Перепрограммирование первичной амниотической жидкости и мембраны клеток для плюрипотентности в условиях Xeno бесплатно

Этот протокол описывает перепрограммирования первичных амниотической жидкости и мембраны мезенхимальных стволовых клеток в индуцированных плюрипотентных стволовых клеток с использованием-интеграция episomal подход в полной мере химически определенных условий. Описаны процедуры извлечения, культуры, перепрограммирования и характеристика результате индуцированных плюрипотентных стволовых клеток жесткими методами.

Аутологичные клетки терапии получил на шаг ближе к реальности с введением индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Фетальных стволовых клеток, например, амниотической жидкости и мембраны мезенхимальных стволовых клеток, представляют собой уникальный тип недифференцированных клеток с обещанием в тканевой инженерии и для перепрограммирования в iPSC для будущих мероприятий педиатрических и банковских стволовых клеток. Протокола, представленные здесь описывает оптимизированная процедура для извлечения и культивирования первичных амниотической жидкости и мембраны мезенхимальных стволовых клеток и генерации episomal индуцированных плюрипотентных стволовых клеток из этих клеток в полностью химически определенной культуры условия использования человеческого рекомбинантного vitronectin и среднего E8. Характеристика новых линий, применяя строгие методы – проточной цитометрии, конфокальная томография, тератома формирования и транскрипционный анализ профиля – также описал. Вновь созданный линии Экспресс маркеры эмбриональных стволовых клеток – Oct3/4A, Nanog, Sox2, TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-4 – при отрицательной для маркера SSEA-1. Линий стволовых клеток образуют тератомы ТКИД бежевый мышей в 6-8 недель и тератомы содержат представителя всех трех зародышевых тканей. Транскрипционный анализ профиля линий, представив глобальное выражение microarray данных алгоритм оценки плюрипотентности bioinformatic считаются все линии плюрипотентных и таким образом, этот подход является привлекательной альтернативой для животных тестирования. Новые линии iPSC легко может использоваться в нижнем течении экспериментов, связанных с оптимизации дифференциации и тканевой инженерии.

Технология индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) приносит потенциал клеточной терапии замены, болезни и развития моделирования и наркотиков и токсикологические скрининг^1,2,3. Терапии концептуально может быть достигнуто путем инъекции клеток, in vitro продифференцировано имплантации ткани (например, сердечный патчи), или руководствуясь регенерации с помощью тканевой инженерии. Амниотической жидкости (Канадские) и мембраны стволовых клеток (АМСГ) являются отличным источником клеток для этих мероприятий либо непосредственно^4,5,6,7 или в качестве начальной популяции клеток для перепрограммирования в плюрипотентности^8,9,10,,1112.

Ранних подходов используется неопределенный культуры систем или перепрограммирования методы, которые требуют предусматривать геномной интеграции конструкции^9,10,,1112. Более недавние исследования занятых xeno свободной среде, хотя менее определенной матрицы вложение базальной мембраны (BMM) был использован, для создания iPSC от амниотической жидкости эпителиальных клеток. Однако пробирного формирования тератома не был включен в исследование наряду с богатством in vitro и молекулярных данных. Амниотической жидкости эпителиальные клетки были обнаружены примерно пищеводный перепрограммирования большую эффективность по сравнению с новорожденным фибробластов¹³. В другом исследовании мезенхимальные стволовые клетки амниотической жидкости были также признаны быть перепрограммированы в iPSC с гораздо более высокой эффективности¹².

Плюрипотентных стволовых клеток могут быть дифференцированы в тканях представитель всех 3 зародышевых и таким образом имеют широкий потенциал. Педиатрических больных выиграют от уборки, перепрограммирования и тканевая инженерия их аутологичные стволовые клетки амниотической жидкости пренатально и амниотической мембраны стволовых клеток перинатально. Кроме того относительно низкий уровень дифференциации фетальных стволовых клеток (ниже, чем взрослые стволовые клетки^14,15) теоретически могут помочь в решении наблюдается сохранение эпигеномные предвзятости из исходных ячеек в iPSC¹⁶.

Здесь мы представляем собой протокол для перепрограммирования амниотической жидкости и мембраны стволовых клеток для плюрипотентности в химически определены xeno бесплатно E8 среднего рекомбинантных vitronectin¹⁷ (СТС) с помощью episomal плазмид¹⁸. Основным преимуществом амниотической жидкости и мембраны клеток как источник клеток для перепрограммирования заключается в их наличие предварительной и перинатально и таким образом этот подход будет главным образом пользу исследования в педиатрических тканевой инженерии.

Протокол следует организационные руководящие принципы Комитета по этике для исследований человеческого. Для использования амниотической жидкости для исследований было получено письменного согласия пациента.

Этот протокол следует политике использования комитета университета Южной Алабамы и институциональный уход животных.

