Birincil amniyotik sıvı ve membran hücreler Pluripotent Xeno-Alerjik koşullarında için yeniden programlama

Bu iletişim kuralı birincil amniyotik sıvı ve membran Mezenkimal kök hücrelerin içine İndüklenmiş pluripotent kök hücreler tamamen kimyasal olarak tanımlanan koşullarda bir sigara entegre episomal yaklaşım kullanarak yeniden programlama açıklar. Yordamlar, ayıklama, kültür, yeniden programlama ve elde edilen İndüklenmiş pluripotent kök hücreler sıkı yöntemlerle karakterizasyonu ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Otolog hücre tabanlı terapiler gerçeklik İndüklenmiş pluripotent kök hücreler getirilmesi ile bir adım daha var. Cenin kök hücre, amniyotik sıvı ve membran Mezenkimal Kök hücre, gibi farklılaşmamış hücreleri söz doku Mühendisliği ve gelecekteki Pediatrik müdahaleler ve kök hücre Bankacılığı IPSC içine yeniden programlama için benzersiz bir tür temsil eder. Burada sunulan Protokolü ayıklamak için en iyi duruma getirilmiş bir yordam açıklanır ve birincil amniyotik sıvı ve membran Mezenkimal Kök hücre kültürü çalışmalarının ve episomal üreten tamamen kimyasal olarak tanımlanmış kültür bu hücreler pluripotent kök hücrelerden indüklenen insan rekombinant vitronectin ve E8 orta kullanan koşullar. -Akış Sitometresi, confocal görüntüleme, teratoma oluşumu ve transkripsiyon profil oluşturma – sıkı yöntemleri uygulayarak yeni satırlar karakterizasyonu ayrıca açıklanmıştır. Yeni oluşturulan satırları işaretleri embriyonik kök hücre – Oct3/4A, MicroRNAs, Sox2, TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-4-SSEA-1 işaretçisi için negatif olurken hızlı. Kök hücre hatları teratomas scid-bej farelerde 6-8 hafta içinde oluşturmak ve teratomas doku tüm üç germ katmandan temsilcisi içerir. Transkripsiyon hatlarını profil oluşturma genel ifade Mikroarray veri bioinformatic pluripotency değerlendirme algoritması göndererek tüm satırları pluripotent sayılır ve bu nedenle, bu yaklaşım hayvan test için cazip bir alternatif. Yeni IPSC hatları kolayca ayırt etme ve doku Mühendisliği optimizasyonu içeren aşağı akım deneylerde kullanılabilir.

İndüklenmiş pluripotent kök hücreler (IPSC) potansiyel hücre replasman tedavileri, hastalık ve gelişimsel modelleme ve uyuşturucu ve toksikolojik tarama^1,2,3hakkında görülmemiș. Yedek terapiler kavramsal olarak hücre enjeksiyon tarafından elde edilebilir, In vitro doku (örneğin kalp yamalar) implantasyon ayrıştırılan veya rejenerasyon doku Mühendisliği aracılığıyla rehberlik. Amniyon sıvısı (AFSC) ve membran kök hücre (AMSC) olan hücreler bu müdahaleler için mükemmel bir kaynak ya da doğrudan^4,5,6,7 veya yeniden programlama için başlangıç bir hücre nüfus olarak Pluripotent^8,9,10,11,12.

Erken yaklaşımlar kullanılan tanımsız kültür sistemleri veya gerektirecektir genomik entegrasyonu gerektiren yöntemleri yeniden programlama yapıları^9,10,11,12. Düz-se bile daha az tanımlanmış membran ek matris (BMM), IPSC amniyotik sıvı epitel hücreleri oluşturmak için kullanılan daha yeni yapılan bir çalışmada xeno-Alerjik orta istihdam. Ancak, teratoma oluşumu tahlil In vitro ve moleküler verileri zenginliği ile birlikte çalışmaya dahil değildi. Amniyotik sıvı epitel hücreleri yenidoğan fibroblastlar¹³ile karşılaştırıldığında bir kabaca 8-fold daha yüksek programlama verimliliği için bulunamadı. Başka bir çalışmada, amniyotik sıvı Mezenkimal kök hücrelerden de bir çok daha yüksek verimlilik ile¹²IPSC içine yeniden programlanan bulunmuştur.

Pluripotent kök hücre tüm 3 germ tabakalarının doku temsilcisi ayrıştırılan ve böylece geniş bir potansiyele sahip. Pediatrik hastalarda hasat, yeniden programlama ve onların Otolog amniyotik sıvı kök hücre doku Mühendisliği prenatally faydalı olacağını ve amniyotik membran kök hücreleri perinatally. Ayrıca, fetal kök hücreleri (erişkin kök hücreleri^14,15düşük) farklılaşma nispeten düşük düzeyde teorik olarak IPSC¹⁶kaynak hücrelerden epigenetik önyargı gözlenen tutma ele yardımcı olabilir.

Burada amniyotik sıvı yeniden programlama için bir iletişim kuralı mevcut ve membran kök hücre içinde pluripotency için kimyasal olarak E8 orta xeno-Alerjik episomal plazmid¹⁸kullanılarak rekombinant vitronectin¹⁷ tarihinde (VTN) tanımlanan.. En büyük avantajı amniyotik sıvı ve membran hücre hücre yeniden programlama için bir kaynak olarak kullanılabilirliklerini öncesi yatıyor ve perinatally ve bu nedenle bu yaklaşım esas olarak Pediatrik doku Mühendisliği içine araştırma yararlanacak.

Protokolü Etik Komitesi insan araştırma için kurumsal kuralları izler. Hastanın yazılı izni amniyotik sıvı araştırma için kullanmak için elde edildi.

Bu iletişim kuralı kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi South Alabama Üniversitesi politikaları izler.

