Polysome LEISHMANIA, insan hücreleri ve fare Testis profil oluşturma

Polysome profil çıkarma tekniği genel amacı, protein sentezi sırasında translasyonel etkinlik bireysel mRNA'ların veya transcriptome mRNA'ların analizidir. Protein sentezi yönetmelik, çeviri harekete geçirmek ve baskı sağlık ve birden çok insan hastalıkları için önemli bir yöntemdir.

Uygun protein ifade doğru zamanda ve doğru miktarda normal hücre işlevi ve hızla değişen bir ortamda hayatta kalma temeli budur. Uzun süre, gen ifade çalışmalar araştırma transkripsiyon düzeyde hakim. Ancak, mRNA'ların kararlı durum düzeyleri de protein üretimi ile ilişkilendirmek değil ve mRNA'ların translatability büyük ölçüde koşullarına göre değişiklik gösterebilir. LEISHMANIA, parazit gibi bazı organizmalarda protein ifade çoğunlukla translasyonel düzeyinde düzenlenmiştir. Son çalışmalar bu protein çeviri bozukluk kanser, metabolik, nörodejeneratif ve diğer insan hastalıkları ile ilişkili olduğunu gösterdi. Polysome profil oluşturma protein çeviri düzenleme eğitim için güçlü bir yöntemdir. Bu çeviri bir genom geniş ölçekte incelemek veya bireysel mRNA'ların translasyonel durumunu ölçmek için sağlar. Bu teknik polizomlar, ribozom, onların alt birimleri ve ücretsiz mRNA'ların sırasında Santrifüjü bir sitoplazmik, sukroz degrade lysate ayrılması temelidir. Burada, üç farklı modellerde - kullanılan bir evrensel polysome profil oluşturma iletişim kuralı parazit LEISHMANIA büyük, kültürlü insan hücreleri ve hayvan dokuları mevcut. LEISHMANIA hücrelerin serbestçe süspansiyon büyümesine ve fare testis bir hayvan doku örneği temsil ederken kültürlü insan hücreleri yapisan monolayer içinde büyür. Böylece, bu kaynakların tümüne adapte bir tekniktir. Protokolü polysomal kesirler analizi için algılama düzeylerinin bireysel mRNA tarafından RT-qPCR, proteinler tarafından Western blot ve Elektroforez tarafından ribozomal RNA'ların analizini içerir. Yöntemi daha da derin RNA-seq tarafından transcriptome düzeyde bir ribozom mRNA'ların ilişkilendirmesiyle incelenmesi ve analiz ribozom ilişkili proteinlerin tarafından kesirler kütle spektroskopisi tarafından uzatılabilir. Yöntem diğer biyolojik modelleri kolaylıkla ayarlanabilir.

Hücrelerde gen ifadesinin düzenlenmesi transkripsiyon, posttranscriptional ve ardından mekanizmaları tarafından kontrol edilir. Derin RNA sıralama gelişmeler genom geniş ölçekli bir benzeri görülmemiş düzeyde kararlı durum mRNA düzeylerinin çalışma izin. Ancak son bulgular kararlı durum mRNA düzeyi her zaman protein üretim^1,2ile ilişkilendirmek değil ortaya. Bireysel bir transkript kaderi çok karmaşıktır ve iç/dış uyaranlara, stres, vbgibi birçok faktöre bağlıdır. Protein sentezi sırasında gen ifade Yönetmeliği ifade kontrol değişen koşullarına hızlı bir yanıt için gerekli bir başka bir katmanı sağlar. Polysome (ya da "polyribosome") profil oluşturma, ayrılık ve görselleştirme aktif ribozomlar, çeviri tür protein sentezi ile çalışmak için güçlü bir yöntemdir. Rağmen ilk deneysel uygulamaları 1960'larda³' te çıktı, polysome profil oluşturma şu anda en önemli teknikler protein çeviri çalışmaları⁴biridir. Tek mRNA'ların bir polysome oluşumu için önde gelen birden fazla ribozom tarafından tercüme edilebilir. Transkript ribozomlara sikloheksimit⁵ üzerinde durdu ve mRNA'ların polizomlar farklı numaralar içeren polysome ayırma sürecinde Sükroz degrade ultrasantrifüj^6,7 tarafından ayrılabilir ^{, 8 , 9}. polysomal kesirler RNA analiz sonra genom geniş ölçekte ve farklı fizyolojik şartlarda^4,7, sırasında değişiklik translasyonel bireysel mRNA'ların durumlarında ölçüm sağlar ¹⁰. yöntem da kullanılmıştır 5' UTR ve 3' UTR serilerinde mRNA translatability¹¹kontrolünü rollerini ortaya çıkarmak, miRNAs translasyonel baskı¹²rolünü incelemek, ribozom biyongenezi^{13 kusurları ortaya çıkarmak için} ve ribozom ilişkili proteinler ile insan hastalıkları^14,15rolünü anlamak. Son on yılda, büyüyen bir rol için çeviri sırasında gen ifade Yönetmeliği insan hastalıkları önemini gösteren ortaya çıkmıştır. Kanser, metabolik translasyonel denetiminde ve nörodejeneratif hastalıklar için kanıt ezici^15,16,17,18' dir. Örneğin, bozukluk eIF4E bağımlı translasyonel denetiminin katkıda otizm ile ilgili açıkları¹⁵ ve FMRP, ribozom mRNA'ların otizm¹⁴' e bağlı üzerinde durdurduklarını ilgilenmektedir. Böylece, polysomal profil oluşturma birden çok insan hastalıkları translasyonel yönetmelikte hataları incelemek için çok önemli bir araçtır.