1. изоляция и культуре первичных амниотической мезенхимальных стволовых клеток

1. Обшивка амниотической жидкости клеток
   1. Получите как минимум 2,5 мл амниотической жидкости, найденным в процессе амниоцентез врачом.
      Примечание: Все обработки живых клеток и тканей должны быть выполнены в кабинете стерильные культуры ткани и надлежащего личного защитного оборудования должны быть использованы. Знакомство с основными клеточной культуры и стерилизации не требуется.
   2. Подготовить амниотической жидкости и мембраны клеток (AFMC) культуры среднего: базальной средний EBM-2, 15% плода бычьим сывороточным (ФБС), 20 нг/мл bFGF, 25 нг/мл EGF, 10 нг/мл IGF. Для культуры первичной амниотической жидкости, а также амниотической мембраны стволовых клеток носитель следует дополнить антибиотик противогрибковое решения.
   3. В день 0 Смешайте 2,5 мл амниотической жидкости с 3,5 мл AFMC питательной среды и пластины в T25 колбу. Инкубируйте на 37 ° C и 5% CO₂ в течение по крайней мере 48 часов спокойно до проверки на наличие колоний.
   4. На 5 день должен присутствовать колоний адэрентных клеток. Встряхните флакон выбить клетки, которые не в полной мере придерживаться нижней и мусора и вакуум аспирата отработанного среднего/амниотической жидкости смеси с помощью пипетки Пастера. Замените с 5 мл свежего AFMC среды.
   5. Культура для еще 5 дней. Изменение среднего каждый день, как описано в шаге 1.1.4.
2. Изоляция первичного мезенхимальных стволовых клеток из человека амнион
   1. Получите как можно скорее после рождения, в течение 24 часов на самой последней, чтобы максимизировать сотовой целостности плаценты. Вырезать 9 см² сегмент амнион, удаления сгустков крови и мойте в 50 мл пластиковых пробирок с PBS, дополнена антибиотик противогрибковое решение по 30 мл.
   2. Фарш мембраны, используя пару скальпелей до изысканных штук в стерильные 10 см ткани культуры блюдо. Пищеварение мембраны и извлечение клеток будет достигаться с помощью системы диссоциации ткани. Следуйте производителя протокол.
      Примечание: тонкие кусочки ткани после измельчения, тем выше число клеток оправился после переваривания.
   3. Передача массы ткани фарш мембраны, с помощью лезвия скальпеля в трубу диссоциации одной ткани и смешать с 4,7 мл среды RPMI 1640. Смешайте в диссоциации ферменты (см. Таблицу материалы).
   4. Подключить трубы на ткани диссоциатором и запустить программу «h_tumor_01». Инкубируйте трубы при 37 ° C на качающейся платформе для 30 мин.
   5. Далее, разбавленных суспензиях с 35 мл RPMI 1640 и применить к стрейнер 70 мкм, помещенном над 50 мл Коллекция пластиковых пробирок.
   6. Центрифуги для 5 минут при 200 x g при комнатной температуре, удалить супернатант, Ресуспензируйте гранулы в 5 мл RPMI 1640, подсчитать количество ячеек с помощью hemacytometer и пластина на плотность 10 000 клеток/см² в культуре ткани лечение сосудов с свежезаваренным подготовлен AFMC средний дополнена антибиотик противогрибковое решения.
      Примечание: В случае неполной пищеварение, небольшие кусочки ткани будет присутствовать и отдельные ячейки будет мало. Спин вниз снова и пластины весь Пелле в одном T75 колбу.
3. Культура первичный Страхователь и АМСГ
   1. Проход колоний AFSC/АМСГ, вакуум аспирационных провел средних с помощью пипетки Пастера и добавление 2 мл клеток отряд фермента в колбу. Инкубируйте при 37 ° C за 5-8 мин.
   2. Нажмите на колбу помочь выбить клетки и смешать подвеска с равным объемом AFMC среды (антибиотик противогрибковое дополнение не должно быть необходимо с этого момента). Центрифуга на 200 г на 4-5 мин удалить супернатант, используя либо стеклянная пипетка Пастера, или просто путем переворачивать трубки и опорожнения его в контейнер для отходов.
   3. Проведите в нижней части пластиковых пробирок разбить Пелле в одну ячейку подвеска в оставшиеся капли жидкости и смешать с AFMC средством для обшивки. Плита в T-колбы на плотности между 2 500 и 5000 клеток/см².
   4. Изменение среднего каждый день. Не культура клеточных линий после прохода 6. Для перепрограммирования целей, используйте как низкий проход максимально.
   5. Готовить замороженные запасы AFSC и АМСГ как ИБП back-ups с использованием замораживания средств. Урожай культур с использованием клеток отряд фермента, центрифуги на 200 г на 4 ° C за 5 мин.
   6. Удалите с помощью пипетки Пастера супернатант и Флик в нижней части трубки множественном числе ячеек в гранулы. Ресуспензируйте в полное замораживание среднего на плотности 1 × 106/мл и Алиготе в криопробирки. Хранить в контейнере замораживания на ночь на-80 ° C. Затем переходите к жидким азотом для длительного хранения.