1. izolasyon ve kültür birincil amniyotik Mezenkimal Kök hücre

1. Amniyotik sıvı hücre kaplama
   1. En az 2.5 mL Amniyosentez sürecinde bir hekim tarafından hasat amniyotik sıvı elde edilir.
      Not: Canlı hücre ve doku tüm işlemenin bir steril doku kültürü dolapta gerçekleştirilmesi gerekir ve uygun kişisel koruyucu ekipman kullanılmalıdır. Temel hücre kültürü ve steril tekniği bilgisi gereklidir.
   2. Amniyotik sıvı ve membran hücre (AFMC) kültür ortamı hazırlamak: EBM-2 Bazal orta, % 15 fetal sığır serum (FBS), bFGF 20 ng/mL, EGF, IGF 10 ng/mL 25 ng/mL. Birincil amniyotik sıvı gibi amniyotik membran kök hücre kültürü için orta ile antibiyotik antimycotic çözüm takıma.
   3. 0 gün, amniyotik sıvı 2.5 mL AFMC kültür orta ve plaka ile 3,5 mL T25 şişesi karıştırın. 37 ° C ve % 5 CO₂ en az 48 saat kolonileri varlığı için kontrol etmeden önce rahatsız edilmeden için kuluçkaya.
   4. 5 günde kolonileri yapisan hücrelerinin bulunması gerekir. Yavaşça yaptım tam olarak alt ve enkaz için uygun ve vakum-Pasteur pipet kullanarak harcanan orta/amniyotik sıvı karışımı aspiratı hücreleri çıkarmak için balonun rock. Taze AFMC orta 5 mL ile değiştirin.
   5. Başka bir 5 gün boyunca kültür. Orta 1.1.4. adımda açıklandığı gibi her gün değiştirin.
2. Yalıtım insan amnion birincil Mezenkimal Kök hücre
   1. En kısa zamanda doğum, hücresel bütünlüğü en üst düzeye çıkarmak için en geç 24 saat içinde takip plasenta edinin. Amnion 9 cm² parçası kesilmiş, kan pıhtıları kaldırmak ve 50 mL santrifüj tüpü ile antibiyotik antimycotic çözüm takıma PBS 30 mL ile yıkayın.
   2. Adet steril 10 cm doku kültürü tabak içinde ince ayar yapmak için neşter bir çift kullanarak membranlar kıyma. Membranlar sindirim ve hücreleri ayıklama bir doku ayrılma sistemi kullanarak elde. Üreticinin iletişim kuralı izleyin.
      Not: yüksekse kıyma sonra doku parçaları, yüksek hücre sayıları sindirim sonra kurtarıldı.
   3. Neşter bıçakları kullanarak bir doku ayrılma tüp içine kıyılmış membran doku kütle transferi ve RPMI 1640 orta 4.7 mL ile karıştırın. (Bkz. Tablo reçetesi) ayrılma enzimler içinde karıştırın.
   4. Tüpler doku dissociator üzerine monte ve programı "h_tumor_01" çalıştırın. Tüpler 37 ° c 30 dk için sallanan bir platform üzerinde kuluçkaya.
   5. Daha fazla RPMI 1640 35 mL ile süspansiyonlar sulandırmak ve 50 mL koleksiyonu santrifüj tüpü üzerinde bir 70 µm süzgeç uygulanır.
   6. Santrifüj 200 x g oda sıcaklığında, atma süpernatant de 5 dk 5 mL RPMI 1640 Pelet resuspend, bir hemacytometer kullanarak hücreleri saymak ve 10.000 hücre/cm² bir yoğunluk doku kültürü tedavi gemi ile içine, taze plaka için hazırlanan AFMC orta antibiyotik antimycotic çözüm ile desteklenmiştir.
      Not: eksik sindirim durumunda doku parçaları mevcut olacak ve tek hücre kıt olacak. Spin aşağı tekrar ve bir T75 şişesi bütün Pelet plakası.
3. Birincil AFSC ve AMSC kültür
   1. AFSC/AMSC geçit kolonileri vakum alıyorum tarafından orta Pasteur pipet kullanma ve hücre dekolmanı enzim 2 mL şişe ekleme geçirdi. 5-8 dakika 37 ° C'de kuluçkaya.
   2. Dokunun hücreleri çıkarmak ve süspansiyon AFMC orta eşit bir hacmi ile karıştırmak için balonun üzerinde (antibiyotik antimycotic ek olmamalıdır bu andan itibaren gerekli). 200 gr 4-5 dk. Kaldır ya da bir cam Pasteur pipet kullanarak süpernatant veya sadece tüp ters çevirme ve atık bir konteyner içine boşalma yoluyla, santrifüj kapasitesi.
   3. Bir tek hücre süspansiyon içinde kalan damla sıvı içine Pelet kıracak ve AFMC orta için kaplama ile karıştırın santrifüj tüpü dibine hafifçe vur. Bir yoğunluk arasında 2.500 ve 5. 000 hücre/cm²plaka T-şişeler içine.
   4. Değişim orta her geçen gün. Hücre hatları geçiş 6 ötesinde kültür değil. Amacıyla yeniden programlama için düşük bir geçiş mümkün olduğunca kullanın.
   5. AFSC ve AMSC dondurulmuş hisse senetleri gibi back-up donma orta kullanarak hazırlamak. Bir hücre dekolmanı enzim, 200 g, santrifüj 4 ° c 5 min için kullanarak kültürler hasat.
   6. Pasteur pipet kullanarak süpernatant kaldırmak ve Pelet hücrelerde singularize tüpü dibine hafifçe vur. 1 × 10⁶/mL ve aliquot yoğunluğu cryovials içine de tam dondurucu ortamda resuspend. -80 ° C'de gecede dondurucu bir kapta saklayın Sonra için sıvı azot uzun süreli depolama için hareket.

