Method Article
このプロトコルでは、完全に化学的に定義された条件における非統合 episomal アプローチを用いた誘導多能性幹細胞にプライマリ羊水液と膜間葉系幹細胞のリプログラミングをについて説明します。抽出、文化、リプログラミング、および厳格な方法で結果の誘導多能性幹細胞の特性の手順に。
自家細胞を用いた治療法は、誘導多能性幹細胞の導入により現実に近い方のステップを得た。羊水など膜幹細胞、胎児の幹細胞は、組織工学、将来小児の介入と幹細胞のバンキングの iPSC にプログラムし直す約束の未分化細胞のユニークな型を表します。ここで提示されたプロトコルを抽出するための最適化手順をについて説明し、プライマリ羊水液と膜間葉系幹細胞を培養させ、episomal 誘導これら完全に化学的に定義された培養細胞からの多能性幹細胞人間の組換えビトロネクチンおよび E8 媒体利用の条件。-フローサイトメトリー、共焦点レーザー顕微鏡、奇形腫形成と転写プロファイリング-厳格な方法を適用することによって新しい行の評価についても述べる.新しく生成された行は、SSEA 1 のマーカーが陰性でありながら胚性幹細胞-Oct3/4 a、Nanog、Sox2、トラ-1-60、トラ-1-81-SSEA 4 のマーカーを表現します。幹細胞は、6-8 週間でベージュ scid マウスにおける奇形を形成し、奇形を含むすべての 3 つの細菌層の代表的な組織。Bioinformatic 多能性評価アルゴリズムをグローバル発現マイクロ アレイ データを提出することにより、行の転写プロファイリングすべて行多能性としたがって、このアプローチは、動物実験に代わる。IPSC の新しい行は、分化とティッシュ エンジニア リングの最適化を含む下流の実験で容易に使用できます。
潜在的なセル置換療法、疾患と発達モデルと薬物毒性スクリーニング1,2,3の誘導多能性幹細胞 (iPSC) の技術をもたらします。細胞の注入により、補充療法が概念的には可能、体外 (心筋パッチ) などの組織移植を区別またはティッシュ エンジニア リングによる再生を誘導します。羊水 (AFSC) と膜幹細胞 (AMSC) いずれかこれらの介入のための細胞の優れた供給源は、直接4,5,6、7リプログラミングの開始セル人口多能性8,9,10、11,12。
初期のアプローチに使用される未定義の文化システムや9,10、11,12の構成要素を伴うゲノムの統合を必要とするメソッドをプログラムし直します。最近の研究より少なく定義された基底膜添付ファイル マトリックス (BMM) は、羊膜上皮細胞から iPSC を生成に使用されたにもかかわらず xeno 自由な媒体を採用しました。しかし、奇形腫形成アッセイは in vitro 及び分子データの富と共に研究に含まれません。新生児線維芽細胞13と比較して約 8 高いリプログラミング効率を持っている羊水上皮細胞が見つかりました。別の研究で、羊水から間葉系幹細胞は多く高効率12iPSC に再プログラムするも発見されました。
多能性幹細胞はすべての 3 胚葉組織代表に区別でき、このように広範な可能性があります。小児患者が恩恵を収穫、リプログラミングとその自家羊水幹細胞の組織工学胎児と羊膜幹細胞周産期。さらに、(成体幹細胞14,15より低い) 胎児の幹細胞の分化の低レベルは、iPSC16でソース セルからエピジェネティックなバイアスの観測の保持に対処に役立つ可能性が理論的に。
羊水をプログラムし直すためのプロトコルの紹介し、膜幹細胞の多能性を化学的に組換えビトロネクチン17 (VTN) episomal プラスミド18を使用して xeno E8 培を定義します。流体と膜羊膜の細胞リプログラミングのソースとしての主な利点は、利用前とこのアプローチは主に小児組織工学に研究の利益周産期そしてこうして。
プロトコル人間研究倫理委員会の機関のガイドラインに従います。研究のため羊水を使用して患者の書面による同意が得られました。
このプロトコル制度動物ケアおよび使用委員会南アラバマ大学のポリシーに従います。
1. 分離とプライマリ羊膜由来間葉系幹細胞の培養
2. 多能性にプログラムし直す
3 特性および多能性の確認
注: は、フローサイトメトリーおよび共焦点顕微鏡の詳細補足ファイルを参照してください。
通知の書面による同意は、遺伝テストの目的と研究のための流体の小さい因数を捧げての羊水を採取する前に患者から得られました。胎盤は医療廃棄物を表し、同意は羊膜の研究の使用のため必要ありません。羊水の流体と膜幹細胞は典型的な間葉系プロパティを表示、形態学的、細胞は紡錘形と相明るい。リプログラミング、セル間葉系上皮性 (MET) 遷移に入るし、石畳のような形態と上皮プロパティを示すコロニーの空間組織を取得します。このプロセスは、早ければ 48 72 h episomal プラスミドをリプログラミングの導入開始します。リプログラミングの 5 日目でこれらのコロニーの不在は、実験の失敗を示します。MET の植民地の細胞が増殖、その結果、植民地なるコンパクト 5 と 14 日間。コンパクトな MET のコロニーは個別に簡単に目に見える (図 1 a) は細胞から成り立っています。14 日の周り完全にプログラムし直された植民地表示されます顕著、運ぶ、単分子膜の配置のセルで簡単に識別できる核と核小体。彼らは機械的に分離し、植民地の適切なサイズに達するし、コンパクトになるときに展開する準備ができている (図 1 b)。
完全に、部分的にプログラムし直されたコロニーは、部分的にプログラムし直された植民地における多能性を必ずしも取得しないリプログラミング期間全体を通して文化に存在。図 2ショー代表フローにおける胚性幹細胞 (ESC) マーカー発現のフローサイトメトリーによる解析を完全に、部分的に多能性植民地と彼らの対応する形態。完全多能性は Nanog Oct4、Sox2、TRA 抗原と SSEA-4 の式に関連付けられた SSEA 1 式はマイナス19,20,21 (図 2 a)。部分的に多能性細胞はしかし、Nanog および TRA 抗原20 (図 2 b) を表現しません。発現および局在 ESC マーカーの免疫染色と広視野または共焦点顕微鏡 (図 3) を使用してイメージを作成して確認すべき。