2. перепрограммирование в плюрипотентность

1. Получить перепрограммирования плазмиды
   1. Приобрести перепрограммирования плазмид через репозиторий некоммерческой плазмиды. Соглашение о передаче материала необходима.
   2. Превратить плазмид в E. Coli сведущие клетки и изолировать плазмид, используя набор для извлечения коммерческих плазмиды. Следуйте инструкциям производителя.
   3. Измерьте концентрацию плазмидной ДНК с помощью спектрофотометра. Цель для высокой концентрации результате плазмида, идеально около 1 мкг/мкл, чтобы избежать разбавления образца во время transfection.
   4. Измерять концентрации индивидуальных плазмиды, с помощью УФ спектрофотометр и Алиготе их индивидуально.
   5. Смешайте 3 мкг, 3 мкг и 2 мкг, EN2K, ET2K и M2L плазмид, соответственно. Это решение перепрограммирования плазмиды. Количество раствора, плазмида достаточно, чтобы transfect 1 x 10⁶ клеток. Подготовьте несколько таких аликвоты.
   6. Хранить все аликвоты-80 ° c.
2. Подготовить целевой культуры пластин
   1. Покрыть один 6-ну пластину с vitronectin – добавьте 1 mL vitronectin буфера для разведения в каждой скважине и смешайте 40 мкл ВТН Стоковый раствор (1 мкг/см²). Оставьте при комнатной температуре (RT) или в инкубаторе при 37 ° C за 1 час.
   2. Вакуум аспирата решения с помощью пипетки Пастера и заменить 2 мл AFMC среды в каждой скважине. Хранить при 37 ° C, до тех пор, пока клетки должны быть покрытием.
      Примечание: Важно: средний AFMC, используемые на этом шаге не должен содержать любой антибиотик или противогрибковое решения.
3. Урожай культивированный первичный Страхователь/AMSC
   Примечание: Расширьте AFSC/АМСГ в культуре достаточно, чтобы замороженные запасы на ряд низкий проход и посвятить один T-75 Фляга для перепрограммирования. С как несколько 100000 клеток являются достаточными для эксперимента, направлены на сбор около 500000 клеток для компенсации потерь, и если оптимизации параметров трансфекции или различные культуры условий должны испытываться.
   1. При первой возможности на низкий проход урожай Канадские/AMSC с использованием клеток отряд фермент смесь, как описано в шаге 1.3.1 для 1.3.2. После того, как клетки были центрифугируется, переходите к следующему шагу.
   2. Ресуспензируйте Пелле в 1 мл PBS и перемешать хорошо мыть компоненты сыворотки. Подсчет количества ячеек с помощью hemacytometer. Отрегулируйте плотность клеток до 100000/мл PBS и Алиготе в 1,5 мл пробирок microcentrifuge. Это обеспечивает только минимальное время контакта между ячейками и буфер, используемый для transfection.
   3. Место пробки microcentrifuge поверх 5 мл полистирола трубы (как адаптеры, позволит центрифугирования в очередной качели ротора) и центрифуги на 200 x g 4 мин при комнатной температуре. Инвертировать трубы и удалить супернатант в контейнер для отходов. Не используйте фиксированный угол ротора.
   4. Выполните дополнительные центрифугирования шаг на 200 x g 3 мин при комнатной температуре. Это позволит остальная жидкость от стен трубки собирать внизу. Тщательно удалить все это с помощью пипетки 200 мкл.
4. Трансфекция с перепрограммирование плазмиды
   1. Для перепрограммирования эксперименты, системы трансфекции (см. Таблицу материалы) будет использоваться для доставки перепрограммирования плазмид в клетки. Место трансфекции советы, transfection трубы, ресуспендирования буфер и электролитический буфера в кабинет министров культуры ткани. Комплект реагентов хранятся в РТ, до тех пор, пока они открыты, то они хранятся при 4 ° C.
      Примечание: Мы используем 10 мкл версию комплекта.
   2. Переместите устройство трансфекции закрыть таким образом, чтобы его станция метро могут быть размещены непосредственно в кабинете. Заполнить один трансфекции трубки с 3 мл электролитический буфера и подключить трубку в станцию, нажав все пути внутри гнезда.
   3. Возьмите перепрограммирования плазмида решение аликвоты, подготовленную на этапе 2.1.5 из-80 ° C для хранения и позволяют им оттепель в РТ в культуре кабинета.
   4. Трансфекция устройства, выберите следующие параметры трансфекции: 950 V, 40 мс и 1 импульса.
   5. Ресуспензируйте гранулы, содержащие 100000 клеток в 10 мкл буфера ресуспендирования. Работать быстро с этого момента на так как буфер ресуспендирования Слаботоксичные и увеличение Выдержка приводит заметно ниже жизнеспособность клеток.
   6. Смешайте в 1/10 перепрограммирования плазмида решения (решения аликвота был подготовлен для в общей сложности 1 х 10⁶ клеток).
   7. Смонтируйте трансфекции наконечник на трансфекции пипеткой.
   8. Аспирационная суспензию клеток в трансфекции наконечник осторожно, избегая образования пузырьков воздуха. Если наблюдаются пузырьки, высылать подвеска и повторите стремление. Пузырьки воздуха будет препятствовать transfection.
   9. Вставьте трансфекции пипетку в трансфекции трубку и нажмите кнопку «Пуск» на экране устройства transfection. Подождите на экране сообщение, информирующее об успехе трансфекции и немедленно выньте дозатор из трубки.
   10. Высылать подвеска в 1 хорошо подготовленных в разделе 2.2 пластины 6-ну целевой. Смешайте в средне-и от соседних хорошо и равномерно подвеска в обеих скважин (результате плотность ячеек будет 50000/хорошо).
   11. Повторите трансфекции для всех microcentrifuge пробирки, содержащие AFSC/AMSC индивидуально. Место пластину в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO₂.
5. Культура transfected AFSC/AMSC