2. yeniden programlama Pluripotency

1. Programlama plazmid elde
   1. Bir kar amacı gütmeyen plazmid depo ile programlama plazmid satın. Bir malzeme Transfer sözleşmesi gerek yoktur.
   2. Plazmid E. Coli yetkili hücrelere dönüşümü ve ticari plazmid ekstraksiyon kiti kullanarak plazmid yalıtır. Üreticinin yönergeleri izleyin.
   3. Plazmid DNA bir Spektrofotometre kullanarak konsantrasyonu ölçmek. Yüksek bir elde edilen konsantrasyon, örnek seyreltme sırasında transfection önlemek için ideal olarak yaklaşık 1 µg/µL plazmid nişan al.
   4. Bir UV Spektrofotometre ve aliquot kullanarak bireysel plazmid konsantrasyonları ölçmek onları tek tek.
   5. Birlikte 3 µg, 3 µg ve Plazmidler, EN2K, ET2K ve M2L 2 µg sırasıyla karıştırın. Programlama plazmid çözüm bu. Plazmid çözüm miktarı 1 x 10⁶ hücre transfect için yeterli. Birkaç böyle aliquots hazırlayın.
   6. Tüm aliquots-80 ° C'de depolayın
2. Hedef kültür tabak hazırlamak
   1. Bir 6-şey plaka vitronectin ile kat-1 mL vitronectin seyreltme arabelleği her kuyuya ve VTN stok çözeltisi (1 µg/cm²) 40 µL içinde karıştırın. Bırakın, oda sıcaklığında (RT) ya da 37 ° C'de kuluçka 1 h için.
   2. Vakum-Pasteur pipet kullanarak çözüm aspiratı ve 2 mL her iyi AFMC orta yerine. Hücreleri kaplama için olana 37 ° C'de depolayın.
      Not: Önemli: Bu adımda kullanılan AFMC orta değil herhangi bir antibiyotik veya antimycotic çözümleri içermesi gerektiğini.
3. Kültürlü birincil AFSC/AMSC hasat
   Not: Düşük geçiş donmuş stokları kılmaktadır ve yeniden programlama için bir T-75 şişesi ayırmanız kültür AFSC/AMSC'nı genişletin. Olabildiğince az gibi beri 100.000 bir deney, hasat, amacı hücreleri yaklaşık 500.000 kayıplarını telafi etmek için ve eğer genişliğini transfection parametreleri veya farklı kültür koşulları test edilmesi için yeterli hücrelerdir.
   1. 1.3.1-1.3.2. adımda açıklandığı gibi hücre dekolmanı enzim karışımı kullanarak AFSC/AMSC düşük bir geçit, en kısa zamanda hasat. Hücreleri centrifuged sonra sonraki adıma geçin.
   2. Resuspend 1 ml Pelet PBS ve mix iyi serum bileşenleri yıkamak için. Bir hemacytometer kullanarak hücreleri saymak. 100.000/ml PBS ve aliquot hücre yoğunluğu 1,5 mL microcentrifuge tüpler içine ayarlayın. Bu sadece çok az kişi vakit arasındaki hücreleri ve transfection için kullanılan arabellek sağlar.
   3. Microcentrifuge tüp 5 mL polistren tüpler üzerine yerleştirin (adaptörler, bir normal salıncak rotor Santrifüjü sağlayacak) ve 200 x g, santrifüj, oda sıcaklığında 4 dk için. Tüpler ters çevir ve süpernatant atık konteyner içine atın. Sabit açılı rotor kullanmayın.
   4. 3 dakika oda sıcaklığında 200 x g adlı bir ek Santrifüjü adımı gerçekleştirin. Bu kalan sağlayacak en altında toplamak için boru duvarlarından sıvı. Dikkatlice hepsini 200 µL pipet kullanarak Aspire edin.
4. Plazmid yeniden programlama ile transfection
   1. Deneyler yeniden programlama için bir transfection sistemi ( Tablo malzemelerigörmek) programlama plazmid hücrelere sunmak için kullanılır. Transfection ipuçları, transfection tüpleri, resuspension arabellek ve elektrolitik arabellek doku kültürü kabinin yerleştirin. Onlar açana kadar o zaman onlar 4 ° C'de depolanan kiti reaktifler RT tutulur
      Not: Biz seti 10 µL sürümünü kullanın.
   2. Transfection aygıtı kapatmak böylece onun Metro İstasyonu'na doğrudan dolap yerleştirilebilir taşıyın. Bir transfection tüp elektrolitik arabellek 3 mL ile doldurulması ve sonuna kadar yuvanın iterek istasyona tüp bağlama.
   3. Programlama plazmid adım 2.1.5-80 ° C depodan hazırlanan çözüm aliquots al ve RT kültür kabine çözülme izin.
   4. Transfection cihaz aşağıdaki transfection parametreleri seçin: 950 V, 40 ms ve 1 darbe.
   5. 10 µL resuspension arabellek 100.000 hücreleri içeren Pelet resuspend. Hızlı bir şekilde bu noktadan itibaren resuspension arabellek biraz zehirli olduğu için ve bir artan pozlama süresi içinde belirgin bir şekilde düşük bir hücre canlılık sonuç iş üstünde.
   6. 1/10 (çözüm aliquot 1 x 10⁶ hücre toplam için hazırlanmıştır) programlama plazmid çözüm mix.
   7. Transfection bahşiş transfection pipet üzerine monte.
   8. Hücre süspansiyon transfection ucunu dikkatle, hava kabarcıklarının oluşumunu önleme Aspire edin. Kabarcıklar gözlenir, süspansiyon sınırdışı ve aspirasyon yineleyin. Hava kabarcıkları transfection engel.
   9. Transfection pipet transfection tüp içine yerleştirin ve transfection cihazın ekranında "Başlat" düğmesine basın. Transfection başarı hakkında bilgilendirilmesi perde haber bekleyin ve pipet tüp sizden hemen kaldırın.
   10. İçine 1 de 2.2 bölümünde hazır hedef 6-şey plaka süspansiyon sınırdışı. Bir de komşu gelen orta mix ve süspansiyon eşit (elde edilen hücre yoğunluğu 50.000/iyi olacak) her iki kuyu dağıtmak.
   11. Transfection tek tek AFSC/AMSC içeren tüm microcentrifuge tüpler için yineleyin. Plaka da kuluçka 37 ° C ve % 5 CO₂yerleştirin.