Protein analizi farklı fizyolojik koşullar altında polysomal kesirler çeviri sırasında ribozomlar ile ilişkili faktörler fonksiyonunun olduğu inceliyor. Maya, memeli hücreleri, bitkiler ve tek hücreli^10,19,20,21de dahil olmak üzere birçok canlı türünün polysome profil çıkarma tekniği kullanılmıştır. Protozoon parazitler Trypanosoma ve LEISHMANIA gibi gen ekspresyonu sınırlı transkripsiyon kontrolü sergi. Onların genleri organizatörü düzenlenir transkripsiyon²²eksikliği polycistronic gen kümeler halinde düzenlenir. Bunun yerine, gelişimsel gen ekspresyonu ağırlıklı olarak protein çeviri ve mRNA istikrar trypanosomatid türler^23,24düzeyinde kontrol edilir. Bu nedenle, transkripsiyon yönetmelik yokluğunda translasyonel kontrol anlayışı bu organizmalar için özellikle önemlidir. Polysomal profil oluşturma posttranscriptional düzenleme LEISHMANIA^25,26,27,28gen ifadesinde, eğitim için güçlü bir araçtır.

Bireysel mRNA'ların düzeyleri gerçek tarafından algılanması son sürüyor kantitatif PCR (RT-qPCR) ve yeni nesil sıralama yanı sıra proteomik teknolojileri tarafından tam transcriptome zaman, çözünürlük ve polysomal yeni bir seviyeye profil oluşturma avantajlarını getiriyor. Bu yöntemlerin kullanımı daha da derin RNA sıralama hücreleri bir genom geniş ölçekte translasyonel durumunu izlemek için proteomik analizi ile birlikte bireysel polysomal kesirler analizi ile genişletilebilir. Bu çeviri farklı fizyolojik ve patolojik şartlar altında düzenleyen yeni moleküler oyuncular tanımlamasını sağlar. Burada, üç farklı modellerde kullanılan iletişim kuralı profil oluşturma bir evrensel polysome mevcut: parazit LEISHMANIA büyük, kültürlü insan hücreleri ve hayvan dokuları. Biz mevcut tavsiye farklı organizmalar, degrade koşullardan optimizasyonu, seçim RNase inhibitörleri ve RT-qPCR, Western blot ve RNA Elektroforez polysome kesirler bu çalışmada analiz etmek için uygulama üzerinden cep lysates hazırlanması.

Tüm hayvan tedaviler ve işleme dokuların çalışmada elde edilen Kurumsal hayvan bakım ve Texas Tech Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Ulusal Enstitüleri uygun olarak kullanım Komitesi tarafından onaylanmış protokolleri göre yapıldı Sağlık hayvan refahı kuralları, protokol numarası 96005. Lütfen omurgalı hayvanlar kurban ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi doku yönergelere göre hazırlayın. Böyle bir komite eksik, lütfen Ulusal Sağlık Enstitüleri hayvan refahı yönergelere bakın. Yetişkin (> 60 gün eski) C57BL/6 fareler kullanılmıştır. Tüm hayvanlar ve doku kurumsal hayvan bakım ve Texas Tech Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Ulusal Sağlık Enstitüleri hayvan refahı yönergelere uygun olarak kullanım Komitesi tarafından onaylanmış protokolleri göre elde edilmiştir. Ötenazi için tek bir fare küçük bir odaya yerleştirildi ve hava yavaş yavaş ile yaklaşık % 30 yerinden karbondioksit anestezi ve hayvan kırılmasını en aza indirmek için. Nefes kesilmesi ölüm hayvan dokuları hasat önce onaylamak için servikal çıkığı kullandık.

Dikkat: Tüm iş ile canlı LEISHMANIA ve kültürlü insan hücreleri Biyogüvenlik BSL-2 sertifikalı dolap yapıldı.

1. hazırlanması sitoplazmik Lysates LEISHMANIA büyük , kültürlü insan hücreleri ve fare dokular

Not: Farklı kaynak malzemelerden lysate müstahzarları çeşitli farklar vardır. Sükroz degrade hazırlık ve polysomal ayırma da dahil olmak üzere diğer adımlar aynıdır ve örnek kaynağında bağlı değildir.