多能性の機能確認は、ベージュ scid マウスに皮下細胞を次フォーム奇形 iPSC ラインの能力のデモンストレーションによって実現されます。終点のサイズに到達する奇形 6-8 週間が必要です。すべての 3 胚葉-次内胚葉、中胚葉 (図 4 a) の組織代表者の存在を確認するは、H & E 染色組織の病理学者によって検査が実行されます。動物実験に代わる、cDNA マイクロ アレイ22,23のようなゲノムのアプローチで多能性に関連する転写署名の分析です。2 つの分類子-多能性のプロットの形でオンライン bioinformatic 多能性評価ソフトウェアによって確立された iPSC と esc キー行のプールの 1 つに重なる転写プロファイルの割合を定量化しことができる、ノベルティ (図 4 b)。多能性のスコアが高いほどより多くのクエリ iPSC 行確立されたラインに似ています。目新しさは高スコアはただし、偏差または高い多能性スコア (テラトーマ行など)22にもかかわらずのも染色体異常を示すでした。ここで提示されたプロトコルに従うことによって生成されたすべての iPSC 行は、フローサイトメトリー、イメージング、奇形腫形成および転写解析メソッドによって多能性とみなされています。
図 1: プログラムし直す時に、細胞の形態学的進行。(A)羊水および膜幹細胞リプログラミングのソース セルを表し、間葉系の典型的な形態、細長いと相明るい (左) まで表示間葉系上皮性遷移 (MET) に入る彼らを上皮のプロパティの取得や石畳のような石細胞 (センター) を持つコロニーの形成に します。これらの植民地は、増殖し、MET 細胞の不規則な細胞塊 (右) を作成します。(B) (14 日目の周りから始まる) をリプログラミングの後の段階で完全にリプログラミング細胞コロニー出現-著名な核を個別に識別できる細胞と核小体明確罫線 (センター)-単分子膜における配置多く (左) をある植民地に会ったと並んで存在。完全にプログラムし直された隔離された成熟したクローンは、右側に描かれています。スケールバー = 100 μ mこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: esc キー マーカーの発現のフローサイトメトリー法による解析の完全および部分的 (MET) 再プログラム細胞コロニー 。(A) SSEA 1 負中に多能性発現プロファイル Oct4、Nanog、Sox2、トラ 1 60、TRA-1-81、SSEA 4、肯定的であります。(B)部分的に-それらがメットを受けて、完全多能性に進むことができなかった-多能性細胞コロニーは Oct4、Sox2 の肯定的なしかし、Nanog、トラおよび SSEA の抗原が存在しません。関連付けられている形態がサイド ・ バイ ・ サイド比較のために含まれます。スケール バー = 200 μ m と 50 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 共焦点成熟した羊水流体 iPSC で esc キー マーカーの発現の解析を画像処理します。転写因子 Nanog Oct3/4 a、Sox2 は TRA 中核でローカライズされ、SSEA 抗原は、糖蛋白質、膜上に局在しました。スケールバー = 50 μ m より大きな倍率 (マージ 2 X) の画像は核局在化のより良い視覚化の Oct3/4、Nanog Sox2 に含まれていた。スケール バー = 25 μ m. 感染-透過光の画像。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 奇形腫形成と成熟した羊水膜と流体の iPSC の転写プロファイリングします。(A)ベージュ scid マウスの皮下に成長して奇形には、すべて 3 つの胚葉 (100 倍) の代表的な組織が含まれています。(B)オンライン多能性ソフトウェアに送信されるグローバル発現マイクロ アレイには、2 つの分類子-多能性と目新しさのプロットが返されます。高い多能性スコアと目新しさは低スコア - 赤雲 - 典型的な ESC/iPSC ラインの発現プロファイルを示します。青空に雲は分化した細胞のクラスター領域を表し、かすかな青い雲が部分的に多能性細胞のクラスター領域を表します。羊水 (3 ライン) と膜 (4 行) iPSC はテストによって多能性を認め。Esc キー行 WA25 コントロールとして含まれていたし、ここで黒の矢印で識別されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
胎児幹細胞から iPSC 生成の最初のフェーズは、胎児の組織、彼らの文化、拡張、および episomal リプログラミング プラスミドの導入からソース セルの抽出を伴います。このフェーズの後に、最初の完全にプログラムし直された植民地を拡大することができます前に約 14-18 日間の培養期間が続きます。最終段階は、iPSC クローンの成熟です。羊膜幹細胞の最初の抽出は、羊膜の組合せ機械と酵素消化によって達成されます。インキュベーション時間 30 分最高最高の生存率で抽出した細胞数の結果がわかった。消化手順は、組織・細胞の塊の小さな断片を作り出すことができます。単一のセルを基準にしてこれらの割合が高い場合は、付着細胞の増殖に貢献することができますので、1 つの容器にすべての塊と単一細胞をめっきすることをお勧めします。セルのみ培養培地と混合し、付着細胞のコロニーが十分なサイズに到達するまでインキュベートした羊水幹細胞をめっきは簡単です。通常の組織培養処理容器に最適です、にもかかわらず、彼らは改良された一次電池文化低目と、継との難しさはこれらに観察したので、専門の表面、お勧めしませんプロセス。
羊水の流体と膜幹細胞を拡大する必要があります、冷凍の株式が、都合つき次第セルがリプログラミングのソース セルとして使用できます。Episomal プラスミドの細胞、950 V に設定したトランスフェクション パラメーターでここで使用されるトランスフェクション システムへの導入を目的として 40 ms と 1 パルスは非常によく行う、すべての行が、最終的に正常にプログラムし直された (で試行以上 10 行)。同様の原理で動作している主要な競合する配信システムは、私たちの手でリプログラミング実験が成功を生成しませんでした。
