دلتا-الأشعة المقطعية (n = 3، ± ووزارة شؤون المرأة، * * * قيمة p = < 0.01). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3: الليفية مسن upregulate CDK مثبطات p16 و p21. (أ) التحديد الكمي للتعبير مرناً p16 في تكاثر (Prol.، أبيض، PD 35.3) أو 5-عزة-تعامل الخلايا BJ (السناتور، الأزرق). (ب) التحديد الكمي للتعبير مرناً p21 في تكاثر (Prol.، أبيض، PD 35.3) أو BJ 5-عزة-تعامل الخلايا (السناتور، الأزرق). وأجرى القياس الكمي باستخدام ثلاثة replicates البيولوجية (يتطابق مع التقنية اثنين كل) مع أشرطة الخطأ عرض الخطأ المعياري للوسط. دلالة إحصائية يحدده مزاوج-التائي الاختبار t على قيم دلتا-الأشعة المقطعية (n = 3، ± ووزارة شؤون المرأة، * * * ف = قيمة < 0.01). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 4: عرض الليفية مسن "النمط الظاهري" (ساسب الافرازية). (أ) التحديد الكمي IL6 مرناً التعبير في الخلايا الليفية BJ تنتشر (Prol.، أبيض، PD 38.7) أو المستحث للشيخوخة بالإشعاعات المؤينة (السناتور، الأزرق). (ب) التحديد الكمي للتعبير بروتين IL6 في تكاثر PD 38.6 (Prol., الأبيض) أو المعالجة بالإشعاعات المؤينة WI38 الليفية (السناتور، الأزرق). وأجرى القياس الكمي باستخدام ثلاثة replicates البيولوجية مع أشرطة الخطأ عرض الخطأ المعياري للوسط. وفي حالة البيانات قبكر، كان كل تكرار البيولوجية نسختين التقنية. دلالة إحصائية يحدده مزاوج-التائي الاختبار t على قيم دلتا-الأشعة المقطعية (n = 3، ± ووزارة شؤون المرأة، * * * قيمةp = < 0.01). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الجدول 1: الأوراق المالية وتعمل الحلول "العلاجات المختلفة" المستخدمة للشيخوخة التي يسببها ابيجينيتيكالي.

الجدول 2: تكوين "الحل تلطيخ" المستخدمة للشيخوخة المرتبطة (SA)-β-غال تلطيخ.

الجدول 3: تسلسل التمهيدي والأسعار المقابلة التحقيق لكشف مرناً من "علامات الشيخوخة" في العينات البشرية المنشأ.

الجدول 4: تكوين رد فعل qPCR مزيج لنظام الأسعار.

البروتوكولات وأوضح هنا هي الأمثل للبشرية الليفية الأولية، لا سيما الخلايا BJ وأي-38. بروتوكولات للشيخوخة ريبليكاتيفي والإشعاع المؤين وميتوتريكسات، قد طبقت بنجاح إلى أنواع أخرى من الخلايا الليفية (HCA2 و IMR90)، وفي أنواع أخرى من الخلايا (الخلايا الصباغية هي المواليد والخلايا الكيراتينيه أو cardiomyocytes المستمدة من اللجنة التوجيهية) في المختبر. ومع ذلك، يمكن أن يكون الأمثل تكييفات لأنواع الخلايا الإضافية عن طريق ضبط بعض التفاصيل مثل عدد خلايا المصنف، والأساليب والمواد الكيميائية لمساعدة الخلايا لإرفاق/فصل ليدعم البلاستيك وجرعة العلاج لتجنب التسمم.