1. LEISHMANIA büyük sitoplazmik lysate hazırlık
   1. LEISHMANIA büyük (FV1 zorlanma) hücrelerin % 10 Fetal sığır Serum (FBS) ve penisilin/streptomisin karışımı içeren 1 x M199 orta²⁹ 30 ml aşılamak (100 adet ve 100 μg/mL buna bağlı olarak), 1 x 10⁵ hücre/mL yoğunluğu .
      Not: LEISHMANIA büyük hücreleri içeren tüm adımları bir biyogüvenlik kabini yürütülmelidir.
   2. Hücreleri da kuluçka makinesine koyun ve onları büyümek 27 ° C'de logaritmik faz kadar (5 x 10⁶ hücre/mL günlük karşılık gelir). Genellikle büyümeye yaklaşık iki gün sürer.
   3. Sikloheksimit LEISHMANIA büyük kültür 100 μg/mL çevrilmiş mRNA'ların üzerinde ribozom tutuklamak için son bir konsantrasyon için ekleyin. Kuluçka makinesi 27 ° C'de 10 dakika geri hücreleri yerleştirmek
   4. Sikloheksimit tedavi tamamlandıktan sonra hücre 50 mL konik tüp aktarmak ve onları 1800 x g ve 8 dk. atma süpernatant için 4 ° C, spin.
   5. Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz (DPBS) 30 mL hücrelerle yıkayın. 8 dk santrifüj 1800 x g ve 4 ° C.
   6. Süpernatant atmak. 1 mL DPBS hücrelerde resuspend.
   7. Bir aliquot hücre alıp % 3,5 formaldehit çözüm ile karıştırın.
   8. Hemasitometre tarafından hücreleri saymak ve onların konsantrasyonu belirlemek. Hücreler için istediğiniz sayıyı microfuge tüp içine aktarın. Lysate 0.5x10⁸-2 x 10⁸ hücre/mL hazırlanmış bir Sükroz degrade yükleme için yeterli olur.
   9. Hücreleri 1800 x g de spin ve 4 ° C 8 dakika süreyle süpernatant atın.
   10. Hücre Pelet lizis arabellek proteaz inhibitörleri ve RNase inhibitörü (20 mM HEPES-KOH, pH 7.4, 100 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 2 mM DTT, %1 NP-40, 1 x proteaz inhibitörü kokteyl (EDTA içermeyen), 200 adet/mL RNase inhibitörü) içeren 1 ml buzda resuspend.
   11. Lysate 23'lik iğne ile üç kez geçmek. Lysate iğne geçitten sonra şeffaf hale gelmelidir.
   12. Santrifüj 11,200 x g ve 4 ° C lysate açıklamak için 10 dakika için. Açıklanan transfer lysate için yeni bir tüp ve sukroz degrade ultrasantrifüj kadar buz üzerinde tutun.
   13. Toplamak, lysate (daha sonra analiz etmek için) giriş olarak 400-500 μL hemen gelecekteki protein analizi için sıvı azot Dondur veya RNA analizi için buz gibi önce RNA arıtma reaktif ekleyin.
2. Kültürlü insan HeLa hücreleri sitoplazmik lysate hazırlık
   1. HeLa hücreleri bölme ve onları 20 mL % 10 FBS ve penisilin/streptomisin karışımı içeren DMEM orta tohum (100 adet ve 100 μg/mL buna bağlı olarak) hücre ile 2 x 10⁵ hücre/mL bir 15 cm tabak içinde saymak.
   2. 37 ° c, % 5 CO₂ 20-24 h. gerçekleştir plazmid DNA transfection göre üreticinin iletişim kuralları için HeLa hücreleri büyümek.
   3. Transfection 37 ° c, % 5 CO₂sonra hücreler 24 h için yaymak.
   4. Sikloheksimit 100 μg/mL çevrilmiş mRNA'ların üzerinde ribozom tutuklayın ve hücreler için 10 dk. 37 ° c, % 5 CO₂kuluçkaya son konsantrasyonu için yetiştirilen HeLa hücreleri ekleyin. Orta Aspire edin. Buz soğuk DPBS iki kez hücrelerle yıkayın.
   5. Lizis arabelleği (20 mM HEPES-KOH pH 7.4, 100 mM KCl, 5 mM MgCl₂, 1 mM DTT, %0,5 NP-40, 1 x proteaz inhibitörü kokteyl (EDTA-free), 200 adet/mL RNase inhibitörü veya 1 mg/mL heparin) 500 μL plakasına eklemek ve hücreleri üzerinde buz kazımak.
   6. Lysed hücre microfuge tüp aktarın. NP-40 konsantrasyonu % 0,5 ve MgCl₂ ' ye göre örnek artan hacmi 5 mM için ayarlayın.
   7. Lysate 23'lik iğne ile 3 - 6 kez geçmek.
   8. 11,200 x g de ve 4 ° C lysate netleştirmek 8 min için spin. Santrifüjü sonra yeni bir tüp süpernatant aktarın. Bir Spektrofotometre hücre lizis etkinliğini değerlendirmek ve yükleme için örnek miktarına geçişin belirlemek için kullanın. 10 μL örnek %0,1 0.5 mL için eklemek Sodyum Lauryl Sülfat (SDS). % 0.1 SDS karşı boş. Ölçmek Absorbans 260 nm. Beklenen Absorbans değerdir etrafında 15-20 adet/mL.
   9. Tüm örnekleri ile lizis arabelleğe Sükroz degrade Santrifüjü önce aynı Absorbans değeri oranında seyreltin. Buz üzerinde örnekleri Sükroz degrade Santrifüjü kadar tutun.
3. Fare testislerden sitoplazmik lysate hazırlık
   1. Fare testis incelemek. Küçük bir insizyon attım tunica albuginea yapmak ve testis seminifer tübüllerin toplamak ve 5 mL 0,1 mM phenylmethylsulfonyl florür (PMSF) ile birlikte DPBS de içeren bir 15 mL konik tüp aktarmak.
   2. Doku birkaç kez ters çevirme tarafından kuvvetle karıştırın. Doku birim ağırlık buz üzerinde 5 min için yerleşmek izin verir.
   3. Kaldırmak ve bağ hücre ve doku parçaları içeren bulutlu arabellek atın. Yordam 2-3 kez daha tekrarlayın. Kalan beyaz Pelet seminifer tübüllerin ve germ hücreleri için zenginleştirilmiştir.
   4. Seminifer tübül Pelet 2 mL microcentrifuge tüp aktarmak ve 500 x g 1 dk. spin süpernatant atın.
   5. Lizis arabelleği (20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 100 mM KCl, 5 mM MgCl₂, 1 mM DTT, %0,5 NP-40, 1 x proteaz inhibitörü kokteyl (EDTA içermeyen), 1 mg/mL heparin veya RNase inhibitörü 200 adet/mL) 500 µL tübüllerin için ekleyin. Doku triturate için bir pipet kullanın.
   6. Süspansiyon küçük ve aktarım (0.5-1.0 mL) Dounce homogenizer. Yedi ya da sekiz darbeleri cam havaneli ile doku bozabilir.
   7. Lysate 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarın.
   8. Örneği 12.000 x g ve lysate temizlemek 8 dk 4 ° C'santrifüj kapasitesi. Süpernatant yeni tüp ve mağaza buza Sükroz degrade yükleme kadar aktarın.
   9. Lysate giriş örnek olarak, 50 μL toplamak, bu hemen gelecek protein analizi için-80 ° C'de dondurmak; veya RNA analizi için buz gibi önce RNA arıtma reaktif ekleyin.