5. Kültür transfected AFSC/AMSC
   1. Transfected hücreleri 2-5 gün için kültür. Sonra günde 3 sodyum bütrat 100 µM ile desteklenmiş E8 oluşan programlama ortamına geçin.
      Not: Kaynak AFSC/AMSC büyüme önlemek için ikincil geçiş yapılabilir. Ancak, passaging bu parametre Eğer programlama verimliliği doğru olarak hesaplamak için seçeneği devre dışı bırakır.
   2. Programlama orta 10 gün boyunca her gün için her gün değiştirin. Orta gün 10 her gün değiştirin.
6. Tam olarak reprogramed kolonileri klonal genişleme için el ile malzeme çekme
   1. Tam olarak programlanmış kolonileri 14 gün yanında görünür. Koloniler boyutu genişletin ve kompakt hale sağlar. Onlar el ile aldım ve taze tabakaları bana gün 15-16 gibi erken transfer.
   2. malzeme çekme işlemi önce 1 h 24-şey pilakalar ve VTN 8 µL vitronectin seyreltme arabelleği iyi (1 µg/cm²) başına 300 µL içinde kat ve RT veya 37 ° c kuluçkaya Çözüm olmadan sodyum bütrat E8 orta yerine.
   3. Koloniler, yeterli boyuta (çapı ideal 400 µm) steril kültür kabine seçin. Faz kontrast mikroskop ya da bir stereomicroscope kullanılabilir.
   4. Onun monitör TemizlikFleksibl ortadan kaldırır bu yana malzeme çekme için kabine yerleştirilmiş bir LCD görüntüleme mikroskobu kullanılacaktır. % 70 etanol ile mikroskop sahne sterilize.
   5. Normal faz kontrast hücre kültür mikroskop kullanarak seçin, mark ve çekilecek kolonileri sayısını not edin. Bu zaman için bu işlem sırasında gerçek malzeme çekme boşa değil emin olmak önemlidir.
   6. PBS içinde 30 µL 0,5 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) ile çekilmek üzere kolonileri sayısından büyük veya eşit bir sayı PCR tüpleri doldurun. Koloniler kaplama önce kısmi ayrılma için bu tüpler içine yerleştirilir.
   7. 5 almaya planı kolonileri tabak 2 µL. için ayarla 10 µL pipet kullanarak aynı anda koloni kenarında bir açıyla pipet ucu tutun ve dikkatli ve yavaş yavaş tüm koloni yüzey kapalı kazımak. Hemen tüm koloni pipet ucu Aspire edin ve hazırlanan PCR tüpleri EDTA ile birinin içine aktarın.
   8. Kalan 4 koloniler ile yineleyin. RT 4-6 dk için kuluçkaya.
   9. Damlalıklı yukarı ve aşağı yavaşça daha küçük kümeleri koloni yıkmak için daha büyük bir pipet ucu kullanarak süspansiyon. Bir tek hücre süspansiyon oluşturmaktan kaçının.
   10. Doğrudan bir hedef de 2.6.2 adımda hazırlanan 24-şey plaka süspansiyon plaka. Kalan koloniler ile yineleyin.
   11. 5'ten fazla kolonileri çekilecek ama 5'ten fazla kolonileri teker teker seçme 2.6.6 2.6.10 aracılığıyla yineleyin. 37 ° C ve % 5 CO₂kuluçkaya.
7. Klonal genişleme ve IPSC olgunlaşma
   1. Koloniler büyümek ve kompakt olmasına izin. 3-6 gün yeterlidir. Kültür orta her gün değiştirin. 400 µL ve hücre yoğunluğu dayalı E8 orta 1 mL arasında kullanın.
   2. 24-şey plaka yeterli bir koloni yoğunluğu ile kuyu 6-şey kalıplara genişletilecektir. passaging önce 1 h VTN 6-şey pilakalar (aynı derecede içinde adım 2.2.1) kat. O zaman iyi çözüm E8 orta iyi başına 2 mL ile değiştirin.
   3. 1 mL pipet kullanarak kaynak kuyulardan harcanan orta Aspire edin ve 0,5 mM EDTA yıkamak için 300 µL ile değiştirin. Hemen aynı pipet ucu kullanarak Aspire edin ve 0,5 mM EDTA 300 µL ile tekrar yerine, sonra 5 dk. Aspire için 1 mL pipet kullanarak tüm sıvı RT kuluçkaya.
   4. 1 mL pipet kapasitesini ayarla, 1 mL wide-geçişli bahşiş üzerine monte ve hedef E8 orta uç de Aspire edin. Kaynak IPSC kültür orta bir akışı ile yıkayın.
   5. Süspansiyon hedef iyi ve damlalıklı kolonileri 20-50 hücre kümeleri içine bölmek için birkaç kez yukarı ve aşağı içine aktarın. Onlar eşit kuyuda hafif sallanan ve plaka sallayarak tarafından dağıtılan ve 37 ° C ve % 5 CO₂kuluçkaya emin olun.
   6. Günlük Orta ve geçiş her 3-4 gün değiştirin. Herhangi bir farklılaştırıcı kolonileri faz kontrast mikroskop altında işaretlenebilir ve kültürde dolabında bir pipet ucu kullanarak kaldırıldı. Bu yüksek kaliteli saf IPSC kültür seçmeli yayılmasını sağlar.
   7. passaging önce 1 h kat VTN 6-şey plakalı olduğu gibi adım 2.2.1 kuyu. Daha sonra çözüm E8 orta iyi başına 2 ml ile değiştirin.
   8. Rutin passaging ilk yapılan 0,5 mM EDTA (Adım 2.7.2 2.7.5) kullanarak passaging için benzer. 6-şey plaka bir iyi harcanan orta yıkama ve atmak için EDTA 1 mL ile değiştirin.
   9. 1 mL EDTA ekleyin ve 5-7 dk kısmi ayrılma için RT kuluçkaya. Kuluçka süresi optimize etmek gerekli, bir süspansiyon emin 20-50-hücrenin etrafında kümeleri üretilen eğer. Ayrılma tek hücreye kaçının.
   10. EDTA çözüm atın ve 1 mL 1 mL pipet hedef de wide-geçişli pipet bahşiş kullanarak E8 orta Aspire edin.
   11. İstenen bir kısmı yüzeyden serbest kadar art arda kapalı kaynak IPSC kültür akışı E8 orta yıkama ve hedef haline de aktarmak. Bu bölümü split oranı temsil eder (örneğin, 1/8 kültür transfer 1:8 oranı için.)
   12. Geçit her 3-4 gün. Onları en az 15 pasajlar için aşağı akım deneylerde kullanmadan önce tarafından kültür olgun IPSC satırlarının izin