حتى استخدام الخلايا الليفية الأولية تطرح عددا من التحديات. تكون عادة أكثر صعوبة لفصل من نظرائهم من تكاثر الخلايا مسن، وغالباً ما يكونون أكثر حساسية تريبسينيزيشن أو أي نوع آخر من فصل الأسلوب، مما يعني أن صلاحية بعد فصل أقل قليلاً من واحد من تكاثر الخلايا. من الصعب اختيار عنصر التحكم المناسب لمختلف أساليب حفز الشيخوخة. على سبيل المثال، للعلاج القائم على المخدرات مثل ميتوتريكسات، نقترح علاج قصير مع السيارة: برنامج تلفزيوني عن 24 ساعة في حالة عينات مراقبة للخلايا المعالجة ميتوتريكسات متبوعاً بحصاد/التجهيز الفوري. وقد يقال أن الخلايا التي يسببها للشيخوخة يمر وقت ثقافة موسعة بعد تطبيق العلاج (ستة أيام إضافية للثقافة للخلايا المعالجة ميتوتريكسات)، وأن تكون الخلايا التحكم مثقف كمية متساوية من الوقت بعد إزالة برنامج تلفزيوني. بيد أن ثقافة طويلة تسمح الخلايا لتقسيم كذلك، لتصبح روافد الإفراط أو تتطلب المزيد باساجينج وزيادة "التقاء النادي" المفرط قد يسبب علامات الشيخوخة، مثل SA-β-غال أن تظهر على الرغم من المحافظة على خلايا بها تنتشر المحتملة³¹. أن PD زيادة الحصول عليها أقرب إلى حد النسخ المتماثل (وإلى الشيخوخة ريبليكاتيفي) وجعلها أقل مماثلة لنظرائهم في تعامل ميتوتريكسات. حالة مماثلة تنطبق على العلاجات الأخرى. وقد اقترحنا الضوابط التي نعتبرها أكثر ملاءمة لكل حالة على حدة.

معظم التقنيات المستخدمة لحمل الخلايا في الشيخوخة تبدو سهلة نسبيا ومباشرة إلى الأمام، ولكن هناك عوامل كثيرة يمكن أن تؤثر على نتائج هذه التجارب. على سبيل المثال، يتم تركيز الجلوكوز العادي للخلية التقليدية الثقافة الإعلامية للخلايا الليفية 4.5 g/l. ومع ذلك، لبعض أنواع الخلايا مثل الخلايا الجذعية، تمديد تركيزات أقل من الجلوكوز بهم التكاثري المحتملة³²، بينما الآخرين تركيزات أعلى قد يؤدي إلى الشيخوخة المبكرة³³. وعلاوة على ذلك، الخلايا مسن الأيضية العالية وإنفاق كميات كبيرة من الطاقة لإنتاج العوامل يفرز³⁴، تعمل الأخرى المرتبطة بالشيخوخة يمكن أن تتأثر بذبذبات في تركيزات الجلوكوز.

متغير آخر محتمل في مستنبت الخلية هو المصل. تكوين المصل عادة غير محدد ويختلف بحسب المصدر الحيواني والدفعة. وبخاصة، يمكن أن تؤثر كمية عوامل النمو والبروتينات برو-التهابات الشيخوخة³⁵. من المستحسن أن تستخدم نفس الدفعة من المصل للتجربة كلها لتجنب التقلبات غير الضرورية والتباس. حتى الآن، يمكن أن تقلل من بعض الشروط التقنية لا مفر منه مثل استخدام خالية من مصل الدم الوسيلة المستخدمة لبعض البروتوكولات القائمة على أليسا ساسب التعبير.