   1. Культура transfected клеток для 2-5 дней. Затем переключиться на перепрограммирования среднего, состоящий из E8, дополняется 100 мкм натрия бутират в день 3.
      Примечание: Среднее прохождение может выполняться избежать разрастание источника AFSC/АМСГ. Однако пассированый будет отключить параметр правильно рассчитать перепрограммирования эффективности, если этот параметр имеет интерес.
   2. Измените перепрограммирования среднего каждый день на каждый день в течение 10 дней. Изменение среднего каждый день от дня 10.
6. Ручной сбор полностью reprogramed колоний клоновых расширения
   1. Полностью перепрограммировать колонии появляются вокруг дней 14. Разрешить колоний расширить размер и стать компактным. Они могут вручную собраны и переданы свежие пластины как день 15-16.
   2. 1 час до процедуры подбора, пальто 24-ну пластины с 8 мкл ВТН в 300 мкл буфера для разведения vitronectin за хорошо (1 мкг/см²) и Инкубируйте на RT или 37 ° C. Замените E8 среднего без натрия бутират решение.
   3. В стерильные культуры кабинета выберите колоний достаточного размера (в идеале более 400 мкм в диаметре). Этап микроскопа контраст или стереомикроскопом может использоваться.
   4. Для комплектации, LCD изображения микроскопа, помещены в кабинете будет использоваться так, как его монитор устраняет необходимость для окуляров. Стерилизуйте микроскопа с 70% этиловом спирте.
   5. С помощью микроскопа культуры клеток очередной этап контраст, выберите, Марк и обратите внимание на количество колоний быть собраны. Это важно, чтобы убедиться, что время не зря этот процесс во время фактической комплектации.
   6. Заполните количество трубок ПЦР, является равным или больше, чем количество колоний выдаются с 30 мкл 0,5 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) в PBS. Колонии будут помещены в эти трубы для частичного диссоциации перед обшивкой.
   7. План выбрать 5 колоний в то время из плит с помощью пипетки 10 мкл, равным 2 мкл. удерживая наконечник пипетки на угол на краю колонии и осторожно и постепенно скрести всей колонии от поверхности. Немедленно аспирационная всей колонии в наконечник пипетки и перевести его в одной из подготовленных ПЦР пробирки с ЭДТА.
   8. Повторите с оставшихся 4 колоний. Инкубируйте на RT для 4-6 мин.
   9. Накапайте подвески вверх и вниз, осторожно с помощью больше кончика пипетки с распадаются в колонии на небольшие сгустки. Избегайте создания отдельной ячейки подвеска.
   10. Пластина подвески прямо в цель хорошо 24-ну пластины, подготовленную на этапе 2.6.2. Повторите с оставшихся колоний.
   11. Повторите шаги 2.6.6 через 2.6.10, если больше чем 5 колоний должны быть собраны, но не выбрать более 5 колоний на один раз. Инкубируйте на 37 ° C и 5% CO₂.
7. Клоновых расширения и созревания iPSC
   1. Разрешить колоний расти и стать компактным. 3-6 дней, достаточно. Изменение культуры среднего ежедневно. Используйте между 400 мкл и 1 мл среды E8, основанный на плотность клеток.
   2. Уэллс 24-ну пластины с достаточной плотностью колонии будет расширена в 6-ну пластины. 1 ч до пассированый, покройте 6-ну пластины с СТС (как в шаге 2.2.1). Затем замените раствора в скважине 2 мл среды E8 в колодец.
   3. Аспирационная отработанного среднего от источника скважин с помощью пипетки 1 мл и замените 300 мкл 0,5 мм ЭДТА мыть. Аспирационная немедленно с помощью же наконечник пипетки и заменить с 300 мкл 0,5 мм ЭДТА снова, а затем Инкубируйте на RT на 5 мин аспирационная все жидкости с помощью пипетки 1 мл.
   4. Установите дозатор 1 мл емкость, смонтировать широкий родила подсказка 1 мл на нем и аспирационная E8 среднего из целевого объекта и в кончик. Смыть культуры iPSC исходного потока среды.
   5. Перенесите подвеска в цель хорошо и пипетки вверх и вниз несколько раз, чтобы разрушить колоний в сгустки 20-50 клеток. Убедитесь, что они получают распределены равномерно в колодец нежный качания и покачивая пластину и Инкубируйте на 37 ° C и 5% CO₂.
   6. Изменение среднего ежедневно и проход каждые 3 до 4 дней. Любые дифференцирования колоний может быть отмечен под микроскопом фазово контрастной и удаляется с помощью кончика пипетки в культуре кабинета. Это позволяет для выборочного распространения культуры чистого iPSC высокого качества.
   7. 1 ч до пассированый, пальто скважин 6-ну пластины с ВТН как шаг 2.2.1. Затем замените решение 2 мл среды E8 в колодец.
   8. Рутинной пассированый похож на первоначальный пассированый делается с помощью 0,5 мм ЭДТА (шаги 2.7.2 в 2.7.5). Замените отработанного среднего в одной скважине 6-ну плиты с 1 мл раствора ЭДТА мыть и отбросить.
   9. Добавьте 1 mL ЭДТА и Инкубируйте на RT на 5-7 мин для частичной диссоциации. Оптимизировать время инкубации при необходимости, убедившись, что приостановление вокруг 20-50-клеток сгустки производится. Избегайте диссоциации в одиночных камерах.
   10. Отменить решение ЭДТА и аспирационная 1 мл E8 среды с помощью пипетки 1 мл из целевого объекта в наконечник пипетки широкий родила.
   11. Смыть источник iPSC культуры с потоком среды E8 неоднократно до тех пор, пока желаемый часть его был освобожден от поверхности и передачи в цель хорошо. Эта часть представляет собой соотношение Сплит (например, 1/8 культуры могут быть переданы на соотношение 1:8.)
   12. Проход каждые 3-4 дня. Позволяют iPSC линии зрелым путем культивирования их для по крайней мере 15 ходов перед их использованием в нижнем течении эксперименты