3. karakterizasyonu ve Pluripotency onayı

Not: ayrıntılı bilgi için ek dosyaları Akış Sitometresi ve confocal mikroskobu bakın.

1. Teratoma oluşumu tahlil
   1. Dokuların tüm üç germ katmandan temsilcisi teratoma oluşumu tahlil tarafından ayırt etmek için IPSC kapasitesini belirlemek için hayvan bakımı ve kullanımı, öncesinde uygun iletişim kuralını dosyalama için zaman tanımak planlama ile ilgili Kurumsal politikalar takip belgeleri. Farelerde teratoma oluşumu arasında 6-10 hafta sürecek.
   2. 6-şey plaka IPSC satır başına 4 kuyu 4 gün boyunca kültür. Bir fare bir kanat enjekte hücre sayısı yaklaşık 0,5-1 x 10⁶ hücreleri olduğunu. İsteğe bağlı: ekstra bir de tek hücre ayrılma bir hücre dekolmanı enzim aracılığıyla bir iyi bir temsilcisi cep numarasını belirleme ve sayım için ayrılmış olması.
   3. IPSC kümeleri içinde askıya E8/BMM karışımı hacmi hesaplamak: bir fare her iki yanları enjekte, her biri 150 µL yığın süspansiyon. Üç fareler bir IPSC satır oluşumu teratoma test etmek yeterli değildir. Ölü hacim kaybı telafi etmek için elde edilen toplu iğne başı bir ekstra 150 µL içerir. fare başına 1 iğne kullanılır. Bu nedenle toplam birimdir 3 * (150 µL * 2 + 150 µL) = 1350 µL
   4. Onlar pasajlı için açıklanan adımlardaki 2.7.8-2.7.10 gibi sanki kısmen IPSC kolonileri EDTA ile ayırmak. Bu kolonilerin kümeleri ayrışmış ve tek hücrelere ayrılmış değil önemlidir.
   5. Yıkama IPSC kolonileri E8 orta (yarım adım 3.3.3 hesaplanan hacmi), 675 µL ile kapalı bir geniş-geçişli ucu kullanarak. Yığın süspansiyon 5 mL polistren tüp içine aktarın. Buza koyun.
   6. BMM 675 µL ile birleştirin. Buz üzerinde elde edilen süspansiyon enjeksiyon kadar tutun.
   7. Onları hareketsiz fareler anestezi isoflurane kullanarak. Bu gerçekleştirilen veya vivaryum yetenekli personeli tarafından destekli.
   8. Girdap 5 mL polistiren kısaca tüp ve yığın süspansiyon (fare başına 450 µL) 22 G iğne ile donatılmış bir insülin şırınga içine Aspire edin. Hücre süspansiyon 150 µL subkutan enjekte et. Bu birim (bkz. Adım 3.1.2) yaklaşık 1 x 10⁶ hücreler içerir.
   9. 3 fare IPSC satır başına enjekte. Uygun hayvan bakımı uygulama için tüm yordamları izleyin.
   10. Fareler sağlığını her gün izlemek.
   11. Teratomas bir son nokta çapı 1,5-2 cm ulaştığınızda, fareler ötenazi, teratomas explant ve onları formalin çözüm için doku fiksasyon 24 h için saklayın.
   12. Hematoksilen Eozin (H & E) boyama için bir Histoloji çekirdek tesise sabit teratomas getir. Bir patolog doku tüm üç germ tabakalarının varlığı sınıf.
       Karyotyping için Not: canlı IPSC kültürler sevk İhtisas karyotip bütünlüğünü sınamak için sitogenetik laboratuarları. Bu sınamanın gerçekleştirilmesini tavsiye edilir her 5 pasajlar.
2. Transkripsiyon profil oluşturma
   1. 6-şey plaka bir RNA örnek almak 3-4 gündür 2 kuyu kültür. Hücreleri ayırt ile küçük kirlenme damlalıklı ipucu kullanarak kazıma ele alınması, sadece yüksek kaliteli kültürler kullanın.
   2. RNA üreticinin protokol sonrası piyasada bulunan bir seti kullanarak IPSC kültürler yalıtmak. Örnek bir özel genomik çekirdek tesise gemi.
   3. Microarrays ( Tablo malzemeler için desteklenen seçenekleri görmek) veya RNA sıralama kullanarak IPSC satırlarının genel transkripsiyon profilleri elde edilir.
   4. "*.İdat" dosya bioinformatic değerlendirmesi pluripotency Coriell Enstitüsü'nde online bir arayüz üzerinden gönderin. Alternatif olarak, gönderin "* .cel" dosyaları pluripotent kök hücreler, Johns Hopkins Üniversitesi'nde online bir arayüz üzerinden de dahil olmak üzere hücre tipinin kimliği bioinformatic için. Malzemeler tablo bireysel bioinformatic deneyleri kabul veri türleri hakkında ayrıntılı bilgi için bkz:.