2. Sükroz degrade hazırlık ve ultrasantrifüj

1. % 10 Sükroz veya % 50 Sükroz içeren iki Sükroz degrade Çözümleri (20 mM HEPES-KOH, pH 7.4, 100 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 1 x proteaz inhibitörü kokteyl), hazır olun. (Tris-HCl, pH 7.4, HEPES yerine kullanılabilir). 200 adet/mL RNase inhibitörü veya 1 mg/mL heparin deneysel tasarım göre ekleyin. Bir ultracentrifuge tüp SW 41 rotor için işaretleyici bloğu içine yerleştirin ve blok üst düzey çizgi çizin. Tüp istikrarlı bir raf aktarın.
2. Bir 10 mL şırınga bağlı katman aygıtı ile almak ve % 10 Sükroz çözüm (yukarıdaki gibi hazırlanmış) ile şırıngaya doldur. Yavaşça işareti tüp ulaşana kadar ultracentrifuge tüp alt kısmında bõrakõn.
3. % 50 Sükroz çözüm ile başka bir şırıngaya doldur ve dikkatle tüpün dibine % 10 Sükroz katmanı yoluyla onun katmanlama aygıtını takın. Yavaşça işareti tüp ulaşana kadar Alttan başlayarak Sükroz çözüm serbest bırakın. Sağlanan kapaklı tüp kapatın.
4. Sükroz degrade hazırlamak için degrade makinesi aygıtı ONaçın. Yukarı veya aşağı düğmelerini kullanarak plaka seviye ve DONEtuşuna basın. Tesviye geçişin doğrusallık için önemlidir.
5. Plaka tesviye sonra GRAD degrade menüsünü açmak için tuşuna basın. Degrade menüsünden liste gidin ve SW 41 Ti rotor seçin. Sonra istenen Sükroz degrade yukarı ve aşağı düğmelerini kullanarak menü listesinden seçin. Basın kullanın.
6. Degrade boru tutucu degrade makinesi tabağa yerleştirin. Tüp tutucu aktarın. Aynı anda en fazla 6 degradeler hazırlanabilir. Basın çalıştırmak. Degrade makinesi programlanmış hızlı ve doğrusal gradyan oluşturan açıları tüpler döner. Degrade hazırlamak için sadece birkaç dakika sürer.
7. İşlem tamamlandığında, tüpler bir rafa yerleştirin. Kapaklar çıkar. Aynı birim numune hacmi olarak ultracentrifuge tüpler tepesinden kaldırın.
8. Dikkatle lysate 15-20 A₂₆₀ adet polizomlar üst içeren 400-500 μL yükleyin. Tüpler rotor kovaları getirin ve onları dengesi.
9. Santrifüj 260.000 x g ve 4 ° C 2 h SW 41 rotor kullanarak için.

3. polysome ayırma ve örnek koleksiyonu

Not: lysate hazırlıklar kaynağına bağlı olarak bazı farklar varken, degrade hazırlık ve polysome ayırma iletişim kuralları her türlü lysates aynıdır.

1. Ultrasantrifüj tamamlanmasından sonra rotor kova tüpler ile Buza koyun. Kesir toplayıcı ve degrade fractionator ONaçmak. İnceden inceye gözden geçirmek fractionator menüsünde'i tıklatın. Bir raf 24 koleksiyonu tüpler kesir toplayıcı koymak.
2. Yan tarafında fractionator deiyonize su ile durulama su deposu doldurmak. 10 için DURULAMA tuşuna basın s fractionator üzerinde pompa durulayın. Pistonu kalibrasyon için su ile dolu şırınga ile durulama adaptörü takın.
3. Fractionator yazılım bilgisayar açın. Basın kalibre. Varsayılan ayarları kullanın ve OKtuşuna basın. Şırıngadan suyu enjekte etmeye hazır ol.
4. Kalibrasyon yapmak için Tamam tuşuna basın. Hemen sonraki 5 için su enjekte başlatmak s. Bu süre içinde su UV dedektörü akışı cep akacaktır ve enstrüman kalibre. İşareti Sıfır Kalibrasyon tamamlandı görünür. Araç ayırma için hazırdır.
5. Durulama adaptör şırınga ile kaldırın. Bir ipucu fractionator piston için ekleyin.
6. Pirinç hava Vana ve basın hava anahtarı 10 için aç s kuru boru ve akış hücre. Hava vanayı kapat.
7. Yavaşça rotor kova degrade tüpü çıkarması ve rafa yerleştirin. Boru tutucu kap tüp uygulamak ve dikkatle tüp tüp yuvasına taşımak ve konumda kilit.
8. Yer tutucu fractionator piston altında. Çoğu zaman, polysomal bantları gözle görülebilir. Kesir sayıları ve birim için istenen ayarları tanıtmak (500 μL/kısmını 24 kesirler genellikle yeterlidir). Dosyayı uygun şekilde adlandırın. Tamam, sonra Gitmek için grafik düğmesini tuşuna basın. Bir sonraki pencerede Başlat taramatuşuna basın. Ayarları görünür, Tamam'ıtıklatın. Toplayıcı ilk kesir için cilt payı hareket edecek ve piston tüpün içine taşınır. Piston üst geçişin ulaştığında seçili hızını yavaşlatır ve kesirler toplanacaktır. Rapor tamamlandığında, piston degrade tüp dışına taşır.
9. Pirinç hava Vana ve basın hava anahtar son kesir almak için fractionator üzerinde açın.
10. Tüpler raf buz üzerinde hareket ettirin.
11. 2 cilt RNA arıtma reaktif her kesir ve flash için sıvı azot RNA arıtma kadar dondurmak ekleyin. Alternatif olarak, protein çözümlenmesi gerekiyorsa, onları Western Blot (bkz. Bölüm 8) konsantre için % 10 son konsantrasyon trichloroacetic asit ekleyin.

4. mRNA'ların seviyeleri sırasında RT-qPCR veri analizi normalleştirme için sentetik RNA In Vitro hazırlanması

Not: E. coli OmpA mRNA normalleştirme için bu protokol için kullanılır. MRNA'ların okudu organizmanın ile kapsamlı kimlik yok diğer RNA (memeli veya LEISHMANIA) kullanılabilir.

1. Standart bir PCR reaksiyon gelen OmpA gene³⁰içeren bir plazmid tarafından SP6 organizatörü içeren OmpA DNA parçası hazırlamak.
2. 100 µL karışımı hazırlayın: 80 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 16 mM MgCl₂, 2 mM Spermidine, 10 mM DTT, 3 mM ATP, 3 mM CTP, 3 mM UTP, 3 mM GTP, 0.5 U/μL RNase inhibitörü, 1 μg OmpA PCR DNA, 3 μL SP6 RNA polimeraz , 0.005 U/μL pyrophosphatase.
3. 2 h için 40 ° C'de kuluçkaya.
4. RNA, RNA arıtma paketi tarafından arındırmak.
5. Konsantrasyon Spektrofotometre tarafından ölçmek ve özel Jel Elektroforez tarafından inceleyin.