3. характеристика и подтверждения плюрипотентность

Примечание: Обратитесь к дополнительные файлы для деталей проточной цитометрии и confocal микроскопии.

1. Тератома формирования пробирного
   1. Для определения способности iPSC дифференцироваться в тканях представителей всех трех зародышевых путем формирования пробирного тератома, следуйте институциональной политики в отношении ухода за животными и использование, планирование впереди дать время для подачи соответствующий протокол документы. Тератома формирования в мышах займет от 6-10 недель.
   2. Культура 4 скважины 6-ну плиты в iPSC линию на 4 дня. Приблизительное количество клеток, вводят в один фланг мыши — 0,5 до 1 x 10⁶ клеток. Опционально: дополнительный хорошо может быть посвящен определение представителя ячейки номер в хорошо посредством диссоциации одной ячейки с энзимом отряд клетки и подсчета голосов.
   3. Рассчитать объем смеси E8/BMM iPSC сгустки будет приостановлено в: оба фланки мыши вводят, каждый с 150 мкл суспензии комок. Три мыши достаточно для тестирования тератома формирования одной линии iPSC. Включите дополнительно 150 мкл на иглу в результате тома, чтобы компенсировать потерю мертвого объема. используется 1 игла на мышь. Общий объем-таким образом 3 * (150 мкл * 2 + 150 мкл) = 1350 мкл
   4. Частично отделить iPSC колоний с ЭДТА, как если бы они должны были быть пассированной, как описано в шагах 2.7.8 для 2.7.10. Важно, что в колонии быть отделен в кусты и не разделены на отдельные клетки.
   5. Смывают iPSC колоний с 675 мкл среды E8 (половина вычислительного объема от шага 3.3.3), используя широкий родила подсказка. Передача подвеска комок в 5 мл трубку из полистирола. Место на льду.
   6. Объединить с 675 мкл BMM. Сохранить полученный подвеска на льду до инъекции.
   7. Анестезировать мышей, чтобы парализовать их с помощью изофлюрановая. Это следует выполнить или руководствуясь квалифицированным персоналом виварий.
   8. Вихревой полистирола 5 мл трубки кратко и аспирационная комок подвеска (450 мкл на мышь) в один инсулин шприц с иглой 22 G. Придать 150 мкл суспензии клеток подкожно. Этот том содержит приблизительно 1 х 10⁶ клеток (см. шаг 3.1.2).
   9. Придать 3 мыши на линию iPSC. Следуйте практике надлежащего ухода за животными для всех процедур.
   10. Следить за здоровьем мышей ежедневно.
   11. Когда тератомы достигают конечной точки диаметром 1,5-2 см, усыпить мышей, explant тератомы и хранить их в растворе формалина для фиксации ткани за 24 ч.
   12. Принести фиксированным тератомы механизма основные гистология гематоксилином (H & E) эозином. Патологоанатом будет класс наличие тканей всех трех зародышевых.
       Примечание для Karyotyping: живой iPSC культур должны быть отправлены в специализированных цитогенетических лаборатории для тестирования целостности кариотипа. Рекомендуется, что это тестирование выполняется каждые 5 проходов.
2. Транскрипционный анализ профиля
   1. Культура 2 скважин 6-ну плиты для 3-4 дней, чтобы получить один образец РНК. Используйте только высококачественные культур, мелкие загрязнения с дифференциации клеток могут быть решены путем соскабливания их с помощью кончика пипетки.
   2. Изолируйте РНК от iPSC культур, использование коммерчески доступных комплект после производителя протокол. Отправляем образцы в учреждение специализированных геномной ядро.
   3. Получения глобальной transcriptional профили линий iPSC, используя microarrays (см. Таблицу материалы для поддерживаемых вариантов) или РНК последовательности.
   4. Отправьте файлы «*.idat» для оценки bioinformatic плюрипотентности через веб-интерфейс в институте Coriell. В качестве альтернативы, представить «* .cel» файлы для bioinformatic идентификации типа клеток, включая плюрипотентных стволовых клеток, через веб-интерфейс при Университете Джонса Хопкинса. Смотрите Таблицу материалы сведений о типах данных отдельных bioinformatic анализы согласиться.