Bilinçli yazılı onayı için genetik test amaçlı ve araştırma için sıvı küçük bir aliquot ithaf amniyotik sıvı hasat önce hastalardan elde edildi. Plasenta tıbbi atık temsil eder gibi hiçbir onayı araştırma amniyotik membran kullanımı için gereklidir. Amniyotik sıvı ve membran kök hücreler tipik Mezenkimal özelliklerini görüntülemek, morfolojik hücrelerine seklinde ve faz parlak. Yeniden programlama, üzerine hücreler Mezenkimal-için-epitel (MET) geçiş geçmesi ve Arnavut kaldırımı benzeri morfoloji ve mekansal organizasyon epitel özellikleri gösteren kolonilerin elde etmek. Bu süreç 48-72 h episomal plazmid yeniden programlama giriş aşağıdaki gibi erken başlatılır. Bu koloniler tarafından yeniden programlama, 5 gün yokluğu deneme başarısızlık gösterir. MET kolonileri hücrelerin prolifere ve sonuç olarak, kolonilerin kompakt gün 5 ile 14 arasında olur. Kompakt MET koloniler ayrı ayrı kolayca fark edilebilir (resim 1A) olmayan hücreleri oluşmaktadır. Gün 14, tam olarak programlanmış kolonileri tanınmış, taşıyan bir monolayer içinde düzenlenmiş hücreler kolayca ayırt çekirdeği ve nükleulus görünür. Mekanik olarak izole ve koloniler uygun bir boyuta ulaşmak ve kompakt hale genişletilmiş hazırlar (şekil 1B).

Kısmen programlanmış kolonileri tam pluripotency elde var ama tamamen ve kısmen programlanmış kolonileri kültürler tüm programlama süresi boyunca mevcut. Şekil 2 gösterir bir temsilcisi akış sitometrik analizi embriyonik kök hücre (ESC) işaretçisi ifade tamamen ve kısmen pluripotent kolonileri ve onların karşılık gelen türleri Morfoloji. SSEA-1 ifade negatif^19,20,21 (şekil 2A) ise tam pluripotency Oct4, MicroRNAs, Sox2, TRA antijenleri ve SSEA-4, ifade ile ilişkilidir. Kısmen pluripotent hücreler, ancak, MicroRNAs ve TRA antijenleri²⁰ (şekil 2B) ifade yok. İfade ve yerelleştirme ESC işaretlerinin boyama ve geniş alanlı veya confocal mikroskop (şekil 3) kullanarak yansıma immunocytochemical tarafından onaylanması.

Pluripotent işlevsel bir onay IPSC satırları yeteneği hücrelerin Subkutan Enjeksiyon scid-bej fareler aşağıdaki formu teratomas göstererek elde edilir. 6-8 hafta son nokta boyutu ulaşmak teratomas için ihtiyaç vardır. H & E doku ve bir patolog tarafından muayene boyama doku temsilcisi tüm katmanların üç germ-endoderm, neuroectoderm ve mesoderm (şekil 4A) varlığını doğrulamak için yapılır sonra. Hayvan testleri için bir alternatif cDNA microarrays^22,23gibi genomik yaklaşımlar pluripotency ile ilişkilendirilmiş transkripsiyon imza analiz etmektir. Örtüşen transkripsiyon profil oranı biriyle bir havuzu köklü IPSC ve ESC hatları sonra online bioinformatic pluripotency değerlendirme yazılımı iki sınıflandırıcı – pluripotency arsa şeklinde tarafından sayısal ve yenilik (şekil 4B). Yüksek pluripotency puanı daha fazla sorgu IPSC satırını kurulan hatları benzer. Bir yüksek yenilik puan, ancak, sapmalar veya bir yüksek pluripotency puanı (olduğu gibi teratocarcinoma çizgiler gibi)²²rağmen bile kromozom anomalileri gösterebilir. Burada sunulan iletişim kuralı takip ederek oluşturulan tüm IPSC satırları pluripotent Akış Sitometresi, görüntüleme, teratoma oluşumu ve transkripsiyon analiz yöntemleri tarafından kabul edilmiştir.