Transfected セルは最初の 3-5 日センテニアルレガシー時中ビトロネクチン コーティング皿にシードされ、媒体は 100 μ M ナトリウム酪酸を添加した E8 に切り替え。これは大きく完全多能性獲得率を向上します。48-72 時間には早くも形態変換の最初の兆候が見られます。元のセルは、メットを受けるし、細胞上皮形態の植民地が表示されます。これらは徐々 に増殖し、コンパクトになります。植民地のサブセットは、完全に多能性幹細胞-著名な核と核小体、個別に識別可能な細胞の形態学的特徴を取得ファジィ境界ではなく、明確に定義されたボーダーとフラットのコロニーが部分的に観察多能性 MET の植民地。完全多能性の獲得の瞬間にコンパクトな MET 細胞コロニーを取得著名な核となり個々 の細胞識別ユニークな形態を作成中。訓練された目にこのパターンは成功の書き換えの明確な兆候です。ただし、PSC 文化訓練を欠いている調査官、完全多能性が正常に進行したコロニーの識別必要があります慎重に評価 MET と iPSC のクローンはお互い間違われることが。図 1と図 2は、両方の例を示します。MET のクローンが代わりに選んだ、徹底したフローサイトメトリー解析はミスを明らかにし、特に、トラ 1 60 とトラ-1-81 抗原はほとんど欠席する場合、図 2に示します。確かに、TRA 抗原は以前厳しい多能性マーカーのように発見されました。ただし、部分的に MET の多能性細胞は、がん研究25に関心のあるかもしれない。
この培養条件はソース AFSC/アムスクの準最適の増殖が遅くなるし、最終的には、彼らが平坦、線維芽細胞のような形態を取得します。元のセルは、この悪影響を及ぼさないプログラムし直すプロセスがリプログラミング、後の段階で表面からデタッチすることができます組織を形成します。逆に、プロセス時に不要な非プログラムし直された細胞材料を排除しながらプログラムし直されたコロニーのための領域を解放に します。独立した組織は、部分的に残して、滅菌ピペット チップと完全に手動選択下流を大幅に簡素化、多能性コロニーを使用して簡単に破棄できます。
完全にプログラムし直されたコロニーの手動狩りは、イメージング システム、安全キャビネットで置くことが、空気の流れを妨げる突き出た任意の部品に欠けている LCD を使用します。このイメージング システム以外ピッキング自体は通常のピペットを使用して実行できるは、特別な装置が必要ありません。選ばれた植民地はクローンとして成長するターゲットの井戸にメッキされている前に、部分的に EDTA/PBS 溶液中解離します。行といくつかの通路のためのクローンによって自発的に分化細胞の文化を汚染可能性があります。手動操作およびシリアル継は通常この問題を除去します。広範な分化だらけのクローンを破棄するか、繰り返しマニュアル分化細胞を処分するのではなく、多能性コロニーのピッキングによるさまざまな程度の成功の貴重なクローンを回収することができますただし。Episomal プラスミドは、iPSC26から完全に失われ約 15 通路を示されていた。したがって、ダウン ストリーム アプリケーションの解析では、TRA の抗原の表現および染色体の日常的な監視を除いてそれらを使用する前に、少なくとも通路の数の成長するクローンを許可することをお勧めします。アッセイのみ約 200,000 セルを必要があり、研究者は培養されたクローンを維持するかどうか疑問でいつでも実行できるプロトコルでは、ここで説明はフローサイトメトリーによる TRA 抗原の発現を監視することができますは簡単に多能性適切。Esc キー マーカー発現の流れフローサイトメトリー解析は候補行19多能性を確認するために十分であると考慮されません。
奇形腫形成アッセイは、標準の決定的な多能性テスト27です。化学的に定義された、xeno 無料条件で栽培 PSC 解離誘起に特に敏感死、したがって、塊として皮下注射が必要に成功した注入8,28。次の注射、通常 4-6 週間は十分な表示する異種移植片の増殖とすべてがすることができます 8 週前に収穫、H & E 染色と分析されました。動物愛護・ コスト ・長期テストに必要な期間は代替手法の開発理由です。ゲノム解析は、高度なと組み合わせて、マシン学習搭載のバイオ情報アプローチ グローバル発現プロファイルの正確な評価を提供します。このようなデータを得るためのコストは奇形腫形成アッセイのコストに匹敵する、しかし、ゲノム アプローチはかなり高速と動物を使用する必要はありません。このような 1 つの試金は bioinformatic の多能性評価ソフトウェア22です。それは、オンラインのインターフェース (材料表) として実装されます。人気の高まりと RNA シーケンスが急落のコストは、このアプローチの継続性を確保します。この多能性ソフトウェアに代わるものはジョンズ ・ ホプキンス大学23 (cellnet.hms.harvard.edu) から入手可能ですと同様のアプローチに基づいており、ひと試料のトランスクリプトームを解析するマイクロ アレイ データを受け入れることが。このソフトウェアの利点は多能性幹細胞だけでなくを識別する能力を持っているが、また分化した細胞と、その精選されたデータセットからプライマリ組織、体外で成長して細胞間類似性のレベルから派生した/組織と体内組織決定できます、微分のプロトコルや組織工学の開発のため優秀な品質管理を提供します。テストには、20 の異なる細胞や組織の種類にクエリを分類する能力があります。現時点では、マイクロ アレイ データを必要とするが、著者は、RNA にプラットフォームのオプションの拡大に向かって作業している同様のシーケンスします。
提案するプロトコルに従って、研究者は完全に化学的に定義された、xeno 無料媒体と非統合の初期化メソッドを使用して再現性の非常に高い羊水の流体と膜幹細胞から iPSC 行を生成できます。これらの行は、微分のプロトコルを最適化し、最終的に病モデルにおける薬物スクリーニング、または小児組織エンジニア リングの研究基礎研究で使用できます。