Обоснованное письменное согласие было получено от пациентов до уборки амниотической жидкости для генетического тестирования и посвятить небольшой Алиготе жидкости для исследования. Согласие не требуется для использования амниотической мембраны в исследованиях как плацента представляет медицинские отходы. Амниотическая жидкость и мембраны стволовые клетки отображения типичных свойств мезенхимальных, морфологически их клетки веретеновидной формы и ярко фаза. После перепрограммирования, клетки проходят мезенхимальных в эпителиальных (МЭТ) перехода и приобрести булыжник как морфология и пространственной организации колоний, указывающее эпителиальных свойства. Этот процесс инициируется 48-72 ч после введения перепрограммирования episomal плазмид в кратчайшие сроки. Отсутствие этих колоний на 5 день перепрограммирования будет означать провал эксперимента. Клетки колонии ВСТРЕТИЛ размножаются и в результате колонии становятся компактные, между 5 и 14 день. Компактный колонии ВСТРЕТИЛ состоят из клеток, которые не являются легко индивидуально ощутимое (рис. 1A). На вокруг дней 14, полностью перепрограммировать колонии появляются с клеток, расположенных в монослое, перевозящих видно, легко различающимися ядер и ядрышками. Они готовы быть механически изолированы и расширена когда колонии достичь подходящего размера и стать компактная (рис. 1B).

Полностью и частично перепрограммировать колоний присутствуют в культурах на протяжении всего периода перепрограммирования, хотя частично перепрограммировать колоний не обязательно приобретать полный плюрипотентности. Рисунок 2 показывает, представитель потока гранулярных анализ экспрессии маркера эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) в полностью и частично плюрипотентных колоний и их соответствующие морфологии. Полное плюрипотентности ассоциируется с выражением Oct4, Nanog, Sox2, TRA антигены и SSEA-4, хотя SSEA-1 выражение является отрицательным^19,20,21 (рис. 2A). Частично плюрипотентных клеток, однако, не выразить Nanog и TRA антигены²⁰ (рис. 2B). Выражение и локализации ESC маркеры должны быть подтверждены иммуноцитохимическое окрашивание и образы, используя широкий поле или конфокального микроскопа (рис. 3).

Функциональные подтверждения плюрипотентности достигается путем демонстрации способности линий iPSC формы тератомы после подкожной инъекции клеток в ТКИД бежевый мышей. 6-8 недель требуются для тератомы достичь конечного размера. H & E окрашивания тканей и экспертизы патологоанатом затем выполняется подтвердить присутствие представителя тканей всех трех зародышевых – neuroectoderm, энтодермы и мезодермы (рис. 4A). Альтернативой тестирование на животных является анализировать транскрипционный анализ подпись, связанную с плюрипотентности геномной подходы как cDNA microarrays^22,23. Доля транскрипционный анализ профиля, что совпадает с одним из бассейна устоявшихся iPSC и ESC линии может быть определена количественно затем онлайн bioinformatic плюрипотентности оценки программного обеспечения в виде участка двух классификаторов – плюрипотентности и Новинка (рис. 4В). Чем выше показатель плюрипотентности, больше запросов iPSC линии напоминает созданы линии. Оценка высокая новизны, однако, может означать отклонения или даже хромосомных аберраций, несмотря на высокий плюрипотентности Оценка (например, teratocarcinoma линии)²². Все линии iPSC, генерируемых протоколом, представленные здесь были сочтены плюрипотентных проточной цитометрии, визуализации, формирования тератома и transcriptional анализа методов.