Şekil 1: hücrelerinin morfolojik ilerlemesi sırasında yeniden programlama. (A) onlar Mezenkimal-için-epitel geçiş (MET) geçmesi kadar amniyotik sıvı ve membran kök hücre, yeniden programlama için kaynak hücreleri gösteren, daha uzun ve faz-parlak bir tipik Mezenkimal Morfoloji (solda) görüntüler hangi epitel özellikleri edinimi ve koloniler Arnavut kaldırımı Taşı benzeri hücreler (Merkezi) oluşumu yol açar. Bu koloniler çoğalırlar ve düzensiz hücresel kitleler MET hücre (sağda) oluşturun. (B) (14 gün başlayarak) yeniden programlama, daha sonraki aşamalarında kolonileri tam olarak programlanmış hücre ortaya-önemli çekirdeği ile tek tek fark edilebilir hücreleri ve nükleulus monolayers, iyi tanımlanmış sınırları (Merkezi)-ile düzenlenen ve daha çok sayıda (sol) MET kolonileri yanında mevcut. Tam olarak programlanmış bir izole olgun klon sağda tasvir edilir. Ölçek çubuğu 100 µm = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2: akış sitometrik analiz ESC işaretleri ifade içinde tamamen ve kısmen (MET) hücre kolonileri reprogrammed. (A) pluripotent ifade profil için Oct4, MicroRNAs, Sox2, TRA-1-60, TRA-1-81 ve SSEA-4, pozitif SSEA-1 için negatif tamamlayın. (B) kısmen pluripotent hücre kolonileri-MET geçirmiş, ancak tam pluripotency için ilerleme başarısız oldu bu-Oct4 ve Sox2 için olumlu ancak MicroRNAs, TRA ve SSEA antijenleri yok. İlişkili türleri Morfoloji yan yana karşılaştırma için dahil edilir. Ölçek Bar = 200 µm ve 50 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: Confocal olgun amniyotik sıvı IPSC ESC işaretlerinin ifade analizi Imaging. Transkripsiyon faktörleri Oct3/4A, MicroRNAs ve Sox2 çekirdeklerin TRA süre içinde lokalizedir ve SSEA antijenleri membran üzerinde lokalize glikoproteinlerin vardır. Ölçek çubuğu = 50 µm. görüntüleri daha büyük büyütme (birleştirme 2 X) Oct3/4, MicroRNAs ve Sox2 için onların nükleer yerelleştirme daha iyi görselleştirme için dahil edildi. Ölçek çubuğu 25 µm. bulaşan – iletilen ışık alınan görüntüleri =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4: Teratoma oluşumu ve transkripsiyon olgun amniyotik sıvı ve membran IPSC içinde profil oluşturma. (A) doku tüm üç germ katmanları (100 X büyütme) temsilcisi scid-bej farelerde subkutan yetiştirilen Teratomas içerir. (B) küresel ifade Mikroarray profilleri çevrimiçi pluripotency yazılım için gönderilmiş iki sınıflandırıcı – Pluripotent ve yenilik bir arsa döndürdü. Yüksek pluripotency puanları ve düşük yenilik puanları - kırmızı cloud - tipik bir ESC/IPSC satırının bir ifade profil gösterir. Soluk mavi bulut kısmen pluripotent hücreler için bir küme alan temsil ederken mavi bulut farklılaşmış hücreler için bir küme alanı temsil eder. Amniyon sıvısı (3 hat) ve membran (4 hat) IPSC pluripotent sınama tarafından kabul edildi. Bir ESC hattı WA25 bir denetim olarak dahil edildi ve burada siyah bir ok ile tanımlanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Cenin kök hücre nesilden IPSC başlangıç aşamasında kaynak hücreleri ayıklama fetal dokularda, kültür, genişleme ve episomal programlama plazmid getirilmesi üzerine kuruludur. Bu aşama yaklaşık 14-18 gün önce ilk tam olarak programlanmış kolonileri genişletilebilir bir kültür döneme göre izlenir. Olgunlaşma IPSC klonların son aşamasıdır. Amniyotik membran kök hücre ilk çıkarma bir kombine mekanik ve Enzimatik sindirim amnion aracılığıyla elde edilir. Bulduğumuz bu hücre ile en yüksek canlılık çıkarılan en yüksek sayısı 30 dk bir kuluçka zaman sonuçlandı. Sindirim yordam küçük parçalar halinde doku ve hücre kümeleri oluşturabilir. Bunlar tek hücreleri göreli oranı yüksektir, tüm yapışık hücreleri outgrowths için katkıda bulunabilir bu yana tüm kümeleri ve tek hücre bir gemi kaplama öneririz. Amniyotik sıvı kök hücre kaplama hücreleri yalnızca kültür orta ile karışık ve koloniler yapışık hücreleri yeterli boyuta ulaşana kadar inkübe şekilde basittir. Normal doku kültürü tedavi plasticware mükemmel uygundur ve bunlar ile biz alt viabilities ve passaging ile zorluklar gözlenen bu yana geliştirilmiş birincil hücre kültürü için tasarlanmıştır olsa bile biz özel yüzeyler, tavsiye etmiyorum işlem.

Amniyotik sıvı ve membran kök hücreleri genişletilmesini ve dondurulmuş stokları ancak, en kısa zamanda hücreleri kaynak hücreleri olarak yeniden programlama için kullanılabilir. Episomal plazmid giriş hücrelerine, burada 950 V, ayarla transfection parametreleri ile kullanılan transfection sistemi amacıyla 40 ms ve 1 darbe var çok iyi bir performans, tüm satırları ile çalıştı sonuçta başarılı bir şekilde programlanmış) 10 satır). Ana rakip dağıtım üzerinde benzer bir ilke işletim sistemini başarılı bir programlama deneme bizim ellerde üretmek değildi.

Transfected hücreleri üzerine vitronectin kaplı yemekleri AFMC orta ilk 3-5 gün boyunca tohumlari, sonra orta 100 µM sodyum bütrat ile desteklenmiş E8 için açık. Bu büyük tam pluripotency edinme hızını artırır. Morfolojik dönüştürme ilk belirtileri erken 48-72 h olarak görülebilir. Kaynak hücrelerde MET geçmesi ve koloniler hücre morfolojisi epitel ile görünür. Bunlar yavaş yavaş çoğalırlar ve kompakt hale gelir. Bir alt koloni tamamen pluripotent kök hücreler-tek tek fark edilebilir hücreleri önemli çekirdekleri ve nükleulus, Morfolojik özellikleri satın alacak aksine bulanık sınırları iyi tanımlanmış sınırları ile düz kolonileri kısmen gözlenen Pluripotent MET koloniler. Tam pluripotency edinimi an, üzerine önde gelen çekirdeklerin kompakt MET hücre kolonileri alacak ve tek tek hücreler benzersiz bir morfolojik desen oluşturulurken fark edilebilir hale. Eğitimli bir göz için bu model başarılı yeniden programlama açık bir ibret vardır. MET ve IPSC klonlar birbirimiz için yanlış olabilir ancak, PSC kültür eğitim yoksun bir dedektif için başarıyla tam pluripotency için hayli ilerlemiştir kolonileri tanımlaması dikkatli değerlendirme gerektirir. Şekil 1 ve Şekil 2 her ikisi de örneklerini verir. MET klonlar yerine aldı, ayrıntılı Akış Sitometresi inceleme hata ortaya ve özellikle, TRA-1-60 ve TRA-1-81 antijenleri olasılıkla yok olacak Şekil 2' de gösterildiği gibi. Nitekim, TRA antijenleri daha önce sıkı pluripotency işaretleri bulundu. Ancak, kısmen pluripotent MET hücreleri kanser araştırma²⁵ilgi olabilir.

Bu kültür durum kaynak AFSC/AMSC için suboptimal ve sonunda, onların yayılması yavaşlatır ve düz, fibroblast benzeri Morfoloji kazanacaklardır. Bu olumsuz programlama işleminin etkilemez rağmen Kaynak hücrelerde yüzeyden yeniden programlama, daha sonraki aşamaları sırasında ayırmadan dokular oluştururlar. Aksine, işlemi bazen için boşaltma için programlanmış kolonileri yer istenmeyen un programlanmış hücresel malzeme ayrıcılıklarına olan yol açar. Müstakil doku kısmen bırakarak bir steril pipet ucu ve tamamen manuel seçim akıntı yönünde önemli ölçüde basitleştirme pluripotent kolonileri arkasında, kullanarak kolayca atılır.