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
この作品は、チューリッヒ大学、チューリッヒ大学、奨学金 10.216 と 12.176、スイス社会循環器科、スイス科学の下、サイエックス NMSChの Forschungskredit フォンこの上海虹橋によって支えられました。財団助成金 [320030 122273] の下と [310030 143992]、第 7 フレームワーク プログラム、生活バルブ、グラント [242008]、オルガ Mayenfisch 財団、EMDO 財団、大学病院チューリッヒの創業助成金 2012 の下欧州委員会と内部は、ミッチェルのがん研究所の資金調達。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Tumor Dissociation Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | tissue dissociation system, reagent kit, includes tissue dissociation tubes and tissue dissociation enzymes |
gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | tissue dissociation system, dissociator |
Thermo Scientific™ Shandon™ Disposable Scalpel No. 10, Sterile, Individually Wrapped, 5.75 (14.6cm) | Thermo-Fisher | 3120032 | |
70 µm cell strainers | Corning | 10054-456 | |
RPMI 1640 medium | Thermo-Fisher | 32404014 | |
rocking platform | VWR | 40000-300 | |
50 ml centrifuge tubes | Thermo-Fisher | 339652 | |
15 ml centrifuge tubes | Thermo-Fisher | 339650 | |
EBM-2 basal medium | Lonza | CC-3156 | basal medium for AFMC medium |
FGF 2 Human (expressed in E. coli, non-glycosylated) | Prospec Bio | CYT-218 | bFGF, supplement for AFMC medium |
EGF Human, Pichia | Prospec Bio | CYT-332 | EGF, supplement for AFMC medium |
LR3 Insulin Like Growth Factor-1 Human Recombinant | Prospec Bio | CYT-022 | IGF, supplement for AFMC medium |
Fetal Bovine Serum, embryonic stem cell-qualified | Thermo-Fisher | 10439024 | FBS |
Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo-Fisher | 15240062 | for primary AFSC/AMSC, for routine AFSC/AMSC it should not be necessary, do not use in medium for transfected cells! |
Accutase cell detachment solution | StemCell Technologies | 07920 | cell detachment enzyme |
CryoStor™ CS10 | StemCell Technologies | 07930 | complete freezing medium |
PBS, pH 7.4 | Thermo-Fisher Scientific | 10010023 | |
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) | Qiagen | 12362 | for plasmid isolation |
pEP4 E02S EN2K | Addgene | 20925 | EN2K, reprogramming factors Oct4+Sox2, Nanog+Klf4 |
pEP4 E02S ET2K | Addgene | 20927 | ET2K, reprogramming factors Oct4+Sox2, SV40LT+Klf4 |
pCEP4-M2L | Addgene | 20926 | M2L, reprogramming factors c-Myc+LIN28 |
NanoDrop 2000c UV-Vis Spectrophotometer | Thermo-Fisher | ND-2000C | spectrophotometer |
Neon® Transfection System | Thermo-Fisher | MPK5000 | transfection system, components: Neon pipette - transfection pipette Neon device - transfection device |