Рисунок 1: морфологические прогрессирование клетки во время перепрограммирования. (A) амниотической жидкости и мембраны стволовых клеток, которые представляют собой источник клеток для перепрограммирования, отображение типичный мезенхимальных морфологии, удлиненные и ярко фаза (слева) до тех пор, пока они проходят мезенхимальных в эпителиальных переход (МЭТ) который приводит к приобретению эпителиальных свойств и формирование колоний с булыжника камень подобных клеток (в центре). Эти колонии размножаться и создать нерегулярных клеточной массы ВСТРЕТИЛ клеток (справа). (B) на более поздних этапах перепрограммирования (начиная от вокруг дней 14), колонии полностью перепрограммировать клетки появляются – индивидуально заметные клетки с выдающихся ядрами и ядрышек в монослои, с четко определенными границами (центр) – и настоящее время наряду с MET колоний, которые являются более многочисленными (слева). Полностью перепрограммировать изолированных Зрелые клон изображен справа. Шкалы бар = 100 мкм пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: поток гранулярных анализ экспрессии маркеров ESC в полностью и частично (МЭТ) перепрограммировать клетки колонии. (A) профиль плюрипотентных выражение является положительным для Oct4, Nanog, Sox2, TRA-1-60, TRA-1-81 и SSEA-4, в то время как негативные SSEA-1. (B) частично плюрипотентных клеток колонии, – те, которые прошли встретились, но не прогрессировали в полной плюрипотентности – являются позитивными для Oct4 и Sox2, но Nanog, TRA и SSEA антигены отсутствуют. Связанные морфологии включены бок о бок сравнения. Масштаб баров = 200 мкм и 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: Confocal изображений анализ экспрессии маркеров ESC в зрелых амниотической жидкости iPSC. Факторы транскрипции Oct3/4A, Nanog и Sox2 локализованы в ядрах при TRA и SSEA антигены являются гликопротеинами, локализованных на мембране. Шкалы бар = 50 µm. изображения большего масштаба (слияния 2 X) были включены в Oct3/4, Nanog и Sox2 для лучшей визуализации их ядерной локализации. Шкалы бар = 25 µm. половым – изображения, полученные на пропускаемого света. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4: формирование тератома и транскрипционный анализ профиля в зрелых амниотической жидкости и мембраны iPSC. (A) тератомы, выращенных в ТКИД бежевый мышей подкожно содержат тканях представителей всех трех зародышевых (100 крат). (B) профили microarray глобальные выражения представлены онлайн плюрипотентности программное обеспечение возвращается участок двух классификаторов – плюрипотентности и новизна. Высокая плюрипотентности баллы и низкой новизна баллы - красный облако - выражение профиль типичного ESC/iPSC линии. Синий облако представляет собой кластер зону для дифференцированных клеток, в то время как слабый синий облако представляет область кластера для частично плюрипотентных клеток. Амниотическая жидкость (3 линии) и мембранные (4 линии) iPSC были сочтены плюрипотентных теста. ESC линии WA25 был включен в качестве элемента управления и определяется здесь с черной стрелкой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Первоначальный этап формирования iPSC из фетальных стволовых клеток влечет за собой извлечение исходных ячеек из фетальных тканей, их культуры, расширение и внедрение episomal перепрограммирования плазмид. Этот этап следует период культуры около 14-18 дней до первого полностью перепрограммировать колонии может быть расширена. Заключительный этап является созревания iPSC клонов. Первоначальное извлечение амниотической мембраны стволовых клеток достигается с помощью комбинированных механических и ферментативного пищеварения амнион. Мы нашли, что это время инкубации 30 мин привело наибольшее количество клеток, извлеченные с высокой жизнеспособности. Пищеварение процедура может производить небольшие кусочки тканей и клеток сгустки. Если высок процент этих относительно одной клетки, мы рекомендуем, покрытие все кусты и одиночных клеток в один сосуд, так как все может способствовать наросты адэрентных клеток. Покрытие амниотической жидкости стволовых клеток является простым, как клетки только смешиваются с питательной среды и инкубировали пока колоний адэрентных клеток достичь достаточного размера. Регулярное лечение культуры ткани пластик идеально подходит, и мы не рекомендуем специальности поверхности, даже несмотря на то, что они предназначены для улучшения первичной клеточной культуры, так как с ним мы наблюдали ниже жизнеспособность и трудности с пассированый процесс.

Амниотическая жидкость и мембраны стволовые клетки должен быть расширен и запасах заморожены, но, скорее, клетки может использоваться как источник клеток для перепрограммирования. С целью введения episomal плазмид в клетки, системы трансфекции, здесь используется с параметрами трансфекции, равным 950 V, 40 мс и 1 импульса очень хорошо, со всеми линиями попытка в конечном счете успешно перепрограммировать ( более 10 строк). Основные конкурирующие системы доставки, работающих на аналогичный принцип не производят успешного перепрограммирования эксперимент в наших руках.

Transfected клеток являются семенами на vitronectin покрытием блюда в AFMC среде для первых 3-5 дней, затем средний переключается E8, дополняется 100 мкм натрия бутират. Это значительно увеличивает скорость полного плюрипотентности приобретения. Первые признаки морфологических трансформации может рассматриваться как 48-72 ч. Источник клетки претерпевают встретились и колоний клеток эпителия морфология появляются. Эти постепенно распространяться и стать компактным. Подмножество колоний приобретут морфологические особенности полностью плюрипотентных стволовых клеток – индивидуально заметные с выдающихся ядер и ядрышек, плоских колониях с четко определенными границами, в отличие от нечеткие границы наблюдается в частично плюрипотентных ВСТРЕТИЛ колоний. На момент приобретения полной плюрипотентности компактный колоний клеток ВСТРЕТИЛ приобретать видных ядер и отдельные клетки проявляются при создании уникальный морфологическая картина. Наметанный глаз эта модель является четким признаком успешного перепрограммирования. Однако к следователю, что не хватает PSC культуры обучения, выявление колоний, которые успешно достигли полного плюрипотентности требует тщательной оценки как ВСТРЕТИЛ и iPSC клоны могут быть ошибочно принято за друг друга. Рисунок 1 и на рисунке 2 приведены примеры обоих. Если вместо этого выбрали ВСТРЕТИЛ клоны, тщательное потока cytometry анализ покажет ошибку и в частности, TRA-1-60 и тра-1-81 антигены скорее будет отсутствовать как показано на рисунке 2. Действительно TRA антигены ранее оказались жесткими плюрипотентности маркеров. Однако частично ВСТРЕТИЛ плюрипотентных клеток может представлять интерес в раковых исследований²⁵.