Tam olarak programlanmış kolonileri el ile çekilmeye görüntüleme sistemi, güvenlik kabini veren, hava akımı rahatsız herhangi bir parça dışarı çıkıntılı eksik bir LCD ekranı kullanın. Malzeme çekme kendisi-ebilmek var olmak kılınmak düzenli Pipetler kullanarak gibi bu görüntüleme sistemi dışında hiçbir özel ekipman gereklidir. Çekilen kolonileri kısmen klonlar büyümeye hedef kuyu içine kaplama önce EDTA/PBS çözümde ayrışmış. Bağlı olarak satır ve çeşitli pasajlar için klon kültürler kendiliğinden hücreleri ile ayırt edilemez. El ile işleme ve seri passaging genellikle bu sorunu ortadan kaldırmak. Geniş farklılaşma ile delik deşik klonlar atılmalıdır, ancak, değerli klonlar başarı değişik derecelerde ile hücreleri ayırt atılması yerine pluripotent kolonileri toplama tekrarlanan el kitabı aracılığıyla kurtarılabilir. Episomal plazmid tamamen IPSC²⁶kaybolmasına yaklaşık 15 pasajlar almak gösterilmiştir. Bu nedenle, bu klonlar için en az o kadar sayıda pasajlar aşağı akım uygulamaları ve analizleri TRA antijen ifade ve karyotip rutin kontrolü dışında için kullanmadan önce büyümeye izin vermek için tavsiye edilir. TRA antijen ifade kolayca Akış Sitometresi tarafından beri tahlil sadece 200,000 hücrelerin gerekli ve araştırmacılar olup kültürlü klonlar bakımı konusunda herhangi bir şüpheniz olduğunda gerçekleştirilen iletişim kuralında, burada açıklandığı şekilde izlenebilir Pluripotent düzgün. Akış Sitometresi Analizi ESC marker ifade pluripotency aday hatları¹⁹onaylamak için yeterli sayılır.

Teratoma oluşumu tahlil standart kesin pluripotency test²⁷yaşında. Kimyasal olarak tanımlanan, xeno-Alerjik koşullarında yetiştirilen PSC özellikle duyarlı ayrılma kaynaklı ölüm ve bu nedenle, onları subkutan kümeleri enjekte onların başarılı implantasyonu^8,28için gerekli. Enjeksiyonu, genellikle 4-6 hafta görünür olmasını xeno Greftler büyümesi için yeterlidir ve 8 hafta önce tüm olabilir hasat, H & E lekeli ve analiz. Hayvan refahı, maliyet ve uzun gereken dönem test alternatif yöntemler geliştirmek için nedenleri vardır. Genomik analizleri ile gelişmiş birlikte, makine öğrenme-yeti bioinformatic Yaklaşımlar küresel ifade profilleri doğru değerlendirilmesi sağlayabilir. Bu tür veri elde etme maliyeti teratoma oluşumu tahlil maliyet için karşılaştırılabilir olduğunu, ancak, genomik yaklaşım hızlıdır ve hiçbir hayvan kullanılması gerekir. Bu tür bir tahlil bioinformatic pluripotency değerlendirme yazılım²²yaşında. Online bir arayüz (Tablo reçetesi) uygulanır. Artan popülaritesi ve RNA sıralama düşen maliyeti bu yaklaşım sürekliliğini sağlamak. Bu Pluripotent yazılım bir alternatif Johns Hopkins Üniversitesi²³ (cellnet.hms.harvard.edu) mevcuttur ve benzer bir yaklaşım üzerinde temel alır ve insan örnekleri transcriptome analiz etmek Mikroarray veri kabul edebilir. Bu yazılım sadece pluripotent kök hücreler tanımlama yeteneği vardır ama aynı zamanda hücreleri ayrıştırılan ve küratörlüğünü, veri beri birincil dokular, yetiştirilen In vitro hücre arasındaki benzerliği düzeyini elde edilmiştir ki, avantajdır / doku ve ın-vivo doku farklılaşması protokolleri veya doku Mühendisliği gelişimi için mükemmel bir kalite kontrol sağlayan belirlenebilir. Test sorguları 20 farklı hücre-doku türleri sınıflandırmak için kapasitesine sahiptir. Şu anda, bu Mikroarray veri gerektirir ancak yazarlar için RNA platformu seçenekleri genişletilmesi doğru çalışan de sıralama.

Sunulan iletişim kuralı takip ederek, araştırmacılar IPSC satırları amniyotik sıvı ve membran kök hücrelerden tamamen kimyasal olarak tanımlanmış ve xeno-Alerjik orta ve bir sigara entegre programlama yöntemi kullanarak çok yüksek bir tekrarlanabilirlik ile oluşturabilirsiniz. Bu satırları temel araştırma farklılaşma protokolleri optimize etmek ve sonuçta çalışmalar Mühendislik eleme veya Pediatrik doku hastalığı modellemede ilaç kullanılabilir.

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Bu eser Fonds Medizinische Forschung Zürih Üniversitesi, Forschungskredit Zürih Üniversitesi, SCIEX NMS^Ch altında Arkadaş grupları 10.216 ve 12.176, Swiss, Kardiyoloji Derneği, İsviçre Ulusal Bilim tarafından desteklenmiştir Kuruluşu'nun altında Grant [320030-122273] ve [310030-143992], 7. çerçeve programı, hayat Vana, Grant [242008], Olga Mayenfisch Vakfı, EMDO Vakfı, Zürih Üniversitesi Hastanesi açılış hibe 2012 Avrupa Komisyonu ve iç Mitchell Kanser Enstitüsü finansman.