5. RNA izolasyonu degrade kesirler ve cDNA hazırlık

Not: bir RNase inhibitörü ribonükleaz inhibitör kullandıysanız doğrudan bu iletişim kuralı için RNA arıtma ile devam edin. Ancak, ribonükleaz inhibitör kullanıldığında, heparin transkriptaz cDNA hazırlanmasında kullanılan yapılmasını engeller. Bu nedenle, heparin lizis tampon ve degrade kullanıldıysa RNA'ın ek arıtma gerekli olacaktır. Bkz. Bölüm 6 heparin kullandıysanız RNA cDNA sentezi için hazırlamak için.

1. RNA arıtma reaktif içeren örnekleri çözülme, 20 eklemek ng RT-qPCR sonuçları normalleştirme için iç kontrol olarak sentetik RNA'ın. Bir değişiklik dışında üreticinin protokolüne göre RNA hazırlık ile devam edin. RNA sınıf glikojen (20 µg) önceki isopropanol bulutlu 1 µL ekleyin. 20-25 µL RNase free su RNA granül geçiyoruz.
   Not: Glikojen bir taşıyıcı olarak hizmet vermektedir ve kayıpları önlemek ve arıtma sırasında RNA Pelet görselleştirmek için yardımcı olur. OmpA mRNA daha fazla normalleştirme RT-qPCR reaksiyonlarda kullanılır.
2. RNA konsantrasyonu yeterli verim sağlamak için Spektrofotometre kullanarak ölçmek. 40'lı, 60'ların ve monosomes prepolysomes olarak içeren RNA kesirler eşit miktarda birleştirin. 2-4 ribozomlara içeren kesirleri ışık polizomlar birleştirmek ve 5-8 ribozomlar olan kesirleri ağır polizomlar birleştirir.
3. 5-10 µL RNA kombine kesirler üzerinden bir seti kullanarak ve üreticinin önerilerini takip cDNAs hazırlamak için kullanın.
4. Nükleaz boş su 80 µL cDNA 20 µL için ekleyin. CDNA örnekleri-20 ° C'de dondurmak

6. RNA arıtma Heparin kontaminasyonu üzerinden

Not: Heparin nükleik asit enzimler transkriptaz gibi işleme engeller. Heparin lizis arabellek ve/veya Degrade kullanıldığında bu nedenle, bu ek arıtma iletişim kuralını kullanın.

1. LiCl 1 M son konsantrasyonu arıtılmış RNA örnekleri için ekleyin.
2. Örnekleri mix ve 1 h için buz üzerinde kuluçkaya.
3. 16.000 x g ve 4 ° C'de 15 dakika örnekleri spin.
4. Süpernatant mümkün olduğu bir pipet kullanarak tamamlanmış olarak kaldırın.
5. Yaklaşık 5 dakika için granül kuruması.
6. Granül RNase free su ilk hacmi yeniden askıya alma.
7. 260 spektrofotometrik ölçüm gerçekleştirmek nm RNA konsantrasyonu belirlemek için. Genellikle, örnek kaybı en az düzeydedir.

7. RT-qPCR ve mRNA dağıtım veri analizi

1. Birleştirmek su, 20 μL SYBR yeşil, gen belirli astar (2,5 μM kümesi) 4,8 μL 10.2 μL, cDNA 5 μL, iyice karıştırın ve triplicates bir kuyu başına 10 μL 384-şey plaka yüklemek.
2. Levha yapıştırıcı film ile sıkı bir şekilde kapak ve 1800 x g 5 min için plaka santrifüj kapasitesi.
3. Bir gerçek zamanlı PCR enstrüman kullanarak qPCR reaksiyon Tablo 1' de gösterilen şartlar altında ayarlayın.
4. Döngüsü eşik (C_T) kullanarak değerleri ve karşılaştırmalı C_T (ΔΔC_T) yöntemi³¹ yüzdesi (%) olarak açıklanan³² bir değişiklik ile prepolysomes, hafif ve ağır polizomlar mRNA dağılımının hesaplama. Sentetik RNA (burada OmpA) veri normalleştirme RT-qPCR veri analizi için kullanın. Sentetik RNA göreli mRNA'ların düzeylerini hesaplama ve karşılaştırmak onları bir degrade farklı kesirler görüntüleyen bir normalleştirme denetimi sağlar.

8. analiz Western Blot tarafından Polysomal kesirler proteinlerin

1. %100 (w/v) stoktan seçilen kesirler (500 μL) son konsantrasyonu % 10, trichloroacetic asit (TCA) eklemek almak için en az 15 dk, bir microfuge santrifüje 5 min için buz üstünde, süpernatant atmak, iki kez buz gibi soğuk aseton ile yıkayın ve S 25 μL içinde erimesi DS-sayfa örnek yükleme arabellek Elektroforez için.
2. SDS-sayfa yükleme ve PVDF membran için aşağıdaki transferi ile standart Elektroforez kuralları. Western Blot³³için devam edin.