توتر الأوكسجين المهم لتحريض الشيخوخة كاملة. يمكن أن تمنع نقص جيروكونفيرسيون، حيث أن الخلايا لا تتكاثر ولكن لا تكون لا رجعة فيها اعتقلت³⁶. بيد أن المشكلة الأكثر شيوعاً في الإعداد التجريبي ليس نقص ولكن هايبروكسيا. وفي الواقع، الشروط القياسية الثقافة غالباً ما تستخدم الأوكسجين 20% ك "نورموكسيا"، لكن الظروف الفسيولوجية لمعظم أنواع الخلايا أقل. Blastocysts الماوس تقديم علامات الشيخوخة (SA-βgal والحمض النووي الضرر) عند مثقف في الأوكسجين 20%، على عكس ما في فيفو-تستمد النظراء أو نفس الخلايا المزروعة في الأكسجين 5%³⁷. وعلاوة على ذلك، مثقف الليفية الماوس في أكثر الظروف الفسيولوجية (3% الأوكسجين) وليس في العرض التقليدية منها (الأوكسجين 20%) من ساسب³⁸. هنا، يمكننا استخدام الأكسجين 5% لجميع الثقافات والتجارب ونحث الباحثين إعادة النظر في تركيزات الأكسجين المستخدمة لنوع خلية معينة من الفائدة.

وأخيراً، هو عامل آخر للنظر في تباين جوهري مسن الخلايا. من ناحية، عرض أنواع مختلفة من الخلية وحتى الخلية سلالات الاختلافات في تعمل المرتبطة بالشيخوخة. على سبيل المثال، بعض سلالات الخلايا الليفية لا upregulate p16 على المستوى النسخي عند الشيخوخة التعريفي^15،،من¹⁶¹⁷، كما هو كما هو موضح في الشكل 3 ألف، حيث على الرغم من رؤية upregulation من p16، وهذا لم يكن معتدا به إحصائيا. P16 هو يسيطر أيضا على المستوى متعدية الجنسيات وبوستترانسلاشونال، حتى يمكن قياس مستويات البروتين في بعض الحالات تزايد نشاط هذا المانع CDK إثبات. ومع ذلك، قد يكون أن بعض الخلايا تعتمد ببساطة على مثبطات CDK الأخرى مثل p21. نحن نوصي بقياس مستويات النسخي لكل منهما. التركيب الدقيق ساسب يعتمد أيضا على الخلية التي تنتج من³. وعلاوة على ذلك، أعرب بعض الخلايا مؤثرا مستويات عالية من بيتا-جالاكتوسيداسي، يعطي نتيجة إيجابية لتلطيخ سا-β-غال التي ليست بالضرورة مؤشرا على الشيخوخة³. في بعض الحالات، قد يكون التغلب على هذه المشكلة بتقليل وقت الحضانة مع الحل المصبوغة خلال بروتوكول المصبوغة سا-β-غال. كما ذكر، خلايا روافد المفرط قد أيضا وصمة عار مع سا-β-غال دونها يجري مسن³¹، لذلك نحن نحث الباحثين إلى خلايا الثقافة قليلة لأداء هذا تلطيخ. من ناحية أخرى، أن النمط الظاهري الشيخوخة نفسها ليست مستقرة³⁹. تكوين ساسب وظهور علامات أخرى للشيخوخة هي تعتمد على الوقت^17،40. هنا، وقد اقترحنا النقاط الزمنية بعد كل معاملة في الخلايا التي تعتبر مسن تماما والتي تستخدم بشكل روتيني في المختبر. الأهم من ذلك، قد يجعل قياس علامات عند نقطة وقت أقصر نتائج سلبية بسبب الشيخوخة ناقصة⁴⁰. وعلاوة على ذلك، حيث في معظم العلاجات لا تصبح نسبة مئوية من الخلايا مسن، استخدام نقطة وقت أطول قد يعطي وقتاً كافياً للخلايا غير مسن القليلة إلى توسيع وتتفوق الثقافة، والحد من التعبير عن علامات مسن. في وجهات النظر إلى التباين في الخلايا مسن والمحاذير متعددة من علامات مختلفة، نحن نشجع الباحثين على استخدام علامات الشيخوخة متعددة داخل نفس العينة.

N/A

ونشكر أعضاء المختبر Demaria لمناقشات مثمرة، وليت van ثيجمين لتقاسم البيانات وبروتوكول بشأن الشيخوخة المستحثة بالأشعة فوق البنفسجية.