Это условие культуры является оптимальным для источника AFSC/AMSC и в конечном итоге, их распространение будет замедляться и они приобретут льстить, фибробластоподобных морфологии. Источник клетки образуют тканей, которые можно отсоединить от поверхности на более поздних этапах перепрограммирования, хотя это не влияет негативно перепрошивка. Напротив этот процесс иногда приводит к высвободить пространство для перенесенной колоний, устраняя нежелательные ООН перепрограммировать клеточного материала. Отдельностоящий ткани легко может быть удален с помощью стерильной пипеткой подсказка, оставляя частично и полностью плюрипотентных колоний позади, значительно упрощая ручной выбор вниз по течению.

Для ручного выбора полностью перепрограммировать колоний, мы используем ЖК изображений системы, которые могут быть помещены в кабинете безопасности, хватает любой части выступающих которые бы нарушить поток воздуха. Помимо этой тепловизионной системы никакого специального оборудования необходима как собирание, сама может производиться с использованием регулярных пипетки. Взял колонии частично отделена в ЭДТА/PBS решения перед покрытием в целевой скважины вырастают как клоны. В зависимости от линии и клон, за несколько проходов культур могут быть загрязнены с спонтанно дифференциации клеток. Ручного манипулирования и серийный пассированый обычно устранить эту проблему. Клоны, загадками с обширной дифференциации следует отказаться, однако, может быть спасен драгоценные клоны с различной степенью успеха посредством повторных ручной сбор плюрипотентных колоний, вместо того, чтобы распоряжаться дифференциации клеток. Episomal плазмид были продемонстрированы принять около 15 проходы будут потеряны полностью от iPSC²⁶. Таким образом желательно, чтобы позволить клоны расти для по крайней мере это количество проходов перед их использованием в нисходящие приложения и анализа, за исключением обычной мониторинг TRA выражение антигена и кариотип. TRA выражение антигена легко может контролироваться с проточной цитометрии, как здесь описано в протоколе, поскольку только требует около 200000 клеток и может быть выполнена, когда исследователи в сомнения ли искусственный клоны сохраняют плюрипотентности должным образом. Потока cytometry анализ экспрессии маркера ESC не считается достаточным для подтверждения плюрипотентности кандидат линий¹⁹.

Тератома формирования пробирного является стандартным убедительных плюрипотентности тест²⁷. PSC, выращенных в условиях химически определенных, xeno бесплатно, особенно восприимчивы к диссоциации индуцированной смерти и, следовательно, их употребление инъекционным путем подкожно как сгустки необходимых для их успешной имплантации^8,28. После инъекции, 4-6 недель обычно достаточно для роста xeno графтов видимым и до 8-й недели, все может быть собрано, H & E-окрашенных и проанализированы. Животных, стоимость и долго тестирование периодов требуется являются основания для разработки альтернативных методов. Геномный анализ в сочетании с передовой, машина обучения powered bioinformatic подходов может обеспечить точную оценку глобальных выражение профилей. Стоимость получения таких данных сопоставима со стоимостью образования Пробирной тератома, однако геномные подход значительно быстрее и животные не должны использоваться. Один из таких пробирного является bioinformatic плюрипотентности оценки программного обеспечения²². Он реализован как онлайн интерфейс (Таблица материалов). Растущая популярность и резкое падение стоимости РНК последовательности воли обеспечить непрерывность этого подхода. Альтернативой этой плюрипотентности программное обеспечение доступно из университета Джона Хопкинса²³ (cellnet.hms.harvard.edu) и основан на аналогичный подход и способен принимать microarray данные для анализа транскриптом человеческих образцов. Преимущество этого программного обеспечения является имеет возможность определить не только плюрипотентных стволовых клеток, но также дифференцированных клеток и, начиная с его куратор наборов данных были получены из основной ткани, определяет уровень подобия между клеток in vitro выросли / может определяться тканей и тканей в vivo , обеспечивая отличные качества для развития дифференциации протоколы или тканевой инженерии. Тест имеет способность классифицировать запросы в 20 различных клеток или типы тканей. В настоящее время, он требует microarray данные, но авторы работают в направлении расширения платформы вариантов РНК последовательности также.

Следуя представленные протокол, исследователи может генерировать iPSC линии из амниотической жидкости и мембраны стволовых клеток с очень высокая воспроизводимость в полностью химически определены и xeno свободной среде и с помощью метода перепрограммирования-интеграция. Эти строки может использоваться в фундаментальных исследований для оптимизации дифференциация протоколов и в конечном итоге в моделировании болезни, наркотиков скрининг, или педиатрического ткани, инженерных исследований.

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Эта работа была поддержана Тюрингия Medizinische Fonds в Цюрихском университете, Forschungskredit университете Цюриха,^Ch SCIEX NMS под 10,216 стипендии и 12.176, Швейцарское общество кардиологии, Швейцарский Национальный научный Фонд под Грант [320030-122273] и [310030-143992], 7-й Рамочной программы, жизнь клапана, Европейской Комиссией в рамках гранта [242008], Ольга Mayenfisch фонд, Фонд EMDO, целевой дотации 2012 больницы университета Цюриха, и внутреннее финансирование института рака Митчелл.