Bu çalışmada, biz üç farklı kaynaklardan polysomal profil çıkarma tekniği uygulamaya tarif: parazit LEISHMANIA büyük, kültürlü insan hücreleri ve fare testis. Süspansiyon içinde sıvı ortamda serbestçe LEISHMANIA hücrelerin büyümesine, kültürlü insan hücreleri yapisan monolayer Tabaklarda büyümek ve fare testis doku örneği temsil eder. Yöntem, süspansiyon, farklı dokuların veya başka bir organizmadan ve kültürlü hücrelerinin farklı türleri serbestçe yetişkin hücrelerinde diğer türleri için kolaylıkla ayarlanabilir. Yaklaşım dört büyük adımlardan oluşur: lysate hazırlık, sukroz degrade hazırlama ve ultrasantrifüj adım, polysome ayırma ve örnek koleksiyon takip kesirler analizi tarafından. Hücreleri farklı kaynaklardan toplanan, yıkanmış ve lizis arabellekte geçit tarafından bir iğne veya Dounce homogenizer üzerinden lysed. Santrifüjü hücre artıkları, lysate açıklığa kavuşturulması kaldırmak için kullanılır. Degrade ayırma şeması şekil 1Aile gösterilir. Sürekli Sükroz degradeyi degrade makinesi % 10 ve % 50 Sükroz çözümlerinde karıştırma tarafından oluşturulur. Lysate üst kısmında degrade yüklenir. Ultrasantrifüj mRNA'ların bir UV dedektörü tarafından ayırma sırasında izlenir ribozomlara farklı bir dizi ile ilgili farklı Absorbans spektrum şekillendirme ayırır. Toplanan kesirler RNA ve protein analizi (şekil 1B) için kullanılır. RNA tarafından Kuzey leke takip veya bireysel mRNA'ların ilişkilendirmesini polizomlar çözümlemek için bir RT-qPCR tepki tarafından takip cDNA üretimi için kullanılan Elektroforez tarafından çözümlenebilir. Yeni nesil sıralama genom geniş ölçekli⁷mRNA'ların translasyonel durumunu analiz etmek için kullanılabilir. Polysomal kesirler protein analizi için onlara konsantre trichloroacetic asitle proteinler çöktürülmüş. Proteinler sonra Western Blot veya kütle spektroskopisi Proteom düzeyde analiz edilir.

Tipik bir polysomal profili aktif büyüyen kültür LEISHMANIA büyük oluşturulan şekil 2Agösterilir. Ayırma Absorbans grafiği ribozom alt birimleri (40'lı ve 60S), tek ribozomlara (80S veya monosomes) ve polizomlar için tipik zirveleri ile farklı bir şekli vardır.

Kantitatif RT-PCR (RT-qPCR) bireysel LEISHMANIA mRNA Derneği ribozom ve polizomlar algılamak için istihdam edildi. Karşılaştırmalı C_T (ΔΔC_T)³¹ yöntemi göreli mRNA'ların düzeyleri hücrelerde çalışmak için basit ve uygun bir yaklaşımdır. Bu yöntem bir iç Denetim (sırasında tedaviler veya deney şartları ifade değişmez istikrarlı mRNA) için hesaplamaları gerektirir. Ancak, iç kontrol polysomal kesirler düzeyleri herhangi bir mRNA veya ribozomal RNA kesirler, onların dernek ile ribozomlar, polizomlar, vbbağlı olarak değişir çünkü yoktur. Bir iç kontrol sorunu çözmek için biz sentetik bakteriyel OmpA mRNA normalleştirme göreli bireysel LEISHMANIA mRNA düzeylerinin kesirler için kullandık. OmpA mRNA Sentezlenmiş vitro yapıldı ve eşit miktarlarda her kesir RNA çekimi önce eklenir. RT-qPCR veri hesaplamaları, daha doğrusu, hesaplamalar için iç kontrol olarak karşılaştırmalı C_T (ΔΔC_T) yöntemi ile hizmet veren yapar çünkü sentetik RNA eklenmesi önemlidir.

Degrade kesirler aliquots üç gruba karışık: prepolysomes (alt birimleri ve monosomes), ışık (2-4 ribozomlar oluşan) polizomlar ve ağır polizomlar (5-8 ribozomlar oluşan). RT-qPCR RNA üzerinde kombine bu kesirler (şekil 2B) arasında mRNA dağıtım analiz etmek için kombine kesirler üzerinden gerçekleştirildi. 18s ribozomal RNA bir denetim olarak kullanıldı. RT-qPCR tarafından belirlenen onun göreceli düzeyleri de küçük ribozomal alt birimleri tahmini dağılımıyla ilişkili (ücretsiz alt birimi ve monosomes ve polizomlar bir parçası olarak) spektrum üzerinde. RT-qPCR analiz test bireysel mRNA'ların çeviri LEISHMANIA büyüme logaritmik faz sırasında nişan farklı bir ölçüde olduğunu açıkladın. Tübülin mRNA verimli çeviri düşündüren tercihen ağır polizomlar ile ilişkilidir. Buna ek olarak, Sherp mRNA prepolysomes ve hafif polizomlar tübülin ile karşılaştırıldığında daha az aktif çeviri destek ile öncelikle bulunur mRNA.

İfade kültürlü hücrelerdeki rekombinant proteinlerin önemli deneysel çalışmaların çeşitli kategorilerde yaklaşımıdır. Burada, başka bir örnek kaynak, kültürlü insan hücreleri rekombinant protein mRNA'ların polysomal profil oluşturma konusunda bir örnek mevcut. HeLa hücreleri geçici rekombinant Kistik fibrozis transmembran gürültülerinden regülatörü (CFTR)³⁴ ya da Norrie hastalık protein (NDP) ifade Plasmid'ler ile transfected. Bu iki bağımsız kültürlerden polysome ayırma Absorbans spectra çok benzer ve içerilen farklı zirveleri ribozomal alt birimleri (40'lı ve 60S), monosomes (80) ve polizomlar (şekil 3A) karşılık gelen edildi. Bu deneyler üzerinden spectra benzerlik degrade ayırma tekrarlanabilirlik göstermektedir. Gibi LEISHMANIA çalışmalarda, RT-qPCR tarafından prepolysomes, hafif polizomlar ve ağır polizomlar (şekil 3B) gösteren kesirler mRNA'ların dağılımı tespit edilmiştir. Algılama küçük ribozomal altbirimde 18S RNA'ın tahmini dağıtımlarında spectra ile ilişkili. CFTR mRNA'ların çoğunlukla savunma pozisyonu daha verimli bir şekilde tercüme düşündüren prepolysome kesirler içinde bulunan .NET Framework mRNA'ların çoğunlukla hafif ve ağır polysomal kesirler ile ilişkili bulunmuştur. .NET Framework nispeten küçük bir proteindir, CFTR bağımsız olarak çeviri³⁵sırasında kat birkaç etki alanlarından oluşan çok büyük bir protein (1480 amino asit kalıntıları) iken. CFTR mRNA polizomlar ile alt nişan cotranslational onun farklı etki alanlarındaki katlama için gereklidir daha yavaş çeviri yansıtabilir.