Neon® Transfection System 10 µL Kit | Thermo-Fisher | MPK1025 | consumables kit for the Neon Transfection System, it contains: Neon tip - transfection tip Neon tube - transfection tube buffer R - resuspension buffer buffer E - electrolytic buffer |
Stemolecule™ Sodium Butyrate | StemGent | 04-0005 | small molecule enhancer of reprogramming |
TeSR-E8 | StemCell Technologies | 05940 | E8 medium |
Vitronectin XF™ | StemCell Technologies | 07180 | VTN, stock concentration 250 µg/ml, used for coating at 1 µg/cm2 in vitronectin dilution (CellAdhere) buffer |
CellAdhere™ Dilution Buffer | StemCell Technologies | 07183 | vitronectin dilution buffer |
UltraPure™ 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15575020 | dilute with PBS to 0.5 mM before use |
EVOS® FL Imaging System | Thermo-Fisher Scientific | AMF4300 | LCD imaging microscope system |
CKX53 Inverted Microscope | Olympus | phase contrast cell culture microscope | |
Pierce™ 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo-Fisher | 28908 | dilute to 4% with PBS before use, diluted can be stored at 2-8 °C for 1 week |
Perm Buffer III | BD Biosciences | 558050 | permeabilization buffer, chill to -20 °C before use |
Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 557782 | isotype control for Oct3/4A, Nanog |
Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 557783 | isotype control for Sox2 |
Mouse anti-human Oct3/4 (Human Isoform A), Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 561628 | |
Mouse anti-human Nanog, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 560791 | |
Mouse anti-human Sox-2, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 562139 | |
Mouse IgGM, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 401617 | isotype control for TRA-1-60 |
Mouse IgGM, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 401618 | isotype control for TRA-1-81 |
Mouse anti-human TRA-1-60, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 330613 | |
Mouse anti-human TRA-1-81, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 330705 | |
Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 400129 | isotype control for SSEA-1 |
Mouse IgG3, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 401321 | isotype control for SSEA-4 |
Mouse anti-human SSEA-1, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 323010 | |
Mouse anti-human SSEA-4, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 330407 | |
Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor® 488 | Jackson Immunoresearch | 115-606-068 | use at a dilution of 1:600 or further optimize |
Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor® 647 | Jackson Immunoresearch | 115-546-068 | use at a dilution of 1:600 or further optimize |