Polysome kesirler proteinler tespiti için de kullanılabilir. Algılama degrade kesirler proteinlerin ribozomal proteinler HeLa hücreleri (şekil 4) arasında örnek üzerinde yapılmıştır. Proteinler tarafından yağış TCA kesirler ve Western blot küçük alt birimi ribozomal protein RPS6 ve büyük alt birimi ribozomal protein RPL11 algılamak için kullanılan % 10 ile konsantre (şekil 4, üst panel). Onların dağıtım Absorbans spektrum üzerinde farklı zirveleri ile de ilişkili. Bu deneyler açıkça polysome kesirler proteinleri verdik onları analiz etmek için kullanılabileceğini gösteriyor.

Birçok farklı Sükroz konsantrasyonlarının gradyanlar (örneğin, 7-%47³⁶, 5-%50⁷, 7-%50⁶ , 10-%50³⁷, 15-%50⁸ve diğerleri) polizomlar ayırma için kullanılmıştır. Burada, biz iki degradeler 10-%50 ve % 17-51 (şekil 5) göre. Her ne kadar kabul edilebilir sonuçlar % 17-51 üretilen, % 10-50 degradedeki ayrılık daha iyi genel oldu.

Şelat ajanlar, EDTA gibi ribozom ve polizomlar^8,9bozabilir iyi belgelenmiştir. Şekil 6' da, önce degradenin üzerinde yükleme doruklarına monosomes ve polizomlar, karşılık gelen kaybolması yol açar ve ribozom alt birimleri önemli artış doruklarına lysate HeLa tedavisinde EDTA gösterildiği gibi. Bu deney bir denetim olarak görev yaptı ve EDTA tedavi olmadan gözlenen doruklarına aslında ribozomal monosomes ve polizomlar olduğunu gösterdi.

Şekil 7 fare testis üzerinden polysome ayırma sonuçlarını gösterir. Bu LEISHMANIA ve HeLa hücreleri ile benzerlikler Absorbans spektrum vardır: farklı ribozomal alt birimleri, monosomes ve polizomlar doruklarına. Onların şekil ve dağıtım üzerinde farklı polysomal spectra belirlemeye kolaylaştıran bir imza görünümünü üretmek. Toplam RNA'ların kesirler saflaştırılmış ve RNA'ların seçili kesirler üzerinden Elektroforez özel jel (Şekil 7, üst panel) tarafından analiz edildi. Elektroforez 18S ve 28S ribozomal RNA'ların tipik dağılımını gösterir. Onların keskin bantları intactness örnekleri gösterir. Jel bireysel mRNA tespiti için aşağıdaki Kuzey leke tarafından kullanılıyor olabilir veya daha önce RNA veya protein analizi - grup RNA bozulması örneklerde belirtmek dağınık ribozomal RNA'ların üzerinde daha fazla deney örnekleri niteliğini değerlendirmek için kullanılabilir.

Çalışmalarımız sırasında biz RNase inhibitörü ve Heparin RNase inhibitörleri lysates ve sukroz gradyanlar içinde olarak kullanılır. İkisi de tatmin edici sonuçlar sağlanan cDNA ve RT-qPCR reaksiyonlar inhibe etmez çünkü RNase inhibitörü kullanımı RNA analizi için tercih edilir oldu. Bu nedenle, bu ek RNA arıtma adımlar gerek yoktu. Araştırmacılar polysome hazırlık sırasında heparin kullanmaya karar verirseniz, ancak, heparin RT-qPCR gibi aşağı akış uygulamaları engeller ve ek RNA arıtma adım (bkz: Protokolü Bölüm 6) gerekli unutmayın.

Resim 1 . Polysome profil oluşturma. (A) düzeni degrade hazırlık, polysome ayırma ve Absorbans profil. (B) şeması kesir analiz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2 . Polysome profil analizi LEISHMANIA büyük kültür Logaritmik büyüme aşamasında. (A) Cytoplasmic lysate % 10-50 Sükroz gradyan içerisinde şeker. (B) 18S RNA, tübülin ve Sherp mRNA (%) prepolysomes içinde göreli dağıtım, hafif ve ağır polizomlar RT-qPCR tarafından analiz günlük hücre. 40'lı içeren kesirleri, 60'lar ve monosomes prepolysomes kombine edilmiştir. 5-8 ribozomlar olan kesirleri toplamak ağır polizomlar oluşan iken kesirler 2-4 ribozomlar ile hafif polizomlar kombine edilmiştir. Sentetik E. coli OmpA mRNA kesirler önceki RNA ayıklama normalleştirme denetim RT-qPCR olarak hizmet ekledi. Karşılaştırmalı C_T (ΔΔC_T)³¹ yöntemi mRNA düzeyleri hesaplanması için kullanıldı. Hata çubukları standart hataları gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3 . Polysome ayırma ve analiz ribozomlara HeLa hücreleri ile rekombinant CFTR ve .NET Framework mRNA'ların ilişkisini transfected plazmid ile DNA'lar. (A) Polysomal HeLa hücreleri profilinde CFTR ve .NET Framework plazmidleri ile transfected. % 10-% 50 Sükroz degrade polizomlar ayrılması ulaşmak için uygulandı. Tepeler için küçük (40) ve büyük (60) alt birimleri, hem hem monosome (80) gösterilir. Kesirler paneli A gösterildiği gibi kombine ve daha fazla analiz için kullanılan. (B) mRNA'ların CFTR ve .NET Framework farklı kesirler dağılımı. RT-qPCR tarafından 18S tespiti polysome ayırma için bir denetim olarak kullanıldı. RNA düzeyleri RT-qPCR analizi ile değerlendirilmiştir. Veri sentetik mRNA kullanarak normalleştirilmiş. Karşılaştırmalı C_T (ΔΔC_T)³¹ yöntemi mRNA düzeyleri hesaplanması için kullanıldı. Hata çubukları standart hataları gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4 . Algılama HeLa polysomal kesirler ribozomal proteinlerin. Hela hücre lysate % 10-% 50 Sükroz degrade Santrifüjü tarafından maruz bırakıldı. Seçili kesirler proteinler TCA ile çöktürülmüş ve Elektroforez %12 tarafından analiz Western Blot kullanarak aşağıdaki SDS-sayfa fare monoklonal RPS6 ve tavşan poliklonal RPL11 antikor olarak birincil antikorlar ve Peroxidase-Conjugated keçi Anti-fare ya da anti-tavşan ikincil antikorlar. Görselleştirme sinyallerin SuperSignal Batı Pico artı chemiluminescent substrat tarafından yapıldı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 5 . HeLa %10 - %50 (siyah) veya % 17-%51 (gri) Sükroz degradeler profil oluşturma polysomal karşılaştırılması. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 6 . Tedavisinde EDTA HeLa hücreleri polysomal profili üzerine etkisi. Hela hücre lysate 10 mM EDTA Sükroz degrade Santrifüjü hemen önce 10 dakika buzda ile tedavi edildi. MgCl₂ 5 mM EDTA Sükroz degrade çözümlerinde yerine. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 7 . Polysomal profil lysate fare testis dokusundan. Kesirler RNA ayıklama bir RNA arıtma reaktif ile tabi ve % 1'özel Jel Elektroforez tarafından incelendi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tablo 1. RT-qPCR için koşullar