DAPI | Thermo-Fisher Scientific | D21490 | stock solution 10 mM, further dilute to 1:12.000 for a working solution |
Corning® Matrigel® Growth Factor Reduced, Phenol Red-Free | Corning | 356231 | basement membrane matrix (BMM) |
scid-beige mice, female | Taconic | CBSCBG-F | |
RNeasy Plus Mini Kit (50) | Qiagen | 74134 | RNA isolation kit |
T-25 flasks, tissue culture-treated | Thermo-Fisher | 156367 | |
T-75 flasks, tissue culture-treated | Thermo-Fisher | 156499 | |
Nunc™ tissue-culture dish | Thermo-Fisher | 12-567-650 | 10 cm tissue culture dish |
6-well plates, tissue-culture treated | Thermo-Fisher | 140675 | |
Neubauer counting chamber (hemacytometer) | VWR | 15170-173 | |
Mr. Frosty™ Freezing Container | Thermo-Fisher | 5100-0001 | freezing container |
FACS tubes, Round Bottom Polystyrene Test Tube, 5ml | Corning | 352058 | 5 ml polystyrene tubes |
Eppendorf tubes, 1.5 ml | Thermo-Fisher | 05-402-96 | 1.5 ml microcentrifuge tubes |
PCR tubes, 200 µl | Thermo-Fisher | 14-222-262 | |
pipette tips, 100 to 1250 µl | Thermo-Fisher | 02-707-407 | narrow-bore 1 mL tips |
pipette tips, 5 to 300 µl | Thermo-Fisher | 02-707-410 | |
pipette tips, 0.1 to 10 µl | Thermo-Fisher | 02-707-437 | |
wide-bore pipette tips, 1000 µl | VWR | 89049-166 | wide-bore 1 mL tips |
glass Pasteur pipettes | Thermo-Fisher | 13-678-20A | |
ethanol, 200 proof | Thermo-Fisher | 04-355-451 | |
vortex mixer | VWR | 10153-842 | |
chambered coverglass, 8-well, 1.5mm borosilicate glass | Thermo-Fisher | 155409 | glass-bottom confocal-grade cultureware |
22G needles | VWR | 82002-366 | |
insulin syringes | Thermo-Fisher | 22-253-260 | |
Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | fixation of explanted teratomas |
Illumina HT-12 v4 Expression BeachChip | Illumina | BD-103-0204 | expression microarray, supported by PluriTest, discontinued by manufacturer |
PrimeView Human Genome U219 Array Plate | Thermo-Fisher | 901605 | expression microarray (formerly Affymetrix brand), soon to be supported by PluriTest |
GeneChip™ Human Genome U133 Plus 2.0 Array | Thermo-Fisher | 902482 | expression microarray (formerly Affymetrix brand), supported by CellNet, soon to be supported by PluriTest |
PluriTest® | Coriell Institute | www.pluritest.org, free service for bioinformatic assessment of pluripotency, accepts microarray data - *.idat files from HT-12 v4 platform, soon to support U133, U219 microarray and RNA sequencing data | |
CellNet | Johns Hopkins University | cellnet.hms.harvard.edu, free service for bioinformatic identification of cell type, including plutipotent stem cells, based on U133 microarray data - *.cel files, soon to support RNA sequencing data |
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