Polysome ayırma Sükroz degrade tarafından RNA ile kombine ve kesirler protein analizi bireysel mRNA'ların veya tüm translatome translasyonel durumunu yanı sıra translasyonel düzenleyen protein etkenler rolleri analiz etmek için güçlü bir yöntemdir makine normal fizyolojik veya hastalık durumu sırasında. Polysomal profil oluşturma nerede transkripsiyon kontrolü büyük ölçüde yoktur ve gen ifade düzenlemesi çoğunlukla oluşur LEISHMANIA de dahil olmak üzere trypanosomatids gibi organizmalar translasyonel yönetmelikte çalışma için özellikle uygun bir tekniktir Çeviri sırasında.

Burada, biz üç modellerde kullanılan bir polysome ayırma iletişim kuralı tarif: LEISHMANIA parazitler, kültürlü insan hücreleri ve fare dokular. Polysome ayırma adım temelde bu çalışmada kullanılan farklı organizmalar için aynıdır; Ancak, lysate hazırlık bazı farklılıklar vardır. LEISHMANIA hücreler sıvı kültüründe büyümek ve Santrifüjü tarafından toplanır ve hücre lizis önce emin olmak için degradenin üzerinde yükleme eşit sayılır. İnsan hücreleri yıkanmış ve doğrudan plaka üzerinde lysed. Eşit yük optik yoğunluk tarafından kontrol edilir. Fare doku gerektiren bir Dounce homogenizer için verimli lizis durumunda LEISHMANIA ve insan hücreleri, onları 23'lik iğne geçmek için yeterli değil.

Kullanılan tüm reaktifler RNase ve proteaz ücretsiz olmalıdır. Heparin ve RNase inhibitörü sitoplazmik lysates faaliyete RNase inhibitörleri olarak karşılaştırılır. Bulduğumuz her iki reaktif etkili RNase engelleyebilirsiniz. Ancak, heparin cDNA hazırlık ve RT-qPCR gibi aşağı akım uygulamaları etkiler. Sonuç olarak, heparin kullanıldığında hazırlık RNA'ın bir ek arıtma adım gerektirir. Bize göre RNase inhibitörü daha uygun bir seçimdir ve etkin iletişim kuralı profil oluşturma polysome kullanılabilir.

Polysomal profil oluşturma yöntemi bir büyük kısıtlamasıdır emek yoğun, var. Aynı anda en fazla altı degradeler hazırlanabilir. Degrade fractionator kısa bir süre içinde işlenmesi gereken 144 kesirler oluşturur. Bireysel kesirler analizini de zaman alıcı ve pahalı olabilir. Bu nedenle, bireysel kesirler öncesi polizomlar birleştiren, hafif ve ağır polizomlar sağlar hızlı ve daha az zahmetli bir şekilde bireysel mRNA'ların translasyonel aktivitesini tahmin etmek için. RT-qPCR sonuçlarımız kombine kesirler farklı mRNA'ların LEISHMANIA ve HeLa hücreleri (Şekil 2, 3) hem de translatability farklılıkları tanımlamak izin verdi. Ancak, ince çözümlemesi gerekiyorsa, bireysel kesirler analizi gerçekleştirilebilir.

Ribozom mRNA translasyonel durumunu incelemek için başka bir yöntemdir ve ölçüm ribozom³⁸tarafından korunan mRNA parçalarının sıralama yoluyla protein üretiminin temel alır. Bu teknoloji bir örnekte tercüme ediliyor belirli polysomal kesirli sayıları mRNA dizileri ilişkilendirme nicel bilgi sağlar ve mRNA'ların karşılaştırma ile kodon çözünürlükte translasyonel durumunu kesin bilgiler sağlayabilir polysome teknoloji profil oluşturma. Ancak, polysome profil oluşturma RNA ve protein analizi, böylece polizomlar Proteom üzerinde ek bilgi sağlamak için kullanılan ve çeviri düzenlenmesi için katkıda etmenleri tanımlayın.

Bu nedenle, polysomal profil oluşturma translasyonel bireysel mRNA'ların, durumunu analiz etmek için kullanılan çok yönlü bir teknik ribozom ilişkili proteinler incelemek ve translasyonel yönetmelikte altında farklı farklı model organizmalar deneysel çalışma olduğunu koşullar.

Yazarlar ifşa gerek yok.

Yazarlar Ching Lee ses kaydı ile yardım için teşekkür. Araştırma Texas Tech Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Start-up fonlarından desteklenen bir durumdu ve Center of Excellence translasyonel Neuroscience ve tedavi (CTNT) tarafından PN-CTNT 2017-05 AKHRJDHW A.L.K. için vermek; NIH grant tarafından kısmen K.Z. James C. Huffman ve Kristen R. Baca R01AI099380 CISER (kök Tümleştirme eğitim ve Araştırma Merkezi) bilim adamları vardı ve program tarafından desteklenen edildi.